LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian dài học tập tại Học viện Quân y, đƣợc sự giúp đỡ của Nhà trƣờng và các Phòng, Ban, Bộ môn của Học viện cũng nhƣ Viện Đào tạo Dƣợc, đến nay em đã hoàn thành chƣơng trình họ.
Trang 1LỜI CẢM ƠN
Sau một thời gian dài học tập tại Học viện Quân y, được sự giúp đỡ của Nhà trường và các Phòng, Ban, Bộ môn của Học viện cũng như Viện Đào tạo Dược, đến nay em đã hoàn thành chương trình học tập Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Đảng ủy - Ban Giám đốc Học viện và Viện Đào tạo Dược, Phòng Đào tạo, Bộ môn Dược lý - Viện Đào tạo Dược đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em thực hiện và hoàn thành khóa luận
Bằng tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn đến PGS TS Nguyễn Hoàng Ngân, người Thầy đã luôn hết lòng quan tâm, động viên giúp đỡ, truyền đạt kiến thức và trực tiếp hướng dẫn em trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy, Cô cùng toàn thể Cán bộ, Nhân viên Viện Đào tạo Dược, đặc biệt là các Thầy, Cô và các anh chị Kỹ thuật viên của Bộ môn Dược lý đã luôn luôn nhiệt tình giúp đỡ, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành khóa luận
Em xin trân trọng cảm ơn các Thầy, Cô trong Hội đồng chấm khóa luận
đã dành nhiều thời gian để cho em những ý kiến quý báu trong quá trình hoàn thiện và bảo vệ khóa luận
Em vô cùng biết ơn sự chăm sóc, động viên của gia đình, những người thân, luôn luôn bên cạnh chia sẻ với em mọi điều trong cuộc sống Em xin trân trọng cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ và tình cảm quý báu của bạn bè đã dành cho em
Hà Nội, ngày 13 tháng 7 năm 2022
Học viên
Lê Thị Mai Hương
Trang 21.1.2 Thành phần có trong viên bao phim Fertil Pro for men 2
1.2 TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ ĐỘC
Trang 3CHƯƠNG 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
2.2.3 Phương pháp xác định các chỉ số nghiên cứu 30
3.1.1 Ảnh hưởng của viên bao phim Fertil Pro for men lên tình trạng
chung và sự thay đổi thể trọng của chuột cống trắng khi dùng dài
3.1.3 Ảnh hưởng của viên bao phim Fertil Pro for men tới một số chỉ
số sinh hóa máu
35
Trang 43.1.4 Ảnh hưởng của viên bao phim Fertil Pro for men lên hình ảnh
đại thể và vi thể một số cơ quan
38
3.2.1 Tình trạng chung và sự thay đổi thể trọng 42
3.2.2 Ảnh hưởng của viên bao phim Fertil Pro for men đến chức
năng tạo máu
3.2.5 Một số công bố khác về độc tính bán trường diễn của các dược liệu
trong viên bao phim Fertil Pro for men
Trang 5DANH MỤC CÁC BẢNG
2.1 Thành phần trong 01 viên bao phim Fertil Pro for men 23
3.1 Trọng lượng cơ thể chuột ở các lô theo thời gian nghiên
3.2 Ảnh hưởng của viên bao phim Fertil Pro for men tới một
3.3 Ảnh hưởng của viên bao phim Fertil Pro for men tới số
3.4 Ảnh hưởng của viên bao phim Fertil Pro for men lên hoạt
3.5 Ảnh hưởng của viên bao phim Fertil Pro for men lên nồng
Trang 6DANH MỤC CÁC HÌNH
2.3 Cho chuột uống thuốc bằng kim cong đầu tù 27
3.1 Ảnh hưởng của viên bao phim đối với thể trọng chuột 38 3.2 Hình ảnh vi thể gan của chuột ở các lô nghiên cứu 39 3.3 Hình ảnh vi thể lách của chuột ở các lô nghiên cứu 40 3.4 Hình ảnh vi thể thận của chuột ở các lô nghiên cứu 40
Trang 7DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
1 ALT Alanin transaminase
2 AST Aspartat transaminase
10 ICH International Conference on Harmonization (Hội nghị
quốc tế về hài hòa hóa các thủ tục đăng ký dược phẩm
sử dụng cho con người)
11 MCV Mean Corpuscular Volume (Thể tích trung bình hồng
cầu)
12 OECD Organisation for Economic Co-operation and
Development (Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế)
13 PLT Platelet Count(Số lượng tiểu cầu)
14 RBC Red Blood Cell (Số lượng hồng cầu)
15 SPSS Statistical Package for the Social Sciences
16 WBC White Blood Cell (Số lượng bạch cầu)
17 WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)
Trang 8ĐẶT VẤN ĐỀ
Xã hội ngày càng phát triển cùng với sự phát triển của Y học hiện đại, nhu cầu chăm sóc sức khỏe của con người ngày càng cao, đặc biệt là nhu cầu chăm sóc sức khỏe sinh sản nói chung và sức khỏe cho nam giới nói riêng
Vô sinh, suy sinh dục là tình trạng bệnh mang tính xã hội Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization, viết tắt WHO) dự báo, hiếm muộn và
vô sinh là căn bệnh nguy hiểm thứ ba của thế kỷ XXI, đứng sau ung thư và các bệnh tim mạch Hiện nay, tình trạng này đang gia tăng và có diễn biến ngày càng phức tạp hơn
Với lịch sử hàng nghìn năm nghiên cứu và phát triển, Y học cổ truyền của Việt Nam đã tìm ra rất nhiều loại cây thuốc có tác dụng trong việc hỗ trợ điều trị, cải thiện vấn đề giúp tăng cường sinh lực ở nam giới Một số đó phải kể đến như: nhục thung dung, ba kích, bá bệnh, nhân sâm, cá ngựa, v.v…
Đã có rất nhiều bài thuốc Y học cổ truyền, có tác dụng bổ thận, tráng dương, cải thiện các vấn đề sinh lý ở nam giới Một trong số đó là bài thuốc
“Bổ thận tăng tinh thang” Từ đó Công ty cổ phần Dược phẩm Phú Tín đã nghiên cứu và bào chế viên bao phim Fertil Pro for men là chế phầm gồm có các dược liệu tự nhiên dựa trên bài thuốc cổ truyền “Bổ thận tăng tinh thang”
có tác dụng tăng cường sinh lực ở nam giới, nhờ sự kết hợp của các loại dược liệu thường có trong bài thuốc dân gian
Để có được cơ sở khoa học về tiêu chuẩn chất lượng và tính an toàn của viên, làm cơ sở cho những nghiên cứu phát triển hiện đại hóa Y học cổ truyền, tạo sản phẩm phục vụ rộng rãi cho cộng đồng Từ đó, em tiến hành
nghiên cứu đề tài “Đánh giá độc tính bán trường diễn của viên bao phim Fertil Pro for men trên động vật thực nghiệm” với mục tiêu sau:
Đánh giá được độc tính bán trường diễn của viên bao phim Fertil Pro for men trên chuột cống trắng
Trang 9CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU
1.1 VIÊN BAO PHIM FERTIL PRO FOR MEN
16g Mỗi viên nén có chứa 1.000 mg cao dược liệu Trong đó:
Ba kích, Sâm cau, Tỏa dương, Tongkat Ali, Lộc nhung: có tác dụng bổ dương
Thục địa, Kỷ tử: có tác dụng dưỡng âm
Nhân sâm: đại bổ nguyên khí
1.1.2 Thành phần có trong viên bao phim Fertil Pro for men
Trang 10Hình 1.1 Cây Tỏa dương
(Nguồn: https://tracuuduoclieu.vn/toa-duong-vt.html/ [1])
- Đặc điểm thực vật: loại cây cỏ trông như một cây nấm, màu đỏ nâu
sẫm, cấu tạo bởi một cán hoa lớn, trên mang hoa dày đặc, có mo bao bọc, màu tím, mùi hôi Cán hoa nạc và mềm, dạng thay đổi, sần sùi, không có lá Hoa đực và hoa cái riêng, cùng gốc hay khác gốc Cụm hoa đực hình trụ dài, 10 -
15 cm, cụm hoa cái hình dầu dài 2 - 3 cm Mùa hoa: tháng 10 - 2 [2]
- Phân bố: thường mọc và sống ký sinh trên những rễ của cây gốc lớn
trong rừng sâu ẩm thấp Thường gặp ở Hà Tây, Lào Cai, Hòa Bình, Yên Bái [2]
- Bộ phận dùng: thân phơi khô của cây
- Thành phần hóa học: 1-hexaco-sanoylglycerol, daucosterol, methyl
gallate, 4-hydroxy-3-methoxycinnamaldehyde, methyl-4 hydroxy cinnamat và methyl caffeate [3]
- Tác dụng:
+ Bổ thận tráng dương, ích thận tinh, nhuận tràng thông tiên [4]
+Trị chứng tảo tiết, liệt dương [5]
Trang 111.1.2.2 Sâm cau
- Tên gọi khác: Ngải cau, Tiên mao
- Tên khoa học: Curculigo orchioides Gaertn Họ: Hypoxidaceae (Sâm cau)
Hình 1.2 Cây Sâm cau
- Phân bố: mọc phổ biến ở nhiều tỉnh miền Bắc nước ta Còn thấy mọc
cả ở Campuchia, Ấn Độ, Malaixia, Thái Lan, Trung Quốc và Philipin
- Bộ phận dùng: thân rễ đã phơi hay sấy khô (Rhizoma Curculiginis)
- Thành phần hóa học: thân rễ chứa các chất thuộc nhóm cycloartan triterpenic, phenolic glycosides, tanin, sitosterol, stigmasterol và các hợp chất flavonoid [6]
Trang 12- Tác dụng dược lý:
+ Khi bổ sung cao sâm cau liều lƣợng 50 mg/ngày tổng số tinh trùng tiến thẳng tăng hơn rõ rệt khi không bổ sung cao sâm cau, nâng cao chất lƣợng tinh dịch, tinh trùng [7]
+ Sâm cau giúp tăng gấp đôi trọng lƣợng tinh hoàn của chuột đực, tăng lực, kích thích trao đổi chất [8]
1.1.2.3 Ba kích
- Tên gọi khác: Ba kích, Ruột gà
- Tên khoa học: Morinda officinalis How, họ Cà phê (Rubiaceae).
Hình 1.3 Ba kích
(Nguồn : https://tracuuduoclieu.vn/ba-kich.html [1])
- Đặc điểm thực vật: dây leo nhỏ, sống lâu năm, ngọn dây non có màu
tím, cành non có cạnh Lá mọc đối hình mác, lá kèm bé Hoa tập trung ở đầu cành thành tán nhỏ, hoa lúc non màu trắng sau hơi vàng Đài 2 - 10 nhỏ, còn lại ở quả, ống tràng ngắn Nhị 4, đính trong họng tràng Quả khi chín màu đỏ mang đài còn lại ở đỉnh [9]
Trang 13- Phân bố: cây mọc hoang và được trồng ở một số vùng đồi núi nước ta
- Bộ phận dùng: rễ phơi hay sấy khô của cây Ba kích (Radix
Morindae)
- Thành phần hóa học: gồm các dẫn chất anthranoid, terpenoid và
steroid tự do, các oligosaccharid và acid amin Nhiều anthraquinon đã phân lập từ ba kích như: rubiadin, 1-hydroxyanthraquinone, physcion
+ Các terpenoid bao gồm asperulosid tetraacetat, monotropein, morindolid và morofficinalosid
+ Steroid tự do có sitosterol, 24-ethylcholesterol
+ Trong ba kích còn có các oligosaccharid kiểu inulin là hexasaccharid
+ Ba kích có tác dụng trên trục dưới đồi - tuyến yên - tuyến thượng thận, tuyến sinh dục [12]
1.1.2.4 Kỷ tử
- Tên gọi khác: Câu khởi, Khởi tử, Địa cốt tử, Khủ khởi
-Tên khoa học: Lycium barbarum (L.), họ Cà (Solanaceae)
Trang 14Hình 1.4 Cây Kỷ tử
(Nguồn: https://tracuuduoclieu.vn/cay-ky-tu-vt.html [1])
- Đặc điểm thực vật: cây kỷ tử là một loại cây nhỏ, cao 0,5 - 1,5 m
cành nhỏ, thỉnh thoảng có gai ngắn mọc ở kẽ lá, dài 5 cm Lá mọc so le một
số mọc vòng tại một điểm Cuống lá ngắn 2 - 6 mm Phiến lá hình mác, đầu lá
và phía cuống lá đều hẹp, hơi nhọn, dài 2 - 6 cm, rộng 0,6 - 2,5 cm, mép lá nguyên Hoa nhỏ mọc đơn độc ở kẽ lá hoặc có một số hoa mọc tụ lại Cánh hoa màu tím đỏ Quả mọng hình trứng dài 0,5 - 2 cm đường kính 4 - 8 mm Khi chín có màu đỏ sẫm hoặc vàng đỏ Hạt nhiều, hình thận, dẹt, dài 2 - 2,5
- Phân bố: có nhiều ở Trung Quốc nước ta còn phải nhập, có ở các tỉnh biên giới Việt Nam như Quảng Đông, Quảng Tây, Vân Nam [2]
- Bộ phận dùng: quả chín phơi hay sấy khô của cây (Fructus Lycii).
-Thành phần hóa học: polysaccharid, carotenoid (zeaxanthin,
zeaxanthin dipalmitat, β-caroten), flavonoid (rutin, hyperosid, quercetin, và morin), phenolic acid (gallic, caffeic, protocatechuic acid, chlorogenic và neochlorogenic acid), các sterol (cycloartenol, cycloartanol, gramisterol) [13]
Trang 15+ Các polysaccharid trong kỷ tử còn được chứng minh là có tác dụng làm tăng trọng lượng tinh hoàn và mào tinh, tăng nồng độ hormon sinh dục trong các tinh hoàn chuột cống bị tổn thương Bên cạnh đó, các polysaccharid có tác dụng cải thiện chức năng sinh sản ở chuột cống đực thiến bán phần, tăng nồng độ hormon sinh dục và cải thiện số lượng và chất lượng tinh trùng [16]
1.1.2.5 Thục địa
- Tên khác: Thục địa hoàng, Địa hoàng than, Sinh địa
- Tên khoa học: Radix Rehmaniae glutinosae praeperata
Là rễ củ đã qua chế biến của cây Địa hoàng hay Sinh địa (Rhemannnia
glutinosa (Gaertn.) Libosch.), họ Hoa Mõm chó (Scrophulariaceae)
Hình 1.5 Thục địa
(Nguồn: https://tracuuduoclieu.vn/thuc-dia-hoang-vt.html/ [1])
Trang 16- Đặc điểm thực vật: cây thảo, cao 10 - 30 cm Toàn cây có lông mềm
Lá dày, phiến lá hình trứng ngược dài 3 - 15 cm, rộng 1,5 - 6 cm, mép lá có răng cưa không đều, mặt dưới có gân nổi rõ Lá mọc vòng ở gốc Hoa màu tím sẫm, mọc thành chùm ở ngọn Thân rễ mẫm thành củ, lúc đầu mọc thẳng sau mọc ngang [9]
- Phân bố: phân bố nhiều ở các vùng giáp danh giữa Trung Quốc và Việt Nam, như các tỉnh Lào Cai, Cao Bằng
- Thành phần hóa học:
Các iridoid, monoterpen và glycosid (catalpol, dihydrocatalpol, danmelittosid, acetylcatalpol, aucubin, rehmanniosid A, B, C, D, ajugol, acteosid, isoacteosid…), monosaccharid (glucose, galactose và fructose), oligosaccharid (mannitol và sucrose, raffinose, mannotriose, stachyose và verbascose), Rehmannia glutinosa polysaccharid, các acid amin và vi khoáng (arginin, alanin, sắt, kẽm…) [17]
ức chế AR của các hoạt chất trên nên Sinh địa có tác dụng cải thiện trong các
trường hợp biến chứng của bệnh tiểu đưòng liên quan đến thận, thần kinh, võng mạc, đục thủy tinh thể [9]
+ Thục địa là thuốc bổ chữa suy nhược cơ thể Thục địa dùng trong các trường hợp tim đập nhanh, rối loạn kinh nguyệt, rong kinh, chóng mặt, ù tai, tóc râu bạc sớm [9]
1.1.2.6 Bá bệnh
- Tên gọi khác: Mật nhân, Bách bệnh
- Tên khoa học: Eurycoma longifolia Jack, họ Thanh thất
(Simaroubaceae)
Trang 17Hình 1.6 Cây Tongkat Ali
(Nguồn: https://tracuuduoclieu.vn/bach-benh.html [1])
- Đặc điểm thực vật: cây nhỏ có cành Lá kép lông chim lẻ gồm 10 - 36
đôi lá chét, hầu như không có cuống, hình trứng dài, dày, nhẵn hoặc có lông ở mặt dưới Hoa và bao hoa phủ đầy lông Quả hạch màu đỏ, nhắn, hơi thuôn dài, đầu tù và cong, mặt trong có lông thưa và ngắn Một hạt, trên mặt hạt có nhiều lông ngắn [2]
- Phân bố: cây mọc phổ biến khắp nước ta, nhiều nhất ở miền trung [2].
- Bộ phận dùng: rễ, phơi hoặc sấy khô (Radix Eurycomae longifoliae).
- Thành phần hóa học: các quassinoid, β-carboline alkaloid,
canthin-6-one alkaloid, dẫn xuất squalene, và eurycolactcanthin-6-one, eurycomalactcanthin-6-one, laurycolactone, biphenyl neolignan [18]
- Tác dụng dược lý:
+ Các chiết xuất tan trong nước của cây bá bệnh có khả năng tăng cường chức năng sinh sản ở nam giới (làm tăng thể tích tinh dịch, tăng số lượng và khả năng di động của tinh trùng) trên các nghiên cứu thực nghiệm ở các loài gặm nhấm và trên các thử nghiệm lâm sàng trên người [19]
+ Dịch chiết từ rễ bách bệnh có khả năng ảnh hưởng đến hoạt động của vùng dưới đồi - tuyến yên, cụ thể hơn là làm tăng số lượng và hoạt động của
Trang 18các tế bào ưa bazơ chịu trách nhiệm sẩn xuất LH ở thùy trước tuyến yên, kích thích tế bào Leydig tăng sản xuất androgen, dehydroepiandrosteron và testosteron, kích thích sản sinh tinh trùng tại tinh hoàn [20]
1.1.2.7 Nhân sâm
- Tên gọi khác: Sâm cao ly, Sâm triều tiên
- Tên khoa học: Panax ginseng C A Mey, họ Ngũ gia bì (Araliaceae)
Hình 1.7 Nhân Sâm
(Nguồn:https://tracuuduoclieu.vn/nhan-sam-vt.html [1])
- Đặc điểm thực vật: cây nhỏ, cao 30 - 50 cm có thể sống trên 50 năm
Cây mang ở ngọn một vòng 4 - 5 lá Cuống lá dài Lá kép chân vịt Lá lúc đầu
có 3 lá chét về sau có 5 lá chét; hai lá chét ngoài nhỏ hơn các lá chét ở giữa Mép lá có răng cưa Hoa đều 5 cánh, lá đài 5 răng, 5 nhị Bầu hạ, 2 ô Quả hạch, màu đỏ gần hình cầu Rễ củ thường phân thành nhiều nhánh trông như hình ngưòi nên có tên là Nhân sâm Đôi khi có những củ sâm có kích thước rất lớn nặng đến 300 - 400 g [9]
- Phân bố: mọc hoang và được trồng ở Triều Tiên, đông bắc Trung
Quốc, Liên Xô cũ Ở nước ta có phát hiện một số loài thuộc chi Panax mọc hoang ở Sapa, Kon Tum và Quảng Nam
Trang 19- Bộ phận dùng: rễ cây nhân sâm (Radix Ginseng)
- Thành phần hóa học: thành phần chính trong Nhân sâm là các saponin
triterpenoid nhóm dammaran gọi chung là ginsenosid Saponin được xem là quan trọng nhất trong Nhân sâm Các thành phần khác: tinh dầu chiếm 0,05% - 0,25%, các hợp chất polyacetylen, vitamin Bl, B2, các phytosterol 0,029%, các hợp chất đường đơn, oligosid và các glycan, các peptidoglycan [9]
- Tác dụng dược lý:
+ Nhân sâm có tác dụng tăng cường khả năng giao phối, kích thích sự sinh tinh, tăng cường khả năng hoạt động và thời gian sống của tinh trùng ở ngoài cơ thể chuột và thỏ [10]
+ Nhân sâm kích thích tuyến thượng thận tiết ra hormon sinh dục… [21] + Nhân sâm làm tăng thời gian giao cấu và hành vi tình dục ở chuột [2]
1.1.2.8 Lộc nhung
- Tên khác: Nhung hươu, Nhung nai
- Tên khoa học: Cornu Cervi Pantotrichum
Sừng non của Hươu sao đực (Cervus nippon Temminck) hoặc nai (Cervus unicolor), họ Hươu (Cervidae)
Hình 1.8 Lộc nhung
(Nguồn:https://tracuuduoclieu.vn/loc-nhung-nhung-huou-vt.html/ [1])
Trang 20- Đặc điểm: Lộc nhung là một trong 4 vị thuốc bổ đứng đầu Đông y
(sâm, nhung, quế, phụ), mặt ngoài phủ đầy lông tơ màu nâu nhạt và mịn như
nhung, trong có nhiều mạch máu rất mọng
+ Huyết nhung: là loại nhung quý nhất: nhung ngắn, mềm, mọng máu, chưa phân nhánh
+ Nhung yên ngựa: là sừng non bắt đầu phân nhánh nhưng còn ngăn, chỗ phân nhánh bên dài bên ngắn như yên ngựa Loại này cũng rất quý vì cho rằng nhung đã phát triển mà chưa thành sừng Nếu đợi ít nữa, 1 phần thành sừng thì kém giá trị [2]
- Thành phần hóa học: canxi phosphat, canxi carbonat, protid, chất keo
và các acid amin, các chất khoáng và nguyên tố vi lượng, các hợp chất phospholipid, các nội tiết tố, estron, progesterol, cortisol… [9]
- Tác dụng dược lý:
+ Dùng trong mọi trường hợp hư tổn trong cơ thể, nam giới hư hao, tinh kém, hoa mắt, hoạt tinh [2]
1.2 TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN
1.2.1 Mục tiêu
Thử độc tính dài ngày chỉ được tiến hành sau khi đã có thông tin về độc tính cấp trên động vật và mẫu thử được dự định sử dụng hoặc tiếp xúc dài ngày trên người
Thử độc tính dài ngày nhằm xác định khả năng dung nạp của động vật thí nghiệm khi dùng mẫu thử nhiều lần Thông tin cần xác định có những biểu hiện độc tính sau khi dùng dài ngày, bao gồm:
- Mức liều không hoặc có gây thay đổi đáng kể tới chức năng, cơ quan hoặc một số biểu hiện sống có thể quan sát được trên động vật thí nghiệm
- Những độc tính có thể quan sát được trên động vật và khả năng hồi phục nếu có [22]
Trang 211.2.2 Lựa chọn mô hình thử
Theo quy định của Bộ Y tế về hướng dẫn thử nghiệm lâm sàng thuốc
cổ truyền, thuốc từ dược liệu, căn cứ vào các thông tin của mẫu thử và kết quả thử độc tính cấp để thiết kế mô hình, mức liều thử
- Trường hợp mẫu thử không thể hiện độc tính cấp hoặc rất ít độc, có thể thử trên 1 loài động vật (gặm nhấm)
- Trường hợp mẫu thử thể hiện độc tính cấp cao, liều gây độc gần với liều có tác dụng dược lý, cần thiết thử trên 2 loài động vật (gặm nhấm và không gặm nhấm) [22]
1.2.3 Thời gian thử
Thời gian thử trên động vật được tính dựa theo thời gian dự kiến dùng trên người hoặc có thể thử với các khoảng thời gian xác định Ngoài ra, thời gian thử còn phụ thuộc vào đích của thử nghiệm là cung cấp thông tin cho thử lâm sàng giai đoạn nào Khi cần thông tin cho thử lâm sàng giai đoạn 1 hoặc
2, thời gian có thể ngắn hơn (14 - 28 ngày), khi cần cung cấp thông tin cho thử lâm sàng giai đoạn 3, thời gian thử cần dài hơn (28 - 90 ngày) Hiện nay, tài liệu hướng dẫn của các nước tham gia hòa hợp ICH (International Conference on Harmonization - Hội nghị quốc tế về hài hòa hóa các thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho con người) giới thiệu tính thời gian thử độc tính theo 2 cách:
- Thời gian thử thuốc bằng 3 - 4 lần thời gian dự kiến dùng trên người
- Thời gian thử theo từng khoảng xác định: 14 ngày, 28 hoặc 90 ngày Lựa chọn từng khoảng thời gian thử tùy theo yêu cầu từng mẫu và điều kiện thử nghiệm
Đánh giá mức độ độc sẽ được xem xét trên báo cáo kết quả tương ứng với từng khoảng thời gian đã thử [23]
1.2.4 Liều dùng
Mức liều thử phải được lựa chọn sao cho có ý nghĩa trong việc đánh giá
về khả năng an toàn hay mức độ gây độc của mẫu thử khi dùng nhiều ngày
Trang 22trên động vật Mức liều thử thường được tính từ các thông tin thu được từ thử độc tính cấp và được quy đổi tương đương theo liều giữa các loài nếu thử trên loài khác nhau Với những nghiên cứu đầy đủ, thử nghiệm được thiết kế với 3 mức liều (tương đương 3 nhóm thử):
- Liều thấp: mức liều đủ để mẫu thử có tác dụng dược lý hoặc điều trị (tức là tương đương mức liều dự kiến dùng để điều trị cho người)
- Liều trung bình: mức liều có thể không gây những độc tính quan sát được hoặc gây ảnh hưởng không đáng kể
- Liều cao: mức liều dự kiến sẽ quan sát được biểu hiện ngộ độc trên cơ quan của động vật thí nghiệm hoặc đến mức thể tích giới hạn cao nhất mà động vật thí nghiệm có thể dùng được [22,24]
Thử nghiệm nên được tiến hành song song với 1 nhóm chứng trong cùng điều kiện với cùng số lượng động vật đã dùng trong nhóm thử Tuy nhiên, trong thời điểm hiện tại phần lớn các nghiên cứu có thể chấp nhận với
1 nhóm chứng và 2 nhóm thử (liều thấp và liều cao) [22]
Cho động vật dùng thuốc hàng ngày, 7 ngày/tuần, trừ khi có chế độ liều đặc biệt
Số động vật trên mỗi nhóm tùy theo loài 8 - 10 con (gặm nhấm), hoặc
2 - 4 con (không gặm nhấm) Việc dùng các động vật không gặm nhấm thường rất tốn kém, đặc biệt là các loài linh trưởng Khi cần thử nghiệm trên động vật không gặm nhấm, đề cương cần được xem xét bởi hội đồng khoa học hoặc khi có yêu cầu của cơ quan quản lý hoặc nhà sản xuất [22]
1.2.5 Đường dùng thuốc
- Độc tính trên động vật thí nghiệm thường được thử theo đường dự kiến dùng cho người hoặc đường mà mẫu nghiên cứu có thể tiếp xúc và gây ảnh hưởng cho người [22]
- Với các chất có thể tiếp xúc và gây ảnh hưởng cho người theo nhiều đường dùng (miệng, hô hấp, ngoài da), việc thử độc tính cần được tiến hành trên các đường dùng tương tự Liều thử trên động vật cần được tính theo cân nặng tương ứng với từng loại thử nghiệm [22]
Trang 23- Thử theo đường uống: cho động vật dùng theo một số cách sau:
+ Đưa thẳng vào dạ dày bằng kim cho uống đầu tù hoặc các loại sonde
y tế có kích thước thích hợp
+ Đưa thuốc qua một dụng cụ thích hợp vào miệng để động vật tự nuốt:
áp dụng với các loại động vật lớn (chó, khỉ) khi cho uống các các mẫu thử dạng rắn (thuốc viên)
+ Khi cho uống, thể tích dịch mẫu thử và chất lỏng cho uống kèm theo được dùng không nên vượt quá sức chứa của dạ dày và nên đồng đều giữa các động vật thí nghiệm (tính theo cân nặng) Thông thường, thể tích chuột nhắt uống là 0,2 mL/10 g/lần; chuột cống 2 mL/100 g/lần; chó, khỉ 5 mL/kg Một
số trường hợp có thể phải thử với thể tích lớn hơn bình thường, nhưng không được quá thể tích cho uống tối đa quy định
+ Thử theo đường tiêm: có thể đưa thuốc qua các đường tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch, phúc mạc hoặc dưới da, tùy theo đường dùng dự kiến trên người Khi tiêm tĩnh mạch với thể tích lớn, nên làm ấm dịch thử trên khoảng 37o
C trước khi tiêm để đảm bảo động vật không bị quá lạnh trước khi tiêm thuốc Dụng cụ tiêm phải đảm bảo vô khuẩn, không dùng chung kim tiêm cho các động vật thí nghiệm khác nhau Khi cần thử ở mức liều cao, có thể tiêm thuốc
ở nhiều vị trí [22]
1.2.6 Theo dõi, đánh giá
Quan sát trên tất cả các động vật thí nghiệm đã dùng trong thử nghiệm, ghi chép các thông số quan sát được của từng động vật thí nghiệm khi xem xét
- Chỉ tiêu quan sát: theo dõi hàng ngày về tình trạng sức khỏe, khả năng tiêu thụ thức ăn, nước uống, tình trạng phân, nước tiểu của động vật thí nghiệm
- Trọng lượng: xác định trọng lượng khi bắt đầu, hàng tuần và kết thúc thí nghiệm
Trang 24- Xét nghiệm các chỉ số huyết học và sinh hóa nên thực hiện vào cuối
kỳ khi kết thúc thí nghiệm Một số trường hợp cần thiết thì xét nghiệm để so sánh trước và sau thí nghiệm
+ Huyết học: số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, hematocrit, hemoglobin
+ Sinh hóa: ALT (alanin transaminase), AST (aspartat transaminase), creatinin, protein toàn phần, glucose huyết…
+ Có thể xét nghiệm thêm một số chỉ số khác nếu cần như nồng độ kali, natri trong máu, gamma glutamyl transpeptidase, các enzym gan khác, chức năng các tuyến… tùy theo khả năng gây độc của mẫu thử
- Quan sát và mô tả các biểu hiện bất thường của động vật thí nghiệm, đặc biệt liên quan tới các chức năng hô hấp, tuần hoàn, tiêu hóa, (nhịp thở, nhịp tim, tình trạng nôn mửa, ỉa chảy, sủi bọt mép); trên thần kinh, vận động như hành vi, cử động, đi lại, co giật; phản xạ của các giác quan như nhắm mắt, mũi của con vật Cần có những quan sát đánh giá để phân biệt các triệu chứng ngộ độc với những biểu hiện do tác dụng dược lý của thuốc (an thần, gây ngủ, hạ huyết áp…)
- Phân tích mô bệnh học: mổ những con vật chết trong quá trình nghiên cứu và những con còn sống khi kết thúc thí nghiệm để quan sát đại thể các tổ chức, ưu tiên các tổ chức gan, thận Quan sát, đánh giá các biểu hiện về màu sắc, hình dạng của các tổ chức Nếu thấy biểu hiện khác thường so với nhóm chứng, cần quan sát trên vi thể để kiểm tra các biến đổi trên mô học Đánh giá những biến đổi trên mô học phải được thực hiện ở các phòng thí nghiệm chuyên ngành có kinh nghiệm
- Khi cần theo dõi khả năng hồi phục, phải bổ sung số động vật thí nghiệm muốn giữ lại để theo dõi (sau khi hết thời gian dùng thuốc) Với cơ quan đã thấy bị tổn thương ở nhóm thử, cần xét nghiệm mô bệnh học trên cơ quan đó ở nhóm phụ để đánh giá khả năng hồi phục được rõ hơn
- Đánh giá: với các giá trị xác định được biểu thị bằng số, lập bảng tóm tắt các kết quả của cả nhóm và tính thống kê giá trị trung bình So sánh kết
Trang 25quả của nhóm thử so với nhóm chứng theo thống kê (Test 1- student), hoặc phương pháp thích hợp với các chi tiết không biểu thị bằng số [22,24]
1.2.7 Một số chỉ số nghiên cứu
1.2.7.1 Các chỉ số huyết học
Máu là một thành phần tổ chức của cơ thể, lưu thông trong mạch máu, thực hiện nhiều chức năng sinh lý quan trọng:
- Vận chuyển chất dinh dưỡng tới mô
- Chuyển chất cặn bã từ các mô tới cơ quan bài tiết
- Đóng vai trò quan trọng trong quá trình hô hấp, đưa oxy từ phổi đến các tế bào rồi lấy carbonic từ tế bào đến phổi để thải ra ngoài
- Duy trì thăng bằng acid - base
- Điều hòa thăng bằng nước
- Điều hòa thân nhiệt
- Tham gia vào các quá trình bảo vệ cơ thể nhờ bạch cầu và kháng thể
- Tham gia vào cơ chế điều hòa các chức phận cơ thể [25]
* Hồng cầu
Chứa 57 - 68% là nước, 32 - 43% là chất khô Trong chất khô chủ yếu
có các thành phần như hemoglobin, lipid, glucid, sắt…
Chức năng chính của hồng cầu là hô hấp: vận chuyển O2, CO2 Ngoài
ra, hồng cầu còn tham gia quá trình điều hòa thăng bằng acid - base, trao đổi muối nước, khử độc H2O2 và nhiều quá trình khác
Hồng cầu sống được khoảng 120 - 130 ngày rồi bị phá hủy ở lách, gan, tủy xương… Diện tích bề mặt hồng cầu trong 1 lít máu là 500 m2, trong toàn
Trang 26Hb gồm 2 thành phần là hem - sắc tố màu đỏ và globin gồm nhiều acid amin liên kết với nhau tạo thành chuỗi polypeptid, chiếm khoảng 95% các chất hữu cơ hoặc 34 - 40% khối lƣợng hồng cầu Nồng độ Hb trong máu phụ thuộc vào số lƣợng hồng cầu và nồng độ Hb của hồng cầu
Hb không bị biến đổi trong thời gian hồng cầu sống 120 ngày Hồng cầu chết thì huyết sắc tố bị phá hủy và giải phóng [25,26]
* Hematocrit
Còn đƣợc gọi là chỉ số dung tích hồng cầu thể hiện tỷ lệ thể tích các tế bào máu (chủ yếu là hồng cầu) chiếm trong máu Đây là chỉ số dùng kiểm tra các tình trạng nhƣ thiếu máu [25]
* Bạch cầu
Khác với hồng cầu, bạch cầu có nhân, ty thể, có nồng độ acid nucleic cao, có quá trình phosphoryl oxy hóa Bạch cầu có 3 loại: tế bào lympho (26%), tế bào mono (7%), bạch cầu đa nhân - bạch cầu hạt (70%) Chức năng chính của bạch cầu là bảo vệ cơ thể
- Tế bào mono và tế bào bạch cầu đa nhân là các loại bạch cầu thực bào Chúng rất giàu enzym phân hủy, đặc biệt là các Protease của lysosom Chúng bắt giữ và tiêu hủy vi khuẩn và các chất lạ lọt vào cơ thể
- Các bạch cầu lympho có vai trò đặc biệt trong đáp ứng miễn dịch của
Trang 27Tiểu cầu chỉ sống 3 - 5 ngày Khi già bị tiêu huỷ ở gan và lách Tiểu cầu giữ vai trò quan trọng trong quá trình đông máu Khi bị thương máu chảy
ra, tiểu cầu chạm vào vết thương, vỡ ra giải phóng serotonin và thrombokinase xúc tiến sự đông máu [26]
1.2.7.2 Các chỉ số sinh hóa
* AST, ALT
AST và ALT là 2 enzym gan xúc tác cho các phản ứng:
Glutamat + Oxaloacetat ↔ .cetoglutarat + Aspartat Glutamat + Pyruvat ↔ .cetoglutarat + Alanin AST được phân bố rộng rãi trong các mô của cơ thể, có nhiều ở gan, tim, cơ xương ALT có mặt trước hết ở gan và ít hơn ở thận, cơ xương
Bình thường hoạt độ AST, ALT thấp Khi tế bào hoặc màng tế bào gan bị tổn thương, hoạt độ AST và ALT huyết thanh tăng cao Tùy theo hoạt
độ của transaminase ta có thể đánh giá được mức độ và diện tổn thương của
tế bào gan [25]
* Creatinin
Là sản phẩm đào thải của thoái hóa creatinin phosphat ở cơ và được lọc hoàn toàn qua thận Nồng độ creatinin huyết tương là chỉ số về chức năng thận nhạy hơn nồng độ ure Nồng độ creatinin phụ thuộc chủ yếu vào khối lượng cơ và hầu như không phụ thuộc vào chế độ ăn protein Tuy nhiên khối lượng cơ tương đối hằng định do đó nồng độ creatinin huyết tương chỉ phụ thuộc vào độ lọc của tiểu cầu thận Giá trị tăng rõ chứng tỏ có suy thận nặng, ngược lại, creatinin bài tiết trong nước tiểu giảm [25]
* Bilirubin toàn phần
Bilirubin (sắc tố mật) có nguồn gốc chủ yếu từ quá trình phá hủy các hồng cầu và một mức ít từ các cytochrome và myoglobin Bilirubin toàn phần trong huyết thanh gồm bilirubin gián tiếp (hay là bilirubin không lên hợp) và bilirubin trực tiếp (bilirubin liên hợp) Trước khi tới gan bilirubin ở dạng bilirubin gián tiếp, khi tới gan chúng sẽ kết hợp với một chất nhất định
Trang 28tạo thành dạng hòa tan là bilirubin trực tiếp Xét nghiệm chỉ số bilirubin toàn phần nhằm đánh giá chức năng gan, mật và chức năng tạo máu của cơ thể [25]
* Cholesterol toàn phần
Cholesterol là một chất béo steroid, có ở màng tế bào của tất cả các
mô trong cơ thể và được vận chuyển trong huyết tương Nhiều mô (nhất là gan và ruột) tổng hợp cholesterol từ acetyl CoA Chức năng chính của cholesterol là được cơ thể sử dụng để sản xuất muối mật và một số hormone steroid Xét nghiệm cholesterol toàn phần trong máu giúp đánh giá một phần chức năng chuyển hóa lipid của gan [25]
1.2.7.3 Các mô tạng
* Gan
Gan là tạng lớn nhất trong cơ quan tiêu hóa và cũng là một cơ quan quan trọng trong cơ thể
Bề mặt gan đồng nhất, với một màu nâu trơn bóng khi vừa lấy ra khỏi
cơ thể sống Gan có 2 mặt là mặt hoành lồi và mặt tạng phẳng với 4 thùy là thùy phải, thùy trái, thùy đuôi và thùy vuông
Gan được phân chia thành các đơn vị cấu trúc gọi là tiểu thùy, mỗi tiểu thùy là một khối nhu mô được vây quanh bởi mô liên kết Gan được duy trì tại chỗ trong khoang bụng bằng tĩnh mạch chủ dưới cùng các tĩnh mạch gan, dây chằng hoành - gan, dây chằng vành và dây chằng liềm [27]
Gan đóng vai trò trung tâm trong tất cả các quá trình chuyển hoá của
cơ thể:
- Chức năng tuần hoàn: chuyển máu từ hệ thống tĩnh mạch cửa sang
hệ thống tuần hoàn chung, dự trữ máu
- Chức năng bài tiết: bài tiết mật xuống ruột
- Chức năng chuyển hóa các chất: chuyển hóa protein, glucid, lipid, vitamin, sắt
- Chức năng bảo vệ và khử độc: khử các chất độc do cơ thể sinh ra
và các chất độc từ ngoài vào
Trang 29- Chức năng huyết học: tạo máu ở thời kỳ bào thai, sản xuất các yếu
Trang 30CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
*Liều dùng: Mỗi viên nén bao phim có khối lượng trung bình 1300
mg/viên, có chứa 1000 mg cao dược liệu Theo tính toán hàm lượng dược chất từ bài thuốc được đưa vào trong mỗi viên thuốc thành phẩm, ước tính liều sử dụng trên người là 2 viên/người/ngày Theo quy ước tính liều, cân nặng của người lấy là 50 kg, ta tính được liều dùng ước tính trên người là
2000 mg/50kg/ngày hay 40 mg/kg/ngày Quy đổi liều tương đương từ người sang động vật, ta có liều trên chuột nhắt là 480 mg/kg/ngày, liều trên chuột cống là 280 mg/kg/ngày, liều trên thỏ là 160 mg/kg/ngày [28]