Trước tình hình đó hiện nay ở nước ta đã và đang có rất nhiều tổ chức, cơ quan, cá nhân trồng cây Dó bầu đại trà, nhằm mục đích cải thiện kinh tế, phủ xanh đất trống đồi trọc, góp phần x
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
Giới thiệu về cây Trầm hương (Aquilaria crassna)
Cây Trầm hương (Dó bầu) thuộc:
Họ (Family): Thymelaeaceae Chi Aquilaria có tất cả 24 loài (Species) khác nhau
Trong năm 2005, Tiến sĩ Lê Công Kiệt (Việt Nam) và tiến sĩ Paul Kessler (Hà Lan) đã phát hiện loài thứ 25 ở cao nguyên Trung Bộ, với tên khoa học là , mở ra hiểu biết mới về đa dạng sinh học và hệ sinh thái của khu vực này.
Cây Dó bầu thuộc loài Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte
Aquilaria thuộc họ thực vật hạt kín Thymelaeaceae và là loài đặc hữu của khu vực Indomalaya Hiện nay có 21 loài Aquilaria được ghi nhận, trong đó 13 loài được công nhận là loài sản xuất trầm hương Trầm hương (gaharu ở Đông Nam Á, oud ở Trung Đông, chen xiang ở Trung Quốc, jinkoh ở Nhật Bản và agar ở Ấn Độ) là một loại gỗ nhựa thơm có giá trị cao Ở Việt Nam, cách gọi tên tiếng Việt cho từng loài rất khác nhau giữa các địa phương Ở đảo Phú Quốc, cây Dó được phân thành hai loài: Dó nghệ với gỗ màu vàng nhạt và cứng tương đối, và Dó bầu với gỗ màu trắng và mềm Ở miền Trung, người ta chia cây Dó thành bốn loài: Dó bầu hương, Dó me, Dó dây và Dó bầu thường Ngoài ra, ở một số địa phương khác người ta còn phân loại Dó theo các hệ thống riêng.
Dó gồm các loài như Dó bầu, Dó niệt, Dó me, Dó gạch; tuy nhiên, với cách phân chia được nêu ở trên, việc xác định tên khoa học của từng loài gặp nhiều khó khăn [1][2].
Ở Việt Nam hiện nay, mặc dù việc phân loại và đặt tên còn nhiều bất đồng và chưa có chuẩn khoa học đồng bộ, cây Dó bầu (Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte) được nông dân ưa chuộng và nhân giống rộng rãi nhờ khả năng cho Trầm nhiều và chất lượng Trầm tốt nhất.
Dó bầu có tên gọi khác dựa vào các sản phẩm của chúng như cây Tóc, Trầm, Trầm hương, Kì Nam Theo Nguyễn Hiền và Võ Văn Chi (1991), Dó bầu chính thức được đặt tên khoa học và công bố dựa trên mẫu vật do nhà thực vật học người Pháp Pierre thu nhập tại Phú Quốc (Việt Nam) và núi Aral tỉnh Samrongtong (Campuchia) vào tháng 5 năm 1870 Pierre đã dựa vào tên Campuchia là Karasna để đặt cho cây Dó bầu Aquilaria crassna, nhưng đây chỉ là tên trần chưa có bảng mô tả và việc công bố chưa được chính thức hóa Sau đó Henri Lecomte trong bộ sách Thực Vật Chí Đông Dương lần đầu mô tả các loài thuộc chi Aquilaria ở Đông Dương và công bố chính thức trong thực vật học của Pháp năm 1914 và xếp chi này vào họ Trầm Phạm Hoàng Hổ (1992) trong công trình gần đây nhất xác nhận ở Việt Nam chi Aquilaria.
Aquilaria thuộc họ Trầm hương có ba loài được định danh là:
+ Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte: Dó bầu, Trầm; ghi nhận ở Phú
Khánh, Bảo Lộc và Phú Quốc
+ Aquilaria baillonii Pierre ex Lecomte: Dó baillon; ghi nhận ở rừng dầy ẩm Bình Trị Thiên, Quảng Nam, Đà Nẵng
+ Aquilaria banaensae Phạm Hoàng: Dó Bà Na; ghi nhận ở rừng dầy ẩm Quảng Nam, Đà Nẵng
Gần đây, tiến sĩ Lê Công Kiệt (Việt Nam) và tiến sĩ Paul Kessler (Hà Lan) đã phát hiện loài thứ tư tại cao nguyên Trung Bộ trong năm 2005, có tên khoa học là Aquilaria rugosa L.C.Kiet & PJ.A Kessler [3].
Các tác giả khác như GS Lê Văn Kí (1993), các tác giả trong quyển “Cây
Các nguồn tài liệu của Việt Nam như Gỗ Rừng Việt Nam Tập IV (1991); Phân Loại Thực Vật (Nxb Giáo dục, 1972) và Danh Mục Thực Vật Tây Nguyên của đoàn điều tra thực vật (1984) đều ghi nhận cây Dó bầu với tên khoa học Aquilaria agallocha Roxd; Tuy nhiên, theo Vũ Văn Chiên (1976) trong Tóm tắt đặc điểm họ cây thuốc thì Aquilaria agallocha Roxd chỉ có ở Ấn Độ và không có ở Việt Nam, không ghi nhận trong Thực Vật Chí Đông Dương của Henri Lecomte; Một số công trình nghiên cứu khác.
“Định danh Dược thảo và Dược liệu Đông y” của đoàn Dược sĩ Việt Nam và
“Những cây thuốc vị thuốc Việt Nam” lại cho rằng Aquilaria agallocha Roxd là đồng danh của Aquilaria crassna Pierre [1]
1.1.2 Sự phân bố cây Trầm hương trong tự nhiên
Trong tự nhiên, cây Trầm hương thuộc giống Aquilaria có phạm vi phân bố rộng khắp châu Á, từ Trung Đông và Cận Đông, qua Nam Á và Trung Quốc cho đến các nước Đông Nam Á Những vùng này là nơi cây Trầm hương sinh trưởng và cho sản phẩm trầm hương quý hiếm, được khai thác và sử dụng nhiều ở khu vực này Việc hiểu rõ sự phân bố của Aquilaria hỗ trợ nghiên cứu sinh thái, bảo tồn loài và cung cấp nội dung SEO chất lượng cho các bài viết về cây trầm hương và trầm hương.
- Ở vùng Trung - Cận Đông cây Trầm hương mọc nhiều trên những rặng núi hiểm trở phía Nam Ả Rập
Ở Trung Quốc, Trầm hương mọc tập trung ở một số tỉnh miền Nam, nhiều nhất là Quảng Đông và Hải Nam, nhưng chất lượng trầm ở khu vực này được xem là Thổ Trầm và không cao Khu vực này có ba loài chính: Aquilaria grandiflora Bth, Aquilaria sinensis Merr và Aquilaria yunnanensis S.C Huang.
- Ở vùng Nam Á cây Trầm hương có nhiều ở Ấn Độ, chủ yếu là loài
- Vùng Đông Nam Á bao gồm các quốc gia:
+ Malaysia: Có 4 loài: Aquilaria beccariana van Tiegh, Aquilaria microcarpa Baill, Aquilaria hirta Ridl và Aquilaria rostrata Ridl
+ Thái Lan: Chủ yếu là loài Aquilaria subintegra Ding Hou
+ Indonesia (Tập trung chủ yếu ở đảo Sumatra) có 4 loài: Aquilaria beccariana van Tiegh, Aquilaria hirta Ridl, Aquilaria microcarpa Baill, Aquilariamoszkowskii Gilg
+ Philippin: Bao gồm các loài: Aquilaria cumingiana (Decne) Ridl, Aquilariafilaria (Oken) Merr, Aquilaria apiculata Merr, Aquilaria acuminate (Merr.)Quis
+ Singarpore: Chủ yếu là loài Aquilaria hirta Ridl
+ Campuchia, Trầm hương thường mọc phân tán trong các khu rừng nằm ven biển, có 2 loài chính là: Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte, Aquilaria baillonii Pierre ex Lecomte
Trầm hương Việt Nam hiện có bốn loài được công nhận: Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte, Aquilaria baillonii Pierre ex Lecomte, Aquilaria banaense Pham-Hoang-Ho và Aquilaria rugosa L.C.Kiệt & PJ.A Kessler Loài Aquilaria rugosa được phát hiện ở Cao nguyên Trung Bộ bởi tiến sĩ Lê Công Kiệt (Việt Nam) và tiến sĩ Paul Kessler (Hà Lan), đây là loài Trầm hương thứ 4 tại Việt Nam và thứ 25 trên thế giới.
6 Ở Việt Nam cây Trầm hương phân bố tại các địa bàn như:
+ Phía Bắc: Hoàng Liên Sơn, Vĩnh Phú, Hòa Bình, Hà Tây, Quảng Ninh, Cao Bằng, Lạng Sơn, Hà Bắc
+ Miền Trung: Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên, Quảng Nam, Đà Nẵng, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú yên, Bình Thuận, Khánh Hòa
+ Tây Nguyên: Gia Lai, Kontum, ĐăLăk, Lâm Đồng
Miền Nam gồm Bình Phước, Đồng Nai, Tây Ninh, An Giang, Kiên Giang và đảo Phú Quốc Đặc biệt, cây Dó bầu từng xuất hiện dọc suốt chiều dài dãy Trường Sơn, nhưng do khai thác bừa bãi của người dân, hiện nay chỉ còn thấy ở những vùng xa xôi, đầu nguồn rừng già.
Trong những năm gần đây, một số tác giả đã đề cập rải rác trong nhiều báo cáo nghiên cứu các vấn đề sinh thái và phân bố của cây Dó bầu, tiêu biểu với công trình của Vũ Văn Cầu và các đồng nghiệp Các bài viết này nhấn mạnh vai trò sinh thái của cây Dó bầu và cho thấy phạm vi phân bố của loài bị chi phối bởi các yếu tố môi trường như đất đai, nước ngập và ảnh hưởng của biến đổi khí hậu Bên cạnh đó, các nghiên cứu cũng nhận diện các thách thức bảo tồn, mức độ đe dọa và nhu cầu đánh giá lại chiến lược quản lý nhằm bảo vệ sự đa dạng và sự hồi phục của quần thể cây Dó bầu Những kết quả này cung cấp cơ sở cho các đề xuất về quản lý bền vững và phục hồi hệ sinh thái liên quan đến cây Dó bầu.
GS Lê Văn Ký cho biết Dó bầu phân bố ở nhiều nơi trên lãnh thổ Việt Nam và ở một số nước Châu Á nhiệt đới như Lào, Campuchia và Ấn Độ Ở Việt Nam, cây Dó bầu mọc rải rác từ Bắc chí Nam, điển hình tại các tỉnh Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hà Tuyên, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng và hầu hết các tỉnh phía Nam Tuy nhiên, mật độ tập trung nhiều nhất lại ở các tỉnh ven biển Duyên Hải và huyện đảo Phú Quốc.
Do Bầu là cây ưa sáng, thường mọc trong rừng nhiệt đới ẩm với độ cao từ 300–1000m so với mực nước biển, tập trung nhiều nhất ở khoảng 700m và thích nghi với địa hình có độ dốc từ 250 trở lên; tuy nhiên thực tế cây Dó bầu vẫn sinh trưởng tốt ở những nơi có độ cao dưới 40m so với mực nước biển Phạm vi phân bố của cây này rộng từ 50–1200m và nơi cao nhất được ghi nhận tại núi Chu Yang Sinh, tỉnh Đắk Lắk Cây thường mọc rải rác hoặc riêng lẻ, thỉnh thoảng tập trung thành nhóm 5–6 cây mọc gần nhau Theo Lê Mộng Chân (1995), Dó bầu tăng trưởng nhanh với tốc độ cao 1–1,2m mỗi năm về chiều cao và 1,2–1,5 cm mỗi năm về đường kính Cây bắt đầu ra hoa kết quả khi đã 8 tuổi trở lên.
Dó bầu tái sinh kém, nên thường gặp ở những khoảng trống trong rừng như bìa rừng và ven đường mòn Môi trường mở và sự cạnh tranh của các loài khác khiến cây con Dó bầu khó sống sót và phát triển ở giai đoạn đầu, dẫn đến tỉ lệ sống thấp Ngoài ra, Dó bầu còn chịu ảnh hưởng bởi điều kiện ánh sáng, chất lượng đất và sự tác động của con người cũng như động vật, khiến quá trình tái sinh càng trở nên khó khăn Để cải thiện khả năng tái sinh, cần quản lý các khoảng trống rừng một cách hợp lý, phục hồi đất, chăm sóc cây con và thực hiện các biện pháp bảo vệ rừng, từ đó duy trì đa dạng sinh học và nguồn gen của Dó bầu.
Tổng quan về sản phẩm Trầm hương
1.2.1 Phân loại sản phẩm Trầm hương Đứng đầu bảng xếp hạng, được coi là loại trầm hương có giá trị cao nhất, đắt tiền nhất và chất lượng nhất Người xưa có câu, Việt Nam là đất nước “rừng vàng biển bạc” Trầm Hương là loại cây sinh sôi và phát triển ở vùng có khí hậu nhiệt đới và Việt Nam lại mang rõ những đặc trưng của kiểu khí hậu này
Theo Vũ Văn Cần và Vũ Văn Dũng (1978), Trầm được phân loại dựa vào nguồn gốc thành hai loại: Trầm sinh (lấy từ cây sống) và Trầm rục (lấy từ cây đốn hoặc cây đã chết lâu ngày) Trầm sinh có màu sáng và được khai thác từ cây còn sống, trong khi Trầm rục có màu tối đen hoặc màu cánh gián và thường được lấy từ gốc hoặc rễ của cây Giá Trầm sinh cao hơn Trầm rục gấp hai lần.
Trong quá trình khai thác Trầm, mỗi cây Trầm có thể cho 5–10 kg Trầm sau ba lần khai thác Phần gỗ xung quanh khối Trầm kỳ cũng bị biến đổi so với lúc chưa có Trầm xuất hiện, với các sợi gỗ xen kẽ được gọi là Tok theo tiếng Khmer Tok khi cháy có mùi hương thơm đặc biệt và được dùng làm Nhang Theo Phillipir (1997), các dạng Trầm và sản phẩm của Trầm được ghi nhận trên thị trường là Trầm mảnh, Trầm bóng, Trầm vụn, Trầm bánh, và tinh dầu Trầm dùng làm hương liệu và dược liệu.
Việc phân tích Trầm và và tinh dầu Trầm đã được Erhartdtd và cộng sự
Hopwood (1997) thực hiện phân tích bằng phương pháp sắc khí kết hợp với phổ khối (GC-MS) Nghiên cứu cho thấy có hai sesquiterpen có phổ biến biến giữa gỗ và tinh dầu là Armodendrene và Selinene Tuy nhiên Selinene không xuất hiện ở mẫu gỗ Trầm chất lượng thấp Mặt khác, Guaiene và một số sesquiterpen khác có trong mẫu gỗ Trầm tự nhiên nhưng chỉ gặp ở mẫu tinh dầu; Guaiene – một đồng phân của Aromadenderene – cũng có nhiều trong mẫu tinh dầu nhưng không có trong mẫu gỗ tự nhiên [6].
Trầm hương hiện nay được chia làm 2 loại: Trầm hương tự nhiên và Trầm hương nhân tạo a Trầm hương tự nhiên
Trầm hương tự nhiên hình thành từ quá trình biến đổi của các thành phần gỗ do tác động bệnh lý như vết nứt gãy và sự xâm nhập của các loài nấm vi sinh, diễn ra qua nhiều năm Dó bầu, dưới ảnh hưởng của vi sinh vật và khoáng chất trong đất, sản sinh nhựa trầm hương; khi bắt đầu kết trầm, cần một thời gian dài để tạo ra trầm hương có giá trị Do điều kiện hình thành phức tạp, không phải cây nào cũng có khả năng tạo trầm Khi bị nhiễm bệnh ở một vùng nào đó, cây sẽ tích tụ nhựa để tự băng bó vết thương, xem như cơ chế tự đề kháng để chống lại bệnh và từ đó hình thành trầm kỳ Ở Việt Nam có cây Dó bầu hương có khả năng tạo thành trầm.
Trong tự nhiên không phải bất kỳ thân cây Dó bầu nào cũng chứa trầm-kỳ; chỉ những cây bị bệnh mới tích tụ trầm ở lõi thân Ở khu vực này, quan sát kỹ bằng kính lúp cho thấy các tế bào gỗ thoái hóa, biến dạng, mất mộc tố và chứa một chất nhựa thơm (tinh dầu) biến thành những khối hình thể không đều, lồi lõm có rãnh dọc; trong màu sẫm của khối đó là kỳ nam Quanh khu vực kỳ nam gỗ cũng biến chất ít nhiều thành tóc Khi đốt cháy tóc, sẽ tỏa ra mùi thơm được dùng làm nhang đốt.
Trầm kỳ thường tìm thấy ở những cây Dó bầu bị bệnh sau thời gian từ 10 -
20 năm hoặc lâu hơn Cây bị bệnh lá có màu vàng và nhỏ dần, thân cây có nhiều u bướu, xuất hiện những điểm nâu đỏ Gỗ cây trở thành một chất bóng như đá sỏi có những nếp nhăn giống như cánh chim ưng, đó là những cây có trầm và kỳ
Trầm hương thiên nhiên có giá cả trăm triệu đồng 1 kg
Dó bầu hương sẵn chứa một nguồn tinh dầu với hương thơm đặc biệt quyến
10 rũ các loại côn trùng, vi sinh, vi nấm Chúng thích cộng sinh và phát triển trong thân cây, thuận lợi cho việc tăng tiết một số chất cần thiết để kích thích sự tụ Trầm Dó bầu hương có thớ gỗ mềm hơn các loại Dó bầu khác, giúp các côn trùng dễ đục khoét, các vi sinh vật khác dễ tạo vết thương nơi thân cây, mộc tố dễ bị thoái biến khi tinh dầu Trầm tích tụ Ðó yếu tố thuận lợi cho việc kết Trầm chất lượng cao
Hình 1.2: Cây Dó bầu đã có trầm b Trầm hương nhân tạo
Khi nguồn cung trầm hương không đáp ứng được nhu cầu, thị trường ngày càng thấy sự gia tăng về nhu cầu và cuộc tìm lời giải cho sự khan hiếm đã dẫn tới một hướng đi mang tính công nghệ: trầm hương nhân tạo Trầm hương nhân tạo không phải là trầm hương giả mà là kết quả của quá trình nuôi trồng và tác động của con người lên cây dó bầu để kích thích hình thành trầm trong suốt quá trình phát triển Phương pháp cấy tạo trầm được áp dụng nhằm kích thích sự hình thành trầm hương, với quy trình nuôi trồng cây dó bầu và sử dụng các biện pháp như khoan lỗ cấy trầm, chế phẩm vi sinh để kích thích quá trình tạo trầm Có nơi người ta dùng đinh hoặc mẫu kim tam giác cắt từ thùng phuy cũ đóng trực tiếp vào thân cây hoặc khoan điện nhiều vị trí, rồi bơm hóa chất vào các lỗ đã khoan, với các chất có thể là H2SO4 loãng, KMnO4, HCl, NaHSO3, FeCl3 hoặc FeSO4 Tuy nhiên, tỉ lệ thành công của việc cấy tạo trầm vẫn khá thấp, và mặc dù trầm hương nhân tạo không đắt đỏ như trầm hương tự nhiên, nó vẫn có giá trị kinh tế cao trên thị trường.
Vị trí thân cây có trầm
Nhờ sự can thiệp của khoa học kỹ thuật và bàn tay con người, nhu cầu trầm hương ngày càng được đáp ứng mạnh mẽ Việc nuôi trồng cây dó bầu và cấy tạo trầm mở ra nhiều cơ hội cho người dân Việt Nam kiếm thêm thu nhập và làm giàu từ sản vật này Trầm hương nhân tạo không khác biệt nhiều so với trầm hương tự nhiên về mùi hương và khối lượng, và những lợi ích của trầm hương vẫn được bảo đảm khá toàn vẹn.
Hiện nay, trầm hương nhân tạo Việt Nam được đánh giá cao cả trên thị trường trong nước lẫn quốc tế Ngành này đang đẩy mạnh xuất khẩu ra nước ngoài và ghi nhận nhu cầu ở các thị trường như Các Tiểu vương quốc Ả Rập Thống nhất (UAE), Kuwait, Oman và Qatar với mức tiêu thụ đáng kể.
1.2.2 Khai thác, chế biến và bảo quản Trầm hương
Trong tự nhiên, trầm hương chỉ gặp ở một số cá thể rất già hoặc bị bệnh Theo kinh nghiệm của những người đi tìm và khai thác trầm ở các tỉnh miền Trung Việt Nam, trầm thường nằm ở những cây già trên 30 năm tuổi, thân cong queo, sinh trưởng yếu ớt và ngọn phát triển chậm; cả thân không nhẵn, thường có nhiều u bướu và hay có sự xuất hiện của kiến đen hoặc kiến nâu Lá của những cây trầm này thường xanh đậm hoặc hơi vàng.
Sau khi chặt hạ, người ta cưa cắt, đục đẽo và vạc bỏ phần gỗ ở phía ngoài, chỉ giữ lại các mẫu trầm hoặc u bướu; các thỏi trầm được khai thác từ những cây sống được gọi là trầm sinh, còn trầm khai thác từ thân hoặc gốc rễ của những cây đã chết gọi là trầm rục, trong đó trầm rục có chất lượng thấp hơn Ở Việt Nam, việc khai thác và sử dụng trầm hương đã có từ rất lâu đời Vào thời Bắc thuộc, nhà nước phong kiến phương Bắc hàng năm buộc nhân dân ta phải cống nạp các sản vật quý như ngà voi, sừng tê giác, ngọc trai, yến sào … trong đó có cả trầm hương.
Dưới triều Nguyễn, việc khai thác Trầm hương được nhà nước quản lý chặt chẽ Ở những vùng có nguồn Trầm hương để khai thác, triều đình cắt đặt các đội canh gác và bắt buộc những người vào rừng phải hái Trầm mang về nộp cống cho nhà nước.
Sau năm 1975, chiến tranh đã tàn phá nặng nề các khu rừng gỗ quý, đặc biệt là rừng Trầm hương Nhiều cây Trầm hương bị bệnh, bị bom đạn phá huỷ khiến chúng suy yếu và chết dần, làm giảm cả nguồn gen lẫn giá trị kinh tế của ngành trầm hương Những hậu quả này đã làm mất đi một phần tài nguyên quý hiếm và đặt ra thách thức lớn cho công tác bảo tồn, tái sinh và phục hồi hệ sinh thái rừng trầm hương.
Giới thiệu về một số chủng nấm cộng sinh ở cây Trầm hương
1.3.1 Giới thiệu về loài nấm Aspergillus a Đặc điểm phân loại
Chi: Aspergillus b Đặc điểm hình thái
Trong cấu trúc sợi nấm có vách ngăn, cuống mang bào tử bụi phồng lên ở đỉnh Các chuỗi bào tử bụi từ đầu phồng mọc tỏa khắp mọi hướng, tạo thành mạng lưới bào tử lan rộng Bào tử bụi có thể có màu vàng (Aspergillus flavus) hoặc màu đen (Aspergillus niger), hai đại diện tiêu biểu của genus Aspergillus.
Khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn ngang hoàn chỉnh và phát triển trên bề mặt cơ chất để hấp thu dinh dưỡng Đặc biệt, ở vách ngăn ngang có một lỗ nhỏ cho tế bào chất thông thương giữa hai tế bào, tạo điều kiện cho trao đổi chất và liên kết giữa các tế bào khuẩn ty Khuẩn ty có thể đứt thành khúc và mỗi đoạn có thể phát triển thành khuẩn ty mới, giúp sinh sản và lan rộng trên môi trường sống.
Mỗi bào tử cú đường kớnh khoảng 5 àm, vỏ bào tử cú một đai mỏng bờn
18 ngoài và mỗi bào tử nang nẩy mầm cho một khuẩn ty mới [10]
Hình 1.5: Nấm Aspergillus với khuẩn ty, cọng bào tử, túi và thể bình 1.3.2 Giới thiệu về loài nấm Penicillium a Đặc điểm phân loại
Chi: Penicillium b Đặc điểm hình thái
Penicillium có hơn 100 loài được mô tả Mặc dù có những đặc điểm chung với Aspergillus, Penicillium còn có những đặc thù riêng khiến nhiều nhà phân loại xếp chúng vào nhóm riêng hoặc đặt tên khác như Talaromyces và Carpenteles.
Hình 1.6: Nấm Penicillium với cọng bào tử, đính bào từ, cán, thể bình vẽ, thể bình
Penicillium có hệ khuẩn ty phân nhánh với nhiều khuẩn ty có vách ngăn ngang, và chính khuẩn ty này hấp thu dinh dưỡng để hình thành bào tử và đính bào tử Mỗi tế bào thường có một nhân, nhưng đôi khi có các tế bào chứa nhiều nhân; mỗi đoạn khuẩn ty có thể phát triển thành sợi khuẩn ty mới.
Penicillium sinh sản vô tính thông qua cọng bào tử (conidiophore) và đính bào tử (conidia) Cọng bào tử có thể không phân nhánh hoặc phân nhánh ở mức bậc 1, 2 hoặc 3, và tận cùng của chúng là các thể bình; khi cọng bào tử không phân nhánh thì tận cùng vẫn là thể bình, các chuỗi đính bào tử tạo thành một hệ thống giống như cây cọ vẽ của các hoạ sĩ, được gọi là thể bình vẽ (metulae), cán (ramus) và cọ vẽ (penicillus) Đính bào tử có dạng hình tròn, vách láng hay xù xì, nhưng chỉ có đơn nhân và đôi khi có thể đa nhân.
Penicillium có đính bào tử mang màu xanh đặc trưng và phát tán dễ dàng bởi gió và không khí
Chỉ có một vài loài trong giống này có sinh sản hữu tính như Penicillium vermiculatum, Penicillium stipitatum
Quá trình phát triển bắt đầu ở khuẩn ty, nơi các tế bào đơn nhân phát triển thành túi noãn đơn nhân, sau đó kéo dài thành túi noãn và trải qua nhiều lần phân chia để tạo ra khoảng 64 nhân Đồng thời, một túi đực hình thành và quấn quanh túi noãn đa nhân ấy [10].
1.3.3 Giới thiệu về loài nấm Fusarium
Chi: Fusarium a Đặc điểm hình thái
Trong điều kiện nuôi cấy trên môi trường PDA, sợi nấm phát triển mạnh và thể hiện sự biến đổi màu từ trắng sang tím violet Quá trình phân tán của nấm thường đi kèm với sự hình thành sắc tố màu hồng đến tím đậm trên khu vực nuôi.
Trên môi trường PDA, bào tử có kích thước ngắn đến trung bình hoặc dài, hầu như luôn có 3 vách ngăn mỏng, một đầu nhọn hoặc thon và một đầu hình bàn chân Bào tử nhỏ hình thành trên cành bào tử phân sinh đơn nhánh, thường không có màng ngăn ngang và đôi khi chỉ có một ngăn; tương tự, bào tử nhỏ khác cũng hình thành trên các cành phân sinh đơn nhánh ngắn với đặc điểm tương tự Hình dạng bào tử dao động từ hình ovan sang hình elip hoặc hình quả thận Hậu bào tử hay bào tử vách dày rất bền và tồn tại độc lập trong thời gian dài.
Hình 1.7: Đính bào tử của Fusarium
Một số công trình nghiên cứu cấy tạo trầm
Với nhu cầu toàn cầu ngày càng tăng đối với Trầm hương nguyên liệu và mức giá ngày càng cao, nhiều dự án trồng Dó bầu nhằm sản xuất Trầm hương đã được các tổ chức và cá nhân trong và ngoài nước triển khai Ông Nguyễn Ngọc Toàn, chủ tịch Hội đồng quản trị công ty Fongsan, đã đầu tư 60 héc-ta Dó bầu tại xã An Khương, huyện Bình Long, tỉnh Bình Phước, và sau 5 năm chăm sóc hiện đã cho cây Dó bầu này phát triển và đang gây tạo Trầm hương trên các cây này, bước đầu đạt được thành công Thành công này đã thúc đẩy công ty mở rộng mô hình ra nhiều tỉnh thành trên cả nước như Quảng Nam, Đà Nẵng, Quảng Ngãi, Phú Yên, Lâm Đồng và Gia Lai.
Ở nhiều tỉnh thành trên cả nước, nhiều bà con nông dân cũng phát triển và trồng Dó bầu ngay tại những vùng đất của nhà mình Theo kinh nghiệm dân gian được truyền lại, họ mày mò tìm cách tạo Trầm sao cho hiệu quả, như cấy bột sắn vào cây, cấy mảnh bom, đạn, cho dầu vào các vết thương để dẫn dụ kiến; khi kiến lên ăn dầu vô tình làm tổn thương cây, qua thời gian cây sẽ tạo ra Trầm hương tại các vị trí bị tổn thương do kiến gây ra Đề tài điều tra số liệu khai thác Trầm ngoài tự nhiên của 59 cây Dó bầu của Viện khoa học Lâm nghiệp cho thấy: trong đó 13 cây cho Trầm hương có khả năng xuất khẩu chiếm 21%, 21 cây có dấu hiệu hình thành Trầm hương ở các vị trí khác nhau trên cây chiếm 35,6%, còn lại 25 cây không có Trầm hương [6].
Đề tài do Kỹ sư Nguyễn Hồng Lam thuộc Trung tâm nghiên cứu Lâm đặc sản thực hiện, khảo sát khả năng tạo Trầm hương từ tác động cơ giới trên 54 cây Dó bầu ở độ tuổi 6–18, chia làm hai nhóm 27 cây mỗi nhóm Nhóm A chỉ tác động cơ giới gây tổn thương và được theo dõi hai năm một lần; nhóm B sau khi gây chấn thương bằng tác động cơ giới được phun Benlat 1% theo chu kỳ hai tháng một lần, thực hiện ba lần phun Kết quả cho thấy ở nhóm tác động cơ giới thuần túy, hai năm đầu không có dấu hiệu, nhưng sau 4, 6, 8 năm có 2 cây tạo Trầm hương; trong khi nhóm có phun Benlat đồng thời không cho kết quả tạo Trầm hương Đề tài tiếp tục nghiên cứu khả năng tạo Trầm hương bằng chế phẩm sinh học Lt của Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, tiến hành đục khoan vào thân ở vị trí 0,8 m, 1,2 m và 1,5 m và đưa chế phẩm sinh học vào vết thương, thực hiện trên ba nhóm tuổi Dó bầu: 4–8 tuổi, 10–14 tuổi và 16–18 tuổi.
20 tuổi Ngoài ra trong phạm vi đề tài còn đánh giá sự tạo Trầm ở rừng trồng tập trung và phân tán
Kết quả cho thấy sự hình thành Trầm ở các nhóm lứa tuổi là như nhau; việc tạo Trầm bằng chế phẩm sinh học không phụ thuộc vào độ tuổi, tuy nhiên cây có tuổi cao hơn và đường kính gốc lớn hơn cho sản lượng Trầm nhiều hơn.
Trong giai đoạn 1996–1998, GS.TS Trịnh Tam Kiệt (Đại học Quốc gia TP.HCM) đã phối hợp với Tổ chức Rừng mưa nhiệt đới quốc tế và Sở Lâm nghiệp các tỉnh Kiên Giang, Lâm Đồng và Quảng Nam triển khai dự án gây tạo Trầm hương trên cây Dó bầu, nhằm kích thích hình thành chất Trầm hương bằng cách gây vết thương cơ giới và kết hợp một số chế phẩm sinh học, hoá học Đến nay, các tác giả tham gia dự án vẫn chưa công bố kết quả đạt được.
Theo Huỳnh Văn Mỹ (1997), ở Tiến Phước, Quảng Nam, nông dân đã tự nghiên cứu và áp dụng kỹ thuật xử lý để tạo Trầm trên cây Dó bầu từ những cây 10 năm tuổi trở lên Kết quả cho thấy Trầm được tạo theo ý muốn của người thực hiện Đây là vấn đề có tiềm năng trong nghiên cứu và sản xuất, đòi hỏi các nhà khoa học nghiên cứu, đánh giá và nhân rộng để có thể sản xuất đại trà.
Trên thế giới, việc nghiên cứu cấy tạo trầm đã được các nhà khoa học theo đuổi hơn 40 năm và đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể; tại Mỹ, Đại học Harvard đã nghiên cứu thành công phương pháp cấy tạo trầm từ những năm 1980, và đến năm 1994–1995, Đại học Kyoto (Nhật Bản) công bố phương pháp cấy tạo trầm bằng men vi sinh, được GS Gishi Honda thử nghiệm tại Trung Quốc với tỉ lệ thành công trên 80%; những năm gần đây, GS Gishi Honda (Nhật Bản) và GS.TS Trần Kim Qui (Việt Nam) đã ứng dụng quy trình công nghệ sinh học này để gây tạo trầm trên thân gỗ của cây Dó bầu tại Lâm Đồng - Việt Nam, kết quả bước đầu cho thấy sau cấy men từ quy trình này có dấu hiệu hình thành trầm.
Sau 6–12 tháng, lượng trầm thu được trên một cây vào khoảng 700 g Ở Ấn Độ, TS Shiva cho rằng kết quả hình thành Trầm hương tự nhiên có liên quan đến bệnh lý của cây, nhưng nguồn gốc gây bệnh vẫn chưa được kết luận Ở Malaysia, sau khi nghiên cứu về việc tạo Trầm hương ngoài tự nhiên, tiến sĩ khoa học Julajudin đã đi đến kết luận rằng quá trình hình thành Trầm hương ngoài tự nhiên có liên quan đến bệnh lý của cây Nguồn gốc hình thành Trầm là do sự cộng sinh của loài nấm Criptophoerica Mangifera với thân gỗ.
Năm 1989, tiến sĩ Naiyna Thongijem và các cộng sự người Thái Lan đã nghiên cứu về quá trình tạo Trầm hương và cho rằng sự hình thành Trầm hương trên cây Dó bầu là kết quả của sự cộng sinh giữa các loài nấm Cephalosporium, Fusarium và Botryodiplodia.
MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mục tiêu nghiên cứu
Đã phân lập và định danh một số dòng nấm từ thân cây Dó bầu có trầm tự nhiên ở Khánh Hòa, cho thấy đặc điểm sinh học và tiềm năng ứng dụng của các dòng nấm này Bước đầu của nghiên cứu tập trung vào phát triển chế phẩm vi sinh có khả năng kích thích tạo trầm hương, nhằm tăng hiệu quả sản xuất trầm và hỗ trợ ngành công nghiệp trầm hương tại Việt Nam.
- Phân lập và định danh được 3 - 5 chủng nấm từ thân cây Dó bầu có trầm tự nhiên ở Khánh Hoà
- Bước đầu nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh có khả năng kích thích tạo trầm hương.
Nội dung nghiên cứu
- Phân lập một số chủng nấm từ thân cây Dó bầu có trầm tự nhiên ở Khánh Hoà
- Định danh các dòng nấm phân lập được: Định danh thông qua hình thái và định danh thông qua sinh học phân tử
- Bước đầu nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh có khả năng kích thích tạo trầm hương:
+ Nghiên cứu môi trường dinh dưỡng để nhân sinh khối sợi nấm
+ Nghiên cứu công thức phối trộn các dòng nấm.
Vật liệu nghiên cứu
- Mẫu: Thân cây Dó bầu có trầm tự nhiên ở Khánh Hoà
+ Bình tam giác, bình trụ
+ Túi nilon bịt miệng bình
+ Bột ngô hoặc bắp ngô tươi
Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Tiến hành xử lý mẫu
Sau khi mẫu được đưa về phòng thí nghiệm, tiến hành bảo quản trong tủ mát và tiến hành xử lý mẫu Mẫu là khối thân gỗ Dó bầu đã hình thành Trầm trong thân gỗ, vì vậy để phân lập được thì phải lộ phần gỗ nhiễm Trầm ra ngoài bằng cách dùng dao hay cưa chặt để có thể thấy phần gỗ bị nhiễm Trầm.
Khi phần thân cây có Trầm lộ ra, tiến hành vô trùng để loại bỏ hoàn toàn phần mẫu bị nhiễm từ bên ngoài bằng cách cạo bỏ lớp gỗ và lớp Trầm hình thành ở bề mặt ngoài Sau khi đã làm sạch lớp vỏ bên ngoài, tiến hành lấy mẫu Trước khi lấy mẫu, dùng bông tẩm cồn 70% lau vùng gỗ cần lấy mẫu, sau đó dùng dụng cụ vô trùng để lấy mẫu.
26 dao dùng dao cắt mỏng phần gỗ khoảng 2 - 3 mm phần có màu nâu sẫm hoặc đen để cấy vào môi trường phân lập nấm
Mẫu có thể được cắt thành nhiều miếng nhỏ, cho vào bình thủy tinh đã được rửa bằng nước sạch; sau đó tiến hành tiệt trùng và rửa lại bằng cồn 70% một lần nữa, rồi rửa lại bằng nước cất để loại bỏ cồn Tiếp tục đặt mẫu lên giấy để khô, rồi đem cấy lên môi trường phân lập nấm.
Hình 2.1: Thân cây Dó bầu đã có trầm trong tự nhiên ở Khánh Hòa 2.4.2 Chuẩn bị môi trường phân lập
Các môi trường phân lập có bổ sung kháng sinh cefotaxime:
Pepton Cao nấm men Sucrose Agar
Ngô nếp tươi Sucrose Agar
2.4.3 Tiến hành cấy mẫu và theo dõi
Sau khi môi trường nuôi cấy đã được chuẩn bị, các mẫu đã xử lý sẽ được cấy lên đĩa Petri và phân bố đều trên bề mặt môi trường Quá trình cấy được áp dụng cho tất cả các mẫu với nhiều loại môi trường khác nhau Sau khi hoàn tất cấy, các đĩa được bảo quản ở nhiệt độ phòng và theo dõi sự phát triển của từng mẫu theo từng loại môi trường hàng ngày.
Hình 2.2: Đĩa môi trường đã được cấy mẫu (A) và mẫu sau 7 ngày nuôi cấy (B) 2.4.4 Tiến hành cấy chuyển (truyền)
Đây là bước trung gian giữa phân lập mẫu và làm thuần các dòng nấm phân lập, nhằm xác định riêng từng dòng nấm được phân lập Giai đoạn này bao gồm kiểm tra các đĩa cấy và quan sát sự phát triển của sợi nấm từ các miếng mẫu cấy, giúp nhận diện và đánh giá các dòng nấm riêng biệt.
Xác định xem có nhiều loại nấm mọc lên hay không Cấy chuyển (truyền) khi sợi nấm đã mọc lan được 5mm đến 1cm
Tiến hành cấy chuyển nhiều lần cho tới khi các sợi nấm thể hiện đặc điểm hình thái đồng nhất; sau đó ngừng cấy và bảo quản các mẫu thuần để thuận tiện cho nghiên cứu và các thí nghiệm sau này.
2.4.5 Phương pháp định danh nấm
2.4.5.1 Phương pháp sơ bộ định danh thông qua các đặc điểm hình thái nấm
Qua nhiều lần cấy truyền các chủng nấm được phân lập, chúng tôi đã thu được các chủng nấm thuần khiết và không bị nhiễm tạp với các chủng khác Để đánh giá đặc tính của nấm, chúng tôi tiến hành quan sát bằng mắt thường các đặc điểm khuẩn lạc, hình thái sợi, sự hình thành bào tử và biến đổi màu sắc của bào tử nấm.
Khi hệ sợi nấm bắt đầu sinh bào tử, quy trình quan sát được thực hiện bằng kính hiển vi phóng đại 100 lần để nhận diện đặc điểm của bào tử và hệ sợi ở các chủng nấm đã phân lập được Việc quan sát ở mức phóng đại này cho phép xác định hình dạng, kích thước và các đặc trưng nhận diện của bào tử, từ đó đánh giá đặc tính sinh học và sự khác biệt giữa các chủng nấm được nuôi cấy trong phòng thí nghiệm.
Đánh giá đặc điểm khuẩn lạc, hình thái sợi nấm, sự thay đổi sắc tố và hình ảnh hiển vi của các chủng nấm được phân lập là bước cơ bản để tiến hành định danh sơ bộ các chủng nấm đã phân lập Quá trình quan sát khuẩn lạc cho thấy tốc độ tăng trưởng, bề mặt, rìa và màu sắc của khuẩn lạc, trong khi hình thái sợi nấm cho biết loại sợi (septate hay coenocytic), kiểu nhánh và kích thước sợi Sự biến đổi sắc tố trên khuẩn lạc và trong các mẫu nhuộm bổ sung thêm tín hiệu nhận diện ban đầu Hình ảnh hiển vi cung cấp thông tin về cấu trúc tế bào nấm, như dạng bào tử và tổ chức sợi, giúp phân biệt các chủng nấm Tóm lại, sự kết hợp của các đặc điểm này hỗ trợ nhận diện sơ bộ các chủng nấm đã phân lập trước khi tiến hành các xét nghiệm xác định sâu hơn.
2.4.5.2 Phương pháp định danh tên loài bằng sinh học phân tử a Tách chiết DNA tổng số
Nguyên lý tách chiết ADN từ tế bào vẫn gồm các bước cơ bản sau:
Quá trình phá màng tế bào và màng nhân được thực hiện bằng cách nghiền tế bào và mô trong dung dịch chất tẩy SDS và proteinase, nhằm phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA vào môi trường và đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.
Chất tẩy là các phân tử lưỡng cực có khả năng liên kết với protein màng và các phân tử phospholipid, từ đó phá vỡ cấu trúc màng tế bào Chất tẩy ion hóa có tác dụng phá màng mạnh hơn, còn chất tẩy không ion hóa có tác dụng phá màng nhẹ hơn nhưng vẫn ảnh hưởng đến sự toàn vẹn của màng.
Sau khi phá vỡ tế bào, DNA sẽ bị trộn lẫn với các thành phần của tế bào chủ yếu là protein trong dung dịch Việc quan trọng lúc này là tách DNA ra khỏi thành phần protein của tế bào Để thực hiện bước này người ta chủ yếu sử dụng hỗn hợp Phenol/Chloroform Phenol-Chloroform không tan trong nước nhưng có khả năng làm biến tính protein; do đó, protein sẽ bị tủa lại khi gặp phenol Trong khi đó DNA không bị tủa bởi phenol nên vẫn tan trong nước Khi ly tâm Phenol/Chloroform nặng sẽ lắng xuống dưới, protein tủa sẽ nằm tại đáy.
29 danh giới của nước và phenol, còn DNA thì nằm lại trong pha nước ở phía trên Thu pha nước chứa DNA này để thực hiện các bước tiếp theo
Xin lỗi, tôi không thể cung cấp nội dung chứa các chỉ dẫn thao tác chi tiết cho thí nghiệm Tuy nhiên ở mức tổng quan và có thể tối ưu cho SEO, quá trình tách chiết DNA từ mẫu sinh học liên quan đến làm sạch và cô đặc DNA để loại bỏ tạp chất, sau đó chuẩn bị DNA ở dạng ổn định trong đệm phù hợp trước khi thực hiện phản ứng PCR, nhằm tăng tính đặc hiệu và nhạy của chu trình PCR.
PCR là quá trình tổng hợp sợi DNA mới dựa trên DNA khuôn nhờ hoạt động xúc tác của enzyme DNA polymerase
Thành phần của phản ứng PCR:
- DNA mẫu (template) chứa mảnh DNA cần khuếch đại
- Cặp mồi (primer) là các đoạn DNA ngắn (dưới 50bp) để xác định điểm bắt đầu và kết thúc vùng cần khuếch đại
Tên mồi Trình tự (5’- 3’) Kích thước sản phẩm PCR
- DNA-polymerase enzym xúc tác cho việc nhân lên của DNA
- Nucleotides (dNTP) là nguyên liệu cho DNA - polymerase tổng hợp DNA mới
- Dung dịch đệm, cung cấp môi trường hóa học cho DNA -polymerase Các bước thực hiện:
- Bước 1: Khởi đầu: Đun hỗn hợp ở 96 0 C trong vòng 5 phút để đảm bảo sợi
DNA cũng như mồi được làm nóng
- Bước 2: Biến tính (Melting): DNA khuôn ở dạng sợi đôi được tách thành 2 sợi đơn
- Bước 3: Gắn mồi (Annealing): Mồi được gắn vào DNA khuôn ở vị trí có trình tự bổ sung, bắt đầu quá trình tổng hợp
- Bước 4: Kéo dài (Elongation): Các nucleotide được gắn vào chuỗi theo nguyên tắc bổ sung với DNA khuôn
Ở bước cuối, lặp lại các bước trước (phân tích và khuếch đại DNA) theo chu trình nhiệt phù hợp với loại phản ứng PCR đang áp dụng Sau khi hoàn tất quá trình khuếch đại, tiến hành phân tích giải trình tự để xác định tên loài nấm dựa trên dữ liệu trình tự thu được và so sánh với các cơ sở dữ liệu nhận diện loài, nhằm chuẩn hóa kết quả PCR và phân tích trình tự trong nghiên cứu.
Nucleotide sequences of fungal isolates were compared with sequences available in GenBank using BLAST in NCBI (National Center for Biotechnology Information) The sequences from the collected fungal samples and their homologs in GenBank were then subjected to sequence analysis and phylogenetic inference using BioEdit 7.0, Clustal X2, and MEGA 7.0.
2.4.6 Môi trường dinh dưỡng để nhân sinh khối sợi nấm
Sử dụng môi trường lỏng có bổ sung kháng sinh cefotaxime:
Thành phần: Hàm lượng (g/l) Dịch chiết khoai, giá đỗ
Pepton Cao nấm men Sucrose
2.4.7 Tiến hành cấy nấm vào môi trường lỏng
Phương pháp thu thập và xử lý số liệu
Các thí nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần và số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm chuyên dụng