Nghiên cứu sự thay đổi thành phần hóa học của dược liệu Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson) trong quá trình chế biến

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y LÊ THỊ THƢ NGHIÊN CỨU SỰ THAY ĐỔI THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA DƢỢC LIỆU HÀ THỦ Ô ĐỎ (Fallopia multiflora (Thunb ) Haraldson) TRONG QUÁ TRÌNH CHẾ BIẾN KH.

(Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson)

TRONG QUÁ TRÌNH CHẾ BIẾN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ ĐẠI HỌC

HÀ NỘI - 2022

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

LÊ THỊ THƯ

NGHIÊN CỨU SỰ THAY ĐỔI THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA DƯỢC LIỆU HÀ THỦ Ô ĐỎ

(Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson)

TRONG QUÁ TRÌNH CHẾ BIẾN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

Cán bộ hướng dẫn: TS Đào Văn Đôn

HÀ NỘI - 2022

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, từ tận đáy lòng mình, em xin bày lỏ lòng biết ơn sâu sắc tới

TS Đào Văn Đôn – Giảng viên bộ môn Hóa Dược – Dược lâm sàng Cảm ơn thầy vì trong suốt thời gian làm khóa luận đã định hướng khoa học và chỉ dẫn học thuật, là người đã đồng hành, chia sẻ khó khăn và động viên em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Em xin trân trọng cảm ơn PGS TS Trịnh Nam Trung – Viện trưởng Viện Đào tạo Dược, TS Nguyễn Văn Bạch – Phó Viện trưởng Viện Đào tạo Dược, TS Quách Thị Hà Vân – Chủ nhiệm bộ môn Hóa Dược – Dược lâm sàng, Học viện Quân Y đã tạo điều kiện hết sức cho em thực hiện khóa luận

Em xin trân trọng cảm ơn tới: Ban Giám Đốc Học viện Quân Y, Viện Đào tạo Dược, Bộ môn Hóa Dược – Dược lâm sàng, Học viện Quân Y đã tạo điều kiện hết sức cho em hoàn thành khóa luận

Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn thể thầy cô giáo và nhân viên trong Viện Đào tạo – Nghiên cứu Dược, Học viện Quân Y, các Bộ môn, Khoa đã nhiệt tình dạy bảo, giúp đỡ và mang lại cho em những kiến thức cùng kinh nghiệm quý báu trong suốt 5 năm học vừa qua

Cuối cùng, với lòng biết ơn vô hạn em xin được gửi tới bố mẹ, anh chị

em, bạn bè và những người thân yêu nhất luôn bên cạnh em và ủng hộ em hết lòng trên con đường học tập cũng như trong suốt quá trình làm khóa luận

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 13 tháng 07 năm 2022 Sinh viên

MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 2

TỔNG QUAN VỀ DƯỢC LIỆU HÀ THỦ Ô ĐỎ 2

1.1 1.1.1 Tên khoa học 2

1.1.2 Mô tả 2

1.1.3 Phân bố 3

1.1.4 Bộ phận dùng 3

1.1.5 Thành phần hóa học 4

1.1.6 Công dụng và tác dụng sinh học của dược liệu Hà thủ ô đỏ 8

1.1.7 Quy trình chế biến vị thuốc Hà thủ ô đỏ 11

1.1.8 Sự thay đổi một số thành phần hóa học sau khi chế biến 12

TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

1.2 1.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol toàn phần 13

1.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng tanin 14

1.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng flavonoid toàn phần 15

1.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng anthraquinon toàn phần 16

CHƯƠNG 2 -NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 17

2.1 2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 17

2.1.2 Dụng cụ, thiết bị 20

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.2 2.2.1 Phương pháp kiểm nghiệm một số chỉ tiêu chất lượng của Hà thủ ô đỏ theo Dược điển Việt Nam V 20

2.2.2 Phương pháp chế biến và xác định sự thay đổi một số thành phần hóa học của Hà thủ ô đỏ trong quá trình chế biến 23

PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 31

2.3 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 31

2.4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 32

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ KIỂM NGHIỆM MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG HÀ 3.1 THỦ Ô ĐỎ THEO DƯỢC ĐIỂN VIỆT NAM V 32

3.1.1 Kết quả kiểm nghiệm chỉ tiêu bột dược liệu 32

3.1.2 Kết quả kiểm nghiệm chỉ tiêu định tính bằng phản ứng hóa học 33

3.1.3 Kết quả kiểm nghiệm chỉ tiêu định tính bằng sắc ký lớp mỏng 33

3.1.4 Kết quả kiểm nghiệm chỉ tiêu độ ẩm 34

3.1.5 Kết quả kiểm nghiệm chỉ tiêu chất chiết được trong dược liệu 35

KẾT QUẢ SO SÁNH SỰ THAY ĐỔI MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA 3.2 HỌC CỦA HÀ THỦ Ô ĐỎ TRONG QUÁ TRÌNH CHẾ BIẾN 36

3.2.1 Sự biến đổi hàm lượng tanin 36

3.2.2 Sự biến đổi hàm lượng flavonoid toàn phần 39

3.2.3 Sự biến đổi hàm lượng anthraquinon toàn phần 42

3.2.4 Sự biến đổi hàm lượng polyphenol toàn phần 46

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số anthraquinon đƣợc phân lập từ rễ Hà thủ ô đỏ 5

Bảng 2.1 Kí hiệu mã hóa các mẫu theo giai đoạn chế biến Hà thủ ô đỏ 18

Bảng 2.2 Nguyên liệu, hóa chất chuẩn dùng trong nghiên cứu 19

Bảng 2.3 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu 19

Bảng 2.4 Các dung môi dùng trong nghiên cứu 20

Bảng 2.5 Quy trình chế biến hà thủ ô đỏ cho một mẻ 23

Bảng 3.1 Độ ẩm các mẫu Hà thủ ô đỏ 35

Bảng 3.2 Hàm lƣợng chất chiết đƣợc trong dƣợc liệu Hà thủ ô đỏ 35

Bảng 3.3 Hàm lƣợng tanin của Hà thủ ô đỏ trong quá trình chế biến 36

Bảng 3.4 Hàm lƣợng flavonoid toàn phần của Hà thủ ô đỏ trong quá trình chế biến 40

Bảng 3.5 Hàm lƣợng anthraquinon toàn phần của Hà thủ ô đỏ trong quá trình chế biến 43

Bảng 3.6 Hàm lƣợng polyphenol toàn phần của Hà thủ ô đỏ trong quá trình chế biến 47

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cây Hà thủ ô đỏ 2

Hình 1.2 Khung chung của các anthraquinon trong rễ Hà thủ ô đỏ 4

Hình 1.3 Công thức hóa học của một số hợp chất stilben trong rễ Hà thủ ô đỏ 6

Hình 1.4 Công thức hóa học của một số hợp chất flavonoid trong rễ Hà thủ ô đỏ 7

Hình 1.5 Phản ứng của thuốc thử Folin - Ciocalteu với acid gallic 14

Hình 1.6 Phản ứng của AlCl3 với rutin 15

Hình 1.7 Phản ứng của oxyanthraquinon với magnesi acetat 16

Hình 2.1 Hình ảnh Hà thủ ô đỏ sau mỗi giai đoạn chế biến 18

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình chế biến hà thủ ô đỏ 25

Hình 3.1 Các đặc điểm của bột dược liệu Hà thủ ô đỏ 32

Hình 3.2 Phản ứng hóa học định tính 3 mẫu từ 3 lô Hà thủ ô đỏ 33

Hình 3.3 Sắc ký đồ dung dịch thử, dung dịch Hà thủ ô đỏ và emodin chuẩn ở ánh sáng thường và ánh sáng tử ngoại 366 nm 34

Hình 3.4 Biểu đồ hàm lượng tanin các lô Hà thủ ô đỏ trong quá trình chế biến 37

Hình 3.5 Biểu đồ hàm lượng flavonoid toàn phần các lô Hà thủ ô đỏ trong quá trình chế biến 41

Hình 3.6 Biều đồ hàm lượng trung bình anthraquinon toàn phần các lô Hà thủ ô đỏ trong quá trình chế biến 44

Hình 3.7 Hàm lượng trung bình polyphenol toàn phần Hà thủ ô đỏ trong quá trình chế biến 48

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

STT Chữ viết tắt Tên đầy đủ

3 RE Rutin Equivalent (Tương đương rutin)

emodin)

7 TNHH MTV Trách nhiệm hữu hạn Một thành viên

8 UV-Vis UltraViolet - Visible Spectroscopy (Tử

ngoại - khả kiến)

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là một quốc gia mang khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa với hệ thống rừng cây phát triển rất phong phú Chính vì lí do đó, từ ngàn xưa, kết hợp với sự sáng tạo của mình, nhân dân ta đã biết sử dụng cây cỏ xung quanh làm thành các vị thuốc, bài thuốc có tác dụng trị bệnh, bồi bổ cơ thể, tăng cường sức khỏe Trong số các dược liệu đó, có rất nhiều dược liệu còn mang giá trị sử dụng đến tận ngày nay do các tác dụng tốt mà chưa có loại thuốc hiện đại nào thay thế được hoặc nếu thay thế sẽ tốn kém về mặt kinh tế Một trong số các dược liệu đó phải kể đến Hà thủ ô đỏ

Trong một số tài liệu còn lưu giữ ở nước ta và tài liệu của Trung Quốc, Hà thủ ô đỏ được coi là vị thuốc có khả năng làm người già hóa trẻ, tóc bạc hóa đen Theo quan điểm của y học cổ truyền, Hà thủ ô đỏ có nhiều tác dụng quý như bổ huyết, điều hoà khí huyết, bổ gan thận, mạnh gân cốt, nhuận tràng, giúp ích cho

sự tiêu hoá Y học hiện đại còn phát hiện Hà thủ ô đỏ có tác dụng làm giảm lượng đường trong máu, có tác dụng tốt đối với các trường hợp suy nhược thần kinh và bệnh về thần kinh, làm tăng hoạt động của tim, làm tăng sự co bóp của ruột, có tác dụng chống viêm…[1, 2] Do đó, Hà thủ ô đỏ được sử dụng rộng rãi

để phục vụ đời sống con người cho đến tận ngày nay

Đáng chú ý, thành phần hóa học trong dược liệu Hà thủ ô đỏ gồm cả nhóm chất tanin có tác dụng chữa tiêu chảy và anthraquinon nhóm nhuận tẩy

có tác dụng nhuận tràng [3] Do vậy, khi dùng dược liệu cần phải chế biến để giảm bớt các thành phần trên, hạn chế tác dụng không mong muốn Nhận thấy, khi chế biến Hà thủ ô đỏ thì cần kết hợp với nghiên cứu các chỉ tiêu hóa

học để kiểm soát và tăng hiệu quả sử dụng dược liệu Đề tài ―Nghiên cứu sự

thay đổi thành phần hóa học của dược liệu Hà thủ ô đỏ (Fallopia

multiflora (Thunb.) Haraldson) trong quá trình chế biến‖ được thực hiện

2

TỔNG QUAN CHƯƠNG 1 -

TỔNG QUAN VỀ DƯỢC LIỆU HÀ THỦ Ô ĐỎ

1.1

1.1.1 Tên khoa học

Cây Hà thủ ô đỏhay còn gọi là thủ ô, giao đằng, dạ hợp, địa tinh…

Tên khoa học là Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson, thuộc họ Rau răm (Polygonaceae), bộ Cẩm chướng (Caryophyllales)

1.1.2 Mô tả

Cây Hà thủ ô đỏ là loại dây leo, sống nhiều năm Thân mềm, nhẵn, mọc xoắn vào nhau Rễ phình thành củ, màu nâu đỏ, củ nguyên có hình giống như

củ khoai lang Lá mọc so le, hình mũi tên, gốc hình tim, đầu thuôn nhọn, dài

từ 5 – 8 cm, rộng 3 – 4 cm; 3 – 5 gân xuất phát từ gốc lá, hai mặt nhẵn, mặt trên sẫm bóng; cuống dài khoảng 2 cm, phủ lông tơ, bẹ chìa mỏng, ngắn, có lông dài Cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành thành chùy phân nhánh, dài hơn lá; lá bấc ngắn; hoa nhỏ nhiều, màu trắng; nhị 8, thường dính vào gốc của bao hoa Quả hình 3 cạnh, nhẵn bóng, nằm trong bao hoa mà 3 mảnh ngoài phát triển thành những cánh rộng Mùa hoa từ tháng 9 – 11; mùa quả từ tháng 12 đến tháng 2 hàng năm Bộ phận dùng là rễ củ của cây [1]

n 1.1 Cây Hà thủ ô đỏ [4]

3

1.1.3 Phân bố

Ở Việt Nam, Hà thủ ô đỏ chỉ có ở một số vùng núi cao (từ 1000 m trở lên) phía bắc, mọc nhiều ở Hà Giang, Lai Châu, Lào Cai, Sơn La Các tỉnh ít gặp hơn như Hòa Bình (Mai Châu), Thanh Hóa (khu Cao Sơn), Nghệ An (Kỳ Sơn), Lạng Sơn (núi Mẫu Sơn), Cao Bằng (Bảo Lạc), Yên Bái (Mù Cang Chải)

Hà thủ ô đỏ là loài cây ưa khí hậu ẩm mát của vùng cận nhiệt đới và vùng nhiệt đới núi cao Cây ưa sáng và có thể hơi chịu bóng Nơi mọc thích hợp nhất là các quần thể rừng núi đá vôi, cao tới 1700 m, nhiệt độ không khí trung bình dưới 20o

C Hà thủ ô đỏ thích nghi với đất ẩm, xốp, nhiều mùn, pH

từ 5 – 6,5, nhất là loại đất ở chân núi đá vôi Cây thường mọc tự nhiên, nhiều chủ yếu ở vùng núi cao Cây được trồng ở đất đồi vùng trung du hay trên đất

đỏ bazan đều phát triển tốt [1]

Hà thủ ô đỏ ra quả hàng năm, mỗi cây có thể ra nhiều quả Sau khi quả già, phần thân leo trên mặt đất làm hạt giống phát tán xung quanh và sẽ nảy mầm vào mùa xuân hè năm sau Có thể trồng cây bằng dây hoặc hạt và sau 4 – 5 năm có thể thu hoạch

Trên thế giới, cây hiện được tìm thấy ở Trung Quốc (các tỉnh Giang Tô, Quảng Đông, Tứ Xuyên, Hồ Bắc, Phúc Kiến) và Nhật Bản

Hiện nay, để phục vụ nhu cầu sử dụng vị thuốc, nhiều nơi ở Việt Nam

có những vùng tự trồng Hà thủ ô đỏ rải rác ở các địa phương

1.1.4 Bộ phận dùng

Bộ phận dùng là rễ củ phơi hay sấy khô của cây Hà thủ ô đỏ, được mô tả: rễ củ tròn, hoặc hình thoi, không đều, củ nhỏ để nguyên, dài 6 – 15 cm, đường kính 4 – 12 cm; củ to bổ đôi theo chiều dọc, hay chặt thành từng miếng

to Mặt ngoài màu nâu đỏ, có những chỗ lồi lõm do các nếp nhăn ăn sâu tạo thành Chất chắc, khó bẻ Mặt cắt ngang có lớp bần mỏng màu nâu sẫm, mô mềm vỏ màu đỏ hồng, có nhiều bột, ở giữa có ít lõi gỗ Mùi nhẹ, vị hơi đắng, hơi ngọt và chát [5]

4

1.1.5 Thành phần hóa học

Năm 2021, tác giả Wang và cộng sự đã phân lập được từ dịch chiết nước và dịch chiết ethanol của rễ Hà thủ ô đỏ 103 hợp chất bao gồm 24 anthraquinon, 21 stilben, 15 acid phenolic, 14 flavonoid và 29 hợp chất khác [6]

Nghiên cứu của tác giả Tao Yi và cộng sự năm 2007 đã phân lập và xác định được 9 hợp chất hóa học thuộc hai nhóm hợp chất chính là anthraquinon

và stilben trong dịch chiết methanol của rễ Hà thủ ô đỏ [7]

Tác giả Wen Rui và cộng sự (năm 2020) đã phân lập được 11 hợp chất hữu cơ có trong cả rễ, thân và lá Hà thủ ô đỏ Các hợp chất này thuộc các nhóm chất: tanin, flavonoid, stiben, anthraquinon, aminoacid [8]

Như vậy, có thể phân chia thành phần hóa học có trong rễ Hà thủ ô đỏ thành các nhóm chính: nhóm anthraquinon, nhóm stilben, nhóm flavonoid, và các thành phần khác

(16) 2 = R (18) 7b= S; 8b = R

1.3 Công thức hóa học của một số hợp chất stilben trong rễ Hà thủ ô đỏ

c Các hợp chất flavonoid

Các nghiên cứu đã cho thấy trong rễ Hà thủ ô đỏ có chứa các thành

phần thuộc nhóm flavonid có tác dụng chống viêm và tăng tuần hoàn máu

Các flavonoid này bao gồm: kaempferol (19) [6, 10]; luteolin (20); vitexin

(21) [1, 9]; quercetin (22) [1, 6, 8]; quercetin-3-o-arabinoside (33) [1]

Ngoài những thành phần trên, trong rễ Hà thủ ô đỏ còn chứa các

phospholipid [9], đặc biệt là lecithin [2]; acid gallic, các hợp chất thuộc nhóm

1.1.6 Công dụng và tác dụng sinh học của dược liệu Hà thủ ô đỏ

1.1.6.1 Công dụng và tác dụng theo y học cổ truyền

Hà thủ ô đỏ có vị đắng chát, hơi ngọt, tính bình, có tác dụng bổ huyết,

cố tinh, điều hoà khí huyết, bổ gan thận, mạnh gân xương, nhuận tràng Nó được dùng để điều trị thần kinh suy nhược, ngủ kém, thiếu máu, đau lưng, mỏi gối, di mộng tinh, bạch đới, đại tiểu tiện ra máu, mẩn ngứa Uống lâu làm đen râu tóc đối với người bạc tóc sớm, làm tóc đỡ khô, đỡ rụng Tại Việt Nam

có nhiều bài thuốc cổ truyền của các danh y (Tuệ Tĩnh, Hải Thượng Lãn Ông) đều sử dụng dược liệu Hà thủ ô đỏ chế bằng cách ngâm rượu hoặc hạ thổ, dùng để chữa các bệnh như phong lở, ngứa ngáy, đái buốt, rụng tóc, phong thấp [1, 17, 18] Rễ Hà thủ ô đỏ dùng trong y học cổ truyền Nhật Bản nhằm điều trị bệnh tăng lipid máu, bệnh viêm, bệnh nấm [1]

1.1.6.2 Tác dụng sinh học

Dược liệu Hà thủ ô đỏ đã được nghiên cứu là có tác dụng giúp chống tăng lipid máu, kích thích mọc tóc, bảo vệ thần kinh, có tác dụng tốt đối với các trường hợp suy nhược thần kinh, chống viêm, làm tăng hoạt động của tim, làm tăng sự co bóp của ruột, kích thích tiêu hóa, cải thiện dinh dưỡng…:

 Tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh, tăng cường trí nhớ:

Năm 2009, Luo và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tác động của TSG trong dịch chiết Hà thủ ô đỏ đối với chuột cống bị Alzheimer do phơi nhiễm Nhôm Nghiên cứu tiến hành với 18 con chuột thuộc nhóm chứng cho uống nước cất và 70 con chuột thuộc nhóm thử cho uống dung dịch AlCl3 0,3% trong 90 ngày Sau đó, 54 trong 70 con chuột nhóm thử được chọn ngẫu nhiên

để sử dụng TSG (4 g/kg) và Vitamin E (40 mg/kg) trong 5 tháng Kết quả cho thấy, 54 con chuột được điều trị đã giảm 60% triệu chứng suy giảm trí nhớ do

9

tác động của Nhôm, trong đó nhóm được sử dụng TSG có hiệu quả tốt hơn Vitamin E Kết luận được nghiên cứu đưa ra là TSG có thể có tác dụng điều trị chống lại bệnh Alzheimer [19]

Đến năm 2016, tác giả Tao Chen và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của việc sử dụng TSG (một thành phần chính có trong dược liệu Hà thủ ô đỏ) đến trí nhớ ở vùng hồi hải mã Nghiên cứu bố trí với 4 nhóm chuột 8 tuần tuổi (20 – 25 g) được chia ngẫu nhiên thành 4 nhóm: nhóm dùng nước muối, nhóm dùng TSG liều thấp (20 mg/kg/ngày), nhóm dùng TSG liều trung bình (40 mg/kg/ngày) và dùng TSG liều cao (80 mg/kg/ngày) Thời gian thử nghiệm dùng thuốc là 4 tuần và sử dụng tác nhân kích thích là dòng điện 0,5

mA Kết quả cho thấy, sử dụng TSG ở cả ba liều trên đều có khả năng giúp tăng cường trí nhớ vùng hồi hải mã [20]

Nhiều nghiên cứu cũng đã chỉ ra tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh, chống lại bệnh Alzheimer và Parkinson của TSG và dẫn chất Emodin trong dịch chiết Hà thủ ô đỏ thông qua một số cơ chế: chống lại tác nhân AChE, thúc đẩy sự biệt hóa các tế bào PC12 giúp tăng cường tính dẻo khớp thần kinh đồi hải mã, chống lại quá trình chết tự nhiên của tế bào thần kinh đồi hải mã [21-24]

 Tác dụng chống oxy hóa:

Nghiên cứu của tác giả Zhou và cộng sự (năm 2013) sử dụng tác nhân gây oxy hóa là D-galactose (liều 150 mg/kg cân nặng) trong 4 và 8 tuần trên chuột thí nghiệm Những con chuột cả sử dụng D-galactose và không sử dụng được cho tiêm TSG (chiết xuất từ Hà thủ ô đỏ) với các liều 42, 84, 168 mg/kg cân nặng pha trong nước muối sinh lý 0,9% trong 4 và 8 tuần Vào ngày thứ

29 và 57 của thử nghiệm, những con chuột được lấy máu và nội tạng để quan sát nghiên cứu Cuối cùng, tác giả đưa ra kết luận, TSG là một chất tiềm năng chống lão hóa trong tương lai [25]

Để nghiên cứu trên invitro tác dụng chống oxy hóa của các stiben chiết xuất từ rễ Hà thủ ô đỏ, năm 2006, tác giả Li-Shuang và các cộng sự đã tiến hành so sánh khả năng bắt gốc tự do DPPH, khả năng thu dọn gốc hydroxyl, khả năng thu dọn gốc aninon O2- và hoạt động ức chế quá trình peroxy hóa

10

lipid của ba loại dịch chiết ethanol thu được từ dược liệu Hà thủ ô đỏ: phần dịch chiết thô, phần dịch chiết được tách bằng nhựa macroporous và tinh thể nguyên chất TSG với resveratrol Kết quả cho thấy, cả ba loại dịch chiết đều

có khả năng chống oxy hóa, riêng phần dịch chiết TSG có khả năng chống oxy hóa cao nhất với giá trị IC50 lần lượt cho các thử nghiêm nêu trên là: 8,06, 2,75 và 0,57 mg/mL Với thử nghiệm ức chế quá trình peroxy hóa lipid ở gan, tim và não, IC50 của TSG là 13,68, 16,34 và 17,62 mg/mL, tương ứng [26]

 Tác dụng chống tăng lipid máu, giảm xơ vữa động mạch:

Tác giả Yang và cộng sự năm 2005 đã nghiên cứu tác dụng làm giảm

xơ vữa động mạch của dịch chiết nước Hà thủ ô đỏ trên thỏ bị tăng cholesterol Nghiên cứu sử dụng 50 con thỏ New Zealand chia thành 5 nhóm cho ăn chế độ bình thường, cholesterol cao và cholesterol cao kết hợp dịch chiết nước Hà thủ ô đỏ (hàm lượng Stibens lớn hơn 60%) với ba nồng độ 25,

50 và 100 mg/kg trong 12 tuần Kết quả cho thấy ở cả 3 nhóm thỏ có sử dụng dịch chiết Hà thủ ô đỏ đều cho lượng triglycerid huyết tương giảm đáng kể so với nhóm không dùng dịch chiết tương ứng Tuy nhiên, chỉ hai nhóm dùng 50

và 100 mg/kg cho kết quả giảm xơ vữa động mạch đáng kể lần lượt là 43% và 60% Nghiên cứu đưa ra kết luận Hà thủ ô đỏ có tiềm năng trong việc điều trị bệnh xơ vữa động mạch [27]

Tác giả W.Wang và cộng sự (năm 2014) đã làm thí nghiệm nghiên cứu tác dụng in vitro của TSG, emodin và physcion (thành phần hóa học đặc trưng trong rễ Hà thủ ô đỏ) trên các enzym tham gia vào quá trình chuyển hóa lipid Nghiên cứu được bố trí với tế bào nội mô gan L02 nuôi cấy trong môi trường nhũ tương béo sinh học rồi chuyển sang môi trường chưa TSG, emodin và physion Kết quả nghiên cứu thu được: cả ba chất trên đều có thể tác động làm giảm hàm lượng HMG-CoA reductase và DGAT1 (hai enzym quan trọng trong quá trình tổng hợp cholesterol và triglycerid) Trong khi hàm lượng của cholesterol 7α-hydroxylase và lipase triglycerid (hai enzym quan trọng trong việc phân giải lipid từ cholesterol và triglycerid) giảm Đáng chú ý là emodin cho tác dụng rõ rệt nhất Kết luận được đưa ra TSG, emodin và physion có tác dụng trong việc điều hòa lipid [28]

11

Các nghiên cứu của các tác giả khác cũng chứng minh trên invivo tác dụng giúp làm giảm hàm lượng trong máu các lipoprotein tỉ trọng thấp và tăng lipoprotein tỉ trọng cao của dịch chiết Hà thủ ô đỏ Đặc biệt là các hoạt chất Emodin, Physion và các chất nhóm Stibens trong dịch chiết thông qua cơ chế chống lại coenzym tổng hợp HMG-CoA và Diacylgycerol acyltransferase

1 [29-31]

 Tác dụng kích thích mọc tóc:

Sun và cộng sự năm 2013 đã phân lập 10 thành phần hóa học có trong dịch chiết rễ Hà thủ ô đỏ, sau đó thử nghiệm tác dụng kích thích mọc lông trên chuột Sau 21 ngày, các hợp chất đều cho kết quả có tác dụng kích thích mọc lông so với nhóm đối chiếu, đặc biệt, Torachrysone-8-O-β-D-glucoside ở nồng độ 10 μM có tác dụng kích thích sự gia tăng mạnh mẽ tế bào nhú da (DPCs), ngăn ngừa rụng tóc do apoptosis gây ra Qua đó, kéo dài giai đoạn phát triền (anagen) và trì hoãn giai đoạn nghỉ (telogen) Còn Emodin có tác dụng ức chế hoạt động của enzym 5-α-reductase, gián tiếp kích thích quá trình mọc tóc [32]

Với tác dụng kích thích mọc tóc của dược liệu Hà thủ ô đỏ, nhiều nghiên cứu cũng đã tiến hành để làm sáng tỏ và cho kết quả tương tự [33-35]

 Một số tác dụng khác của dược liệu Hà thủ ô đỏ đã được nghiên cứu:

 Tác dụng điều hòa miễn dịch [36, 37]

 Tác dụng kháng viêm và mau lành vết thương do làm giảm sự cảm ứng qua trung gian của các yếu tố gây viêm ở tế bào microglia thông qua việc giảm hoạt động liên kết của NF-κB [38-40]

 Tác dụng làm giảm yếu tố gây bệnh tiểu đường type 2 [39, 41, 42]

1.1.7 Quy trình chế biến vị thuốc Hà thủ ô đỏ

Chế biến Hà thủ ô đỏ theo Dược điển Việt Nam V: Rửa sạch củ, ngâm nước vo gạo 1 ngày 1 đêm, sau đó rửa lại Đổ nước đậu đen cho ngập (cứ 1 kg

hà thủ ô cần 100 g đậu đen, 2 L nước, nấu đến khi đậu đen nhừ nát), nấu đến khi gần cạn, cần đảo luôn cho chín đều Khi củ đã mềm, lấy ra, bỏ lõi (nếu có) Nếu còn nước đậu đen thì tẩm phơi cho hết Làm sạch vụn nát Thái hoặc

ô đỏ ở nhiệt độ 60°C – 70°C, tẩm tiếp dịch nấu, làm lặp lại đến hết dịch nấu Phơi hoặc sấy đến khô kiệt Để nguội, đóng gói‖ [43]

1.1.8 Sự thay đổi một số thành phần hóa học sau khi chế biến

Hiện nay, các tài liệu và các bài nghiên cứu đều tập trung vào sự thay đổi thành phần hóa học trong Hà thủ ô đỏ trước và sau chế biến Cụ thể, theo tác giả Đỗ Huy Bích, hàm lượng các hoạt chất trong dược liệu Hà thủ ô đỏ thay đổi rõ rệt sau khi chế: lúc chưa chế, Hà thủ ô đỏ sống chứa 7,68% tanin; 0,25% dẫn chất anthraquinon tự do; 0,8058% dẫn chất anthraquinon toàn phần Sau khi chế, còn 3,82% tanin; 0,1127% dẫn chất anthraquinon tự do và 0,2496% dẫn chất anthraquinon toàn phần [1]

Năm 2005, Liu và cộng sự đã nghiên cứu sự thay đổi hàm lượng của các thành phần emodin; physcion; 2,3,5,4'-stilbene glucoside và tanin trong

Hà thủ ô đỏ với các phương pháp chế biến khác nhau Riêng với phương pháp chế biến ninh với nước đậu đen, tác giả đã đưa ra kết luận, sau 48 giờ ninh, các thành phần hóa học trên đều giảm so với dược liệu tươi Giải thích việc giảm hàm lượng là do sự diễn ra các phản ứng thủy phân dưới tác động của nhiệt độ [44]

Tác giả Liu và các cộng sự năm 2008 tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của phản ứng Maillard trong quá trình hấp dược liệu Hà thủ ô đỏ theo quy trình của Dược điển Trung Quốc 2005 Kết quả của nghiên cứu cho thấy hàm lượng THSG, emodin và physion tăng sau 32 giờ đầu tiên và giảm sau 48 giờ

kê Giai đoạn nấu và tẩm dịch nấu làm cho hàm lượng các chất này tăng dần Sau khi chế biến, trong 1 g dược liệu chế khô tuyệt đối có chứa 22,73 ± 0,21

mg phenol toàn phần tính theo acid gallic, tăng khoảng 3% so với trước khi chế biến (sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p = 0,011) [46]

Như vậy, các nghiên cứu đều đã đưa ra được kết luận có những điểm chung

là hàm lượng các hợp chất anthraquinon, tanin giảm trước và sau chế biến

TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1.2

1.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol toàn phần

Phương pháp đo màu được dùng phổ biến và thông dụng để định lượng polyphenol khi không yêu cầu định lượng hàm lượng một chất cụ thể trong dược liệu Các phương pháp đo màu thường được sử dụng là phương pháp tạo màu với thuốc thử Folin - Ciocalteu (phương pháp Folin - Ciocalteu), phương pháp tạo màu với ferricyanid (phương pháp Prussian Blue), phương pháp tạo màu với Fe3+ với sự có mặt của CMC /EDTA (phương pháp Bishop) [47-49]

Khi sử dụng thuốc thử Folin – Ciocalteu (thành phần gồm phosphomolybdat và phosphotungstat) để phản ứng với các polyphenol, phản ứng oxy hóa khử diễn ra Các nhóm phenol bị khử thành các nhóm quinon tạo

ra phức màu xanh nước biển và có thể xác định bằng phương pháp đo quang tại bước sóng 750 nm [50]

Phụ lục 12.6, Dược điển Việt Nam V sử dụng phương pháp đo quang với thuốc thử Folin – Ciocalteu và đo tại bước sóng 760 nm để định lượng

polyphenol toàn phần [51] Hình 1.5 biểu diễn cơ chế của phản ứng:

da sống chuẩn Chúng được gọi là pseudotanin

Cuối thế kỉ 18, người ta tiến hành các thí nghiệm đầu tiên về tách chiết các chất hoạt động từ dung dịch nước sau khi chiết rễ và gỗ của các loại cây lá nhọn có thuộc da, vì vậy chúng có tên ―các chất chiết thuộc da‖ và không bao lâu sau thay bằng thuật ngữ ―chất thuộc‖ mà tiếng latin gọi là ―tanin‖ [52]

Cho đến nay, có nhiều phương pháp xác định hàm lượng tanin trong dược liệu như Dược điển Việt Nam I và dược điển Liên Xô (cũ) quy định sử dụng phương pháp oxy hóa (phương pháp Lowenthal), Dược điển Việt Nam

V sử dụng 2 phương pháp: phương pháp bột da và phương pháp đo màu với thuốc thử Folin, ngoài ra các nghiên cứu còn sử dụng phương pháp tạo tủa với đồng acetat hay phương pháp đo UV-VIS nhưng sử dụng dung dịch polyvinyl alcohol (PVA) để tách tanin, sau đó cho tác dụng với thuốc thử Folin rồi đem

đo quang ở bước sóng 725 nm [53]

15

Phương pháp đo màu với thuốc thử Folin lợi dụng phản ứng thuộc da của tanin mà các polyphenol khác không có ở điều kiện thí nghiệm để tách tanin ra khỏi dung dịch mẫu thử rồi tiến hành định lượng phần polyphenol không phải tanin

1.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng flavonoid toàn phần

Flavonoid là một nhóm nhỏ của các hợp chất polyphenol, cũng giống như các polyphenol, có thể dùng các phương pháp như HPLC, GC, để định lượng flavonoid toàn phần cũng như từng chất một cách chính xác trong dung dịch [54]

Tuy nhiên, để định lượng flavonoid toàn phần mà không yêu cầu về hàm lượng từng chất cụ thể thì phương pháp đo màu vẫn là phương pháp thông dụng và thuận tiện nhất Nguyên lý của phương pháp dựa vào các phản ứng tạo màu của Flavonoid với các kim loại Al3+

thường được lựa chọn vì nó tạo phức mạnh và ít độc hại Phức màu tạo ra có độ hấp thụ tại bước sóng 510

nm xác định bằng máy đo UV Dựa vào độ hấp thụ tại bước sóng này để định lượng hàm lượng flavonoid toàn phần trong mẫu

Rutin và quercetin thường được sử dụng như là chất chuẩn để định lượng hàm lượng flavonoid toàn phần Hình 1.6 biểu diễn cơ chế của phản ứng giữa AlCl3 với rutin

n 1.6 Ph n ứng của AlCl 3 với rutin

16

1.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng anthraquinon toàn phần

Để định lượng anthraquinon toàn phần trong dược liệu, có nhiều phương pháp có thể sử dụng như: HPLC, phương pháp cân của Daels và Kroeber, phương pháp so màu, phương pháp so màu sử dụng magnesi acetat, phương pháp thể tích của Tschirch và Schmitz…[3] Trong đó, phương pháp cân và phương pháp thể tích đem đến sai số lớn nên ít được sử dụng Phương pháp HPLC mặc dù có độ chính xác cao, tuy nhiên, trong trường hợp mục tiêu nghiên cứu là quan sát sự thay đổi tổng hàm lượng toàn phần của một nhóm hoạt chất thì phương pháp so màu tỏ ra ưu thế hơn do đơn giản và ít tốn kém hơn

Với phương pháp so màu sử dụng magnesi acetat, đầu tiên, các anthraquinon sẽ được cho phản ứng với chất khử mạnh để chuyển từ dạng khử sang dạng oxy hóa Do phản ứng tạo chelat, các dẫn chất oxyanthraquinon có ít nhất một nhóm α-OH sẽ cho màu với thuốc thử magnesi acetat trong cồn Hình 1.7 biểu diễn cơ chế của phản ứng của oxyanthraquinon với magnesi acetat Dược điển Việt Nam IV sử dụng phương pháp so màu với thuốc thử magnesi acetat để kiểm nghiệm hàm lượng anthaquinon trong dược liệu Đại hoàng và Lô hội [55]

n 1.7 Ph n ứng của oxyanthraquinon với magnesi acetat

2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu

Nguyên liệu nghiên cứu là mẫu Hà thủ ô đỏ được chế biến tại xưởng sản xuất của Công ty TNHH MTV xuất nhập khẩu và phát triển công nghệ Nhật Bản

Mẫu nghiên cứu được lấy trong mỗi giai đoạn chế biến Hà thủ ô đỏ bao gồm: mẫu tươi; mẫu sau ngâm nước gạo 12 giờ, 24 giờ; mẫu ninh 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ; mẫu tẩm lần 1; mẫu tẩm lần 2 Các mẫu lấy từ 03 lô, mỗi

lô gồm 03 mẻ sản xuất có khối lượng 200 kg/mẻ

Các mẫu dược liệu lấy khối lượng 500 – 600 g

Sau mỗi thời điểm lấy mẫu, các mẫu đều được bỏ lõi, thái miếng, sấy ở nhiệt độ 600C đến hàm ẩm dưới 8% và xay nhỏ dược liệu, rây qua rây 180

mm để tiến hành nghiên cứu các chỉ tiêu

18

n 2.1 Hình nh Hà thủ ô đỏ sau mỗi iai đoạn chế biến

 Các giai đoạn trong quy trình chế biến đƣợc mã hóa nhƣ sau:

n 2.1 Kí hiệu mã hóa các mẫu theo iai đoạn chế biến Hà thủ ô đỏ

Giai

đoạn Mẫu tươi

12 giờ

24 giờ

12 giờ

24 giờ

36 giờ

48 giờ

19

 Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu:

n 2.2 Nguyên liệu, hóa chất chuẩn dùng trong nghiên cứu

 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu:

n 2.3 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu

1 Acid hydrocloric Trung Quốc Tiêu chuẩn cơ sở

2 Natri cacbonat Trung Quốc Tiêu chuẩn cơ sở

3 Natri nitrit Trung Quốc Tiêu chuẩn cơ sở

4 Natri hydroxyd Trung Quốc Tiêu chuẩn cơ sở

20

 Các dung môi dùng trong nghiên cứu:

n 2.4 Các dung môi dùng trong nghiên cứu

5 ether ethylic Trung Quốc Tinh khiết phân tích

6 Ethyl acetat Trung Quốc Tinh khiết phân tích

2.1.2 Dụng cụ, thiết bị

 Máy đo quang phổ UV-VIS (EMC- LAB, Đức)

 Cân phân tích Mettler Toledo có độ chính xác 0,1 mg

 Cân kĩ thuật Mettler Toledo có độ chính xác 0,01 g

 Tủ sấy Memmert – Đức (UNB 500)

 Bếp khuấy từ có gia nhiệt IKA

 Các thiết bị, dụng cụ tại phòng thí nghiệm khác

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2

2.2.1 Phương pháp kiểm nghiệm một số chỉ tiêu chất lượng của Hà thủ ô

đỏ theo Dược điển Việt Nam V

2.2.1.1 P ươn p áp làm tiêu b n bột dược liệu

Lấy một lượng nhỏ bột dược liệu đã rây qua rây 250 cho vào lam kính

đã nhỏ 1 giọt nước, dùng kim mũi mác dàn đều cho bột thấm nước, đậy lamen trên lam kính, quan sát dưới kính hiển vi

21

2.2.1.2 P ươn p áp định tính bằng ph n ứng hóa học

A, Lấy 2 g bột dược liệu cho vào ống nghiệm, ngâm với 10 mL nước trong 30 phút, gạn lấy 5 mL, thêm 3 giọt đến 4 giọt dung dịch natri hydroxyd (TT) sẽ có màu đỏ sẫm

B, Lấy 0,1 g bột dược liệu, thêm 10 mL dung dịch natri hydroxyd 10 % (TT) đun trong cách thủy trong 5 phút, để nguội, lọc Acid hóa dịch lọc bằng dung dịch acid hydrocloric 10% (TT) đến môi trường acid (thử bằng giấy quỳ), sau đó lắc với 20 mL ether ethylic (TT), lớp ether ethylic có màu vàng cam, gạn lấy 5 mL ether, thêm 5 mL amoniac đậm đặc (TT), lớp amoniac sẽ

có màu đỏ

2.2.1.3 P ươn p áp định tính bằng sắc ký lớp mỏng

 Bản mỏng: Silica gel G

 Dung môi khai triển: Ethyl acetat – methanol – nước (100 : 17 : 13)

 Dung dịch thử: Lấy 0,25 g bột dược liệu, thêm 20 mL ethanol 96% (TT) đun hồi lưu trên cách thủy trong 30 phút, để nguội, lọc, để bay hơi dịch lọc đến cạn Thêm vào cắn 10 mL nước và 1 mL dung dịch acid hydrocloric 10% (TT), đun hồi lưu trong cách thủy 30 phút, để nguội sau đó lắc với ether ethylic (TT) 2 lần, mỗi lần 20 mL Gộp dịch chiết ether, để bay hơi tự nhiên còn khoảng 1 mL dùng làm dung dịch thử

 Dung dịch chất đối chiếu: Hòa tan emodin trong ethanol 96% (TT) để được dung dịch có nồng độ 0,1% Dung dịch dược liệu đối chiếu: Lấy 0,25 g bột Hà thủ ô đỏ (mẫu chuẩn), chiết như mô tả trong mục Dung dịch thử

 Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 pl mỗi dung dịch trên Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra, để khô trong không khí ở nhiệt độ phòng Quan sát các vết dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 366 nm Sau đó cho bản mỏng tiếp xúc với hơi amoniac (TT) Quan sát dưới ánh sáng thường Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết cùng giá trị Rf và màu sắc với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch dược liệu đối chiếu, trong đó phải có một vết cùng màu sắc, cùng giá trị Rf với vết emodin trên sắc ký đồ của dung dịch chất đối chiếu

22

2.2.1.4 P ươn p áp xác địn độ ẩm

Tiến hành theo DĐVN V phụ lục 9.6: ―Xác định mất khối lượng do làm khô‖ Độ ẩm nguyên liệu được xác định bằng phương pháp sấy 1 g nguyên liệu tại 105oC trong 5 giờ tới khối lượng không đổi

2.2.1.5 P ươn p áp xác định chất chiết được trong dược liệu

Cách tiến hành

Cân chính xác khoảng 4,000 g bột dược liệu cho vào trong bình nón

250 mL đến 300 mL Thêm chính xác 100,0 ml ethanol 30%, đậy kín, ngâm lạnh, thỉnh thoảng lắc trong 6 giờ đầu, sau đó để yên 18 giờ Lọc qua phễu lọc khô vào một bình hứng khô thích hợp Lấy chính xác 20 mL dịch lọc cho vào một cốc thủy tinh đã cân bì trước, cô trong cách thủy đến cắn khô sấy cắn ở 105°C trong 3 giờ, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm 30 phút, cân nhanh để xác định khối lượng cắn sau khi sấy, tính phần trăm lượng chất chiết được bằng ethanol theo dược liệu khô

 mt: khối lượng bì cốc thủy tinh

 ms: khối lượng cắn và bì sau sấy

 m: Khối lượng cân (g)

 d: Hàm ẩm của mẫu thử (%)

n 2.5 Quy trình chế biến hà thủ ô đỏ cho một mẻ

Nước sạch sinh hoạt

Dung môi rửa, ninh dược liệu và pha bột gạo

Vừa đủ

1, Chuẩn bị dược liệu, phụ liệu, dung môi, dụng cụ, thiết

bị

– Chuẩn bị HTOĐ: đạt tiêu chuẩn nhà sản xuất

– Phụ liệu: đạt tiêu chuẩn nhà sản xuất

– Dụng cụ, thiết bị phải sạch

– Rửa dược liệu: rửa sạch dược liệu với nước sạch sinh hoạt

và cắt khúc kích thước dài 3 – 5 cm, cắt đôi củ theo chiều dọc với những khúc kích thước lớn

2, Ngâm dược liệu

30 cm và giữ lại nước sau khi ninh

– Để nguội, lấy dược liệu ra, bỏ lõi, làm sạch vụn nát, thái miếng dày 1 – 2 mm

4, Sấy – Tẩm – Tiến hành sấy HTOĐ sau khi thái miếng ở nhiệt độ 60o

C cho tới khi hàm ẩm dưới 8%

– Giảm thể tích dịch ninh bằng cách cô cạn trong 15 phút ở nhiệt độ 105oC

– Ngâm miếng HTOĐ đã sấy khô vào dịch ninh còn lại ở bước trên trong khoảng 20 phút rồi tiếp tục sấy khô, – Lặp lại quá trình Sấy – Tẩm cho tới khi hết nước ninh HTOĐ

– Sấy HTOĐ đến hàm ẩm dưới 5%, đóng gói, dán nhãn, bảo quản

25

n 2.2 Sơ đồ quy trình chế biến hà thủ ô đỏ 2.2.2.2 P ươn p áp xác định sự t ay đổi một số thành phần hóa học của

Hà thủ ô đỏ trong quá trình chế biến

a Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol toàn phần

Hàm lượng polyphenol toàn phần được xác định bằng phương pháp đo quang với thuốc thử Folin – Ciocalteu [5, 46]

Nguyên tắc

Pha dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 50 mg acid gallic chuẩn

vào một bình định mức 100 ml màu nâu, thêm khoảng 80 mL nước để hòa tan

và bổ sung nước vừa dù đến vạch Hút chính xác 5 mL dung dịch trên vào bình định mức 50 mL màu nâu, thêm nước vừa đủ, lắc đều thu được dung dịch chuẩn có nồng độ acid gallic khoảng 50 µg/mL

Xây dựng đường chuẩn: hút chính xác lần lượt 1,0 mL; 2,0 mL; 3,0

mL; 4,0 mL; 5,0 mL dung dịch chuẩn vào các bình định mức 25 mL riêng biệt màu nâu, thêm vào mỗi bình 1 mL thuốc thử Folin – Ciocalteu (TT), sau đó thêm lần lượt 11 mL, 10 mL, 9 mL, 8 mL, 7 mL nước vào các bình tương ứng, thêm dung dịch natri carbonat 29% đến vạch, lắc đều Đo độ hấp thụ của các dung dịch thu được ở 760 nm, chuẩn bị song song một mẫu trắng là nước cất Dựng đường biểu diễn độ hấp thụ của dung dịch theo nồng độ acid gallic Cgal (µg/mL)

Chuẩn bị dung dịch thử: cân chính xác khoảng 5 g bột dược liệu cho

vào bình định mức 250 mL màu nâu, thêm 150 mL nước, để qua đêm, siêu

âm trong 10 phút Để nguội về nhiệt độ phòng rồi thêm nước vừa đủ 250 mL, lắc đều, để lắng Lọc, bỏ 50 mL dịch lọc đầu, hút chính xác 20 mL dịch lọc vào bình định mức 100 mL màu nâu, thêm nước đến vạch, lắc đều được dung dịch A

Xác định hàm lượng polyphenol toàn phần: hút chính xác 1 mL dung

dịch A vào bình định mức 25 mL màu nâu Thêm 1 mL thuốc thử Folin – Ciocalteu (TT), trộn đều, thêm 10 mL nước, thêm dung dịch natri carbonat 29% đến vạch, lắc đều Đo độ hấp thụ của dung dịch ở 760 nm, dựa vào đường chuẩn đã xây dựng để xác định hàm lượng polyphenol toàn phần tính theo acid gallic C (µg GAE/mL) Mẫu thử được tiến hành lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình