PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG NUCLEIC ACID

KỸ THUẬT DI TRUYỀN PHÂN TÍCChuẩn bịmột công đoạn cho phương pháp khác: thu hồi DNA, phân tách DNA Kiểu điện di: điện di agarose, điện di polyacrylamide, điện di trên điện trường xung, điện di mao quảnH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG NUCLEIC ACID ThS Nguyễn Thị Mỹ Nương Email ntmnuonghcmus edu vn Nội dung1 Điện di Mục tiêu + Định tính sự hiện diện, cấu hình phân tử, kích thước.

PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG NUCLEIC ACID

ThS Nguyễn Thị Mỹ Nương Email: ntmnuong@hcmus.edu.vn

Nội dung

1 Điện di:

- Mục tiêu:

+ Định tính: sự hiện diện, cấu hình phân tử, kích thước

+ Định lượng: hàm lượng tương đối so với thang hàm lượng

+ Chuẩn bị/một công đoạn cho phương pháp khác: thu hồi DNA, phân tách DNA

- Kiểu điện di: điện di agarose, điện di polyacrylamide, điện di trên điện trường xung, điện di mao quản

2 Đo quang phổ:

- Mục tiêu:

+ Định lượng tuyệt đối: nồng độ nucleic acid + Định tính: độ tinh sạch của mẫu, tính chất nucleic acid

- Kiểu đo quang phổ: UV, huỳnh quang

Điện di

ĐIỆN DI DNA TRÊN GEL AGAROSE

- Điện di theo phương nằm ngang

- Giá thể là gel agarose

- Phát hiện với màu nhuộm ethidium bromide, … phát huỳnh quang dưới đèn tử ngoại

- Khả năng phân giải trung bình, phụ thuộc vào nhiều yếu tố, đặc biệt là nồng độ agarose (0,5 – 5%)

ĐIỆN DI TRONG TRƯỜNG XUNG (PULSED-FIELD

ELECTROPHORESIS)

- Tương tự điện di

trên gel agarose

- Điện trường theo

nhiều phương

- Dùng phân tách

DNA kích thước lớn: 50.000 – 250.000 bp

ĐIỆN DI TRÊN GEL POLYACRYLAMIDE (PAGE)

- Điện di theo phương thẳng đứng

- Giá thể là gel polyacrylamide

- Phát hiện với màu nhuộm Coomassie blue, nhuộm bạc, phát hiện trên phim tín hiệu đồng vị phóng xạ

- Khả năng phân giải cao, phân biệt được những trình tự chỉ cách nhau 1 nucleotide

Điện di protein SDS-PAGE

Phân tách dựa vào trọng lượng phân tử

CÁC BƯỚC CHÍNH

1 Trước khi bắt đầu, cần xác định:

- Mục tiêu => thiết kế thí nghiệm,

chọn phương pháp

- Kích thước protein mục tiêu =>

nồng độ gel, thang điện di

- Số lượng mẫu cần phân tích =>

khuôn, số giếng

- Đặc tính của mẫu: điều kiện hòa

tan, cấu trúc, nồng độ => xử lý mẫu phù hợp

2 Chuẩn bị gel

3 Điện di

4 Nhuộm: comassive/bạc

5 Chụp ảnh và phân tích

Chú thích:

1: Thang

2: E.coli không cảm ứng biểu hiện Sap-2

3: E.coli biểu hiện Sap-2 – pha tổng

4: E.coli biểu hiện Sap-2 – pha tan

5: Sap-2 sau tinh sạch – phân đoạn 2

6: E.coli biểu hiện Sap-2 – pha tủa

7: Dịch Sap-2 qua cột (những thành phần không bám cột do không có gắn đuôi His) 8: Sap -2 sau tính sạch – phân đoạn 1

1 2 3 4 5 6 7 8

10kDa

15kDa

11 kDa

Kết quả ví dụ

Điện di 2 chiều protein trên gel

polyacrylamide (2D PAGE)

Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis )

- Điện di trong các ống mao quản

- Mẫu nucleic acid được đánh dấu

huỳnh quang => phát hiện bằng hệ thống phát và thu tín hiệu huỳnh quang

- Độ nhạy cao, nhanh, ít tốn công,

có thể chạy nhiều mẫu cùng lúc, có thể tự động hóa

Kết quả ví dụ

Đo quang phổ

Đo độ hấp thu ở bước

Qubit fluorometer NanoDrop

Agilent 2100 BioAnalyzer

KỸ THUẬT RFLP (RESTRICTION FRAGMENT

LENGTH POLYMORPHISM – ĐA HÌNH KÍCH

THƯỚC CÁC TRÌNH TỰ CẮT GIỚI HẠN

VNTR (VARIABLE NUMBER OF

TANDEM REPEATS)

Phân tích VNTR để nhận biết tính đa hình di truyền ở cá

thể Sử dụng mẫu dò kết hợp với RE để phân tích VNTR

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT

ĐIỆN DI TRONG NGHIÊN CỨU PHẢ HỆ

Ví dụ về việc sử dụng PCR và điện

di trong xác định phả hệ

Đây là phả hệ của Sa hoàng, vợ, 3

con, bác sĩ gia đình và các người

hầu

KỸ THUẬT “ELECTROPHORETIC MOBILITY SHIFT

ASSAY : PHÁT HIỆN NHÂN TỐ TRANS

Các phân đọan protein được ủ với một đoạn DNA đã được đánh dấu phóng xạ và

có mang một trình tự CIS Các tổ hợp trên sau đó sẽ được phân tích bằng điện di

không biến tính (đối với protein) Các phân đọan DNA không gắn protein sẽ di

chuyển xa hơn các phân đọan trong đó trình tự CIS liên kết với protein (7, 8 trong

hình) Như vậy các phân đọan protein tương ứng với các tổ hợp 7 và 8 sẽ được xác

định.

CÂU HỎI - PHẦN 2

1 Các điểm khác biệt trong phương pháp tiến hành điện di trên gel

agarose và gel polyacrylamide

2 Các ứng dụng của điện di trên gel agarose, điện di trên gel

polyacrylamide

3 Phương pháp đo mật độ quang (OD) :

- Nguyên lý và cách xác định hàm lượng nucleic acid

- Nguyên lý và cách xác định độ sạch của nucleic acid

4 Nguyên lý và cách tiến hành phương pháp RFLP (Restriction Fragment

Length Polymorphism)

5 Nguyên lý và cách tiến hành phương pháp VNTR (Variable Number of

Tandem Repeats)

6 Nguyên lý và cách tiến hành phương pháp Electrophoretic Mobility Shift

Assay