Trước đây, phòng thí nghiệm của giáo sư Makoto Kobayashi đã phân lập các gen tương đồng của cá ngựa vằn của Nrf2 và gen điều hòa Keap1 của nó nrf2, keap1a và keap1b và chứng minh rằng sự
Tính cấp thiết của đề tài
Stress oxy hóa gây ra thiệt hại cho nhiều thành phần tế bào, chẳng hạn như DNA, protein và lipid, và có liên quan đến các tình trạng bệnh lý khác nhau của con người, bao gồm ung thư, thoái hóa thần kinh và các bệnh viêm (Endo et al 2020) Một số protein như superoxide dismutase (SOD), catalase, glutathione peroxidase (Gpx), peroxiredoxin (Prdx), và các phân tử thiol nhỏ glutathione (GSH) và thioredoxin (Txn), tham gia trực tiếp vào việc loại bỏ stress oxy hóa
Những khám phá gần đây về hệ thống chống oxy hóa tế bào đã làm nảy sinh khái niệm mới về “chất chống oxy hóa gián tiếp”, hoạt động thông qua việc tăng cường khả năng chống oxy hóa tế bào bằng cách tăng cường biểu hiện gen do yếu tố phiên mã Nrf2 (Takaya et al 2012; Nguyen et al 2020) Nrf2 là một yếu tố phiên mã dị loại hóa với các protein Maf nhỏ và liên kết với yếu tố phản ứng chống oxy hóa (ARE) trong vùng điều hòa của các gen mục tiêu của nó (Itoh et al 1997) Một loạt các gen bảo vệ tế bào mã hóa các enzym giải độc giai đoạn 2 và các protein chống oxy hóa, chẳng hạn như glutathione S-transferase (GST), NAD(P)H: quinone oxidoreductase và glutamate-cysteine ligase, được cảm ứng bởi Nrf2 (Okawa et al 2006) Trong điều kiện cơ bản, Nrf2 liên tục bị phân hủy thông qua con đường ubiquitin-proteasome theo cách phụ thuộc Keap1 Khi tiếp xúc với electrophin hoặc căng thẳng oxy hóa, Nrf2 thoát khỏi sự phân hủy protein, tích tụ trong nhân và kích hoạt phiên mã các gen mục tiêu của nó.
Trước đây, phòng thí nghiệm của giáo sư Makoto Kobayashi đã phân lập các gen tương đồng của cá ngựa vằn của Nrf2 và gen điều hòa Keap1 của nó (nrf2, keap1a và keap1b) và chứng minh rằng sự cảm ứng của các gen bảo vệ tế bào bởi hệ thống Keap1- Nrf2 được bảo tồn ở các động vật có xương sống (Tian et al 2018) Bằng cách sử dụng hệ thống cá ngựa vằn này, chúng tôi đã cung cấp những hiểu biết mới về các chức năng của Nrf2 (Kobayashi et al 2002, 2009; Nakajima et al 2011), ví dụ sự phân lập của một số dòng cá ngựa vằn đột biến biểu hiện phản ứng suy giảm với các hợp chất kích hoạt Nrf2, và chứng minh sự biểu hiện cụ thể ở mô của Nrf2 và các gen mục tiêu của nó
Tuy nhiên, vai trò sinh lý của Nrf2 ở cá ngựa vằn vẫn chưa rõ ràng và cần được làm sáng tỏ để hiểu các chức năng của Nrf2 từ quan điểm tiến hóa Trong nghiên cứu
“Nghiên cứu thiết lập dòng cá ngựa vằn knockout gene nrf2 phục vụ nghiên cứu oxy hóa” này, tôi đã loại bỏ gen Nrf2 để xác định đặc điểm cá ngựa vằn bằng phương pháp
CRISPR-Cas9 (Ota et al 2014) Kết quả của chúng tôi cho thấy cá ngựa vằn loại bỏ gen Nrf2 có thể sống được và có khả năng sinh sản Đây sẽ là mô hình lý tưởng để sử dụng phân tích các đặc điểm oxy hóa trong tương lai
- Mục tiêu của nghiên cứu này là làm rõ vai trò sinh lý của Nrf2 khi bị mất chức năng Nhiều nghiên cứu Nrf2 dựa trên các tế bào nuôi cấy liên quan đến cảm cảm biến căng thẳng đã được báo cáo bao gồm chúng tôi Đầu tiên, chúng tôi sẽ tạo ra các dòng cá loại bỏ gen Nrf2, và kiểm tra đặc tính di truyền ở các thế hệ sau từ F0 đến F2 Thứ hai, chúng tôi sẽ làm sáng tỏ chức năng sinh lý của cá ngựa vằn bị loại bỏ gen Nrf2
Tuy nhiên, trong khuôn khổ đề tài sinh viên, thời gian ngắn Nên tôi xin thực hiện mục đích nghiên cứu đầu tiên là tạo được dòng cá ngựa vằn loại bỏ gen Nrf2 đến thế hệ F2.
Nhiệm vụ nghiên cứu
- Loại bỏ được gen Nrf2 để xác định đặc điểm cá ngựa vằn bằng phương pháp
Phương pháp nghiên cứu
- Loại bỏ gen Nrf2 ở cá ngựa vằn bằng phương pháp CRISPR-Cas9 và vi tiêm
CRISPR-Cas9 vào phôi cá ngựa vằn giai đoạn một tế bào.
Các kết quả đạt được của đề tài
- Loại bỏ được gen Nrf2 ở cá ngựa vằn mà cá thể vẫn có khả năng sống tiếp và sinh sản
Kết cấu của khoá luận tốt nghiệp
Khoá luận tốt nghiệp này gồm 4 chương:
- Chương 2 - Cơ sở khoa học của đề tài nghiên cứu
- Chương 3 - Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
- Chương 4 – Kết quả và thảo luận
TỔNG QUAN
Giới thiệu về kỹ thuật knockout gene
Knockout gene là một kỹ thuật di truyền trong đó một trong các gen của sinh vật không hoạt động được Knockout được thực hiện thông qua sự kết hợp của nhiều kỹ thuật, bắt đầu trong ống nghiệm với plasmid, nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn hoặc cấu trúc DNA khác, và tiến hành nuôi cấy tế bào Các tế bào riêng lẻ được chuyển gen với cấu trúc DNA Thông thường, mục đích là tạo ra động vật chuyển gen có gen bị thay đổi Có thể thay thế 1 đoạn gen khác vào vị trí loại bỏ thay vì loại bỏ hoàn toàn đoạn gen đó.
Tổng quan về hệ thống CRISPER-Cas9
Một số lượng chưa từng có của thông tin bộ gen bây giờ đã có sẵn của mô hình sinh vật khác nhau bao gồm cả thực vật và động vật Tuy nhiên, các chức năng sinh học và phát triển liên quan đến các gen riêng lẻ nằm trong các bộ gen này không phải lúc nào cũng được hiểu rõ Sự phát triển của các nuclease ở các vị trí đặc trưng nhân tạo như các zinc finger nucleases (ZFNs) và transcription activator like effector ‐ ‐ nucleases (TALENs) đã cho phép điều tra các kiểu hình của các gen bị mất chức năng liên quan Cả ZFNs và TALENs đều bao gồm một tên miền DNA Binding (tên miền ‐ zinc finger hoặc TALE) và tên miền xúc tác FOK I nuclease ‐
Các DNA sợi đơn bị phá vỡ (Double strand breaks (DSBs)) được gây ra bởi ZFNs hoặc TALENs tại locus bộ gen được lựa chọn mục tiêu trước đó có thể được sửa chữa bởi tái tổ hợp các gen tương đồng hoặc không tương đồng Việc sữa chữa thường gây ta quá trình chèn và/hoặc xóa (indel) các đột biến vào các vị trí của DSBs, dẫn đến đột biến lệch khung đọc (frameshift mutation) mà dẫn đến sự phá vỡ chức năng gen Nhìn chung, cả hai phương pháp ZFNs và TALENs đều được chứng minh là công cụ mạnh mẽ để chỉnh sửa bộ gen Tuy nhiên, quy trình của các phương pháp này rất phức tạp trong việc thiết kế và đưa vào sử dụng trong thực tế Do đó tính ứng dụng của các phương pháp này chưa cao, đặc biệt đối với các ứng dụng lâm sàng (Kotani et al 2015).
Hình 1.1 Spacer, protospacer và PAM Protospacer là DNA đích; PAM tiếp giáp với DNA sợi đôi được nhắm mục tiêu Phần đệm (Spacer) là một phần của RNA dẫn đường gắn kết với protospacer Nguồn: https://www.idtdna.com/
Gần đây, hệ thống CRISPR-Cas9 đã nổi lên như một mảng công nghệ chỉnh sửa bộ gen mới (Jinek et al 2012) CRISPR được viết tắt từ những chữ cái đầu của cụm từ Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Tên gọi này được sử dụng ở thời điểm khi các nhà sinh học chưa biết rõ nguồn gốc và tại sao lại có mặt các đoạn trình tự riêng rẽ xen giữa các đoạn trình tự giống hệt nhau Ở thời điểm đó CRISPRs được miêu tả như là đoạn DNA nhân sơ chứa các đoạn ngắn có trình tự base giống nhau được lặp lại Trong một đoạn trình tự xuôi ngược lặp đi lặp lại, khi đọc theo hướng xuôi hay ngược thì đều có được trình tự nucleotide giống hệt nhau Nằm cạnh mỗi trình tự xuôi ngược là các đoạn DNA đệm có độ dài duy nhất mà sau này được phát hiện là có nguồn gốc từ DNA ngoại lai (thể thực khuẩn hoặc plasmid) Ngoài các đoạn trình tự xuôi ngược ngắn và vùng đệm DNA, còn có cụm nhỏ (cluster) các gen cas (hệ đi kèm với CRISPR) nằm bên cạnh các trình tự CRISPR Hệ thống CRISPR/Cas là một hệ thống miễn dịch thích ứng được tìm thấy trong vi khuẩn và vi khuẩn cổ, và nó bảo vệ các bộ gen của các sinh vật chống lại virus xâm lược và plasmid (Wiedenheft et al 2012) Một số nhóm đã chứng minh rằng loại II CRISPR/Cas9, CRISPR/Cas9, đặc biệt hữu ích cho các thay đổi bộ gen được nhắm mục tiêu trong các tế bào động vật có vú (Cong et al 2013; Mali et al.
2013) và các sinh vật mô hình khác nhau bao gồm cá ngựa vằn (Hwang et al 2013), chuột (Li et al 2013b), và chuột nhắt (Li et al 2013a, b)
Hình 1.2 Chỉnh sửa gen CRISPR-Cas9 Hình thành RNP (bước 1) có thể xảy ra bên trong tế bào hoặc phòng thí nghiệm Đầu tiên, CRISPR RNA (crRNA) và CRISPR RNA chuyển hóa (tracrRNA) kết hợp với nhau, tạo thành RNA dẫn đường (gRNA) hoàn chỉnh Tiếp theo, gRNA liên kết với enzyme Cas, tạo thành ribonucleoprotein (RNP) Nếu quá trình hình thành RNP được thực hiện trên phòng thí nghiệm, thì RNP sau đó phải được chuyển đến các tế bào Trong bước 2, gRNA hướng RNP đến mục tiêu bên trong tế bào Sau đó mục tiêu được phân tách (bước 3) Nguồn: https://www.idtdna.com/
Trong hệ thống này, các chuỗi gen được nhắm mục tiêu nằm liền kề với một trình tự tiền vùng đệm (protospacer adjacent motif- PAM) mà được ghi nhận bởi RNA hướng dẫn (gRNA)- chứa các trình tự bổ sung cho các vị trí đích và được phân cắt bởi một phức hợp của gRNA và nuclease Cas9 Các đột biến indel tiếp theo gây ra bởi các nuclease Cas9 góp phần vào sự gián đoạn gen Trong thực tế, sự gián đoạn gen duy nhất gây ra bởi CRISPR/Cas9 ở cá ngựa vằn đã được báo cáo bởi một số nhóm (Jao et al 2013; Hwang et al 2013; Chang et al 2013; Hruscha et al 2013; Sung et al 2014; Bannikov và Lavrov 2017).
Hình 1.3 Các kết quả có thể xảy ra sau khi phân tách DNA bộ gen Các con đường sửa chữa DNA của tế bào chẳng hạn như nối kết cuối không tương đồng (NHEJ) có thể dẫn đến xóa (deletion), thay đổi trình tự (changed sequences) và chèn nhỏ (small insertion) Nguồn: https://www.idtdna.com/
Trình tự CRISPR lần đầu tiên được tìm ra vào năm 1987 do các nghiên cứu của
Yoshizumi Ishino và cộng sự tại trường Đại học Osaka, Nhật Bản Điều này thúc đẩy các nhà khoa học tập trung nghiên cứu chức năng đặc biệt của chúng trong hệ miễn dịch của vi khuẩn trong những năm gần đây Vào năm 2012, hai nhóm nghiên cứu độc lập của Tiến sĩ Emmanuelle Charpentier tại trường đại học Umea và Tiến sĩ Jennifer Doudna tại trường đại học California, Berkeley đã cùng khám phá ra cơ chế hoạt động của enzyme Cas và CRISPR
Tiến sĩ Craig Mello, người được trao giải thưởng Nobel về Sinh lý học và Y học năm
2006 về công trình nghiên cứu RNAi (RNA interference), đã có những lời bình luận về tương lai hứa hẹn của phương pháp này như sau: “CRISPR/Cas có ý nghĩa vô cùng to lớn, khả năng của nó vô cùng mạnh mẽ, bời vì chúng ta về cơ bản có thể thay đổi bộ gen theo bất cứ điều gì chúng ta muốn” Mello nhấn mạnh rằng phương pháp này có thể được sử dụng rộng rãi từ các ứng dụng cho nông nghiệp đến các ứng dụng liệu pháp gen trong điều trị các bệnh lý trên người Phương pháp này thật sự là một thành công của nghiên cứu khoa học cơ bản, đây cũng là một đột phá to lớn có tác động mạnh mẽ đối với di truyền học phân tử.
Hình 1.4 Sửa chữa theo hướng tương đồng (HDR) có thể kết hợp các trình tự mới vào DNA bộ gen Các trình tự nhỏ có thể được thay đổi cho các mục đích chỉnh sửa hoặc sửa đổi gen (trái), và các trình tự lớn như toàn bộ gen có thể được thêm vào một cách ngẫu nhiên (phải) Nguồn: https://www.idtdna.com/ gRNA (RNA hướng dẫn) là một phân tử RNA tổng hợp ngắn được sử dụng trong chỉnh sửa bộ gen dựa trên hệ thống CRISPR, một trong những loại công cụ chỉnh sửa bộ gen đặc biệt cao gRNA bao gồm chuỗi nucleotide dài ̴ 20 bp liên kết với trình tự DNA mục tiêu của bộ gen Trình tự này được gọi là trình tự miếng đệm Phân tử gRNA bao gồm một chuỗi giàn giao cho liên kết của Cas, endonuclease Vì vậy, hai thành phần của chỉnh sửa bộ gen dựa trên CRISPR là gRNA và CRISPR liên kết endonuclease (Cas) Mặt khác, mục tiêu bộ gen của hệ thống CRISPR thay đổi theo trình tự của gRNA. sgRNA là RNA hướng dẫn duy nhất, một thuật ngữ được sử dụng để mô tả gRNA, trong khi gRNA là RNA được hướng dẫn, một phân tử RNA được sử dụng để chỉ định một mục tiêu cụ thể cho endonuclease trong chỉnh sửa bộ gen dựa trên hệ thống
CRISPR Vì thế, cả sgRNA và gRNA là các thuật ngữ có thể hoan đồi cho nhau để mô tả cùng một phân tử Không có nhiều sự khác biệt giữa sgRNA và gRNA Cả sgRNA và gRNA đều là các phân tử tổng hợp và giống với crRNA trong hệ thống CRISPR theo chức năng.
Có ba loại gRNA dựa trên phương pháp tổng hợp Chúng là crRNA tổng hợp, sgRNA lentivirus và sgRNA tổng hợp.
Hình 1.5 Các dạng gRNA khác nhau được sử dụng để loại bỏ gen Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn dạng sgRNA (bao gồm crRNA và tracrRNA). sgRNA có tính bền và không cần ủ nhiệt trước khi chuyển vào phôi cá ngựa vằn.
Nguồn: https://www.idtdna.com/
Hình 1.6 Vị trí PAM và gRNA Cas9 Vị trí PAM nằm trên chuỗi DNA không nằm trong mục tiêu trình tự loại bỏ gen RNA dẫn đường liên kết với sợi mục tiêu RNA dẫn đường trong hình này là RNA dẫn đường hai phần, bao gồm crRNA và tracrRNA Nguồn: https://www.idtdna.com/
Hình 1.7 So sánh hai phần gRNA (A) và sgRNA (B) Cả hai loại gRNA đều có thể được thêm vào Cas9 để tạo thành Ribonucleoprotein (RNP), sau đó có thể được phân phối đến các tế bào Nguồn: idtdna.com/
CRISPR/Cas đang ngày căng chứng tỏ tiềm năng ứng dụng mạnh mẽ của mình Các nhà khoa học đang tiến hành việc nghiên cứu để sử dụng hệ thống này để sửa chữa các sai hỏng trong DNA bộ gen trong các bệnh lý di truyền ở con người Một hướng ứng dụng khác là trong các nghiên cứu tế bào gốc nhằm biệt hóa các tế bào gốc thành nhiều loại tế bào khác nhau nhờ điều chỉnh di truyền trong DNA bộ gen Ngoài ra, CRISPR/Cas còn có thể được sử dụng trong việc tạo ra các loại động vật và thực vật biến đổi gen với hiệu quả cao Thậm chí gần đây, nhóm nghiên cứu của Giáo sư Yoshio Koyanagi còn sử dụng hệ thống CRISPR/Cas để phá hủy bộ gen của HIV nhằm dùng nó như một liệu pháp tiềm năng đối với bệnh AIDS Nhiều kết quả khả quan ban đầu của việc sử dụng hệ thống này cũng đã được công bố trên các tạp chí uy tín trên thế giới Mặc dù chỉ mới được phát triển gần đây, nhưng hệ thống CRISPR/Cas nhanh chóng được sử dụng rộng rãi trong việc biến đổi DNA bộ gen.
Định nghĩa về hệ thống keap1-nrf2
1.3.1 Lịch sử tiền khám phá Nrf2
Nhận thức về khái niệm môi trường có ảnh hưởng đến sức khỏe của chúng ta, đặc biệt là trong những trường hợp gây ung thư, được Percival Pott mô tả lần đầu tiên vào năm 1775 trong ấn phẩm Quan sát Chirurgical Pott nhận thấy tỷ lệ mắc ung thư bìu (dương vật) cao bất thường trong các cuộc quét ống khói ở London và cho rằng muội than là một yếu tố môi trường gây ra ung thư Năm 1915, mối liên hệ nhân quả giữa hóa chất môi trường và ung thư đã được Yamagiwa và Ichikawa chứng minh rõ ràng Họ cho thấy rằng ung thư mãn tính trên tai thỏ do việc tiếp xúc với than đá Ngày nay, người ta đánh giá cao rằng việc tránh và loại bỏ tiếp xúc với các yếu tố bất lợi của môi trường là rất quan trọng trong việc ngăn ngừa ung thư hóa học ở người.
Trong những năm 1960 và 1970, người ta đã chứng minh rằng các chất gây ung thư từ than đá và từ các môi trường làm việc khác, thường yêu cầu phải trải qua chuyển hóa sinh học thành các chất chuyển hóa có tính ái lực điện tử (electrophilic) để tạo thành các chất cộng hóa trị với protein, RNA và DNA (Debaun et al 1970) Sự kích hoạt trao đổi chất này thường được xúc tác bởi hệ thống sắc tố tế bào (cytochrom P-450) của microsome và các oxyase khác, còn được gọi là enzyme pha I (Miller 1978) Trong khi sự chú ý ngày càng tăng đối với hóa chất là nguyên nhân gây ung thư ở người, các nghiên cứu khác đã tìm kiếm các thuốc để trị bệnh ung thư gây ra từ hóa chất, mà có khả năng ức chế các bước kích hoạt trao đổi chất và/hoặc tăng cường giải độc của các chất trực tiếp hay trải qua phản ứng trung gian gây ung thư của chúng Mối quan tâm ban đầu đối với các chất ức chế ung thư đã tập trung vào các chất chống oxy hóa từ thực phẩm và các sản phẩm tự nhiên như: flavonoid và isothiocyanate, được cho là an toàn đối với con người Tiền xử lý động vật gặm nhấm bằng chất chống oxy hóa từ thực phẩm (2 (3)-tert-butyl-4- hydroxyanisole (BHA)) có khả năng ức chế hiệu quả quá trình gây ung thư (Yamamoto et al 2018).
Benson và các đồng nghiệp (Benson et al 1980) đã báo cáo rằng BHA làm tăng các hoạt động enzyme của glutathione S-transferase, epoxide hydratase, NAD(P)H: quinone oxyoreductase và các enzyme giải độc khác trong nhiều mô của chuột Nhiều loại hợp chất chống oxy hóa khác như phenolic, thuốc nhuộm azo, chất thơm đa vòng, flavonoid, coumarin, cinnamate, indole, isothiocyanate, 1,2-dithiole-3-thiones và thiocarbamate đã được xác định là các chất có khả năng gây kích hoạt sự hoạt động của những enzyme giải độc này Một vài trong số các chất kích hoạt này có chứa một tính năng hóa học đặc biệt là các chất nhận phản ứng Michael, được đặc trưng bởi các liên kết olefinic để tạo ra ái lực điện tử (tích điện dương) bằng cách kết hợp với các chất hút electron Hiệu lực của các chất gây kích hoạt này chia sẻ tính chất chung của việc sửa đổi các nhóm sulfhydryl bằng cách oxy hóa, khử hoặc kiềm hóa (Talalay et al 1988) Sự phơi nhiễm của các tế bào với liều thấp với các phản ứng electrophile sulfhydryl làm gia tăng hoạt động các enzyme này (gọi là enzyme pha II), do đó bảo vệ các tế bào chống lại độc tính của electrophile Sự thích ứng này của tế bào được gọi là phản ứng chống electrophile
(Prestera et al 1993) Xuất phát từ những quan sát này, giả thuyết đã đưa ra rằng các tế bào có khả năng cảm biến (sensor) với các phân tử nhờ vào chức năng sulfhydryl độc đáo để nhận ra và phản ứng với các chất gây kích hoạt enzyme bảo vệ.
1.3.2 Khám phá Nrf2: một phân tử chính trong phản ứng chống electrophile
Hoạt động enzyme giải độc bởi các chất electrophile hiện nay chủ yếu là do tăng khả năng phiên mã của các gen tương ứng của chúng Các yếu tố điều hòa quan trọng cho sự biểu hiện cảm ứng của gen mã hóa enzyme pha II đã được xác định là yếu tố đáp ứng chống oxy hóa (ARE) hoặc yếu tố đáp ứng electrophile (EpRE) Tuy nhiên, các yếu tố điều hòa mã hóa của các yếu tố phiên mã cho ARE/EpRE vẫn chưa được biết cho đến khi Itoh et al tạo được mô hình chuột loại bỏ hoàn toàn gen NRF2 và phân tích biểu hiện của enzyme pha II (Itoh et al 1997) NRF2 ban đầu được phân lập như là một yếu tố phiên mã tạo máu tương đồng NF-E2 p45, nhưng chức năng của nó chưa được biết (Itoh et al 1995) Họ phát hiện ra rằng kích hoạt các enzyme pha II của BHA đã bị bãi bỏ hoàn toàn ở chuột bị loại bỏ gen NRF2 Việc xác định NRF2 như một phân tử điều hóa chính của phản ứng chống electrophile đã mở ra một cánh cửa mới trong nghiên cứu độc học, nơi các cơ chế giải độc được giải mã và hiểu ở cấp độ phân tử.
1.3.3 Lịch sử khám phá KEAP1: Bộ cảm biến nhận biết các chất elecreophile
Thật may mắn, cảm biến của các chất hóa học từ môi trường và điều hòa hoạt động của NRF2 đã sớm được phát hiện Năm 1999, Itoh et al phân lập (bằng cách sàng lọc hai loại nấm men) một loại protein mới giàu group thiol (R-SH) và là phân tử ức chế của NRF2, được đặt tên là KEAP1 (Itoh et al 1999) KEAP1 thúc đẩy sự suy giảm NRF2 trong điều kiện không bị căng thẳng Ngược lại trong điều kiện có các chất kích thích oxy hóa khử, chúng có khả năng trực tiếp làm thay đổi các nhóm thiol của KEAP1 và dẫn đến bất hoạt chức năng của KEAP1, kết quả NRF2 không bị ức chế bởi KEAP1, ổn định hoạt động và di chuyển vào nhân tế bào nơi mà NRF2 có khả năng phiên mã tạo ra các gen bảo vệ tế bào chất Do đó KEAP1 được coi là bộ cảm biến sinh học (biological sensor) cho các chất electrophile và ROS.
1.3.4 Tổng quan về chức năng của hệ thống phân tử KEAP1-NRF2
Hệ thống KEAP1-NRF2 đã được công nhận là cơ chế phòng thủ thống trị của cơ thể để chống lại các tác động có hại của môi trường Hệ thống KEAP1-NRF2 là một hệ thống bao gồm hai thành phần điển hình: KEAP1 như một bộ cảm biến để nhận biết các chất ái lực điện tử, NRF2 như một tác nhân kích hoạt sự phối hợp của các gen bảo vệ tế bào Trong tế bào chất, KEAP1 tạo thành phức hợp ligase ubiquitin E3 với CULLIN3 (CUL3) và NRF2, đánh dấu NRF2 cho sự thoái hóa nhanh chóng qua hệ thống proteasome
Do đó, trong điều kiện không bị căng thẳng, NRF2 được tổng hợp, nhưng liên tục bị suy giảm Tuy nhiên, khi tiếp xúc với các chất ái lực điện tử hoặc các gốc tự do, dư lượng cysteine phản ứng của KEAP1 được sửa đổi trực tiếp, làm giảm hoạt động ligase ubiquitin E3 của phức hợp KEAP1-CUL3 và dẫn đến ổn định NRF2 NRF2 mới được tạo ra sau đó có thể chuyển trực tiếp vào nhân, dị hóa với một trong các protein sợi cơ nhỏ (sMAF), liên kết với yếu tố ARE/EpRE và kích hoạt mạnh mẽ năng lượng của các enzyme pha II, do đó hoạt động như một yếu tố phiên mã chính.
Hình 1.8 Cơ chế phân tử của hệ thống KEAP1-NRF2 kích hoạt gen mục tiêu NRF2 trong điều kiện căng thẳng Nguồn: https://www.idtdna.com/
Các nghiên cứu rộng rãi trên toàn thế giới về hệ thống KEAP1-NRF2 đã dẫn đến sự tích lũy đáng kể những bằng chứng chứng minh tầm quan trọng của hoạt động NRF2 và các cơ chế điều chỉnh của nó đối với việc duy trì sức khỏe của chúng ta Điều quan trọng sự điều hòa của hệ thống KEAP1-NRF2 làm cơ sở cho sinh bệnh khác nhau ở người Hiện tại, người ta nhận ra rằng hệ thống KEAP1-NRF2 cung cấp một mục tiêu hấp dẫn để phát triển thuốc cho các tinh trạng bệnh lý khác nhau của con người, như bệnh tiểu đường, viêm và ung thư.
1.3.5 Cơ chế bảo tồn của hệ thống KEAP1-NRF2 giữa các loài động vật có xương sống Hệ thống KEAP1-NRF2 được bảo tồn rất cao giữa các loài động vật có xương sống, từ cá đến động vật có vú Zebrafish KEAP1 điều chỉnh hoạt động NRF2 của cá ngựa vằn theo cách tương tự như ở động vật có vú Hệ thống này cũng được bảo tồn ở động vật không xương sống (Hình 3) Ví dụ, ortholog NRF2 của ruồi giấm (Drosophila) được gọi là nắp cổ áo (cap’n’ collar - CNC) Gen cnc ở Drosophila tạo ra nhiều biến thể mối nối thay thế, với các sản phẩm CncA, CncB và CncC là các đồng dạng chính CncC là isoform dài nhất và giống nhất với NRF2 của động vật có vú Tương tự như động vật có xương sống NRF2, CncC của Drosophila yêu cầu sMAF để thực hiện các chức năng giống như NRF2 của nó Một ortholog KEAP1 ở Drosophila tương tác với CncC và hoạt động như một bộ điều hòa ức chế, giống như KEAP1 điều chỉnh NRF2 ở động vật có vú (Pitoniak and Bohmann 2015).
Hình 1.9 Một bản tóm tắt về dư lượng cystein của Keap1 Việc bảo tồn từng cystein được chỉ định như sau: O: được bảo tồn; ∆: Không được bảo tồn nhưng cysteine tồn tại ba axit amin; X: không bảo tồn Các cystein cảm biến được tô màu đỏ, xanh lá cây và xanh dương Mm: chuột; Hs: người; Ol: cá medaka; và Dr: cá ngựa vằn.
Ngược lại, ở loài giun (C Elegans) sở hữu một ortholog NRF2 được gọi là SKN-1 và hoạt động thông qua một hệ thống phòng thủ khác chống lại căng thẳng oxy hóa
(Blackwell et al 2015) Cần lưu ý rằng, do tuổi thọ ngắn, Drosophila và C Elegans thường được sử dụng cho các nghiên cứu lão hóa Kích hoạt CncC bằng đột biến KEAP1 giúp kéo dài tuổi thọ của Drosophila Sự gián đoạn SKN-1 ở C Elegans làm giảm khả năng chống lại căng thẳng và rút ngắn tuổi thọ (Tullet et al 2017) Sự đóng góp của SKN-1 vào kéo dài tuổi thọ cho thấy rằng việc củng cố phản ứng căng thẳng oxy hóa là một cơ chế chống lão hóa hiệu quả Một nghiên cứu gần đây sử dụng chuột chũi trần, loài gặm nhấm có tuổi thọ tự nhiên dài, tiết lộ rằng hoạt động NRF2 cao hơn có liên quan chặt chẽ với tuổi thọ của chúng (Yamamoto et al 2018) Các báo cáo này ủng hộ mạnh mẽ quan niệm rằng hoạt động NRF2 cao hơn có lợi cho tuổi thọ.
1.3.6 Cơ chế điều hoà hoạt động của hệ thống KEAP1-NRF2
KEAP1 là một protein giàu thiol chứa nhiều gốc cysteine, một số nằm liền kề với các axit amin cơ bản ở các dạng anion phản ứng của nhóm sulfhydryl Liên kết cộng hóa trị với các chất gây cảm ứng electrophile với các gốc cystein đã được quan sát bằng phép đo phổ khối Sự đóng góp đáng kể của gốc cystein vào chức năng của KEAP1 như một cảm biến nhận biết các chất đã được chứng minh trong các tế bào nuôi cấy (McMahon et al 2010; Fourquet et al 2010), cá ngựa vằn (Kobayashi et al 2009) và chuột (Yamamoto et al 2008; Suzuki et al 2011; Saito et al 2015) Các nghiên cứu này cho thấy ba gốc cysteine chính của KEAP1 rất quan trọng để điều chỉnh hoạt động ligase ubiquitin E3 của phức hợp KEAP1 - CUL3 Các gốc cystein quan trọng này là Cys151 ở domain BTB và Cys273 và Cys288 ở domain IVR.
Hình 1.10 Mã Cysteine của phản ứng dựa trên KEAP1 đối với các rối loạn oxy hóa khử khác nhau Ba gốc cystein chính, Cys151, Cys273 và Cys288, của KEAP1 chịu trách nhiệm chính cho các phản ứng đối với nhiều loại electrophile OA-NO2, axit béo nitro; 4HNE, 4- hydroxynonel (Yamamoto et al 2018).
Ứng dụng trị liệu của hệ thống KEAP1-NRF2
Dựa trên những đóng góp sâu sắc của NRF2 trong việc ngăn ngừa và giảm bớt nhiều tình trạng bệnh lý trong mô hình chuột, các nỗ lực trên toàn thế giới đã được thực hiện để phân lập từ các nguồn tự nhiên hoặc phát triển các hóa chất kích hoạt NRF2 mạnh và đặc hiệu Trong số đó, dimethyl fumarate (Tecfidera) đã được Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm và Thiết bị Y tế, Mỹ phê duyệt và được kê toa lâm sàng cho bệnh nhân mắc bệnh đa xơ cứng CDDO-Me, một thành viên của nhóm thuốc gây cảm ứng oleanane triterpenoid NRF2 cực kỳ mạnh, đang trải qua các thử nghiệm lâm sàng tại Nhật Bản để điều trị bệnh thận đái tháo đường, mặc dù sự phát triển của nó bị dừng lại ở Hoa Kỳ do sự xuất hiện của biến chứng tim ở bệnh nhân ở giai đoạn cuối bệnh thận (Pergola et al 2011; de Zeeuw et al 2013) Các chất cảm ứng có hiệu lực và độ đặc hiệu ít hơn cũng đang được phát triển lâm sàng, đặc biệt là các axit béo nitro (Delmastro- Greenwood et al 2014) và isothiocyanate sulforaphane có nguồn gốc từ bông cải xanh (Dinkova-Kostova et al 2017) Có thể việc sửa đổi dư lượng cystein bổ sung ngoài KEAP1 có thể kích hoạt tín hiệu bổ sung giúp tăng cường hiệu quả bảo vệ Một số thử nghiệm nhỏ ở bệnh tự kỷ (Singh et al 2014) và ô nhiễm không khí (Egner et al 2014) sử dụng sulforaphane dưới dạng chiết xuất bông cải xanh đã cho thấy những tác động đầy hứa hẹn, ít nhất là một phần Mặc dù dư lượng cystein của KEAP1 có tính phản ứng cao và được sửa đổi hiệu quả bởi các chất electrophile này, các chiến lược không đòi hỏi tính đặc hiệu của electrophile vẫn cần được xem xét Do đó, các chất gây cảm ứng NRF2 có độ đặc hiệu cao hơn có thể được tìm thấy ở dạng hóa chất không phải electrophile mà phá vỡ sự tương tác giữa KEAP1 và NRF2.
Lưu ý rằng KEAP1 chứa một số cảm biến cysteine riêng biệt và hoạt động tự động(C151, C226, C273, C288 và C613), bằng chứng hiện tại cho thấy NRF2 và KEAP1 tích hợp tín hiệu oxit nitric, Zn2+ và alkenal với tín hiệu oxi hóa khử với nhau Các tác động trực tiếp và gián tiếp khác nhau của các chất kích hoạt NRF2 đôi khi được hiểu là tác dụng không đặc hiệu Tuy nhiên, sự phát triển của một số công tắc oxi hóa khử dựa trên thiol (R-SH) riêng biệt trong KEAP1 cho phép các loài động vật có vú thích nghi với phổ rộng của hóa chất thực vật Đặc biệt, các lợi ích đa mục tiêu của kích hoạt NRF2 bao gồm duy trì tín hiệu oxy hóa khử, tăng cường sinh học xenobiotic, kiểm soát và giải quyết tình trạng viêm, ức chế gluconeogenesis và lipogenesis gan, hỗ trợ quá trình tạo protein và ức chế xơ hóa Trong bối cảnh này, đáng chú ý là hầu hết các bệnh mãn tính, đặc biệt là những bệnh nhân bị giới hạn trong dân số già, không có căn nguyên độc nhất, cũng không biểu hiện một bệnh lý đơn lẻ, và như vậy chúng có thể được điều trị hiệu quả nhất bằng thuốc kích hoạt NRF2 Thật vậy, việc kích thích các cơ chế bảo vệ tế bào rộng khi kích hoạt NRF2 ít có khả năng bị áp đảo hoặc phá vỡ một cách hiệu quả bởi các quá trình gây bệnh hơn là các biện pháp can thiệp điều trị được nhắm mục tiêu cụ thể hơn.
Hệ thống KEAP1-NRF2 ở cá ngựa vằn
Cá ngựa vằn (Danio rerio) đã trở thành một mô hình hữu ích cho các ứng dụng y tế và sinh học Cá ngựa vằn ở giai đoạn phôi thai và ấu trùng cá ngựa vằn có màu trong suốt Do đó có thể dễ dàng theo dõi sự biểu hiện của gen So với các mẫu chuột, việc bảo trì và chăm sóc dễ quản lý hơn và không đắt bằng Cá ngựa vằn cũng có thể cung cấp một số lượng đáng kể phôi để phân tích thống kê Rất khó để tạo ra cá ngựa vằn loại trực tiếp gen, nhưng gần đây, các cụm thường xuyên lặp lại palindromic ngắn xen kẽ nhau
(CRISPR) -CRISPR liên kết protein 9 phương pháp (Cas9) đã được giới thiệu trong lĩnh vực cá ngựa vằn và bộ gen cá ngựa vằn có thể sửa đổi dễ dàng (Ota et al., 2014) Do đó, việc phân tích loại gen và biểu hiện gen ở cá ngựa vằn đã trở nên dễ dàng.
Hình 1.11 Các điểm mạnh khi sử dụng mô hình cá ngựa vằn trong nghiên cứu sinh học phân tử.
Ngoài ra, cá ngựa vằn đã được sử dụng làm mô hình ứng dụng dịch bệnh và sàng lọc thuốc với thành công lớn (Lam & Gong, 2006; Mukaigasa và cộng sự, 2018; Park và cộng sự, 2008; Smith và cộng sự, 2010; Tobia và cộng sự., 2013; Weigt và cộng sự, 2011; White, 2015; Yen và cộng sự, 2014) Hơn nữa, so với các loài động vật có vú, hệ thống Keap1-Nrf2 ở cá ngựa vằn được bảo tồn (Fuse & Kobayashi, 2017), và Nrf2 và Keap1 của cá ngựa vằn đã được Kobayashi và cộng sự, (2002) phân lập Đầu tiên, thể đột biến Nrf2, nrf2afh318 đã được phân lập và thể hiện độ nhạy cao với stress oxy hóa
(Mukaigasa et al., 2012) Sau đó, người ta phát hiện ra rằng Keap1 thoát ra ở cá ngựa vằn trong hai đồng trực hệ, keap1a và keap1b, mà Li và cộng sự, (2008) đã xác định được keap1a Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng cả keap1a và keap1b đều có các hoạt động đàn áp tương tự trong Nrf2, nhưng khác biệt về các hoạt động cảm nhận căng thẳng (Kobayashi và cộng sự, 2009) Do đó, cá ngựa vằn có thể là một mô hình tuyệt vời để nghiên cứu không chỉ Nrf2 mà còn cả hàm Keap1.
Khả năng thành công
Trước đây rất khó để tạo ra đột biến gen ở cá, nhưng gần đây, phương pháp
CRISPR-Cas9 đã được ứng dụng thành công ở cá ngựa vằn (Ota et al 2014), và do đó bộ gen của cá ngựa vằn có thể sửa đổi dễ dàng Bằng cách tận dụng công nghệ này, chúng tôi quyết định tạo ra các dòng cá ngựa vằn được loại bỏ gen Keap1a và Keap1b để tìm hiểu các chức năng sinh lý của chúng.
Tính mới, tính thời sự
Đây sẽ là đề tài mô tả knockout gen Nrf2 bằng CRIPR-Cas9 được thực hiện trên đối tượng cá ngựa vằn đầu tiên trên thế giới Đây cũng là dự án đầu tiên sử dụng phương pháp CRISPR-Cas9 thực hiện loại bỏ gen trên đối tượng cá ngựa vằn tại Việt Nam Do vậy dự án nghiên cứu này thành công sẽ thúc đẩy các nhà khoa học có cái nhìn mới hơn về phương pháp loại bỏ gen bằng hệ thống CRISPR-Cas9 cho các nhà khoa học tại Việt Nam trong tương lai. Điểm tập trung của nghiên cứu này là sử dụng cá ngựa vằn làm mô hình động vật để nghiên cứu vai trò sinh lý của Nrf2 Từ các nghiên cứu Nrf2 trước đây của chúng tôi, chúng tôi nhận thấy rằng các loài cá nhỏ như cá ngựa vằn là một mô hình tuyệt vời để phân tích chức năng in vivo của các phân tử liên quan đến căng thẳng Điểm độc đáo của nghiên cứu này là dựa trên nghiên cứu in vitro trước đây của Mukagasa et al 2012 cho thấy hai Nrf2 của cá ngựa vằn có khả năng cảm biến với các chất oxy hóa khác nhau.
Ý nghĩa khoa học và sự cần thiết vấn đề cần nghiên cứu
Xác định vai trò sinh lý của "cảm biến căng thẳng" sẽ khá hữu ích cho không chỉ khoa học cơ bản mà còn ứng dụng, chẳng hạn như sự phát triển của thuốc kích hoạt Nrf2.
Hơn nữa, việc xác định vai trò sinh lý của Keap1 là "thuốc ức chế ung thư" sẽ rất quan trọng để xem xét sự cân bằng giữa chống lão hóa và chống ung thư.
Giới thiệu chung về cá ngựa vằn
Cá ngựa vằn được sắp xếp theo hệ thống phân loại như sau:
Ngành có dây sống: Chordata
Họ cá rô phi: Cyprinidae
Tên tiếng việt: Cá ngựa vằn; Cá sọc ngựa.
Cá ngựa vằn có tên khoa học là Danio rerio, là một giống cá nước ngọt vùng nhiệt đới từ lâu đã là một loại cá yêu thích cho những người chơi cá cảnh cũng như đối với các nhà khoa học vì các đặc tính như dễ nuôi, sinh sản nhanh, và các đặc bộ gen học thú vị Cá ngựa vằn đã được dùng làm động vật mô hình thí nghiệm từ giữa những năm 1900s Vào những năm 1980s, tiến sĩ George Streisinger và cộng sự ở đại học Oregon đã thực hiện một cuộc cách mạng về mô hình nghiên cứu di truyền mà trước đây chỉ thực hiện ở động vật không có xương sống
Tiếp đó, các nhóm nghiên cứu khác ở Boston và Đức đã thực hiện hai cuộc sàng lọc di truyền lớn tạo ra hàng ngàn các chủng đột biến, là công cụ vô giá để hiểu rõ về sự phát triển ở mức độ phân tử Những nghiên cứu mang tính bước ngoặc này lần đầu tiên được xuất bản vào đầu những năm 1990s, đã đưa cá ngựa vằn trở thành một mô hình động vật nghiên cứu về sự phát triển Qua thời gian, cá ngựa vằn đã được mở rộng làm các mô hình nghiên cứu về sức khoẻ và bệnh lý ở con người, mô hình thử độc tính, mô hình cách thức hành động và tiến hoá (Harper and Lawrence 2011).
1.9.2 Lịch sử phân bố tự nhiên
Cá ngựa vằn, có nguồn gốc từ Nam Á, phân bố chủ yếu khắp hạ lưu của nhiều sông lớn của Ấn Độ, Bangladesh và Nepal Địa lý này khu vực được đặc trưng bởi khí hậu gió mùa của nó, với mùa mưa và mùa khô Cá ngựa vằn chủ yếu là một loài sống ở vùng ngập lũ, và thường là gặp ở các vùng nước nông, đứng hoặc chuyển động chậm với thảm thực vật thủy sinh ngập nước và lớp nền phủ phù sa Chất lượng nước trong những môi trường sống này có thể thay đổi rộng rãi Ví dụ, phạm vi pH và nhiệt độ được ghi lại tại một số địa điểm thu thập cá ngựa vằn trong tự nhiên lần lượt là 5,9 – 8,5 và 16 – 38°C Trong tự nhiên, cá ngựa vằn chủ yếu ăn nhiều loại động vật phù du và côn trùng (cả dưới nước và trên cạn), tảo, mảnh vụn, và nhiều vật liệu hữu cơ khác (Harper and
1.9.3 Đặc tính sinh học cơ bản
Cá ngựa vằn là loài cá nhỏ, năng động, với 5 đến 7 sọc ở hai bên cơ thể của chúng Chúng có 3 vây chưa ghép đôi và 2 vây có cặp Cá ngựa vằn cũng có 2 cặp vạch ở mặt bên bụng của khoang miệng Cá ngựa vằn một tuổi có thể dài từ 25 mm đến 35 mm Tốc độ tăng trưởng của cá ngựa vằn là nhanh nhất trong thời gian 3 tháng đầu đời và về 0 trong giai đoạn từ khoảng 18 tháng tuổi Tốc độ phát triển của cá ngựa vằn được nuôi trong phòng thí nghiệm lớn hơn tốc độ tăng trưởng của cá ngựa vằn hoang dã Cá cái lớn hơn cá ngựa vằn đực bất kể chúng có nguồn gốc từ tự nhiên hay phòng thí nghiệm, con đực mảnh mai hơn con cái, có màu vàng nhạt trên bụng của chúng, và có xu hướng có vây hậu môn lớn hơn so với cá cái (Harper and Lawrence 2011).
Hình 1.12 Cá ngựa vằn đực và cái.
Cá ngựa vằn có thời gian sinh sản ngắn, từ 2 đến 4 tháng, và thụ tinh là bên ngoài Trong tự nhiên, cá ngựa vằn được cho là đẻ trứng trước và trong mùa mưa Trong điều kiện phòng thí nghiệm, cá ngựa vằn có thể đẻ trứng hàng ngày, đẻ vài trăm trứng hoặc nhiều hơn Khi thụ tinh, trứng có đường kính khoảng 0,7 mm Các phôi trong suốt về mặt quang học trong vài ngày đầu tiên sau khi thụ tinh (dpf), và tất cả các cơ quan chính hình thành trong vòng 36 giờ sau khi thụ tinh Ấu trùng cá ngựa vằn bắt đầu tìm kiếm thức ăn ở ngày thứ 5 Tuổi thọ của cá ngựa vằn trong môi trường phòng thí nghiệm khoảng 42 tháng, có khi lên đến 66 tháng (3.5 – 5.5 năm) Các chủng đột biến có thể có tuổi thọ ngắn hơn, tùy thuộc vào các khiếm khuyết di truyền (Harper and Lawrence 2011).
1.9.4 Bộ gen cá ngựa vằn
Cá ngựa vằn có bộ gen lưỡng bội, gồm 25 cặp nhiễm sắc thể Bộ gen được giải trình tự bởi viện Welcome Trust Sanger khởi xướng vào năm 2001, dài khoảng 1.4x 109 bp, bằng khoảng gần một nửa kích thước của bộ gen người, dự đoán chứa hơn 26,000 gen mã hoá cho protein với số lượng cao hơn so với bất kỳ động vật nào đã được giải trình tự trước đó bao gồm người, chuột, gà, với các trình tự lặp lại cao ước tính chiếm khoảng 40%, đây là đặc tính giống với bộ gen người Thật vậy, mức độ tương đồng của bộ gen cá ngựa vằn và người tương đối cao chiếm khoảng 70% (Howe et al 2013).
Hình 1.13 Sự tương quan giữa bộ gen người, gà, chuột và cá ngựa vằn (Howe et al 2013)
Một so sánh trực tiếp giữa gen mã hoá cho protein ở người và cá ngựa vằn cho thấy các đặc tính thú vị sau Đầu tiên, 71.4% số gen người có ít nhất một đồng phân với cá ngựa vằn được xác định bởi Ensembl Ngược lại, 69% số gen cá ngựa vằn có ít nhất 1 đồng phân ở người Trong số các gen đồng phân, 47% gen người có mối quan hệ 1-1 với đồng phân ở cá ngựa vằn (Howe et al 2013).
Một trong những số đồng phân này thể hiện qua con đường chống oxy hoá bảo vệ tế bào bằng hoạt hoá Keap1-Nrf2 đã được nghiên cứu có sự bảo tồn từ cá ngựa vằn cho đến người Tuy nhiên, ở người chỉ có 1 gen keap1 trong khi ở cá ngựa vằn có 2 dạng đồng phân là keap1a và keap1b (Nguyen et al 2020)
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• Thời gian thực hiện: từ 11/2021 đến 04/2022
• Địa điểm: Phòng Công nghệ Sinh học Thủy sản, Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM.
\ Hình 2.1 Hệ thống nuôi cá và bàn làm việc, thí nghiệm của phòng Công nghệ
Sinh học Thủy sản, Trung tâm Công nghệ Sinh học TP Hồ Chí Minh
2.2 Vật liệu và hoá chất nghiên cứu
Các loại hóa chất, dụng cụ, thiết bị sử dụng cho nghiên cứu được liệt kê theo các bảng bên dưới:
Bảng 2.1 : Các hóa chất - nguyên liệu được sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên hóa chất – nguyên liệu
2 Dược liệu khô mỗi loại 200g
Bảng 2.2 : Các dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu
1 Pippete và đầu típ các loại
Bảng 2.3 : Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu
3 Máy xay dược liệu khô
4 Hệ thống máy chạy Realtime PCR
8 Bộ chạy điện di đứng
2.3.1 Phương pháp chuẩn bị chuỗi RNA hướng dẫn đơn -single guilde RNA
Các dòng cá ngựa vằn được loại bỏ gen Nrf2 sẽ được tạo ra bởi phương pháp CRISPR-Cas9 Cụ thể
Hình 2.2 Vị trí được thế kế ở vị trí Neh2 domain (exon 2) của bộ gen cá ngựa vằn.
Biểu đồ được tạo bằng phần mềm Snapgen 2.3.2. Để thiết kế các chuỗi RNA hướng dẫn đơn (sgRNA) cụ thể, chúng tôi tìm các mục tiêu của vị trí RNA hướng dẫn (gRNA) bộ gen bằng cách làm theo hướng dẫn của trang web: http://chopchop.cbu.uib.no Cụ thể, nhập tên gen (trong nghiên cứu này là gen nfe2l2a (Nrf2) vào mục “Target”, bấm chọn “Danio rerio (danRer11/GEC11)” ở mục
“In” Tiếp theo chọn “CRISPR/Cas9” ở mục “Using” và “knockout” ở mục “For” Cuối cùng bấm vào nút giữa cuối cùng “Find Target Sites” (Hình 1)
Các vị trí gRNA mục tiêu của Nrf2 ở cá ngựa vằn lần lượt là 5'-
TGGATCTGATCGATATCCTGTGG -3' (Trình tự PAM được gạch chân) (Hình 2; 5)
Tiếp theo để xác định được hiệu quả knockout gen Nrf2 sau khi vi tiêm để tạo cá thế hệ F0 và F1 Các cặp mồi Nrf2.hma.f1; Nrf2.hma.r1 (Hình 14; bảng 1) được thiết kế theo đề xuất của trang web: http://chopchop.cbu.uib.no (Hình 3; 5) Các cặp mồi được đề xuất sau khi lựa chọn các vị trí RNA dẫn đường được thực hiện.
Hình 2.3 Trang web (http://chopchop.cbu.uib.no) hỗ trợ thiết kế vị trí các chuỗi RNA hướng dẫn đơn (sgRNA) của gen Nrf2 ở cá ngựa vằn Cụ thể, nhập tên gen (trong nghiên cứu này là gen nfe2l2a) vào mục “Target”, bấm chọn Danio rerio
(danRer11/GEC11) ở mục “In” Tiếp theo chọn CRISPR/Cas9 ở mục “Using” và knockout ở mục “For” Cuối cùng bấm vào nút giữa cuối cùng “Find Target Sites”.
Hình 2.4 Vị trí sgRNA nfe2l2a (Nrf2) cá ngựa vằn được thiết kế từ http://chopchop.cbu.uib.no/ Rank: 1 với trình tự mục tiêu:
TGGATCTGATCGATATCCTGTGG được lựa chọn (trình tự PAM được gạch chân).
Hình 2.5 Lựa chọn cặp mồi để phát hiện indel sau khi knockout gen Nrf2 bằng
CRISPR-Cas9 ở cá ngựa vằn Cặp mồi thiết kế sẵn có từ trang web http://chopchop.cbu.uib.no sau khi thiết kế sgRNA keap1b
Cụ thể cặp mồi đầu tiên Nrf2.hma.f1: 5’- ctaGTGTGTGATGCCTGACCTC và
Nrf2.hma.r1: 5’- CAGTGTcttctcctgctcctg được lựa chọn.
Các trình tự gRNA mục tiêu của Nrf2 ở cá ngựa vằn 5'-
TGGATCTGATCGATATCCTGTGG -3' sau đó được gởi đến công ty “Integrated DNA Technologies, Inc” để tổng hợp RNA dẫn đường đơn (sgRNA) keap1a và keap1b Alt-R S.p HiFi Cas9 Nuclease V3 được mua từ công ty “Integrated DNA Technologies, Inc”
Hình 2.6 sgRNA Nrf2 của cá ngựa vằn được tổng hợp từ công ty IDT
2.3.2 Loại bỏ gen bằng CRISPR-Cas 9 và Phương pháp vi tiêm
Cá ngựa vằn hoang dại AB được sử dụng cho sinh sản để tiến hành loại bỏ gen Đầu tiên chuẩn hóa 10 nmol của 100 bases Alt-R CRISR-Cas9 sgRNA Nrf2 bằng cách thờm 100 àL nuclease free duplex buffer (IDT) để cú nồng độ cuối là 100 àM
Tiếp theo pha loóng Alt-R S.p HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 àg (10 àg/àL) (10 àg/àL Alt-R S.p HiFi Cas9 Nuclease V3 0.5 àL; Cas9 working protein buffer (20 mM HEPES;
150 mM KCl 7.5 pH) 9.5 àL, để đạt nồng độ cuối 0.5 àg/àL Alt-R S.p HiFi Cas9 Nuclease V3). Để pha dung dịch thực hiện vi tiờm tạo sản phẩm RNP, kết hợp 3 àL sgRNA Nrf2 với 3 àL của 0.5 àg/àL Alt-R S.p HiFi Cas9 Nuclease V3 Ủ ở nhiệt độ 37 o C cho 10 phút, sau đó để mẫu hạ xuống nhiệt độ phòng.
Cho đẻ cá ngựa vằn dòng AB: Để tiến hành knockout gen Nrf2, dòng cá ngựa vằn AB (được thu thập từ trường Đại học Tsukuba, Nhật Bản) được sử dụng để cho sinh sản tạo phôi trứng, sẵn sàng để thực hiện knockout gen keap1a và keap1b
Cá ngựa vằn nuôi đạt kích thước khoảng 3 tháng tuổi Sau đó cá cá đực và cái được tách ra nuôi từng bể riêng
Trước ngày cho đẻ 1 ngày, tiến hành ghép cá đực và cái theo tỉ lệ 3 cái: 2 đực trong bể cho đẻ được tiết kế có lớp lưới inox ngăn bên dưới để trứng rơi xuống, mà tránh cá bố mẹ ăn trứng (Hình 9)
Hình 2.7 Thiết lập bể cho đẻ cá ngựa vằn dòng cá AB A: Bể có thể tích 1.5 lít nước Bể đẻ được bố trí 3 cá cái và 2 cá đực B: Trứng cá ngựa vằn dòng AB sau khi đẻ được thu để trong đĩa petri sẵn sàng phục vụ vi tiêm Trứng màu trắng đục là trứng không thụ tinh.
Trứng màu trong suốt là trứng phát triển tốt.
Thu trứng cá ngựa vằn dòng AB ở giai đoạn 1 tế bào và thực hiện vi tiêm 3 nL sản phẩm kết hợp RNP Vi tiêm ít nhất 20 trứng cho mỗi lần tiêm Sau khi vi tiêm kiểm tra tỉ lệ sống của phôi tại thời điểm 8 hrs; 24 hrs; 48 hrs; và 96 hrs)
Sau 96 hrs, tiến hành thu 15 ấu trùng cá riêng biệt để chạy PCR với cặp mồi
Nrf2.hma.f1/r1 và Nrf2.hma.f1/r1 để kiểm tra hiệu quả knockout gen ở thế hệ F0 Phân tích sản phẩm PCR trên 9% acrylamide gel và đánh giá hiệu quả chuyển gen
Sau khi đánh giá hiệu quả sau vi tiêm, cá F0 sẽ được nuôi đến giai đoạn thành thục (~3 tháng), sau đó cho lai với cá hoang dại tạo ra đàn cá F1, ấu trùng cá F1 hoặc F2 ở giai đoạn sau 96 hrs sau khi thụ tinh sẽ được đánh giá hiệu quả knockout gen bằng cặp mồi Nrf2.hma.f1 và Nfr2.hma r1 Nếu xuất hiện band heteroduplex, các mẫu này sẽ được thực hiện giải trình tự với mồi ở bảng 1 để đánh giá liệu gen đó được loại bỏ (deletion) hay thêm vào (insertion) các nucleotide.
Bảng 2.4: Trình tự các cặp mồi (Oligonucleotide)
Genes Mục đích Trình tự mồi
Xác định kiểu gen
Đối với kiểu gen, DNA tổng số được chiết xuất từ cắt vây đuôi cá trưởng thành bằng cách sử dụng môi trường tách chiết: 10 mM Tris-HCl (pH 8.2), 10 mM EDTA (pH 8.0), NaCl 200 mM, 0.1 % sodium đoecyl sulfate và 400 g/mL proteinase
K (Nacalai Tesque, Kyoto, Nhật Bản), bằng cách ủ ở 55°C trong 4 h DNA tổng số thu được sẽ được khuếch đại bằng PCR bằng cách sử dụng cặp mồi 5′-
TGTGATGCCTGACCTCTGATGT và mồi 5′- GTCGAACACCTCACGGCCC cho gen Nrf2 (Bảng 2) Kiểu gen được đánh giá sau khi chạy điện di trên 9% gel polyacrylamide.
2.4.1 Cắt đuôi cá, tách DNA
Số con cá được cắt đuôi để tiến hành chạy PCR là 32 con Để thực hiện cần chuẩn bị cá F1 Nrf2 knockout gen; Chất gây mê (Ben zocaine); 32 ly đựng nước có đánh số từ 1 đến 32; 32 ống eppendorf cú đỏnh số từ 1 đến 32 cú chứa 50àL TNEST để giỳp phõn hủy đuôi cá sau khi cắt nhằm thu được DNA của cá; nước sạch; 2 đĩa petri; Muỗng; Nhíp cắt đuôi cá.
Bảng 2.5: các thành phần của môi trường TNES, dùng để chiết xuất DNA
Hỡnh 2.8 Đĩa petri bờn trỏi chứa 50 àL Ben zocaine (chất gõy mờ) với 50 mL nước Đĩa petri bên phải chứa nước sạch.
Hình 2.9 Các dụng cụ cần chuẩn bị để tiến hành cắt đuôi cá.
Các bước tiến hành cắt đuôi cá: Đầu tiên bắt cá F1 Nrf2 knockout gene cho vào đĩa petri có pha chất gây mê để cá nằm yên (khoảng 1 phút) Sau đó, vớt cá qua đĩa petri chứa nước sạch, lấy nhíp cắt 1 phần đuôi cá (cắt 1 phần đuôi cá để cá có thể phục hồi đuôi) Sau đó bỏ đuôi cá đã cắt vào ống eppendorf đã chuẩn bị có chứa TNEST và đậy nắp lại Cuối cùng thả cá sau khi tiến hành cắt đuôi xong vào ly chứa nước sạch đã chuẩn bị.
Hình 2.10 Thao tác bỏ đuôi cá đã cắt vào ống eppendorf chứa TNEST.
Thờm 0.5 àL enzyme proK (50 mg/mL) for 50 uL mụi trường TNEST buffer Sau đó, ủ mẫu ở 55oC ít nhất 4 hrs Sau khi mẫu ủ, tiến hành pha loãng mẫu DNA 1/10 để chạy PCR.
2.4.2 Chạy PCR mẫu cá F1 Nrf2
Sau khi để mẫu đuôi cá qua đêm thì sẽ chạy PCR Đầu tiền là pha loãng mẫu DNA của cỏ ngựa vằn Hỳt 2àL mẫu đuụi cỏ pha với 38àL H2O Sau đú, chuẩn bị cỏc thiết bị và hoá chất bao gồm: H2O, 10uM-Nrf2.seq.f5, 10uM-Nrf2.seq.r5, DreamTag Green PCR master mix.
Bảng 2.6: Các thành phần để chạy PCR
Chuẩn bị pha premix để chạy PCR X1 Mẫu X1 X23
Water, nuclease-free 5.5 àL 3.5 àL 81.3 àL
10uM-Nrf2.seq.f5 0.5 àL 0.3 àL 7.4 àL
10uM-Nrf2.seq.r5 0.5 àL 0.3 àL 7.4 àL
DreamTag Green PCR master mix 7.5 àL 4.8 àL 110.9 àL
Sau đú, chia đều 9 àL premix vào PCR tube
Cho thờm 1 àL DNA đó pha loóng vào mỗi PCR tube Rồi tiến hành đưa cỏc PCR tube vào máy PCR để chạy theo chu trình.
Bảng 2.7: Chu trình chạy PCR
Hình 2.11 Tiến hành bỏ mẫu vào để chạy PCR
Sau khi chạy PCR xong thì sẽ tiến hành đổ gel Các dụng cụ, thiết bị và hoá chất cần chuẩn bị bao gồm: khuôn đổ gel, lược tạo giếng cho gel, H2O, 30% Acrylamide, 10X TBE, TEMDED, 10% APS.
Bảng 2.8: Thành phần các chất để đổ gel Đổ gel Acrylamide 9% 1 Gel 2 Gel
Sau đó, trộn đều hỗn hợp rồi đổ vào khuôn, gắn lược Đợi khoảng 30 phút sau gel sẽ đông lại.
Sau khi gel đụng và mẫu trong mỏy PCR chạy xong thỡ sẽ tiến hành hỳt 9 àL từ PCR tube để bơm vào cỏc giếng trong miếng gel Giếng đầu tiờn sẽ cho 7 àL thang vào.
Hình 2.12 Bơm mẫu vào các giếng trong gel
Sau khi xong sẽ cho gel vào máy chạy điện di để chạy điện di mẫu Chu trình chạy điện di mẫu: 200V, 60mA, 50 phút.
Hình 2.13 Quá trình chạy điện di
Sau khi chạy điện di 50 phút thì sẽ lấy gel ra và cho vào trong dung dịch ethidium bromide khoảng 30 phút rồi cho vào máy để đọc gel.
Hình 2.14 Kết quả sau khi chạy điện di
GIẢI TRÌNH TỰ
Bước 1: Cho vào tuýp 5àL mẫu PCR, 2àL EXP SAPit
Bước 2: Chạy mẫu ở điều kiện 37 o C trong vòng 15 phút và 80 o C trong vòng 15 phút
PCR for sequencing Nrf2 KO
PCR product 5uL Incubate 37oC 15min
Exp SAPit 2uL 80oC 15 min
4oC oo for sequencing or store at -20oC
Premix 2 Nrf2.seq.f1 x 1 x 6 PCR condition
Big dye terminator 0.5 uL 3 uL 96oC 10 sec
10uM Nrf2.seq.f1 0.15 uL 0.9 uL 60oC 4 min
Total 7 uL 42 uL 4oC oo
Add Exo SAPit mixture 3 uL
Hình 2.15 Cách pha Exo SAPit để tinh sạch sản phẩm PCR.
Hình 2.16 Hoá chất EXP SAPit 2.5.2 Giải trình tự
Sau đây là các bước pha mẫu để giả trình tự:
1 Ly tâm mẫu chạy 5-10 giây
2 Thêm 2.5 uL của 125 mM EDTA
QUAN TRỌNG! Cho trực tiếp EDTA xuống dưới các mẫu GTT.
3 Thêm 30uL của 100% Ethanol Tổng mẫu 42.5 uL/giếng
4 Chuyển 42.5 uL mỗi mẫu từ tube PCR sang eppendoft 1.5 mL
5 Votex eppendoft 2-3 seconds Sau đó ly tâm nhanh 5-10 seconds at 1.000 g
6 Để mẫu ở nhiệt độ phòng 15 phút tạo kết tủa
QUAN TRỌNG! Thời gian tạo kết tủa là quan trọng
QUAN TRỌNG! Thực hiện bước kế tiếp ngay lập tức
Nếu không thể, tiến hành li tâm tiếp 2 phút trước khi chuyển sang bước tiếp theo
8 Cẩn thận loại bỏ dịch nổi
QUAN TRỌNG! Thực hiện bước kế tiếp ngay lập tức
Nếu không thể, tiến hành li tâm tiếp 2 phút trước khi chuyển sang bước tiếp theo
12 Cẩn thận loại bỏ dịch nổi
14 Để khô trong không khí, miệng úp xuống, tránh sáng ở nhiệt độ phòng 5-10 phút.
15 Cho 15 uL HIDI-Formamide để hoàn tan cục kết tủa
16 Nung nóng mẫu 96oC trong 2 phút, bỏ trong đá 4oC ngay lập tức.
17 Chuyển mẫu vào đĩa giải trình tự Đậy nắp
18 Thực hiện giải trình tự
Hình 2.18 Quá trình ly tâm mẫu
Hình 2.19 Bỏ mẫu vào máy để chuẩn bị sấy khô
Hình 2.20 Bỏ vào máy tác dụng nhiệt
Hình 2.21 Máy giải trình tự gen 3500XL - hãng Applied Biosystems của Trung tâm
Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh
CHƯƠNG 3KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Vi tiêm tạo cá knockout gen
sgRNA Nrf2 cùng với Cas9 protein được vi tiêm vào giai đoạn phôi 1 tế bào cá ngựa vằn Hiệu quả vi tiêm sẽ được kiểm tra sau những ngày này.
Hình 3.1 Điện di kiểm tra hiệu quả sau khi vi tiêm sgRNA Nrf2 vào phôi cá ngựa vằn giai đoạn F0 (4 ngày sau khi vi tiêm).
Hình 3.2 Kết quả chạy PCR xác định cá ngựa vằn knockout gen Nrf2 ở thế hệ F1 (được lai từ cá F0 và cá hoang dại) Kết quả có 03 dòng (Cá 2; 4 và cá 5) được knockout gen
Nrf2 thành công được tạo ra.
Qua kết quả cho thấy, cá ngựa vằn sau khi vi tiêm sgRNA-Keap1a/Cas9 ở giai đoạn 01 tế bào, được xác định hiệu quả vi tiêm knockout bằng phương pháp PCR với cặp mồi keap1a-hma-f1 (5’-TTGTGCCTGTATTTCTTCATGG) và keap1a-hma-r1 (5’- GCCTCTCCATTGAATCTGTGTT), cho kết quả thành công tạo band hetetoduplex (hình 1) ở thế hệ F0 (4 ngày sau khi vi tiêm)
Các dòng cá F0 này được nuôi lớn sau 3-4 tháng đạt giai đoạn thành thục sẽ được cho lai với cá hoang dại Các phôi cá nở sau 4 ngày được sử dụng tiến hành chạy PCR với cặp mồi Keap1a-seq-f1 (5’-TTTCAACAATGCCAACCTGG) và Keap1a-seq-r1 (5’- GCCTCTCCATTGAATCTGTGTT) và kiểm tra các dòng cá được knockout gen keap1a hay không Kết quả hình 2 cho thấy, có 3 dòng kiểm tra knocout gen thành công Dòng 1 (mẫu 2.6 có 9 bp deleted); dòng 2 (mẫu 2.10 9 bp deleted); và dòng 3 (mẫu 2.11 24 bp deleted + 21 bp insert = 3 bp deleted).
Giải trình tự cá knockout gen keap1b
Hình 3.3 Giải trình tự xác định cá ngựa vằn knocout gen keap1b ở thế hệ
F1 Kết quả có 02 dòng được knockout gen keap1a thành công Dòng 1 (mẫu 3 có
4 bp deleted); dòng 2 (mẫu 7 15 bp deleted).
Hình 3.4 cặp mồi nrf2-seq-f5 chạy điện di và cặp mồi nrf2-seq-f1 chạy giải trình tự
Hình 3.5 Kết quả sau khi giải trình tự
Qua kết quả cho thấy, cá ngựa vằn sau khi vi tiêm sgRNA-Keap1b/Cas9 ở giai đoạn 01 tế bào, được xác định hiệu quả vi tiêm knockout bằng phương pháp PCR với cặp mồi keap1b-hma-f1 (5’- GTGTGTATGATGTGTGCGTGTC) và keap1b-hma-r1 (5’-CTCCAGCGTGTAGCTGAAGAC), cho kết quả thành công tạo band hetetoduplex (hình 3) ở thế hệ F0 (4 ngày sau khi vi tiêm)
Các dòng cá F0 này được nuôi lớn sau 3-4 tháng đạt giai đoạn thành thục sẽ được cho lai với cá hoang dại Các phôi cá nở sau 4 ngày được sử dụng tiến hành chạy PCR với cặp mồi Keap1b-seq-f1 (5’-
CGACGTGTGTGTCGAGCG) và kiểm tra các dòng cá được knockout gen keap1a hay không Kết quả hình 4 cho thấy, có 2 dòng kiểm tra knocout gen thành công Dòng 1 (mẫu 3 có 4 bp deleted); dòng 2 (mẫu 7 15 bp deleted).
Các dòng cá F1 này được nuôi lớn và cho sinh sản tạo ra cá F2 Các dòng cá F2 này đang được nuôi sàn lọc tạo các dòng ổn định phục vụ cho thí nghiệm
Tóm lại, chủ nhiệm đề tài đã tạo được các dòng cá knockout gen keap1a và keap1b theo như tiến độ đề tài.
Hình 3.6 Cá F1 được cho lai tạo dòng cá ổn định ở thế hệ hệ F2 knockout gen Nrf2.
Hình 3.7 Giàn cá chuyển gen Nrf2 của Trung tâm Công nghệ sinh học
Thành phố Hồ Chí Minh
Hình 3.8 Cá được chia ra đực, cái rõ ràng
Hình 3.9 Mô tả tóm tắt phương pháp tạo dòng cá knockout gen ổn định đến thế hệ F2 bằng phương pháp CRISPR-Cas9
Kết luận
Đã tạo được 3 dòng cá knockout gen Nrf2 bằng CRISPR-Cas9
5 Kết luận và kiến nghị