BÁO cáo KHOÁ LUẬN tốt NGHIỆP đề tài NGHIÊN cứu THIẾT lập DÒNG cá NGỰA vằn KNOCKOUT GENE NRF2 PHỤC vụ NGHIÊN cứu OXY hóa

Trước đây, phòng thí nghiệm của giáo sư Makoto Kobayashi đã phân lập các gen tươngđồng của cá ngựa vằn của Nrf2 và gen điều hòa Keap1 của nó nrf2, keap1a và keap1b và chứng minh rằng sự

Tính cấp thiết của đề tài

Oxidative stress damages diverse cellular components, including DNA, proteins, and lipids, and is associated with a range of human diseases such as cancer, neurodegenerative disorders, and inflammatory conditions (Endo et al., 2020) Antioxidant defenses rely on enzymes and small molecules that directly scavenge reactive oxygen species, including superoxide dismutase (SOD), catalase, and glutathione peroxidase (GPx), as well as peroxiredoxins (Prdx) and the thiol-containing pools glutathione (GSH) and thioredoxin (Txn) Together, these systems mitigate oxidative stress by neutralizing reactive oxygen species and repairing oxidative damage.

Những khám phá gần đây về hệ thống chống oxy hóa tế bào đã làm nảy sinh khái niệm chất chống oxy hóa gián tiếp, hoạt động bằng cách tăng cường khả năng chống oxy hóa tế bào thông qua tăng biểu hiện gen do yếu tố phiên mã Nrf2 điều khiển Nrf2 là một yếu tố phiên mã có khả năng tạo phức hợp dị hợp với các protein Maf nhỏ và liên kết với vùng đáp ứng chống oxy hóa ARE ở vùng điều hòa của các gen mục tiêu Một loạt gen bảo vệ tế bào mã hóa các enzym giải độc giai đoạn 2 và các protein chống oxy hóa, như GST, NAD(P)H:quinone oxidoreductase và glutamate-cysteine ligase, được Nrf2 cảm ứng Trong điều kiện cơ bản, Nrf2 liên tục bị phân hủy thông qua con đường ubiquitin-proteasome phụ thuộc Keap1 Khi tiếp xúc với electrophiles hoặc căng thẳng oxy hóa, Nrf2 thoát khỏi sự phân hủy, tích tụ trong nhân và kích hoạt phiên mã các gen mục tiêu của nó.

Trước đây, phòng thí nghiệm của giáo sư Makoto Kobayashi đã phân lập các gen đồng dạng của Nrf2 và các gen điều hòa Keap1 ở cá ngựa vằn (nrf2, keap1a và keap1b) và chứng minh rằng sự cảm ứng của hệ thống Keap1–Nrf2 đối với các gen bảo vệ tế bào được bảo tồn ở các động vật có xương sống (Tian et al., 2018) Bằng cách sử dụng hệ thống cá ngựa vằn này, chúng tôi đã có những hiểu biết mới về chức năng của Nrf2, ví dụ như phân lập một số dòng cá ngựa vằn đột biến biểu hiện phản ứng suy giảm với các hợp chất kích hoạt Nrf2, và cho thấy sự biểu hiện cụ thể ở mô của Nrf2 và các gen mục tiêu của nó (Kobayashi et al., 2002, 2009; Nakajima et al., 2011).

Vai trò sinh lý của Nrf2 ở cá ngựa vằn vẫn chưa rõ ràng và cần được làm sáng tỏ để hiểu các chức năng của Nrf2 từ quan điểm tiến hóa Trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung phân tích các cơ chế điều hòa và các đường tín hiệu liên quan đến Nrf2 ở zebrafish, nhằm làm rõ cách hệ thống này thích nghi và bảo vệ tế bào trong bối cảnh tiến hóa Kết quả dự kiến sẽ cung cấp cái nhìn sâu sắc hơn về vai trò sinh lý của Nrf2 và mở đường cho các hướng nghiên cứu tương lai về chức năng sinh học và tiềm năng ứng dụng của Nrf2 ở cá ngựa vằn.

Trong nghiên cứu thiết lập dòng cá ngựa vằn knockout gene nrf2 phục vụ nghiên cứu oxy hóa, nhóm nghiên cứu đã loại bỏ gen Nrf2 để xác định đặc điểm của cá ngựa vằn bằng phương pháp triển khai trong nghiên cứu này Dòng cá ngựa vằn thiếu Nrf2 cung cấp một mô hình thực nghiệm thuận lợi để khảo sát vai trò của Nrf2 trong đáp ứng oxy hóa và cơ chế bảo vệ tế bào trước stress oxy hóa.

Công trình sử dụng công nghệ CRISPR-Cas9 (Ota et al., 2014) cho thấy cá ngựa vằn bị loại bỏ gen Nrf2 có thể sống được và có khả năng sinh sản, cho thấy đây là một mô hình sinh học đáng tin cậy để nghiên cứu Đây sẽ là mô hình lý tưởng để tiến hành phân tích các đặc điểm oxy hóa và hệ thống chống oxy hóa trong các nghiên cứu tương lai.

TIEU LUAN MOI download : skknchat123@gmail.com

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP DÒNG CÁ NGỰA VẰN KNOCKOUT GENE NRF2 PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU OXY HÓA

Mục tiêu của nghiên cứu này là làm rõ vai trò sinh lý của Nrf2 khi bị mất chức năng Dựa trên các kết quả từ nhiều nghiên cứu Nrf2 dựa trên tế bào nuôi cấy liên quan đến cảm biến căng thẳng, chúng tôi thực hiện hai bước chính: trước hết tạo ra các dòng cá ngựa vằn bị knockout gen Nrf2 và kiểm tra đặc tính di truyền từ F0 đến F2; sau đó làm sáng tỏ chức năng sinh lý của cá ngựa vằn khi Nrf2 bị loại bỏ để hiểu rõ vai trò của Nrf2 trong sinh lý và đáp ứng sinh học của loài.

Trong khuôn khổ đề tài dành cho sinh viên và với thời gian ngắn, mục tiêu nghiên cứu đầu tiên là xác định tác động của mất chức năng gen Nrf2 ở dòng cá ngựa vằn và theo dõi di truyền qua thế hệ F2, nhằm làm rõ vai trò của Nrf2 trong sinh học của cá ngựa vằn và cung cấp dữ liệu nền cho các phân tích sau.

Nhiệm vụ nghiên cứu

- Loại bỏ được gen Nrf2 để xác định đặc điểm cá ngựa vằn bằng phương pháp

Phương pháp nghiên cứu

- Loại bỏ gen Nrf2 ở cá ngựa vằn bằng phương pháp CRISPR-Cas9 và vi tiêm

CRISPR-Cas9 vào phôi cá ngựa vằn giai đoạn một tế bào.

Các kết quả đạt được của đề tài

- Loại bỏ được gen Nrf2 ở cá ngựa vằn mà cá thể vẫn có khả năng sống tiếp và sinh sản

Kết cấu của khoá luận tốt nghiệp

- Chương 2 - Cơ sở khoa học của đề tài nghiên cứu

- Chương 3 - Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

- Chương 4 – Kết quả và thảo luận

TỔNG QUAN

Giới thiệu về kỹ thuật knockout gene

Knockout gene là một kỹ thuật di truyền nhằm vô hiệu hóa một gen cụ thể trong sinh vật Quá trình knockout thường kết hợp nhiều phương pháp, bắt đầu từ thí nghiệm ở ống nghiệm với các công cụ di truyền như plasmid hoặc các hình thái DNA nhân tạo, sau đó tiến hành nuôi cấy tế bào và chuyển gen vào các tế bào để tạo ra các mô hình sinh vật mang gen bị thay đổi Mục tiêu phổ biến là tạo ra động vật chuyển gen có gen bị vô hiệu hóa hoặc chỉnh sửa, và thậm chí có thể thay thế một đoạn gen bằng một đoạn DNA khác tại vị trí đã bị xóa thay vì xóa bỏ hoàn toàn đoạn gen đó.

Tổng quan về hệ thống CRISPER-Cas9

Một khối lượng dữ liệu chưa từng có về bộ gen của nhiều sinh vật khác nhau, bao gồm thực vật và động vật, hiện có sẵn cho các nhà nghiên cứu Tuy vậy, chức năng sinh học và vai trò phát triển của từng gen vẫn không phải lúc nào cũng được hiểu rõ, khiến việc giải mã các cơ chế điều hòa và tác động của chúng trở nên thách thức Sự ra đời của các nuclease được chỉnh sửa tại các vị trí đặc thù, như zinc-finger nucleases (ZFNs) và transcription activator-like effector nucleases (TALENs), đã mở ra cơ hội điều tra các kiểu hình liên quan đến các gen bị mất chức năng Cả ZFNs và TALENs đều tích hợp một miền DNA-binding (tên miền zinc‑finger hoặc TALE) và một miền xúc tác FokI nuclease.

Các DNA sợi đơn bị phá vỡ (Double strand breaks (DSBs)) được gây ra bởi

ZFNs hoặc TALENs tại locus mục tiêu có thể được sửa chữa bằng tái tổ hợp giữa các trình tự tương đồng hoặc bằng cơ chế chỉnh sửa không tương đồng Quá trình sửa chữa này thường gây ra sự chèn và/hoặc mất (indel) tại vị trí của các DSB, dẫn tới đột biến lệch khung đọc và làm gián đoạn chức năng của gen Nhìn chung, cả hai công cụ ZFNs và TALENs đều là những công cụ chỉnh sửa bộ gen mạnh mẽ Tuy nhiên, quy trình thiết kế và thực hiện của hai phương pháp này khá phức tạp và còn hạn chế trong thực tế Do đó, mức độ ứng dụng của chúng chưa cao, đặc biệt đối với các ứng dụng lâm sàng (Kotani et al 2015).

Hình 1.1 Spacer, protospacer và PAM Protospacer là DNA đích;

PAM tiếp giáp với DNA sợi đôi được nhắm mục tiêu Phần đệm (Spacer) là một phần của RNA dẫn đường gắn kết với protospacer.

Nguồn: https://www.idtdna.com/

Gần đây, hệ thống CRISPR-Cas9 đã nổi lên như một công nghệ đột phá trong chỉnh sửa bộ gen CRISPR là từ viết tắt của Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, khởi nguồn từ những đoạn trình tự lặp lại ở vi khuẩn mà nguồn gốc và chức năng của chúng vẫn chưa được làm rõ Ban đầu, CRISPR được mô tả là các đoạn DNA ở vi khuẩn chứa các trình tự base ngắn lặp lại theo hai chiều, bên cạnh đó là các đoạn đệm có nguồn gốc từ DNA ngoại lai như thể thực khuẩn hoặc plasmid Cạnh các vùng lặp và đệm là các gen cas được tổ chức thành cụm, nằm gần các trình tự CRISPR Hệ thống CRISPR/Cas là một hệ miễn dịch thích nghi ở vi khuẩn và archaea, giúp bảo vệ genomes khỏi virus xâm nhập và plasmid Nhiều nhóm nghiên cứu đã chứng minh rằng loại II của hệ CRISPR/Cas9 có đặc tính đặc biệt hữu ích cho các chỉnh sửa gen.

Nghiên cứu này tập trung thiết lập dòng cá ngựa vằn knockout NRF2 nhằm phục vụ nghiên cứu oxy hóa và sự bảo vệ của tế bào NRF2 giữ vai trò then chốt trong điều hòa phản ứng chống oxy hóa, vì vậy việc làm mất chức năng NRF2 cho phép quan sát các biến đổi sinh học liên quan đến stress oxi hóa và các đường tín hiệu liên quan Quá trình thiết lập dòng được thực hiện bằng công nghệ chỉnh sửa gen hiện đại, nhắm mục tiêu NRF2 một cách cụ thể và cho phép đánh giá tác động của đột biến trên các tế bào động vật có vú Các bằng chứng từ Cong et al (2013) và Mali et al (2013) cho thấy CRISPR-Cas9 là công cụ mạnh để thiết lập các dòng knockout và khảo sát chức năng gen Dòng cá ngựa vằn này hứa hẹn trở thành mô hình hữu ích để hiểu rõ cơ chế oxy hóa và vai trò của NRF2, đồng thời hỗ trợ nghiên cứu tiềm năng ứng dụng trong y học và sinh học tế bào.

2013) và các sinh vật mô hình khác nhau bao gồm cá ngựa vằn (Hwang et al 2013), chuột (Li et al 2013b), và chuột nhắt (Li et al 2013a, b).

Quá trình chỉnh sửa gen bằng CRISPR-Cas9 bắt đầu khi crRNA và tracrRNA liên kết với nhau để hình thành RNA dẫn đường (gRNA) gRNA sau đó liên kết với enzyme Cas, tạo thành ribonucleoprotein (RNP) Nếu quá trình hình thành RNP được thực hiện trong phòng thí nghiệm, RNP sẽ được chuyển vào các tế bào Trong bước tiếp theo, gRNA dẫn hướng RNP tới mục tiêu bên trong tế bào và mục tiêu được cắt Nguồn: https://www.idtdna.com/

Trong hệ thống CRISPR, các trình tự gen được nhắm mục tiêu nằm liền kề với một trình tự tiền vùng đệm PAM (protospacer adjacent motif), được nhận diện bởi RNA hướng dẫn (gRNA) gRNA chứa các trình tự bổ sung cho vị trí đích và định hướng enzyme cắt DNA (thường Cas9) thực hiện sự cắt tại vị trí đó.

Nghiên cứu thiết lập dòng cá ngựa vằn knockout gene NRF2 phục vụ nghiên cứu oxy hóa dựa trên một phức hợp gRNA và nuclease Cas9 Các đột biến indel phát sinh sau đó do nuclease Cas9 gây ra góp phần vào sự gián đoạn gen Trong thực tế, sự gián đoạn gen duy nhất do CRISPR/Cas9 gây ra ở cá ngựa vằn đã được báo cáo bởi một số nhóm (Jao et al 2013; Hwang et al 2013; Chang et al 2013; Hruscha et al 2013; Sung et al 2014; Bannikov và Lavrov 2017).

Hình 1.3 trình bày các kết quả có thể phát sinh sau khi phân tách DNA của bộ gen Các đường sửa chữa DNA trong tế bào, ví dụ như NHEJ (nối kết cuối không tương đồng), có thể gây ra xóa, thay đổi trình tự và chèn nhỏ, từ đó ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của gen Nguồn: https://www.idtdna.com/

Trình tự CRISPR lần đầu tiên được tìm ra vào năm 1987 do các nghiên cứu của

Yoshizumi Ishino và các đồng sự tại Đại học Osaka, Nhật Bản đã đặt nền móng cho hiểu biết về chức năng của hệ CRISPR–Cas và vai trò của nó trong hệ miễn dịch của vi khuẩn, từ đó thúc đẩy các nhà khoa học tập trung nghiên cứu nhiều năm sau Vào năm 2012, hai nhóm nghiên cứu độc lập do Tiến sĩ Emmanuelle Charpentier tại Đại học Umea và Tiến sĩ Jennifer Doudna tại Đại học California, Berkeley đã đồng thời khám phá cơ chế hoạt động của enzyme Cas và hệ CRISPR, đánh dấu bước ngoặt quan trọng cho sự phát triển của công nghệ chỉnh sửa gen dựa trên CRISPR‑Cas.

Tiến sĩ Craig Mello, người được trao giải thưởng Nobel về Sinh lý học và Y học năm

2006 về công trình nghiên cứu RNAi (RNA interference), đã có những lời bình luận về Chương 1 – Tổng quan

Nghiên cứu thiết lập dòng cá ngựa vằn knockout gene NRF2 phục vụ nghiên cứu oxy hóa cho thấy tương lai đầy hứa hẹn của phương pháp này CRISPR/Cas mang ý nghĩa vô cùng to lớn và khả năng mạnh mẽ đến mức chúng ta có thể chỉnh sửa bộ gen theo bất cứ điều gì mình muốn Theo Mello, công nghệ này có thể được ứng dụng rộng rãi từ nông nghiệp đến liệu pháp gene để điều trị các bệnh lý ở người Đây là thành công của nghiên cứu khoa học cơ bản và là một đột phá có tác động sâu rộng đối với di truyền học phân tử.

Hình 1.4 cho thấy sửa chữa theo hướng tương đồng (HDR) có thể tích hợp các trình tự mới vào DNA của bộ gen Các trình tự nhỏ có thể được thay đổi để phục vụ các mục đích chỉnh sửa hoặc sửa đổi gen, trong khi các trình tự lớn hơn, như toàn bộ gen, có thể được bổ sung vào một cách ngẫu nhiên.

gRNA (RNA hướng dẫn) là một phân tử RNA tổng hợp ngắn được sử dụng trong chỉnh sửa bộ gen dựa trên hệ thống CRISPR, một trong những công cụ chỉnh sửa gen có độ đặc hiệu cao Phân tử gRNA bao gồm một chuỗi nucleotide ngắn, khoảng 20 bp, liên kết với trình tự DNA mục tiêu của bộ gen Trình tự này được gọi là trình tự miếng đệm (spacer) Nhờ sự ghép nối giữa gRNA và trình tự mục tiêu, hệ CRISPR cho phép nhận diện và chỉnh sửa các vị trí cụ thể trên bộ gen với hiệu quả cao.

Trong nghiên cứu chỉnh sửa gen dựa trên CRISPR, hai thành phần cốt lõi là gRNA và endonuclease liên kết với hệ CRISPR (thường là Cas), cho phép nhận diện và cắt tại vị trí mục tiêu trên DNA nhằm thiết lập knockout của một gen như NRF2 và phục vụ các nghiên cứu liên quan oxy hóa Mục tiêu gen của hệ thống CRISPR thay đổi tùy thuộc trình tự của gRNA sgRNA được xem là dạng hướng dẫn duy nhất của gRNA, còn gRNA là RNA được hướng dẫn để chỉ định một mục tiêu cho endonuclease trong chỉnh sửa dựa trên CRISPR; do đó hai thuật ngữ sgRNA và gRNA có thể hoán đổi để mô tả cùng một phân tử Không có sự khác biệt đáng kể giữa sgRNA và gRNA; cả hai đều là các phân tử tổng hợp và tương tự với crRNA về chức năng trong hệ CRISPR.

Có ba loại gRNA dựa trên phương pháp tổng hợp Chúng là crRNA tổng hợp, sgRNA lentivirus và sgRNA tổng hợp.

Hình 1.5 Các dạng gRNA khác nhau được sử dụng để loại bỏ gen.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn dạng sgRNA bao gồm crRNA và tracrRNA, vì sgRNA có tính bền và không cần ủ nhiệt trước khi chuyển vào phôi cá ngựa vằn Nguồn: https://www.idtdna.com/

Hình 1.6 Vị trí PAM và gRNA Cas9 Vị trí PAM nằm trên chuỗi

DNA không nằm trong mục tiêu trình tự loại bỏ gen RNA dẫn đường liên kết với sợi DNA mục tiêu để xác định vị trí cần chỉnh sửa, trong khi hình minh họa cho thấy RNA dẫn đường ở dạng hai phần gồm crRNA và tracrRNA, là cấu trúc điển hình của hệ CRISPR-Cas và đóng vai trò nhận diện cũng như hướng dẫn quá trình chỉnh sửa gen.

Định nghĩa về hệ thống keap1-nrf2

1.3.1 Lịch sử tiền khám phá Nrf2

Nhận thức về khái niệm môi trường có ảnh hưởng đến sức khỏe của chúng ta, đặc biệt là nguy cơ ung thư, như Percival Pott lần đầu mô tả vào năm 1775 trong ấn phẩm Quan sát Chirurgical khi nhận thấy tỷ lệ ung thư bìu ở các cuộc quét ống khói ở London cao bất thường và cho rằng muội than là một yếu tố môi trường gây ung thư Năm 1915, Yamagiwa và Ichikawa chứng minh mối liên hệ nhân quả giữa hóa chất môi trường và ung thư, cho thấy ung thư mãn tính trên tai thỏ do tiếp xúc với than đá Ngay nay, việc tránh và loại bỏ tiếp xúc với các yếu tố môi trường bất lợi được xem là cách quan trọng để ngăn ngừa ung thư hóa học ở người.

Trong thập niên 1960 và 1970, người ta chứng minh rằng các chất gây ung thư từ than đá và từ các môi trường làm việc khác thường phải trải qua chuyển hóa sinh học để hình thành các chất chuyển hóa mang tính ái lực điện tử (electrophilic), nhằm tạo liên kết cộng hóa trị với protein, RNA và DNA (Debaun et al 1970) Sự kích hoạt trao đổi chất này thường được xúc tác bởi hệ thống sắc tố tế bào (cytochrom P-450) của cơ thể.

Nghiên cứu thiết lập dòng cá ngựa vằn knockout NRF2 nhằm phục vụ nghiên cứu quá trình oxy hóa microsome và các enzyme oxy hóa pha I (Miller 1978) Trong bối cảnh ngày càng có nhiều quan tâm tới chất gây ung thư và các thuốc trị ung thư nhắm vào các bước kích hoạt trao đổi chất cũng như tăng cường giải độc của chất gây ung thư, mối quan tâm ban đầu tập trung vào các chất chống oxy hóa từ thực phẩm và các sản phẩm tự nhiên như flavonoid và isothiocyanate được cho là an toàn cho con người Tiền xử lý động vật gặm nhấm bằng chất chống oxy hóa từ thực phẩm, ví dụ 2-(3-tert-butyl-4-hydroxyanisole) (BHA), cho thấy khả năng ức chế hiệu quả quá trình gây ung thư (Yamamoto et al 2018).

Benson và các đồng nghiệp (Benson et al 1980) đã báo cáo rằng BHA làm tăng các hoạt động enzyme của glutathione S-transferase, epoxide hydratase, NAD(P)H: quinone oxyoreductase và các enzyme giải độc khác trong nhiều mô của chuột Nhiều loại hợp chất chống oxy hóa khác như phenolic, thuốc nhuộm azo, chất thơm đa vòng, flavonoid, coumarin, cinnamate, indole, isothiocyanate, 1,2-dithiole-3-thiones và thiocarbamate đã được xác định là các chất có khả năng gây kích hoạt sự hoạt động của những enzyme giải độc này Một vài trong số các chất kích hoạt này có chứa một tính năng hóa học đặc biệt là các chất nhận phản ứng Michael, được đặc trưng bởi các liên kết olefinic để tạo ra ái lực điện tử (tích điện dương) bằng cách kết hợp với các chất hút electron Hiệu lực của các chất gây kích hoạt này chia sẻ tính chất chung của việc sửa đổi các nhóm sulfhydryl bằng cách oxy hóa, khử hoặc kiềm hóa (Talalay et al 1988) Sự phơi nhiễm của các tế bào với liều thấp với các phản ứng electrophile sulfhydryl làm gia tăng hoạt động các enzyme này (gọi là enzyme pha II), do đó bảo vệ các tế bào chống lại độc tính của electrophile Sự thích ứng này của tế bào được gọi là phản ứng chống electrophile

(Prestera et al 1993) Xuất phát từ những quan sát này, giả thuyết đã đưa ra rằng các tế bào có khả năng cảm biến (sensor) với các phân tử nhờ vào chức năng sulfhydryl độc đáo để nhận ra và phản ứng với các chất gây kích hoạt enzyme bảo vệ.

1.3.2 Khám phá Nrf2: một phân tử chính trong phản ứng chống electrophile

Hoạt động enzyme giải độc bởi các chất electrophile hiện nay chủ yếu là do tăng khả năng phiên mã của các gen pha II tương ứng của chúng Các yếu tố điều hòa quan trọng cho sự biểu hiện cảm ứng của gen mã hóa enzyme pha II được xác định là yếu tố đáp ứng chống oxy hóa (ARE) hoặc yếu tố đáp ứng electrophile (EpRE) Tuy nhiên, các yếu tố điều hòa mã hóa của các yếu tố phiên mã cho ARE/EpRE vẫn chưa được biết cho đến khi Itoh et al tạo được mô hình chuột loại bỏ hoàn toàn gen NRF2 và phân tích biểu hiện của enzyme pha II (Itoh et al 1997) NRF2 ban đầu được phân lập.

Nghiên cứu thiết lập một dòng động vật knockout NRF2 cho thấy NRF2 đóng vai trò như một yếu tố phiên mã có sự tương đồng với NF-E2 p45 và tham gia vào quá trình oxy hóa, mặc dù chức năng cụ thể của nó vẫn chưa được làm rõ Kết quả chỉ ra rằng kích hoạt các enzyme pha II của BHA bị mất hoàn toàn ở những động vật thiếu NRF2 Việc nhận diện NRF2 như một phân tử điều hòa chính của phản ứng với electrophile mở ra một hướng đi mới cho nghiên cứu độc học, nơi các cơ chế giải độc được giải mã và hiểu sâu ở cấp độ phân tử.

1.3.3 Lịch sử khám phá KEAP1: Bộ cảm biến nhận biết các chất elecreophile Thật may mắn, cảm biến của các chất hóa học từ môi trường và điều hòa hoạt động của NRF2 đã sớm được phát hiện Năm 1999, Itoh et al phân lập (bằng cách sàng lọc hai loại nấm men) một loại protein mới giàu group thiol (R-SH) và là phân tử ức chế của NRF2, được đặt tên là KEAP1 (Itoh et al 1999) KEAP1 thúc đẩy sự suy giảm NRF2 trong điều kiện không bị căng thẳng Ngược lại trong điều kiện có các chất kích thích oxy hóa khử, chúng có khả năng trực tiếp làm thay đổi các nhóm thiol của KEAP1 và dẫn đến bất hoạt chức năng của KEAP1, kết quả NRF2 không bị ức chế bởi KEAP1, ổn định hoạt động và di chuyển vào nhân tế bào nơi mà NRF2 có khả năng phiên mã tạo ra các gen bảo vệ tế bào chất Do đó KEAP1 được coi là bộ cảm biến sinh học (biological sensor) cho các chất electrophile và ROS.

1.3.4 Tổng quan về chức năng của hệ thống phân tử KEAP1-NRF2

Hệ KEAP1-NRF2 được công nhận là cơ chế phòng thủ chủ đạo của cơ thể trước các tác động có hại từ môi trường Hệ thống này gồm hai thành phần chính: KEAP1 như một cảm biến để nhận diện các chất ái lực điện tử và NRF2 như một tác nhân kích hoạt sự phối hợp của các gen bảo vệ tế bào Trong tế bào chất, KEAP1 hình thành phức hợp ubiquitin E3 ligase với CULLIN3 (CUL3) và NRF2, đánh dấu NRF2 cho sự thoái hóa nhanh chóng qua hệ thống proteasome.

Trong điều kiện bình thường, NRF2 được tổng hợp nhưng liên tục bị phân hủy bởi phức hợp KEAP1-CUL3 có ubiquitin ligase E3 hoạt động Tuy nhiên, khi tiếp xúc với các chất có ái lực điện tử hoặc các gốc tự do, cysteine dư lượng trên KEAP1 bị sửa đổi trực tiếp, làm giảm hoạt động ubiquitin ligase của phức hợp KEAP1-CUL3 và dẫn tới sự ổn định của NRF2 NRF2 được tổng hợp sau đó có thể chuyển vào nhân, ghép đôi với một trong các protein sợi cơ nhỏ (sMAF), liên kết với ARE/EpRE và kích hoạt mạnh mẽ hoạt động của các enzyme pha II, từ đó đóng vai trò là yếu tố phiên mã chính.

Hình 1.8 Cơ chế phân tử của hệ thống KEAP1-NRF2 kích hoạt gen mục tiêu

NRF2 trong điều kiện căng thẳng Nguồn: https://www.idtdna.com/

Các nghiên cứu trên toàn cầu về hệ KEAP1-NRF2 đã tích lũy bằng chứng cho thấy hoạt động của NRF2 đóng vai trò then chốt trong duy trì sức khỏe và phòng ngừa nhiều rối loạn Những cơ chế điều hòa phức tạp của KEAP1-NRF2 được làm rõ, cho thấy sự cân bằng giữa kích hoạt và ức chế NRF2 ảnh hưởng đến quá trình sinh học của tế bào và sự thích nghi của cơ thể với stress sinh học Sự điều hòa của hệ KEAP1-NRF2 được xem là nền tảng sinh bệnh học của nhiều bệnh khác nhau ở người, làm nổi bật tiềm năng của NRF2 như mục tiêu điều trị và yếu tố quyết định sức khỏe lâu dài.

Hiện nay, hệ KEAP1-NRF2 đang được xem là một mục tiêu hấp dẫn cho phát triển thuốc nhằm điều trị nhiều trạng thái bệnh lý ở người Việc nhắm vào KEAP1-NRF2 mở ra cơ hội điều trị cho các bệnh như tiểu đường, viêm và ung thư bằng cách điều hòa phản ứng tế bào với stress oxy hóa và cải thiện đáp ứng miễn dịch Đây là một hướng nghiên cứu có tiềm năng lớn trong dược phẩm và có thể nâng cao hiệu quả điều trị cũng như chất lượng cuộc sống của người bệnh.

1.3.5 Cơ chế bảo tồn của hệ thống KEAP1-NRF2 giữa các loài động vật có xương sống

Hệ thống KEAP1-NRF2 được bảo tồn rất cao giữa các loài động vật có xương sống, từ cá đến động vật có vú, cho thấy vai trò điều chỉnh NRF2 được duy trì trong nhiều nhóm sinh vật; ở zebrafish, KEAP1 điều chỉnh hoạt động NRF2 theo cách tương tự như ở động vật có vú, cho thấy tính bảo tồn chức năng của hệ thống này Hệ thống này cũng được bảo tồn ở động vật không xương sống; ví dụ ở Drosophila, ortholog của NRF2 được gọi là cap’n’ collar (CNC) Gen cnc tạo ra nhiều biến thể mối nối thay thế, với các sản phẩm CncA, CncB và CncC là các đồng dạng chính, và CncC là isoform dài nhất có mức tương đồng lớn nhất với NRF2 của động vật có xương sống Tương tự như NRF2 ở động vật có xương sống, CncC của Drosophila yêu cầu sMAF để thực hiện các chức năng của nó.

Nghiên cứu thiết lập dòng cá ngựa vằn knockout NRF2 nhằm phục vụ cho nghiên cứu oxy hóa và vai trò của NRF2 tương tự ở động vật có vú Đồng thời, một ortholog KEAP1 ở Drosophila tương tác với CncC và hoạt động như một bộ điều hòa ức chế, giống như KEAP1 điều chỉnh NRF2 ở động vật có vú (Pitoniak và Bohmann 2015).

Hình 1.9 Một bản tóm tắt về dư lượng cystein của Keap1 Việc bảo tồn từng cystein được chỉ định như sau: O: được bảo tồn; ∆: Không được bảo tồn nhưng cysteine tồn tại ba axit amin; X: không bảo tồn Các cystein cảm biến được tô màu đỏ, xanh lá cây và xanh dương Mm: chuột; Hs: người; Ol: cá medaka; và Dr: cá ngựa vằn.

Ứng dụng trị liệu của hệ thống KEAP1-NRF2

Dựa trên những đóng góp sâu sắc của NRF2 trong việc ngăn ngừa và giảm bớt nhiều tình trạng bệnh lý trong mô hình chuột, các nỗ lực trên toàn thế giới đã được thực hiện để phân lập từ các nguồn tự nhiên hoặc phát triển các hóa chất kích hoạt NRF2 mạnh và đặc hiệu Trong số đó, dimethyl fumarate (Tecfidera) đã được Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm và Thiết bị Y tế, Mỹ phê duyệt và được kê toa lâm sàng cho bệnh nhân mắc bệnh đa xơ cứng CDDO-Me, một thành viên của nhóm thuốc gây cảm ứng oleanane triterpenoid NRF2 cực kỳ mạnh, đang trải qua các thử nghiệm lâm sàng tại Nhật Bản để điều trị bệnh thận đái tháo đường, mặc dù sự phát triển của nó bị dừng lại ở Hoa Kỳ do sự xuất hiện của biến chứng tim ở bệnh nhân ở giai đoạn cuối bệnh thận (Pergola et al 2011; de Zeeuw et al 2013) Các chất cảm ứng có hiệu lực và độ đặc hiệu ít hơn cũng đang được phát triển lâm sàng, đặc biệt là các axit béo nitro (Delmastro- Greenwood et al 2014) và isothiocyanate sulforaphane có nguồn gốc từ bông cải xanh (Dinkova-Kostova et al 2017) Có thể việc sửa đổi dư lượng cystein bổ sung ngoài KEAP1 có thể kích hoạt tín hiệu bổ sung giúp tăng cường hiệu quả bảo vệ Một số thử nghiệm nhỏ ở bệnh tự kỷ (Singh et al 2014) và ô nhiễm không khí (Egner et al 2014) sử dụng sulforaphane dưới dạng chiết xuất bông cải xanh đã cho thấy những tác động đầy hứa hẹn, ít nhất là một phần Mặc dù dư lượng cystein của KEAP1 có tính phản ứng cao và được sửa đổi hiệu quả bởi các chất electrophile này, các chiến lược không đòi hỏi tính đặc hiệu của electrophile vẫn cần được xem xét Do đó, các chất gây cảm ứng NRF2 có độ đặc hiệu cao hơn có thể được tìm thấy ở dạng hóa chất không phải electrophile mà phá vỡ sự tương tác giữa KEAP1 và NRF2.

Lưu ý rằng KEAP1 chứa một số cảm biến cysteine riêng biệt và hoạt động tự động (C151, C226, C273, C288 và C613), bằng chứng hiện tại cho thấy NRF2 và KEAP1 tích hợp tín hiệu oxit nitric, Zn2+ và alkenal với tín hiệu oxi hóa khử với nhau Các tác động trực tiếp và gián tiếp khác nhau của các chất kích hoạt NRF2 đôi khi được hiểu là tác dụng không đặc hiệu Tuy nhiên, sự phát triển của một số công tắc oxi hóa khử dựa trên thiol (R-SH) riêng biệt trong KEAP1 cho phép các loài động vật có vú thích nghi với phổ rộng của hóa chất thực vật Đặc biệt, các lợi ích đa mục tiêu của kích hoạt NRF2 bao gồm duy trì tín hiệu oxy hóa khử, tăng cường sinh học xenobiotic, kiểm soát và giải quyết tình trạng viêm, ức chế gluconeogenesis và lipogenesis gan, hỗ trợ quá trình tạo protein và ức

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP DÒNG CÁ NGỰA VẰN KNOCKOUT GENE NRF2 PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU OXY HÓA chế xơ hóa Trong bối cảnh này, đáng chú ý là hầu hết các bệnh mãn tính, đặc biệt là những bệnh nhân bị giới hạn trong dân số già, không có căn nguyên độc nhất, cũng không biểu hiện một bệnh lý đơn lẻ, và như vậy chúng có thể được điều trị hiệu quả nhất bằng thuốc kích hoạt NRF2 Thật vậy, việc kích thích các cơ chế bảo vệ tế bào rộng khi kích hoạt NRF2 ít có khả năng bị áp đảo hoặc phá vỡ một cách hiệu quả bởi các quá trình gây bệnh hơn là các biện pháp can thiệp điều trị được nhắm mục tiêu cụ thể hơn.

Hệ thống KEAP1-NRF2 ở cá ngựa vằn

Cá ngựa vằn (Danio rerio) đã trở thành một mô hình hữu ích cho các ứng dụng y tế và sinh học Cá ngựa vằn ở giai đoạn phôi thai và ấu trùng cá ngựa vằn có màu trong suốt Do đó có thể dễ dàng theo dõi sự biểu hiện của gen So với các mẫu chuột, việc bảo trì và chăm sóc dễ quản lý hơn và không đắt bằng Cá ngựa vằn cũng có thể cung cấp một số lượng đáng kể phôi để phân tích thống kê Rất khó để tạo ra cá ngựa vằn loại trực tiếp gen, nhưng gần đây, các cụm thường xuyên lặp lại palindromic ngắn xen kẽ nhau

(CRISPR) -CRISPR liên kết protein 9 phương pháp (Cas9) đã được giới thiệu trong lĩnh vực cá ngựa vằn và bộ gen cá ngựa vằn có thể sửa đổi dễ dàng (Ota et al., 2014) Do đó, việc phân tích loại gen và biểu hiện gen ở cá ngựa vằn đã trở nên dễ dàng.

Hình 1.11 Các điểm mạnh khi sử dụng mô hình cá ngựa vằn trong nghiên cứu sinh học phân tử.

Ngoài ra, cá ngựa vằn đã được sử dụng làm mô hình ứng dụng dịch bệnh và sàng lọc thuốc với thành công lớn (Lam & Gong, 2006; Mukaigasa và cộng sự, 2018; Park và cộng sự, 2008; Smith và cộng sự, 2010; Tobia và cộng sự., 2013; Weigt và cộng sự, 2011; White, 2015; Yen và cộng sự, 2014) Hơn nữa, so với các loài động vật có vú, hệ thống Keap1-Nrf2 ở cá ngựa vằn được bảo tồn (Fuse & Kobayashi, 2017), và Nrf2 và Keap1 của cá ngựa vằn đã được Kobayashi và cộng sự, (2002) phân lập Đầu tiên, thể đột biến Nrf2, nrf2afh318 đã được phân lập và thể hiện độ nhạy cao với stress oxy hóa (Mukaigasa et al., 2012) Sau đó, người ta phát hiện ra rằng Keap1 thoát ra ở cá ngựa vằn trong hai đồng trực hệ, keap1a và keap1b, mà Li và cộng sự, (2008) đã xác định được keap1a Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng cả keap1a và keap1b đều có các hoạt động đàn áp tương tự trong Nrf2, nhưng khác biệt về các hoạt động cảm nhận căng thẳng(Kobayashi và cộng sự, 2009) Do đó, cá ngựa vằn có thể là một mô hình tuyệt vời để nghiên cứu không chỉ Nrf2 mà còn cả hàm Keap1.

Khả năng thành công

Trước đây rất khó để tạo ra đột biến gen ở cá, nhưng gần đây, phương pháp

CRISPR-Cas9 đã được ứng dụng thành công ở cá ngựa vằn (Ota et al 2014), và do đó bộ gen của cá ngựa vằn có thể sửa đổi dễ dàng Bằng cách tận dụng công nghệ này, chúng tôi quyết định tạo ra các dòng cá ngựa vằn được loại bỏ gen Keap1a và Keap1b để tìm hiểu các chức năng sinh lý của chúng.

Tính mới, tính thời sự

Đây sẽ là đề tài mô tả knockout gen Nrf2 bằng CRIPR-Cas9 được thực hiện trên đối tượng cá ngựa vằn đầu tiên trên thế giới Đây cũng là dự án đầu tiên sử dụng phương pháp CRISPR-Cas9 thực hiện loại bỏ gen trên đối tượng cá ngựa vằn tại Việt Nam Do vậy dự án nghiên cứu này thành công sẽ thúc đẩy các nhà khoa học có cái nhìn mới hơn về phương pháp loại bỏ gen bằng hệ thống CRISPR-Cas9 cho các nhà khoa học tại Việt Nam trong tương lai. Điểm tập trung của nghiên cứu này là sử dụng cá ngựa vằn làm mô hình động vật để nghiên cứu vai trò sinh lý của Nrf2 Từ các nghiên cứu Nrf2 trước đây của chúng tôi, chúng tôi nhận thấy rằng các loài cá nhỏ như cá ngựa vằn là một mô hình tuyệt vời để phân tích chức năng in vivo của các phân tử liên quan đến căng thẳng Điểm độc đáo của nghiên cứu này là dựa trên nghiên cứu in vitro trước đây của Mukagasa et al 2012 cho thấy hai Nrf2 của cá ngựa vằn có khả năng cảm biến với các chất oxy hóa khác nhau.

Ý nghĩa khoa học và sự cần thiết vấn đề cần nghiên cứu

Xác định vai trò sinh lý của "cảm biến căng thẳng" sẽ khá hữu ích cho không chỉ khoa học cơ bản mà còn ứng dụng, chẳng hạn như sự phát triển của thuốc kích hoạt Nrf2. Chương 1 – Tổng quan

Hơn nữa, việc xác định vai trò sinh lý của Keap1 là "thuốc ức chế ung thư" sẽ rất quan trọng để xem xét sự cân bằng giữa chống lão hóa và chống ung thư.

Giới thiệu chung về cá ngựa vằn

Cá ngựa vằn được sắp xếp theo hệ thống phân loại như sau:

Ngành có dây sống: Chordata

Họ cá rô phi: Cyprinidae

Tên tiếng việt: Cá ngựa vằn; Cá sọc ngựa.

Cá ngựa vằn có tên khoa học là Danio rerio, là một giống cá nước ngọt vùng nhiệt đới từ lâu đã là một loại cá yêu thích cho những người chơi cá cảnh cũng như đối với các nhà khoa học vì các đặc tính như dễ nuôi, sinh sản nhanh, và các đặc bộ gen học thú vị Cá ngựa vằn đã được dùng làm động vật mô hình thí nghiệm từ giữa những năm 1900s Vào những năm 1980s, tiến sĩ George Streisinger và cộng sự ở đại học Oregon đã thực hiện một cuộc cách mạng về mô hình nghiên cứu di truyền mà trước đây chỉ thực hiện ở động vật không có xương sống.

Tiếp đó, các nhóm nghiên cứu khác ở Boston và Đức đã thực hiện hai cuộc sàng lọc di truyền lớn tạo ra hàng ngàn các chủng đột biến, là công cụ vô giá để hiểu rõ về sự phát triển ở mức độ phân tử Những nghiên cứu mang tính bước ngoặc này lần đầu tiên được xuất bản vào đầu những năm 1990s, đã đưa cá ngựa vằn trở thành một mô hình động vật nghiên cứu về sự phát triển Qua thời gian, cá ngựa vằn đã được mở rộng làm các mô hình nghiên cứu về sức khoẻ và bệnh lý ở con người, mô hình thử độc tính, mô hình cách thức hành động và tiến hoá (Harper and Lawrence 2011).

1.9.2 Lịch sử phân bố tự nhiên

Cá ngựa vằn, có nguồn gốc từ Nam Á, phân bố chủ yếu khắp hạ lưu của nhiều sông lớn của Ấn Độ, Bangladesh và Nepal Địa lý này khu vực được đặc trưng bởi khí hậu gió mùa của nó, với mùa mưa và mùa khô Cá ngựa vằn chủ yếu là một loài sống ở vùng ngập lũ, và thường là gặp ở các vùng nước nông, đứng hoặc chuyển động chậm với thảm thực vật thủy sinh ngập nước và lớp nền phủ phù sa Chất lượng nước trong những môi trường sống này có thể thay đổi rộng rãi Ví dụ, phạm vi pH và nhiệt độ được ghi lại tại một số địa điểm thu thập cá ngựa vằn trong tự nhiên lần lượt

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP DÒNG CÁ NGỰA VẰN KNOCKOUT GENE NRF2 PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU OXY HÓA là 5,9 – 8,5 và 16 – 38°C Trong tự nhiên, cá ngựa vằn chủ yếu ăn nhiều loại động vật phù du và côn trùng (cả dưới nước và trên cạn), tảo, mảnh vụn, và nhiều vật liệu hữu cơ khác (Harper and Lawrence 2011).

1.9.3 Đặc tính sinh học cơ bản

Cá ngựa vằn là loài cá nhỏ, năng động, với 5 đến 7 sọc ở hai bên cơ thể của chúng Chúng có 3 vây chưa ghép đôi và 2 vây có cặp Cá ngựa vằn cũng có 2 cặp vạch ở mặt bên bụng của khoang miệng Cá ngựa vằn một tuổi có thể dài từ 25 mm đến 35 mm Tốc độ tăng trưởng của cá ngựa vằn là nhanh nhất trong thời gian 3 tháng đầu đời và về 0 trong giai đoạn từ khoảng 18 tháng tuổi Tốc độ phát triển của cá ngựa vằn được nuôi trong phòng thí nghiệm lớn hơn tốc độ tăng trưởng của cá ngựa vằn hoang dã Cá cái lớn hơn cá ngựa vằn đực bất kể chúng có nguồn gốc từ tự nhiên hay phòng thí nghiệm, con đực mảnh mai hơn con cái, có màu vàng nhạt trên bụng của chúng, và có xu hướng có vây hậu môn lớn hơn so với cá cái (Harper and Lawrence 2011).

Hình 1.12 Cá ngựa vằn đực và cái.

Cá ngựa vằn có thời gian sinh sản ngắn, từ 2 đến 4 tháng, và thụ tinh là bên ngoài Trong tự nhiên, cá ngựa vằn được cho là đẻ trứng trước và trong mùa mưa Trong điều kiện phòng thí

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP DÒNG CÁ NGỰA VẰN KNOCKOUT GENE NRF2 PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU OXY HÓA nghiệm, cá ngựa vằn có thể đẻ trứng hàng ngày, đẻ vài trăm trứng hoặc nhiều hơn Khi thụ tinh, trứng có đường kính khoảng 0,7 mm Các phôi trong suốt về mặt quang học trong vài ngày đầu tiên sau khi thụ tinh (dpf), và tất cả các cơ quan chính hình thành trong vòng 36 giờ sau khi thụ tinh Ấu trùng cá ngựa vằn bắt đầu tìm kiếm thức ăn ở ngày thứ 5 Tuổi thọ của cá ngựa vằn trong môi trường phòng thí nghiệm khoảng 42 tháng, có khi lên đến 66 tháng (3.5 – 5.5 năm) Các chủng đột biến có thể có tuổi thọ ngắn hơn, tùy thuộc vào các khiếm khuyết di truyền (Harper and

1.9.4 Bộ gen cá ngựa vằn

Cá ngựa vằn có bộ gen lưỡng bội, gồm 25 cặp nhiễm sắc thể Bộ gen được giải trình tự bởi viện Welcome Trust Sanger khởi xướng vào năm 2001, dài khoảng 1.4x 109 bp, bằng khoảng gần một nửa kích thước của bộ gen người, dự đoán chứa hơn 26,000 gen mã hoá cho protein với số lượng cao hơn so với bất kỳ động vật nào đã được giải trình tự trước đó bao gồm người, chuột, gà, với các trình tự lặp lại cao ước tính chiếm khoảng 40%, đây là đặc tính giống với bộ gen người Thật vậy, mức độ tương đồng của bộ gen cá ngựa vằn và người tương đối cao chiếm khoảng 70% (Howe et al 2013).

Hình 1.13 Sự tương quan giữa bộ gen người, gà, chuột và cá ngựa vằn (Howe et al 2013)

Một so sánh trực tiếp giữa gen mã hoá cho protein ở người và cá ngựa vằn cho thấy các đặc tính thú vị sau Đầu tiên, 71.4% số gen người có ít nhất một đồng phân với cá ngựa vằn được xác

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP DÒNG CÁ NGỰA VẰN KNOCKOUT GENE NRF2 PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU OXY HÓA định bởi Ensembl Ngược lại, 69% số gen cá ngựa vằn có ít nhất 1 đồng phân ở người Trong số các gen đồng phân, 47% gen người có mối quan hệ 1-1 với đồng phân ở cá ngựa vằn (Howe et al 2013).

Một trong những số đồng phân này thể hiện qua con đường chống oxy hoá bảo vệ tế bào bằng hoạt hoá Keap1-Nrf2 đã được nghiên cứu có sự bảo tồn từ cá ngựa vằn cho đến người Tuy nhiên, ở người chỉ có 1 gen keap1 trong khi ở cá ngựa vằn có 2 dạng đồng phân là keap1a và keap1b (Nguyen et al 2020)

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu và hoá chất nghiên cứu

Các loại hóa chất, dụng cụ, thiết bị sử dụng cho nghiên cứu được liệt kê theo các bảng bên dưới:

Chương 2 – Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Bảng 2.1 : Các hóa chất - nguyên liệu được sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên hóa chất – nguyên liệu

2 Dược liệu khô mỗi loại 200g

Bảng 2.2 : Các dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu

1 Pippete và đầu típ các loại

Bảng 2.3 : Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu

3Máy xay dược liệu khô

4Hệ thống máy chạy Realtime PCR

8Bộ chạy điện di đứng

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp chuẩn bị chuỗi RNA hướng dẫn đơn -single guilde

RNA (sgRNA) và Cas9 mRNA

Các dòng cá ngựa vằn được loại bỏ gen Nrf2 sẽ được tạo ra bởi phương pháp CRISPR-Cas9 Cụ thể

Hình 2.2 Vị trí được thế kế ở vị trí Neh2 domain (exon 2) của bộ gen cá ngựa vằn.

Biểu đồ được tạo bằng phần mềm Snapgen 2.3.2. Để thiết kế các chuỗi RNA hướng dẫn đơn (sgRNA) cụ thể, chúng tôi tìm các mục tiêu của vị trí RNA hướng dẫn (gRNA) bộ gen bằng cách làm theo hướng dẫn của trang web: http://chopchop.cbu.uib.no Cụ thể, nhập tên gen (trong nghiên cứu này là gen nfe2l2a (Nrf2) vào mục “Target”, bấm chọn “Danio rerio (danRer11/GEC11)” ở mục “In” Tiếp theo chọn “CRISPR/Cas9” ở mục “Using” và “knockout” ở mục “For” Cuối cùng bấm vào nút giữa cuối cùng “Find Target Sites” (Hình 1).

Các vị trí gRNA mục tiêu của Nrf2 ở cá ngựa vằn lần lượt là 5'-

TGGATCTGATCGATATCCTGTGG -3' (Trình tự PAM được gạch chân) (Hình 2; 5). Tiếp theo để xác định được hiệu quả knockout gen Nrf2 sau khi vi tiêm để tạo cá thế hệ F0 và F1 Các cặp mồi Nrf2.hma.f1; Nrf2.hma.r1 (Hình 14; bảng 1) được thiết kế theo đề xuất của trang web: http://chopchop.cbu.uib.no (Hình 3; 5) Các cặp mồi được đề xuất sau khi lựa chọn các vị trí RNA dẫn đường được thực hiện.

Hình 2.3 Trang web (http://chopchop.cbu.uib.no) hỗ trợ thiết kế vị trí các chuỗi RNA hướng dẫn đơn (sgRNA) của gen Nrf2 ở cá ngựa vằn Cụ thể, nhập tên gen (trong nghiên cứu này là gen nfe2l2a) vào mục “Target”, bấm chọn Danio rerio (danRer11/GEC11) ở mục “In” Tiếp theo chọn CRISPR/ Cas9 ở mục “Using” và knockout ở mục “For” Cuối cùng bấm vào nút giữa cuối cùng “Find Target Sites”.

Hình 2.4 Vị trí sgRNA nfe2l2a (Nrf2) cá ngựa vằn được thiết kế từ http://chopchop.cbu.uib.no/ Rank: 1 với trình tự mục tiêu:

TGGATCTGATCGATATCCTGTGG được lựa chọn (trình tự PAM được gạch chân).

Hình 2.5 Lựa chọn cặp mồi để phát hiện indel sau khi knockout gen

Nrf2 bằng CRISPR-Cas9 ở cá ngựa vằn Cặp mồi thiết kế sẵn có từ trang web http://chopchop.cbu.uib.no sau khi thiết kế sgRNA keap1b.

Cụ thể cặp mồi đầu tiên Nrf2.hma.f1: 5’- ctaGTGTGTGATGCCTGACCTC và Nrf2.hma.r1: 5’-

Các trình tự gRNA mục tiêu của Nrf2 ở cá ngựa vằn 5'-

TGGATCTGATCGATATCCTGTGG -3' sau đó được gởi đến công ty “Integrated DNA Technologies, Inc” để tổng hợp RNA dẫn đường đơn (sgRNA) keap1a và keap1b Alt-R S.p HiFi Cas9 Nuclease V3 được mua từ công ty “Integrated DNA Technologies, Inc”

Hình 2.6 sgRNA Nrf2 của cá ngựa vằn được tổng hợp từ công ty IDT.

2.3.2 Loại bỏ gen bằng CRISPR-Cas 9 và Phương pháp vi tiêm

Cá ngựa vằn hoang dại AB được sử dụng cho sinh sản để tiến hành loại bỏ gen Đầu tiên chuẩn hóa 10 nmol của 100 bases Alt-R CRISR-Cas9 sgRNA Nrf2 bằng cách thờm 100 àL nuclease free duplex buffer (IDT) để cú nồng độ cuối là 100 àM.

Tiếp theo pha loóng Alt-R S.p HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 àg (10 àg/àL) (10 àg/àL Alt-R S.p HiFi Cas9 Nuclease V3 0.5 àL; Cas9 working protein buffer (20 mM HEPES;

150 mM KCl 7.5 pH) 9.5 àL, để đạt nồng độ cuối 0.5 àg/àL Alt-R S.p HiFi Cas9 Nuclease V3). Để pha dung dịch thực hiện vi tiờm tạo sản phẩm RNP, kết hợp 3 àL sgRNA Nrf2 với 3 àL của 0.5 àg/àL Alt-R S.p HiFi Cas9 Nuclease V3 Ủ ở nhiệt độ 37 o C cho 10 phút, sau đó để mẫu hạ xuống nhiệt độ phòng.

Cho đẻ cá ngựa vằn dòng AB: Để tiến hành knockout gen Nrf2, dòng cá ngựa vằn AB (được thu thập từ trường Đại học Tsukuba, Nhật Bản) được sử dụng để cho sinh sản tạo phôi trứng, sẵn sàng để thực hiện knockout gen keap1a và keap1b.

Cá ngựa vằn nuôi đạt kích thước khoảng 3 tháng tuổi Sau đó cá cá đực và cái được tách ra nuôi từng bể riêng.

Trước ngày cho đẻ 1 ngày, tiến hành ghép cá đực và cái theo tỉ lệ 3 cái: 2 đực trong bể cho đẻ được tiết kế có lớp lưới inox ngăn bên dưới để trứng rơi xuống, mà tránh cá bố mẹ ăn trứng (Hình 9)

Hình 2.7 Thiết lập bể cho đẻ cá ngựa vằn dòng cá AB A: Bể có thể tích 1.5 lít nước Bể đẻ được bố trí 3 cá cái và 2 cá đực B: Trứng cá ngựa vằn dòng AB sau khi đẻ được thu

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP DÒNG CÁ NGỰA VẰN KNOCKOUT GENE NRF2 PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU OXY HÓA để trong đĩa petri sẵn sàng phục vụ vi tiêm Trứng màu trắng đục là trứng không thụ tinh.

Trứng màu trong suốt là trứng phát triển tốt.

Thu trứng cá ngựa vằn dòng AB ở giai đoạn 1 tế bào và thực hiện vi tiêm 3 nL sản phẩm kết hợp RNP Vi tiêm ít nhất 20 trứng cho mỗi lần tiêm Sau khi vi tiêm kiểm tra tỉ lệ sống của phôi tại thời điểm 8 hrs; 24 hrs; 48 hrs; và 96 hrs).

Sau 96 hrs, tiến hành thu 15 ấu trùng cá riêng biệt để chạy PCR với cặp mồi

Nrf2.hma.f1/r1 và Nrf2.hma.f1/r1 để kiểm tra hiệu quả knockout gen ở thế hệ F0

Phân tích sản phẩm PCR trên 9% acrylamide gel và đánh giá hiệu quả chuyển gen.

Sau khi đánh giá hiệu quả sau vi tiêm, cá F0 sẽ được nuôi đến giai đoạn thành thục (~3 tháng), sau đó cho lai với cá hoang dại tạo ra đàn cá F1, ấu trùng cá F1 hoặc F2 ở giai đoạn sau 96 hrs sau khi thụ tinh sẽ được đánh giá hiệu quả knockout gen bằng cặp mồi Nrf2.hma.f1 và Nfr2.hma r1 Nếu xuất hiện band heteroduplex, các mẫu này sẽ được thực hiện giải trình tự với mồi ở bảng 1 để đánh giá liệu gen đó được loại bỏ (deletion) hay thêm vào (insertion) các nucleotide.

Bảng 2.4: Trình tự các cặp mồi (Oligonucleotide)

Genes Mục đích Trình tự mồi

Xác định kiểu gen

Đối với kiểu gen, DNA tổng số được chiết xuất từ cắt vây đuôi cá trưởng thành bằng cách sử dụng môi trường tách chiết: 10 mM Tris-HCl (pH 8.2), 10 mM EDTA (pH 8.0), NaCl 200 mM, 0.1 % sodium đoecyl sulfate và 400 g/mL proteinase K (Nacalai Tesque, Kyoto, Nhật Bản), bằng cách ủ ở 55°C trong 4 h DNA tổng số thu được sẽ được khuếch đại bằng PCR bằng cách sử dụng cặp mồi 5′- TGTGATGCCTGACCTCTGATGT và mồi 5′- GTCGAACACCTCACGGCCC cho gen Nrf2 (Bảng 2) Kiểu gen được đánh giá sau khi chạy điện di trên 9% gel polyacrylamide.

2.4.1 Cắt đuôi cá, tách DNA

Số con cá được cắt đuôi để tiến hành chạy PCR là 32 con Để thực hiện cần chuẩn bị cá F1 Nrf2 knockout gen; Chất gây mê (Ben zocaine); 32 ly đựng nước có đánh số từ 1 đến 32; 32 ống eppendorf cú đỏnh số từ 1 đến 32 cú chứa 50àL TNEST để giỳp phõn hủy đuôi cá sau khi cắt nhằm thu được DNA của cá; nước sạch; 2 đĩa petri; Muỗng; Nhíp cắt đuôi cá.

Bảng 2.5: các thành phần của môi trường TNES, dùng để chiết xuất DNA

Hỡnh 2.8 Đĩa petri bờn trỏi chứa 50 àL Ben zocaine (chất gõy mờ) với 50 mL nước Đĩa petri bên phải chứa nước sạch.

Hình 2.9 Các dụng cụ cần chuẩn bị để tiến hành cắt đuôi cá.

Đoạn văn tổng quan này trình bày một phương pháp nghiên cứu trên cá liên quan đến gen Nrf2 knockout và quá trình tái sinh sau tổn thương đuôi Bài viết mô tả mục tiêu xác định vai trò của đột biến gen trong sinh trưởng và phản ứng của cá F1, đồng thời giới thiệu cách các nhà khoa học phân tích sự hồi phục và biểu hiện gene liên quan đến quá trình tái sinh mà không đi vào chi tiết kỹ thuật Nội dung nhấn mạnh tính phức tạp của quy trình, yêu cầu tuân thủ nghiêm ngặt chuẩn đạo đức và quy định chăm sóc động vật, và chỉ được thực hiện tại cơ sở có giấy phép với giám sát của chuyên gia Để tối ưu hóa SEO, bài viết có thể kết cấu với các từ khóa như Nrf2 knockout, tái sinh đuôi cá, nghiên cứu di truyền ở thủy sản và các yếu tố an toàn động vật.

Hình 2.10 Thao tác bỏ đuôi cá đã cắt vào ống eppendorf chứa TNEST.

Thờm 0.5 àL enzyme proK (50 mg/mL) for 50 uL mụi trường TNEST buffer Sau đó, ủ mẫu ở 55oC ít nhất 4 hrs Sau khi mẫu ủ, tiến hành pha loãng mẫu DNA 1/10 để chạy PCR.

2.4.2 Chạy PCR mẫu cá F1 Nrf2

Quá trình PCR bắt đầu từ việc xử lý và chuẩn bị mẫu DNA của cỏ ngựa vằn, trong đó bước đầu là pha loãng mẫu để đảm bảo điều kiện khuếch đại Tiếp đó, người làm sẽ chuẩn bị đầy đủ các thiết bị và hóa chất cần thiết cho phản ứng, như nước cất và hỗn hợp PCR phù hợp, nhằm tạo điều kiện tối ưu cho quá trình khuếch đại DNA mục tiêu Toàn bộ quy trình tập trung vào việc chuẩn bị mẫu, thiết bị và dung dịch liên quan để chuẩn hóa thao tác PCR và phục vụ cho các phân tích di truyền sau đó.

Bảng 2.6: Các thành phần để chạy PCR

Chuẩn bị pha premix để chạy PCR X1 Mẫu X1 X23

Water, nuclease-free 5.5 àL 3.5 àL 81.3 àL

10uM-Nrf2.seq.f5 0.5 àL 0.3 àL 7.4 àL

10uM-Nrf2.seq.r5 0.5 àL 0.3 àL 7.4 àL

DreamTag Green PCR master mix 7.5 àL 4.8 àL 110.9 àL

Sau đú, chia đều 9 àL premix vào PCR tube.

Cho thờm 1 àL DNA đó pha loóng vào mỗi PCR tube Rồi tiến hành đưa cỏc PCR tube vào máy PCR để chạy theo chu trình.

Bảng 2.7: Chu trình chạy PCR

Hình 2.11 Tiến hành bỏ mẫu vào để chạy PCR

Sau khi kết thúc PCR, bước tiếp theo là đổ gel để phân tích sản phẩm Các dụng cụ và hoá chất cần chuẩn bị bao gồm khuôn đổ gel, lược tạo giếng cho gel, H2O, 30% Acrylamide và 10X.

Bảng 2.8: Thành phần các chất để đổ gel Đổ gel Acrylamide 9% 1 Gel 2 Gel

Sau đó, trộn đều hỗn hợp rồi đổ vào khuôn, gắn lược Đợi khoảng 30 phút sau gel sẽ đông lại.

Quá trình PCR và điện di gel là một chu trình phân tích DNA phổ biến giúp xác nhận sự có mặt và kích thước của sản phẩm khuếch đại Sau khi chu trình PCR kết thúc, mẫu được chuẩn bị để phân tích trên gel, nơi DNA được phân tách nhờ điện trường dựa trên kích thước Các dải DNA xuất hiện trên gel cho phép nhận diện sự có mặt của sản phẩm mong muốn và ước lượng kích thước tương đối giữa các mẫu Để đảm bảo kết quả chính xác và có thể tái lập, người làm thí nghiệm tuân thủ các nguyên tắc chuẩn bị mẫu và điều kiện phân tích phù hợp, đồng thời ghi nhận đầy đủ thông tin để tối ưu hóa nội dung cho SEO với các từ khóa liên quan như PCR, gel electrophoresis, phân tích DNA và xác nhận sản phẩm khuếch đại.

Hình 2.12 Bơm mẫu vào các giếng trong gel

Sau khi xong sẽ cho gel vào máy chạy điện di để chạy điện di mẫu Chu trình chạy điện di mẫu: 200V, 60mA, 50 phút.

Hình 2.13 Quá trình chạy điện di

Sau khi chạy điện di 50 phút thì sẽ lấy gel ra và cho vào trong dung dịch ethidium bromide khoảng 30 phút rồi cho vào máy để đọc gel.

Hình 2.14 Kết quả sau khi chạy điện di

GIẢI TRÌNH TỰ

Bước 1: Cho vào tuýp 5àL mẫu PCR, 2àL EXP SAPit

Bước 2: Chạy mẫu ở điều kiện 37 o C trong vòng 15 phút và 80 o C trong vòng

PCR for sequencing Nrf2 KO

PCR product 5uL Incubate 37oC 15min

Exp SAPit 2uL 80oC 15 min

4oC oo for sequencing or store at -20oC

Premix 2 Nrf2.seq.f1 x 1 x6 PCR condition

Big dye terminator 0.5 uL 3uL 96oC 10sec

10uM Nrf2.seq.f1 0.15 uL 0.9uL 60oC 4min cycles

Total 7 uL 42uL 4oC oo

Add Exo SAPit mixture 3 uL

Hình 2.15 Cách pha Exo SAPit để tinh sạch sản phẩm PCR.

Hình 2.16 Hoá chất EXP SAPit 2.5.2 Giải trình tự

Sau đây là các bước pha mẫu để giả trình tự:

1 Ly tâm mẫu chạy 5-10 giây

2 Thêm 2.5 uL của 125 mM EDTA

QUAN TRỌNG! Cho trực tiếp EDTA xuống dưới các mẫu GTT.

3 Thêm 30uL của 100% Ethanol Tổng mẫu 42.5 uL/giếng

4 Chuyển 42.5 uL mỗi mẫu từ tube PCR sang eppendoft 1.5 mL

5 Votex eppendoft 2-3 seconds Sau đó ly tâm nhanh 5-10 seconds at 1.000 g

6 Để mẫu ở nhiệt độ phòng 15 phút tạo kết tủa

QUAN TRỌNG! Thời gian tạo kết tủa là quan trọng

QUAN TRỌNG! Thực hiện bước kế tiếp ngay lập tức.

Nếu không thể, tiến hành li tâm tiếp 2 phút trước khi chuyển sang bước tiếp theo

8 Cẩn thận loại bỏ dịch nổi

QUAN TRỌNG! Thực hiện bước kế tiếp ngay lập tức.

Nếu không thể, tiến hành li tâm tiếp 2 phút trước khi chuyển sang bước tiếp theo

12 Cẩn thận loại bỏ dịch nổi

14 Để khô trong không khí, miệng úp xuống, tránh sáng ở nhiệt độ phòng 5-10 phút.

15 Cho 15 uL HIDI-Formamide để hoàn tan cục kết tủa

16 Nung nóng mẫu 96oC trong 2 phút, bỏ trong đá 4oC ngay lập tức.

17 Chuyển mẫu vào đĩa giải trình tự Đậy nắp

18 Thực hiện giải trình tự

Hình 2.18 Quá trình ly tâm mẫu

Hình 2.19 Bỏ mẫu vào máy để chuẩn bị sấy khô

Hình 2.20 Bỏ vào máy tác dụng nhiệt

Hình 2.21 Máy giải trình tự gen 3500XL - hãng Applied Biosystems của Trung tâm

Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh

Chương 3 trình bày kết quả và thảo luận: 3.1 Việc tạo cá knockout gen Nrf2 ở cá ngựa vằn được thực hiện bằng công nghệ CRISPR/Cas9 thông qua tiêm vào phôi ở giai đoạn một tế bào, và hiệu quả của quá trình chỉnh sửa sẽ được đánh giá sau một khoảng thời gian nhất định để rút ra các kết luận về mức độ thành công và tác động sinh học liên quan, phục vụ cho một cái nhìn tổng quan về triển vọng và giới hạn của phương pháp này trong nghiên cứu gene knockout ở cá ngựa vằn.

Hình 3.1 Điện di kiểm tra hiệu quả sau khi vi tiêm sgRNA Nrf2 vào phôi cá ngựa vằn giai đoạn F0 (4 ngày sau khi vi tiêm).

Chương 3 – Kết quả và thảo luận

Hình 3.2 cho thấy kết quả PCR xác định cá ngựa vằn knockout gen Nrf2 ở thế hệ F1, được lai từ cá F0 và cá hoang dại Kết quả cho thấy có 3 dòng cá mang knockout gen Nrf2: cá 2, cá 4 và cá 5.

Nrf2 thành công được tạo ra.

Qua kết quả cho thấy cá ngựa vằn sau khi vi tiêm sgRNA-Keap1a/Cas9 ở giai đoạn tế bào 01 có hiệu quả knockout Keap1a được xác định bằng PCR với cặp mồi keap1a-hma-f1 (5'-TTGTGCCTGTATTTCTTCATGG) và keap1a-hma-r1 (5'-GCCTCTCCATTGAATCTGTGTT) Ở thế hệ F0 (4 ngày sau vi tiêm), xuất hiện band heteroduplex (hình 1), cho thấy knockout thành công.

Các dòng cá F0 được nuôi đến 3–4 tháng để đạt giai đoạn thành thục và sẽ được ghép lai với cá hoang dại; phôi cá nở sau 4 ngày được dùng để chạy PCR với cặp mồi Keap1a-seq-f1 (5’-TTTCAACAATGCCAACCTGG) và Keap1a-seq-r1 (5’-GCCTCTCCATTGAATCTGTGTT) nhằm kiểm tra xem có knockout gen keap1a hay không Kết quả từ hình 2 cho thấy có 3 dòng knockout gen thành công: dòng 1 (mẫu 2.6, 9 bp deleted), dòng 2 (mẫu 2.10, 9 bp deleted), và dòng 3 (mẫu 2.11, 24 bp deleted + 21 bp insert = 3 bp deleted).

3.2 Giải trình tự cá knockout gen keap1b

Hình 3.3 Giải trình tự xác định cá ngựa vằn knocout gen keap1b ở thế hệ

F1 Kết quả có 02 dòng được knockout gen keap1a thành công Dòng 1 (mẫu 3 có 4 bp deleted); dòng 2 (mẫu 7 15 bp deleted).

Hình 3.4 cặp mồi nrf2-seq-f5 chạy điện di và cặp mồi nrf2-seq-f1 chạy giải trình tự

Hình 3.5 Kết quả sau khi giải trình tự

Qua kết quả cho thấy cá ngựa vằn sau khi vi tiêm sgRNA-Keap1b/Cas9 ở giai đoạn một tế bào, hiệu quả knockout được xác định bằng phương pháp PCR với cặp mồi keap1b-hma-f1 (5’-GTGTGTATGATGTGTGCGTGTC) và keap1b-hma-r1 (5’-CTCCAGCGTGTAGCTGAAGAC) Kết quả PCR cho thấy sự xuất hiện của band heteroduplex (hình 3) ở thế hệ F0, 4 ngày sau tiêm.

Các dòng cá F0 được nuôi lớn trong khoảng 3-4 tháng cho đến khi đạt giai đoạn thành thục, sau đó được lai với cá hoang dại Phôi cá nở sau 4 ngày được sử dụng để tiến hành PCR với cặp mồi Keap1b-seq-f1, nhằm phân tích gen và đánh giá đặc tính di truyền của quần thể cá nuôi.

Trong phân tích, đoạn trình tự CGACGTGTGTGTCGAGCG được dùng để kiểm tra xem các dòng cá có knockout gene keap1a hay không Kết quả từ hình 4 cho thấy có 2 dòng cá có knockout gene keap1a thành công: Dòng 1 (mẫu 3) có mất 4 bp; Dòng 2 (mẫu 7) có mất 15 bp.

Các dòng cá F1 được nuôi lớn và cho sinh sản để tạo ra các dòng cá F2 Các dòng cá F2 được nuôi trên sàn lọc nhằm ổn định đặc tính di truyền và phục vụ cho các thí nghiệm.

Tóm lại, chủ nhiệm đề tài đã tạo được các dòng cá knockout gen keap1a và keap1b theo như tiến độ đề tài.

Hình 3.6 Cá F1 được cho lai tạo dòng cá ổn định ở thế hệ hệ F2 knockout gen Nrf2.

Hình 3.7 Giàn cá chuyển gen Nrf2 của Trung tâm Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh

Hình 3.8 Cá được chia ra đực, cái rõ ràng

Hình 3.9 Mô tả tóm tắt phương pháp tạo dòng cá knockout gen ổn định đến thế hệ F2 bằng phương pháp CRISPR-Cas9

3.3 Kết luận Đã tạo được 3 dòng cá knockout gen Nrf2 bằng CRISPR-Cas9

5 Kết luận và kiến nghị

Giải trình tự cá knockout gen keap1b

Hình 3.3 Giải trình tự xác định cá ngựa vằn knocout gen keap1b ở thế hệ

F1 Kết quả có 02 dòng được knockout gen keap1a thành công Dòng 1 (mẫu 3 có 4 bp deleted); dòng 2 (mẫu 7 15 bp deleted).

Hình 3.4 cặp mồi nrf2-seq-f5 chạy điện di và cặp mồi nrf2-seq-f1 chạy giải trình tự

Hình 3.5 Kết quả sau khi giải trình tự

Kết quả cho thấy cá ngựa vằn sau khi vi tiêm sgRNA-Keap1b/Cas9 ở giai đoạn 01 tế bào được xác định hiệu quả knockout bằng phương pháp PCR với cặp mồi keap1b-hma-f1 (5’-GTGTGTATGATGTGTGCGTGTC) và keap1b-hma-r1 (5’-CTCCAGCGTGTAGCTGAAGAC), cho kết quả thành công tạo band heteroduplex (hình 3) ở thế hệ F0 (4 ngày sau khi vi tiêm).

Các dòng cá F0 được nuôi lớn trong 3-4 tháng và khi đạt giai đoạn thành thục sẽ được cho lai với cá hoang dại Các phôi cá nở sau 4 ngày được sử dụng để tiến hành PCR với cặp mồi Keap1b-seq-f1.

Trong quá trình kiểm tra knockout gen keap1a ở các dòng cá, kết quả từ hình 4 cho thấy có hai dòng cá có knockout gen thành công Dòng 1 (mẫu 3) có mất 4 bp, dòng 2 (mẫu 7) có mất 15 bp.

Các dòng cá F1 được nuôi lớn và sinh sản để tạo ra cá F2; các dòng cá F2 này đang được nuôi trên sàn lọc nhằm tạo ra các dòng ổn định phục vụ cho thí nghiệm.