NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYME TYROSINASE CỦA MỘT SỐ DỊCH CHIẾT VI TẢO ĐỂ PHÁT TRIỂN KEM LÀM TRẮNG DA TỰ NHIÊN

Đề tài được thực hiện nhằm mục đích khảo sát khả năng hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase, khả năng chống oxy hóa của cao chiết từ bột tảo của 3 chủng giống tảo Spirulina platensis: Spirulina platensis 1 (Sp1), Spirulina platensis 3 (Sp3), Spirulina platensis 5 (Sp5) từ đó làm tiền đề cho các nghiên cứu ứng dụng cao chiết tảo trong việc phát triển kem làm trắng da tự nhiên. Cao chiết được chuẩn bị từ dung môi chiết là ethanol và ethyl acetate bằng máy Soxhlet. Khả năng ức chế enzyme tyrsoinase từ 3 mẫu dịch chiết tảo Spirulina platensis: S.platensis 1, S.platensis 3, S.platensis 5 là phản ứng cạnh tranh với phần trăm ức chế lần lượt là: 57,2785%, 42,8072%, 53,1488% trên dung môi ethyl acetate lần lượt và 59,0564%, 46,855%, 51,1775% trên dung môi ethanol. Kết quả của phản ứng enzyme tyrosinase và cơ chất LDOPA với các nồng độ khác nhau (1,2,3,4,5M) với chất ức chế S.platensis 1, S.platensis 3, S.platensis 5 theo các nồng độ được giá trị của ba mẫu chiết

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMKHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

~~~~~***~~~~~

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ỨC CHẾ

ENZYME TYROSINASE CỦA MỘT SỐ DỊCH

CHIẾT VI TẢO ĐỂ PHÁT TRIỂN KEM LÀM TRẮNG

DA TỰ NHIÊN

Hà Nội, 2022

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

~~~~~***~~~~~

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ỨC CHẾ

ENZYME TYROSINASE CỦA MỘT SỐ DỊCH

CHIẾT VI TẢO ĐỂ PHÁT TRIỂN KEM LÀM TRẮNG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài “NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYMETYROSINASE CỦA MỘT SỐ DỊCH CHIẾT VI TẢO ĐỂ PHÁT TRIỂN LÀMKEM TRẮNG DA TỰ NHIÊN” là công trình nghiên cứu cá nhân của tôi trong thờigian qua Mọi số liệu được sử dụng, hình ảnh, kết quả nghiên cứu là do tôi tự tìmhiểu, phân tích một cách khách quan, trung thực, có nguồn gốc rõ ràng và chưađược công bố dưới bất kì hình thức nào

Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đề tài này đã được cảm ơn và các thôngtin trích dẫn trong đề tài đều được ghi nguồn gốc rõ ràng

Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan của mình trước Học viện và Hộiđồng

Hà Nội, ngày 8 tháng 3 năm 2022

Sinh viên

Trần Thị Thảo Vân

LỜI CẢM ƠN

Sau khi kết thúc thời gian thực tập tại Bộ môn Sinh học - Khoa Công nghệSinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam được sự quan tâm, chỉ bảo tận tình củacác Thầy giáo, Cô giáo và cán bộ tại phòng thí nghiệm; cùng với sự cố gắng, nỗ lựccủa bản thân, tôi đã rút ra những bài học kinh nghiệm

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinhhọc cùng toàn thể các Thầy giáo, Cô giáo đã truyền đạt cho tôi những kiến thứcchuyên ngành, kỹ năng làm việc trong phòng thí nghiệm và những bài học quý báutrong suốt thời gian học tập, rèn luyện tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn và biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thanh Hảo,người thầy hướng dẫn tận tâm, giải đáp các thắc mắc câu hỏi cũng như giúp đỡ tôinhiệt tình trong quá trình làm thí nghiệm và thu được kết quả tốt nhất

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy, Cô và cán bộ Viện nghiên cứu Vitảo và Dược mĩ phẩm đã tận tình giúp đỡ, định hướng cách tư duy và cách làm việckhoa học Đó là nhứng góp ý hết sức quý báu không chỉ trong quá trình thực hiệnkhóa luận tôt nghiệp mà còn là hành trang tiếp bước cho tôi trong quá trình học tập

và làm việc sau này

Cuối cùng, với tất cả lòng kính trọng và biết ơn vô hạn, tôi xin gửi lời cảm ơnsâu sắc tới gia đình cùng những người thân,bạn bè và Thầy Cô đã luôn luôn động viên,giúp đỡ, tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu cũng như trongquá trình làm khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2022

Sinh viên

Trần Thị Thảo Vân

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC ĐỒ THỊ viii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix

TÓM TẮT x

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu đề tài 2

1.2.1 Mục đích của đề tài 2

1.2.2 Yêu cầu của đề tài 2

1.3.Ý nghĩa đề tài 2

1.3.1.Ý nghĩa khoa học 2

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về enzyme tyrosinase 3

2.1.1 Khái niệm và nguồn gốc của enzyme tyrosinase trong tự nhiên 3

2.1.2.Vai trò và ứng dụng của enzyme tyrosinase 4

2.1.3 Sự hình thành enzyme tyrosinase trong tự nhiên và hình thành sắc tố da ở

người 6

2.1.4 Cơ chế hoạt động của enzyme tyrosinase 8

2.1.5 Ảnh hưởng của chất ức chế đến hoạt động của enzyme tyrosinase 8

2.2 Động học phản ứng enzyme tyrosinase 12

2.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc độ chuyển hóa cơ chất 12 2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cơ chất 13

2.3 Các chất ức chất enzyme tyrosinase 15

2.4 Ứng dụng chất ức chế enzyme tyrosinase 19

2.5 Các nghiên cứu về sàng lọc các chất ức chế enzyme tyrosinase 20

2.5.1 Nghiên cứu hoạt động ức chế enzyme tyrosinase từ tảo lam 20

2.6.1 Khái quát chung về Spirulina platensis loại vi tảo có hoạt tính ức chế tyrosinase 21

2.6.2 Hoạt chất sinh học có trong Spirulina platensis 21

2.7 Giới thiệu về một số phương pháp chiết 22

2.7.1 Phương pháp chiết Soxhlet 23

2.7.2 Ngấm kiệt 24

2.7.3 CO2 tới hạn 25

2.7.4 Lôi cuốn hơi nước 26

PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

3.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 26

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 26

3.1.2 Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ 27

3.1.3 Thiết bị 27

3.1.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 27

3.2 Nội dung nghiên cứu 28

3.3 Phương pháp nghiên cứu 28

3.3.1 Phương pháp tách chiết thu dịch chiết tảo 28

3.3.2 Phương pháp thử hoạt tính enzyme tyrosinase 29

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

4.1 Ảnh hưởng của dung môi đến hiệu quả tách chiết 39

4.2 Xác định động học enzyme tyrosinase 42

4.2.1 Xác định nồng độ enzyme tối ưu cho phản ứng 42

4.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất L-DOPA đến phản ứng 44

4.2.3 Đánh giá khả năng phân giải arbutin của enzyme tyrosinase từ dịch chiết tảo 45

4.3 Xác định động học enzyme tyrosinase khi có mặt dịch chiết tảo 46

4.3.1 Nghiên cứu khả năng ức chế enzyme tyrosinase của dịch chiết tảo trong dung môi ethyl acetate 46

4.3.2 Nghiên cứu khả năng ức chế enzyme tyrosinase của dịch chiết tảo trong dung môi ethanol 49

4.3.3 Phân tích động học enzyme tyrosinase khi có chất ức chế tham gia 51

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

5.1 Kết luận 55

5.2 Kiến nghị 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Khối lượng hóa chất, thể tích, nồng độ cần pha của đệm Potassium 34

Bảng 3.2: Khối lượng hóa chất, thể tích, nồng độ cần pha của hóa chất 35

L-DOPA (3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-L-alanine) 35

Bảng 3.3: Dãy nồng độ pha loãng của acid arbutin 35

Bảng 3.4: Khối lượng, thể tích, nồng độ cần pha của hóa chất acid arbutin 36

Bảng 3.5: Dãy nồng độ pha loãng từ dung dịch gốc 38

Bảng 3.6: Thể tích hút của mỗi chất vào giếng trên bản ELISA 38

Bảng 4.1: Ảnh hưởng của dung môi và thời gian đến khối lượng cao chiết tảo xoắn S.platensis 1 43

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của dung môi và thời gian đến khối lượng cao chiết tảo xoắn S.platensis 3 44

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của dung môi và thời gian đến khối lượng cao chiết tảo xoắn S.platensis 5 44

Bảng 4.5: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme khác nhau đến vận tốc phản ứng 46

Bảng 4.6: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất L-DOPA đến phản ứng 48

Bảng 4.7: Bảng đo độ hấp thụ huỳnh quang của đối chứng (+) 49

Bảng 4.8: Phần trăm ức chế enzyme tyrosinase của arbutin 49

Bảng 4.9: Khả năng ức chế enzyme của các dịch chiết trong ethyl acetate 50

Bảng 4.10 : Phần trăm ức chế enzyme tyrosinase từ ba loại dịch chiết tảo bằng dung môi ethyl acetate 51

Bảng 4.11: Khả năng ức chế enzyme của các dịch chiết trong ethanol 53

Bảng 4.12: Phần trăm ức chế enzyme tyrosinase từ ba loại dịch chiết tảo bằng dung môi ethanol 54

Bảng 4.13: Tổng hợp Ic50, mức độ ức chế, Km và Vmax của ba dịch chiết tảo trong 2 loại dung môi 57

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Cấu trúc của enzyme tyrosinase 3

Hình 2.2 Cơ chế tổng hợp melanin hình thành sắc tố da và vai trò của enzyme tyrosinase xảy ra trong melanosome 7

Hình 2.3 Sự hình thành các mảng sắc tố da dưới tác dụng của tia UV và enzyme tyrosinase 8

Hình 2.4 Sơ đồ chất kìm hãm cạnh tranh: cơ chất(S) và chất kìm hãm (I) 9

Hình 2.5 Lineweaver –Burk plot 10

Hình 2.6 Đồ thị đảo ngược kép mô tả các kiểu ức chế phản ứng enzyme 11

Hình 2.7 Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào [E] 13

Hình 2.8 Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất 14

Hình 2.9 Tinh chất dưỡng trắng da Naris Nature Whitening Serum Nhật Bản 20

Hình 2.10 Hình ảnh tảo S.Platensis 1, S.Platensis 3, S.Platensis 5 được chụp dưới kính hiển vi 21

Hình 2.13 Hình ảnh dụng cụ Soxhlets 23

Hình 2.14 Sơ đồ hoạt động bộ chiết CO2 siêu tới hạn 25

Hình 2.15 Sơ đồ hoạt động chưng cất lôi cuốn hơi nước 26

Hình 3.1 Máy đọc miễn dịch ELISA MR-96A Mindray Xuất xứ: Trung Quốc và giếng ELISA (96 giếng ) 29

Hình 3.2 Hóa chất L-DOPA (3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-L-alanine) 30

Hình 3.3 Hóa chất acid arbutin 32

Hình 3.4 Enzyme mushroom tyrosinase 33

Hình 4.1 Chiết bột tảo bằng máy Soxhlet 41

Hình 4.2 Dịch chiết của ba loại tảo sau khi chiết Soxhlet 41

Hình 4.3 Cao chiết ba loại tảo 42

Hình 4.4 Phản ứng trên đĩa microtiter 43

Hình 4.5 Phản ứng trên đĩa microtiter 45

DANH MỤC ĐỒ THỊ Biểu đồ 4.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme khác nhau đến phản ứng enzyme – cơ chất………

……….43

Biểu đồ 4.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến tốc phản ứng 44

Biểu đồ 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ arbutin đến khả năng ức chế enzyme tyrosinase 46

Biểu đồ 4.4 Khả năng ức chế enzyme của các dịch chiết trong ethyl acetate 47

Biểu đồ 4.5 Khả năng ức chế enzyme của các dịch chiết trong ethanol 50

Biểu đồ 4.6 Mức độ ức chế enzyme của các dịch chiết trong ethanol 51

Biểu đồ 4.7 Linweaver- Burk plots về hoạt động của tyrosinase với cơ chất L-DOPA và nồng độ của dịch chiết tảo S platensis 1 lần lượt là 50,200,400 và 800µg/ ml 52

Biểu đồ 4.8 Linweaver- Burk plots về hoạt động của tyrosinase với cơ chất L-DOPA và nồng độ của dịch chiết tảo S platensis 3 lần lượt là 50,200,400 và 800µg/ ml 53

Biểu đồ 4.9 Linweaver- Burk plots về hoạt động của tyrosinase với cơ chất L-DOPA và nồng độ của dịch chiết tảo S platensis 5 lần lượt là 50,200,400 và 800µg/ ml 53

cao chiết tảo trong việc phát triển kem làm trắng da tự nhiên Cao chiết được chuẩn

bị từ dung môi chiết là ethanol và ethyl acetate bằng máy Soxhlet Khả năng ức chế

enzyme tyrsoinase từ 3 mẫu dịch chiết tảo Spirulina platensis: S.platensis 1, S.platensis 3, S.platensis 5 là phản ứng cạnh tranh với phần trăm ức chế lần lượt là:

57,2785%, 42,8072%, 53,1488% trên dung môi ethyl acetate lần lượt và 59,0564%,46,855%, 51,1775% trên dung môi ethanol Kết quả của phản ứng enzymetyrosinase và cơ chất L-DOPA với các nồng độ khác nhau (1,2,3,4,5M) với chất ức

chế S.platensis 1, S.platensis 3, S.platensis 5 theo các nồng độ được giá trị của ba

mẫu chiết lần lượt là:

Spirulina platensis 1: Km = 3,3 mM, V max= 0,123 µmol min-1

Spirulina platensis 3: Km = 2.6 mM, Vmax = 0,254 µmol min-1

Spirulina platensis 5: Km = 2.28mM, Vmax= 0,33 µmol min-1

Từ những kết quả thí nghiệm trên, khả năng ức chế enzyme tyrosinase từ dịch chiết

tảo thì tảo Splatensis 1 có khả năng ức chế enzyme tyrsosinase cao nhất, từ đó phát

triển làm nguyên liệu cho quá trình sản xuất các loại kem làm trắng da có nguồn gốc

tự nhiên

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Sắc tố tạo nên màu của da, tóc, màng nhầy và võng mạc của mắt Sắc tố đượchình thành do sự lắng đọng của sắc tố melanin Trong khi đó, melanin được sảnxuất bởi các tế bào melanocytes và sắc tố da có ở lớp đáy của thượng bì, các sắc tốmelanin có tác dụng chống lại ảnh hưởng của tia cực tím UV từ mặt trời Sắc tốmelanin được chia thành hai loại: Eumelanin có màu đen hoặc nâu sẫm và được tìmthấy ở những người có làn da xỉn, mờ (nó có tác dụng bảo vệ da tránh được tia UV).Phaeomelanin: loại sắc tố này còn được gọi là melanin đỏ, thường xuất hiện ởnhững người có làn da trắng hoặc tóc đỏ Phaeomelanin không có tác dụng bảo vệchống lại tia UV Ngược lại, sự tổng hợp của loại sắc tố này sẽ tạo ra các gốc tự dotấn công da Hai loại sắc tố melanin này thường xuất hiện ở tất cả các làn da củamỗi người Tuy nhiên, với từng cá nhân sẽ có tỷ lệ khác nhau Số lượng hai loại sắc

tố này sẽ là yếu tố quyết định màu da tự nhiên của mỗi người, cũng như độ rámnắng của họ khi tiếp xúc với ánh nắng mặt trời

Sắc tố da là kết quả của một quá trình hoạt động với bốn giai đoạn phức tạp.Giai đoạn đầu tiên, tia cực tím và các chất trung gian sinh học (các chất đượctìm thấy trong tế bào da) kích thích quá trình tạo sắc tố Giai đoạn tiếp theo, melaninđược sản xuất bởi melanocytes Giai đoạn thứ ba, melanin sản xuất bởi melanocytesđược phân phối qua hai lớp biểu bì da Giai đoạn cuối cùng, sắc tố melanin dichuyển đến bề mặt da thông qua sự đổi mới liên tục của các tế bào trong lớp biểu bì.Nám da, sạm đen là các dấu hiệu bệnh lý do sự biểu hiện vượt mức melanin ở da

Để khắc phục các triệu chứng này, người ta thường sử dụng các hóa chất cókhả năng ức chế enzyme tyrosinase tham gia sinh tổng hợp melanin Tuy nhiên,việc sử dụng các hóa chất này có thể gây ra tác dụng phụ cho người dùng, trong số

đó một số loại đã bị cấm sử dụng ở nhiều nước Vậy nên những hoạt chất chiết xuất

từ dược liệu có khả năng ức chế tyrosinase được sử dụng bởi hiệu quả làm trắng da

và tính an toàn, vẫn là mối quan tâm của các ngành công nghệ dược phẩm và hóa

mỹ phẩm Các chiết xuất từ vi tảo như: Endarachne binghamiae, Schizymenia dubyi, Ecklonia cava, Sargassum silquastrum, Scenedesmus obliquus đã chứng

minh hoạt động ức chế tyrosinase mạnh mẽ tương tự như acid arbutin đối chứng.Việc nghiên cứu và phát triển thuốc mới ức chế tyrosinase là một quy trình rất tốnkém cả về thời gian và tiền bạc, tuy nhiên tỷ lệ thất bại lại tương đối cao Do đó,trong nghiên cứu này đã ứng dụng phương pháp tính toán và mô phỏng phân tử (gọi

tắt là phương pháp invitro silico) trên ba chủng của giống tảo Spirulina Platensis:

để sàng lọc các hợp chất ức chế tyrosinase nhằm giảm thiểu chi phí và thời gian tìmkiếm hợp chất tiềm năng ức chế enzyme tyrosinase

1.2 Mục đích và yêu cầu đề tài

1.2.1 Mục đích của đề tài

Khảo sát và đánh giá khả năng ức chế enzyme tyrosinase từ ba loại cao chiết

tảo Spirulina platensis: S.platensis 1, S.platensis 3, S.platensis 5.

1.2.2 Yêu cầu của đề tài

Tách chiết thu cao chiết từ ba chủng của giống tảo Spirulina platensis:

S.platensis 1, S.platensis 3, S.platensis 5

Nghiên cứu đánh giá thử hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase từ ba chủng của giống tảo Spirulina platensis: S.platensis 1, S.platensis 3, S.platensis 5.

1.3.Ý nghĩa đề tài

1.3.1.Ý nghĩa khoa học

Sàng lọc và phát hiện một số loại vi tảo có hoạt chất ức chế enzymetyrosinase từ đó làm cơ sơ thực hiện những nghiên cứu tiếp theo, ví dụ như làm kemtrắng sáng da

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Dựa vào kết qủa nghiên cứu để lựa chọn một số loại vi tảo làm nguyên liệu

để sản xuất các sản phẩm làm kem làm trắng da

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về enzyme tyrosinase

2.1.1 Khái niệm và nguồn gốc của enzyme tyrosinase trong tự nhiên

Enzyme tyrosinase (EC 1.14.18.1) hay còn gọi là enzyme polyphenoloxidase (PPO), là một enzyme monooxygenase có chứa đồng tham gia vào hai phảnứng của quá trình chuyển hóa melanin; một là hydroxyl hóa monophenol thành O-dophenol, hai là oxi hóa O-diphenol thành O-quinon; sau đó, O-quinon tham giamột loạt các phản ứng ức chế để tạo thành melanin Các nghiên cứu khoa học đãchứng minh sự hiện diện của enzyme chứa đồng trong các mô động vật và thực vật,xúc tác bởi quá trình oxy hóa từ tyrosine melanin và các sắc tố khác Ở thực vật,tyrosinase là enzyme chịu trách nhiệm tạo ra màu nâu không mong muốn khi đểthực vật trong không khí ví dụ như khoai tây Tyrosinase nằm trong các tế bào sắc

tố da, đặc biệt trong các melanosome Gen TYR là gen chịu trách nhiệm mã hóatyrosinase ở người

Hình 2.1 Cấu trúc của enzyme tyrosinase

Enzyme tyrosinase đã được phân lập và tinh chế từ các nguồn khác nhauchẳng hạn như một số thực vật, động vật, nấm và vi sinh vật, Trong số các nguồn

tyrosinase khác nhau, tyrosinase từ nấm: Agaricus bisporus, Agaricus bisporus, Neurospora crassa, Amanita muscaria, Lentinula edodes, Aspergillus oryzae, Portabella mushrooms, Pycnoporussanhuineus, Lentinula boryana (Ali Nawaz và

cs (2017) là một nguồn chính và rẻ của enzyme tyrosinase với tính tương đồng và

tương đồng cao so với tyrosinase của người Do những đặc tính tốt này, cấu trúc,chức năng và đặc điểm sinh hóa của tyrosinase nấm đã được được nghiên cứu rộngrãi như một hệ thống mô hình để sàng lọc tyrosinase các chất ức chế và các nghiêncứu tạo hắc tố, các phản ứng xúc tác bởi enzyme và các nghiên cứu cấu trúc chất ức

chế enzyme cho đến nay Tyrosinase từ Agaricus bisporus với hai đơn vị con, nặng

và nhẹ, được phân lập đầu tiên bởi Bourquelot và Bertrand năm 1895 Nó có bamiền và hai vị trí liên kết đồng liên kết với sáu gốc histidine và tương tác với oxyphân tử trong vị trí hoạt động của tyrosinase, liên kết disulfua ổn định cấu trúc hơn

Bên cạnh đó tyrosinase được thu nhận từ vi khuẩn: Rhizobium, Symbiobacterium thermo-philum, Pseudomonas maltophilia, Sinorhizobium meliloti, Marinomonas mediterra-nea, Thermomicrobium roseum, Bacillus thuringiensis, Pseudomonas putida, Streptomyces castaneoglo-bisporus, Ralstoniasolana cearum, Verrucomicrobium spino-sum (Ali Nawaz và cs (2017) Tyrosinase thu nhận từ thực vật: Monastrell grape, táo, hoa hướng dương, Solanum melongena, Portulaca grandiflora (Ali Nawaz và cs (2017)

2.1.2.Vai trò và ứng dụng của enzyme tyrosinase

Ứng dụng y tế / lâm sàng

Tyrosinase tham gia vào quá trình sinh tổng hợp melanin trong cácmelanosome gây ra sắc tố da, tóc và mắt ở động vật có vú, giúp bảo vệ chống lại tia

UV Đóng một phần quan trọng trong phản ứng miễn dịch và chữa lành vết thương

ở thực vật, động vật không xương sống khác nhau cũng như bọt biển Tyrosinase có

ý nghĩa đối với sự hình thành bào tử, bảo vệ sự tồn tại của các mô sau một số tổnthương hoặc tổn thương ở nấm, là một phần quan trọng trong việc bảo vệ vi khuẩn

Các ứng dụng y tế quan trọng bao gồm tổng hợp melanin cho mục đích điều trị, sảnxuất

L-DOPA, một loại thuốc được sử dụng để điều trị bệnh Parkinson, sản xuấtlincomycin kháng sinh và điều trị các bệnh thần kinh khác nhau tyrosinase nấm cóứng dụng lâm sàng để điều trị bệnh bạch biến Là tiền chất trong xét nghiệm miễndịch và vi phân giải kháng thể để sản xuất L-DOPA (Ali Nawaz và cs (2017)

Khử nhiễm phenol bằng tyrosinase ý nghĩa môi trường

Các ngành công nghiệp khác nhau như giấy, hóa chất, dệt may, khai thác mỏ,than đá và dầu mỏ tạo ra nước thải bao gồm các phenol và các dẫn xuất của nó.Tyrosinase có khả năng oxy hóa phenol thành các chất không hòa tan có thể đượcloại bỏ bằng cách kết tủa hoặc lọc chúng Các hợp chất phenolic có trong dung dịchnước có thể được loại bỏ bằng cách hấp phụ chúng vào than hoạt tính dạng hạt Vìtyrosinase là chất khử độc của xenobiotics có cấu trúc phenol, do đó trong số đó,chlorophenol là chất gây ô nhiễm cụ thể có trong nước thải Các ngành công nghiệpnhư da, dệt, dược phẩm và giấy, tạo ra các loại thuốc nhuộm khác nhau, chủ yếu làthuốc nhuộm azo, là chất nguy hiểm cho môi trường Trong những điều kiện nhấtđịnh, chúng bị vi khuẩn khử màu và sau đó bị phân hủy bởi tyrosinase Cơ chế như

chất nhũ hóa và sản xuất thực phẩm ít chất béo hơn và ít calo hơn Làm cảm biếnsinh học để phát hiện hợp chất phenolic độc hại

Các polyme tự nhiên có thể được liên kết chéo để tạo ra các polyme mớibằng cách sử dụng tyrosinase của nấm Chúng hình thành các liên kết chéo trên cơ

sở khả năng tiếp cận và sự phong phú của protein mục tiêu Những thay đổi trongcác đặc tính là rất quan trọng để sử dụng trong các lĩnh vực khác nhau như chế biếnthực phẩm Tyrosinase có thể được sử dụng để ghép các hợp chất cụ thể với cácchất tạo màng sinh học và tạo ra các sản phẩm sinh học mới Tyrosinase cung cấpmột phương pháp dễ dàng trong việc chuyển đổi các sản phẩm phụ của quá trìnhchế biến thực phẩm thành các mặt hàng có lợi cho môi trường với các đặc tính chứcnăng có giá trị và chuyển đổi L –tyrosine thành L-DOPA và sau đó thành o-dopaquinone liên quan đến việc áp dụng tyrosinase (Ali Nawaz và cs 2017)

2.1.3 Sự hình thành enzyme tyrosinase trong tự nhiên và hình thành sắc tố da

ở người

Sắc tố da Melanin là chất được bắt nguồn từ tyrosinase, một acid amin nằmtrong tế bào sắc số Melanocyte ở tầng thượng bì của da, quy định màu sắc của da,tóc và mắt của cơ thể con người với vai trò quan trọng là bảo vệ da khỏi tác hại củacác yếu tố bên ngoài bao gồm tia UV trong ánh nắng mặt trời, từ đó giảm thiểu cácnguy hiểm như tổn thương cấu trúc DNA, ung thư da, tuy nhiên đây cũng là nguyênnhân gây ra nhứng vấn đề nám, sạm, thâm trên da

Quy trình hình thành Melanin được chia làm ba bước, trong đó enzymetyrosinase đóng vai trò hết sức quan trọng

Bước 1: Kích hoạt enzyme tyrosinase: dưới tác dụng của ánh nắng mặt trời,tổn thương vật lý, hormone, stress

Bước 2: Khi enzyme Tyrosinase được kích hoạt, nó sẽ kích hoạt quá trìnhsinh sản melanin trong melanosome – một bộ phận của tế bào sắc tố qua 3 phản ứnghóa học: Acid amin tyrosine >> DOPA >> Dopaquinone >> Melanin (Pheo –melanin hay EU-melanin)

Bước 3: Melanin từ melanasome qua tế bào keratinocyce và đưa lên trên bềmặt da, tạo thành những vùng sạm, nám hoặc vết thâm

Sự hình thành melanin còn chịu ảnh hưởng của yếu tố nội tiết và thần kinh,

do đó sự hình thành sắc tố da phụ thuộc vào cơ địa của mỗi người và tùy thuộc vàođiều kiện sinh lý cũng như nội tiết của người đó

Hình 2.2 Cơ chế tổng hợp melanin hình thành sắc tố da và vai trò của enzyme

tyrosinase xảy ra trong melanosome

(Kondo và Hearing, 2011)Như vậy, sự hình thành các vết nám hay tàn nhang là do sự tích lũy củamelanin là sản phẩm chuyển hóa xúc tác bởi enzym tyrosinase và có sự tham giacủa tia tử ngoại trong ánh nắng mặt trời Tia tử ngoại UV trong ánh nắng mặt trời sẽkích hoạt các tế bào melanocyte dẫn đến tăng sản xuất melanin và hậu quả tạo racác vến nám, tàn nhang trên da Khi lượng melanin tăng quá mức sẽ tạo ra các vùngtích lũy melanin không đều gây ra hiện tượng da không đồng nhất màu làm ảnhhưởng đến thẩm mĩ Việc ngăn chặn hoặc loại bỏ melanin tích lũy dưới da sẽ giúplàm cho da dần trở lại sáng hơn hay còn gọi là quá trình làm trắng sáng da Cơ chếnày khác với cách làm trắng da nhanh chóng bằng cách sử dụng các loại kem cótính axit mạnh làm tẩy lột da nhưng không có tác dụng ức chế sự hình thànhmelanin từ bên trong nên lớp da mới hình thành lại tiếp tục bị nám sau 1 thời gian.Nếu lạm dụng các kem làm sáng da theo tính chất trên sau một thời gian sẽ làm da

bị hỏng, lóa hóa không thể phục hồi hoặc tạo ra sự rối loạn tổng hợp melanin giữ

các lớp da dẫn đến hiện tượng tàn nhang hoặc loang lổ màu trên da rất khó điều trị

và phục hồi

Hình 2.3 Sự hình thành các mảng sắc tố da dưới tác dụng của tia UV và

enzyme tyrosinase

(Jean-Yves Berthon và cs, 2017)

2.1.4 Cơ chế hoạt động của enzyme tyrosinase

Cơ chế hoạt động của enzyme tyrosianse gồm ba giai đoạn:

Giai đoạn đầu : enzyme tyrosinase kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạothành phức hợp enzyme – cơ chất (ES) không bền nhờ hình thành liên kết đặc biệt

là liên kết hydrogen Sự liên kết này làm thay đổi cấu hình không gian của cơ chấtlàm thay đổi động năng cũng như thế năng, kết quả là làm cho phân tử cơ chất trởnên linh hoạt hơn, nhờ đó tham gia phản ứng dễ dàng

Giai đoạn tiếp theo xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá vỡcác liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng

Giai đoạn cuối cùng enzyme tyrosinase xúc tác lên cơ chất tạo thành sảnphẩm, enzyme tyrosinase được giải phóng dưới dạng tự do

2.1.5 Ảnh hưởng của chất ức chế đến hoạt động của enzyme tyrosinase

Chất ức chế enzyme hay chất kìm hãm enzyme là phân tử liên kế với enzyme

và làm giảm hoạt độ của enzyme Tốc độ của phản ứng enzyme sẽ bị giảm bởi táccác tác dụng của các chất ức chế đặc hiệu – chất ức chế đặc hiệu kết hợp vớienzyme và ngăn cản enzyme kết hợp với cơ chất một cách bình thường

Các dạng chất kìm hãm thuận nghịch

Chất kìm hãm thuận nghịch liên kết với các enzyme bằng các liên kết (tươngtác) phi đồng hóa trị như liên kết hydro, tương tác hydrophobic và liên kết ion Cácliên kết yếu giữa chất kìm hãm và trung tâm hoạt động của enzyme tạo nên kiểu liênkết đặc thù So với cơ chất và chất kìm hãm không thuận nghịch, nói chung các chấtkìm hãm thuận nghịch không có phản ứng hóa học với enzyme và có thể loại bỏ dễdàng bởi chất pha loãng hoặc chất thẩm tách Có 3 kiểu ức chế thuận nghịch mangcác đặc điểm động học khác nhau Đó là kiểu ức chế cạnh tranh (competitiveinhibition và hai kiểu ức chế không cạnh tranh (noncompetitive và uncompetitiveinhibition)

Ức chế cạnh tranh (competitive inhibition)

Các chất ức chế cạnh tranh có thể kết hợp thuận nghịch với trung tâm hoạtđộng của enzyme và cạnh tranh với cơ chất để lấy trung tâm hoạt động Khi trungtâm hoạt động bị chất ức chế chiếm giữ, không thể kết hợp với cơ chất Sự kết hợpcủa chất ức chế cạnh tranh I với enzyme E có thể được mô tả giống sự kết hợp giữaenzyme và cơ chất, mặc dù chất ức chế không chuyển hóa thành sản phẩm:

E + I  EIHằng số phân ly Ki của phức hệ EI là:

Ki =

Hình 2.4 Sơ đồ chất kìm hãm cạnh tranh: cơ chất(S) và chất kìm hãm (I)

(GS.TS Mai Xuân Lương, 2005)

Đặc điểm của ức chế cạnh tranh là có cùng điểm cắt trục tung (1/Vmax ) nhưphản ứng không ức chế nhưng độ nghiêng thì khác với phản ứng không ức chế bởigiá trị 1+ [I]/Km

Hình 2.5 Lineweaver –Burk plot

(GS.TS Mai Xuân Lương, 2005)

Đồ thị trong hình dưới đây cho thấy rõ khi nồng độ của S cao thì phản ứng ít

bị ức chế, ngược lại khi nồng độ của S giảm thì mức độ ức chế tăng lên cùng vớicác giá trị [I]/ [S] và Kim

Hình 2.6 Đồ thị đảo ngược kép mô tả các kiểu ức chế phản ứng enzyme

(GS.TS Mai Xuân Lương, 2005)

(a): ức chế competive, (b): ức chế uncompetitive, (c): ức chế noncompetitive

Km và Vmax được xác định từ độ dốc và các điểm cắt của các phản ứng không ức chế,còn Ki – từ độ dốc và/hoặc chỗ cắt của các phản ứng bị ức chế

Ức chế không cạnh tranh kiểu thứ I ( noncompetitive inhibition )

Trong trường hợp này không có mối quan hệ giữa mức độ ức chế với nồng

độ cơ chất Ức chế chỉ phụ thuộc vào nồng độ của chất ức chế Trái ngược với chất

ức chế cạnh tranh, người ta cho rằng sự hình thành EI xảy ra tại nơi không phải đểenzyme tiếp xúc với cơ chất

Ức chế không cạnh tranh kiểu thứ II (uncompetitive inhibition).

Kiểu ức chế này xảy ra khi một chất ức chế chỉ kết hợp thuận nghịch với phức

hệ ES để tạo ra ESI mà sau đó không thể tạo ra sản phẩm (các chất ức chếnoncompetitive có thể kết hợp với cả enzyme tự do và với phức hệ ES) như vậy:

Ki =

2.2 Động học phản ứng enzyme tyrosinase

2.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc độ chuyển hóa cơ chất

Trong điều kiện dư thừa cơ chất, nghĩa là [S] >>[E] thì tốc độ phản ứng phụthuộc vào [S], V= K[E] có dạng y=ax Nhờ đó người ta đã đo [E] bằng cách đo vậntốc phản ứng do enzyme đó xúc tác

Có nhiều trường hợp trong môi trường có chứa chất kìm hãm hay hoạt hóa thì vậntốc phản ứng do enzyme xúc tác không phụ thuộc tuyến tính với [E] đó

Hình 2.7 Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào [E]

(GS.TS Mai Xuân Lương, 2005) 2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

Ta khảo sát trường hợp đơn giản nhất chỉ một cơ chất với:

E: Nồng độ enzyme tyrosinase

S: Cơ chất

k1: Tốc độ chuyển hóa tạo ra phúc chất (ES) và ngược lại

k2: Tốc độ chuyển hóa phúc chất (ES) tạo ra (E) và (P)

(P): Sản phẩm tạo ra

Gọi v1 là vận tốc của phản ứng tạo thành phức chất ES

Gọi V-1 là vận tốc của phản ứng tạo phân ly phức chất ES tạo thành E và S

Gọi V2 là vận tốc của phản ứng tạo thành E và P (sản phẩm)

V1 = k1[E][S]

V-1 = k-1[ES]

V2 = k2[ES]

Khi hệ thống đạt trạng thái cân bằng ta có:

Phương trình (5) gọi là phương trình Michelis Menten

Km gọi là hằng số Michelis Menten đặc trưng cho mỗi enzyme Km đặc trưng cho

ái lực của enzyme với cơ chất, Km có trị số càng nhỏ thì ái lực của enzyme với cơchất càng lớn, nghĩa là vận tốc của phản ứng do enzyme xúc tác càng lớn

Hình 2.8 Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất

(GS.TS Mai Xuân Lương, 2005)

Khi tăng [S] thì V phản ứng tăng, tăng [S] đến một giá trị nào đó thì V đạtđến giá trị Vmax và sẽ không tăng nữa nếu ta vẫn tiếp tục tăng [S]

Khi Km = [S] thì v0 =1/2 Vmax

2.3 Các chất ức chất enzyme tyrosinase

Các nguồn tự nhiên bao gồm thực vật, vi khuẩn và nấm gần đây ngày càng đượcquan tâm vì hoạt động antityrosinase của chúng bằng cách tạo ra các hợp chất hoạttính sinh học

Thực vật:

Theo các nghiên cứu các hợp chất phenolic là nhóm chất phytochemical lớn nhấtđược tìm thấy trong thực vật, là yếu tố chịu trách nhiệm cho các hoạt động trongchiết xuất thực vật Hoạt động ức chế tyrosinase của nhiều chất chiết xuất từ thựcvật đã được thực hiện để tìm ra các nguồn hợp chất chống tyrosinase mới Ví dụ,các hoạt động chống tyrosinase của các loài thực vật sau đây đã được các nhà

nghiên cứu khác nhau báo cáo: Asphodelus microcarpus, Morus nigra L, Greyia radlkoferi Szyszyl, Limonium tetragonum, Arctostaphylos uva-ursi, Pleurotus ferulae, Agastache rugnososa Kuntze được lên men với Lactobacillus , Artemisia aucheri Boiss, Cassia tora, S brevibracteata subsp, Rhodiola crenulata, Alpinia officinarum Hance và Zanthoxylum bungeanum Maxim, Mangifera indica, Podocarpus falcatus, Momordica charantia, Cymbopogon citrates, Greyia vinife chiết xuất (IC50 = 3,84 mg/ml) và Inula britannica L Ngoài ra, hoạt động ức chế

tyrosinase của 91 cây bản địa từ miền trung Argentina Kết quả của họ đã phê duyệt

hoạt động ức chế của những chất chiết xuất này chống lại tyrosinase: Achyrocline satureioides, Artemisia verlotiorum, Cotoneaster glaucophylla, Dalea elegans, Flourensia campestris, Jodina rhombifolia, Kageneckia lanceolata, Lepechinia floribundhya, Pecca-chiuluro, Porteri vi nấm, Lepe-chiuluroreme Ruprechtia apetala, Senna aphylla, Sida rhombifolia, Solanum argentinum, Tagetes minuta và Thalictrum decipiens Bên cạnh đó, các loài thực vật thuộc họ Moraceae bao gồm các chi Morus, Artocarpus, Maclura (Cudrania), Broussonetia, Milicia (Chlorophora) và Ficus đã cho thấy sự ức chế tyrosinase in vitro Ngoài ra, chiết xuất etanolic và metanolic của một số cây khác như Ardisia elliptica Thunb, Phyllanthus acidus (L.) Skeels, Rhinacanthus nasutus L Kurz (IC50 là 271,50 µg/ml), Arbutus andrachne L (IC50 = 1 mg/ml ), Quả Withania somnifera L Dunal và Solanum nigrum L., Pulmonaria officinalis và Centarium umbellatum và

lá dây leo chân Camel (Bauhinia vahlii) cũng ức chế đáng kể hoạt động của

tyrosinase, các đặc tính ức chế tyrosinase của cây thuốc Peru Trong số các chất

chiết xuất từ thực vật này, Hypericum laricifolium Juss, Taraxacum officinale F.H.Wig (IC50 là 290,4 µg/ml), và Muehlenbeckia vulcanica Meisn (IC50 là

280,1µg/ml) cho thấy hoạt tính chống tyrosinase lớn nhất (Samaneh Zolghadri vàcộng sự, 2019)

Nấm và vi khuẩn

Nấm từ các chi khác nhau như Aspergillus sp, Trichoderma sp, Paecilomyces

sp, Phellinus linteus, Daedalea dickinsii, Dictyophora indusiata cùng với nuôi cấy lỏng của Neolentinus lepideus đã được báo cáo là một nguồn ức chế tyrosinase mới

bằng cách tạo ra các hợp chất hoạt tính sinh học Ngoài ra, đã có một số báo cáo về

chất ức chế tyrosinase từ một số loài nấm biển như Myrothecium sp phân lập từ tảo

và Pestalotiopsis sp Z233 Ngoài ra, có một số báo cáo về sự ức chế tyrosinase của các loài vi khuẩn và các chất chuyển hóa của chúng Trong số đó, Streptomyces sp., Chẳng hạn như S hiroshimensis TI-C3 được phân lập từ đất, một actinobacterium tên là Streptomyces swartbergensis sp Nov và Streptomyces roseolilacinus NBRC

12815 là nguồn vi khuẩn tiềm năng ức chế tyrosine Hơn nữa, một số chất ức chế

tyrosinase đã được báo cáo từ một loại vi khuẩn biển gram âm Thalassotalea sp Pp2-459 và một chủng vi khuẩn lam độc hại, Oscillatoria agardhii Điều thú vị là một số chế phẩm sinh học như Lactobacillus sp được sử dụng trong quá trình lên

men đã được nghiên cứu là nguồn ức chế tyrosinase tự nhiên Dựa trên các nghiêncứu, người ta đã xác nhận rằng các hoạt động sinh lý của chất chiết xuất lên mencao hơn đáng kể so với chất chiết xuất chưa lên men và hoạt tính gây độc tế bào củachúng thấp hơn so với chất chiết xuất chưa lên men Gần đây, sự ức chế tyrosinasecủa bốn chủng vi khuẩn acid lactic khác nhau được phân lập từ phân bò sữa

Bên cạnh các nguồn ức chế enzyme tyrosinase từ tự nhiên còn có các chất ứcchế tyrosinase có nguồn gốc tổng hợp Để loại bỏ melanin tại các vùng tăng sắc tốbằng công nghệ laser màu nhưng có thể gây tổn thương da hoặc bong tróc da Mặc

dù phương pháp này đang được sử dụng khá phổ biến dựa trên nguyên tắc “Phânhủy quang nhiệt chọn lọc” để phá hủy melanin nhưng ít gây tổn thương da Tuynhiên phương pháp này vẫn cần được cải tiến để tránh các tác động không mongmuốn làm tổn thương da hoặc phải dưỡng da rất lâu sau khi xử lý Song song vớiviệc sử dụng các phương pháp trị liệu vật lý, hướng tiếp cận sử dụng các hợp chấthóa học để tẩy lột lớp da cũ nhằm loại bỏ melain tích lũy dưới da cũng được nhiềungười sử dụng, tuy nhiên khi sử dụng các loại kem tẩy trắng da hoặc ức chế vĩnhviễn tế bào sinh sắc tố da sẽ có nguy cơ tạo ra hiện tượng bạch tạng cục bộ hoặcloang màu dẫn đến không thể phục hồi Do đó, nhiều nghiên cứu đã sử dụng một sốhợp chất sau để làm trắng sáng da

Tretinoin: Sử dụng tretinoin ở nồng độ rất thấp có tác dụng điều trị các rối

loạn sắc tố của da, nhưng chỉ được sử dụng vào ban đêm và phải tránh ánh nắng vìTretinoin rất nhạy cảm với tia UV trong ánh sáng mặt trời có thể làm tăng độ mẫncảm của da và càng gây sạm da hơn

Hydroquinone: là nhóm chất được sử dụng trong nhiều năm do có tác dụng ức

chế enzyme tyrosinase dẫn đến ức chế tổng hợp melanin Hydroquione thường dùngvới nồng độ là 2% và 4%, hoặc kết hợp với Tretinoin 0,05% – 0,1% có tác dụng cao

trong điều trị tăng sắc tố Tuy nhiên việc sử dụng cả 2 chất này đã gây ra nhiều tácdụng phụ, trong đó có nguy cơ gây ung thư da, do đó ở Châu Âu hiện nay các loạikem chăm sóc hay dưỡng da mà có chứa thành phần này sẽ bị cấm lưu hành ở bất

cứ nồng độ nào Ở Mỹ, FDA cho phép sử dụng nồng độ hydroquinone ở ngưỡngnồng độ dưới 2% Còn tại các nước châu Á, đặc biệt Nhật Bản và Hàn Quốc vẫnđược chấp nhận với nồng độ dưới 4% Hiện nay tại Việt Nam trên thị trường nhiềuloại kem chứa hydroquinone ở ngưỡng 2%

Acid arbutin: là hợp chất được coi là thần dược trong công nghệ làm trắng da

được sử dụng thay thế cho Hydroquinone vì an toàn hơn và không gây tác dụng phụ

so với hydroquinone nhưng tác động không mạnh, do đó cần có thời gian mới thấytác dụng Về mặt hóa học, phân tử arbutin chứa gốc hydroquinone gắn thêm glucose

do đó nó an toàn hơn và phù hợp với nhiều loại da hơn Arbutin có mặt trong chiếtxuất tự nhiên từ cây dâu tằm và quả của cây việt quất

Acid kojic: là một sản phẩm phụ trong quá trình lên mẹn rượu sake từ gạo có

nguồn gốc tự Nhật Bản có tác dụng làm trắng da do tác dụng ức chế enzymetyrosinase Mặc dù axit kojic có tác dụng tốt để làm trắng sáng da nhưng do khôngbền dễ bị phân hủy dưới ánh sáng mặt trời khó giữ được hoạt tính nhất là sau thờigian bảo quản lâu Hiện nay, tác dụng phụ của acid kojic còn chưa rõ và còn tranhcãi, tuy nhiên đây là thành phần quan trọng có mặt ở nhiều loại mỹ phẩm làm trắngsáng da

Acid azelaic: cũng tương tự như acid kojic, đây là một thành phần của ngũ

cốc, như lúa mì, lúa mạch đen và lúa mạch được đưa vào các loại kem chăm sóc da

ở nồng độ cao có tác dụng điều trị các rối loạn da như trứng cá và làm sáng da Một

số nghiên cứu đã xác định acid azelaic có tác dụng ức chế enzyme tyrosinase

Vitamin C: có tác dụng ức chế enzyme tyrosinase dẫn đến ức chế hình thành

melanin Ngoài ra, vitamin C còn có tác dụng kích thích tổng hợp colagen và chốngoxy hóa Do đó, vitamin C cũng được sử dụng làm thành phần chống lão hóa, làmtrẻ hoá làn da đồng thời do tính acid yếu nên vitamin C có tác dụng giúp da đào thải

các tế bào sừng đã chết và giúp cải thiện tình trạng da hư tổn hoặc có tác dụng hỗtrợ chống nắng Tuy nhiên, vitamin C không bền và dễ bị phân hủy dưới ánh sángmặt trời Khi sử dụng quá nhiều vitamin C trong các kem dưỡng da sẽ có khả năngtăng thêm mụn.

Glutathione và L-Glutathione: Là một dạng tripeptide do cơ thể tự sinh ra (nội

sinh) gồm 3 axit amin cysteine, glutamic và glycine liên kết lại với nhau Trong đócysteine có tác dụng kích thích sản xuất ra nhiều melanin dạng giả melanin(phaomelanin) nên cạnh tranh với sự hình thành melanin thật (Eumelanin), do đócác tác dụng làm sáng trắng da Ngoài ra glutathione còn có tác dụng chống oxy hóamạnh, tăng cường miễn dịch nâng cao sức đề kháng cho cơ thể

Alpha Hydroxy acid (AHA): Chủ yếu ở dạng acid lactic và glycolic có tác dụng

tẩy tế bào chết và ngăn chặn quá trình vận chuyển melanine và giảm lượngmelanine đến các tế bào sừng AHA cũng có tác dụng thúc đẩy đào thải các tế bàochết bong ra ngoài qua đó có tác dụng làm trắng da

Niacinamide (dẫn xuất Vitamin B3) có tác dụng tăng cường hàng rào bảo vệ da

cũng như giảm sự bài tiết melanine ở các tế bào melanocyte Ngoài ra niacinamidegiúp cho da khỏe, sáng đều màu và an toàn khi sử dụng Ngoài ra chất này còn cótác dụng làm se khít lỗ chân lông, chống lão hóa da

Acid salicylic: Là một axit hữu cơ thuộc nhóm BHA (Beta hydroxy acid) tan

trong dầu nên có tác dụng làm sạch sâu, tẩy tế bào chết đồng thời làm sạch các lỗchân lông, có tác dụng điều trị mụn khi kết hợp cùng các thuốc điều trị Vì có tácdụng tẩy tế bào chết giúp đào thải melanine nên có tác dụng nhỏ làm trắng da ởnồng độ 0,5% – 2%

Acid tranexamic: có tác dụng điều trị nám và tàng nhang do ức chế enzyme

tyrosinase dẫn đến ức chế hình thành melanin vừa có tác dụng ức chế tia UV hoạthóa plasmin trong tế bào sừng bằng các ngăn việc liên kết của plasminogen với tếbào sừng, kết quả làm giảm acid arachidonic tự do và có khả năng làm giảm bớt sựhình thành PG2 và làm giảm hình thành nám trong các tế bào sắc tố

2.4 Ứng dụng chất ức chế enzyme tyrosinase

Hiện nay trên thị trường có rất nhiều sản phẩm về làm đẹp Mỗi loại kemdưỡng làm trắng sáng da có thành phần hoạt tính khác nhau, tuy nhiên về cơ bảnphải có những thành phần hoạt chất giúp làm đều màu da, ngăn chặn việc hìnhthành các hắc tố melanin, giúp làm mờ các vùng da bị sạm màu, làn da trắng sáng,đồng thời cấp ẩm sâu và toàn diện Về hoạt chất, các kem làm sáng da thường chứacác hợp chất acid arbutin, acid kojic, các hợp chất sesquiterpene, flavonoid có trongdịch chiết của loài cây thuộc học dâu tằm, dâu đất có tác dụng ức chế hình thành vàchuyển hóa melanin thông qua việc ức chế enzyme tyrosinase Các hợp chất tựnhiên thuộc nhóm flavonoid còn có tác dụng hấp thu tia UV giúp bảo vệ da tránhtác hại do ánh nắng mặt trời Các hợp chất là dẫn xuất của vitamin B, C, E có tácdụng ngăn ngừa các gốc tự do, chống oxy hóa, làm mờ sắc tố, giúp da trắng sáng.Đặc biệt chiết xuất từ hoa anh đào giúp cải thiện tình trạng nám da, tàn nhang Tinhchất hoa anh đào được chứng minh có tác dụng ức chế hoạt động của enzimtyrosinase và tế bào melanona B16, từ đó có tác dụng giúp ngăn ngừa sự hình thànhhắc sắc tố melanin trên da, cải thiện tình trạng nám da hay tàn nhang Tinh chấtdưỡng trắng giúp ngăn ngừa và loại bỏ các sắc tố melamin, bảo vệ da khỏi các yếu

tố có hại Với chiết xuất từ hoa anh đào, tinh chất trà xanh giúp da trắng lên, ngừanám sạm mang lại hiệu quả làm sáng da cao, hạn chế sự phát triển của hắc tốmelamin, đồng thời cung cấp độ ẩm cho da, mang lại làn da tươi sáng rạng rỡ.Người ta đã cho ra sản phẩm tinh chất dưỡng trắng da Naris Nature WhiteningSerum Nhật Bản

Hình 2.9 Tinh chất dưỡng trắng da Naris Nature Whitening Serum Nhật Bản 2.5 Các nghiên cứu về sàng lọc các chất ức chế enzyme tyrosinase

2.5.1 Nghiên cứu hoạt động ức chế enzyme tyrosinase từ tảo lam

Các vấn đề về da, đặc biệt là lão hóa và sạm da là vấn đề thẩm mỹ lớn củacon người Các hợp chất tự nhiên khác nhau đã được sử dụng để giải quyết các đốm

da không mong muốn từ xưa đến nay Ngày nay, xu hướng của những người chămsóc bản thân đối với các sản phẩm tự nhiên ngày càng tăng Các loài vi tảo có cả sự

đa dạng về phân loại và tính ổn định môi trường cao có thể là nguồn cung cấp tốtcho các sản phẩm mỹ phẩm Trong bối cảnh này, các hoạt động ức chế tyrosinase

của chất chiết xuất từ nước và ethanol của Spirulina platensis đã được đánh giá

trong nghiên cứu này Dịch chiết ethanol cho thấy hoạt tính ức chế enzymetyrosinase (IC50: 1,4 × 10−3 g/ml) cao hơn so với dịch chiết nước (IC50: 7,2 × 10−3g/ml) Do cấu trúc giống như cơ chất của chúng, acid ferulic và caffeic trong chiếtxuất ethanol có thể là chất ức chế chính của tyrosinase (S Cengiz Sahin inMolecular Biology, 2017)

2.6.1 Khái quát chung về Spirulina platensis loại vi tảo có hoạt tính ức chế

tyrosinase

2.6.1.1.Đặc điểm sinh học và phân bố của Spirulina platensis

Spirulina platensis là tên gọi do nhà tảo học người Đức –Deurben đặt vào

năm 1827 dựa trên hình thái đặc trưng nhất là dạng sợi xoắn ốc với khoảng 5-7

vòng đều nhau không phân nhánh Spirulina platensis thuộc ngành Cyanobacteria, thuộc chi Arthrospira Là loài trong họ Osciliatoriaceae- nghĩa là chúng có khả

năng vận động tiến về phía trước hoặc phía sau Vận động này được thực hiện bởicác lông ở sườn bên cơ thể (fimbria)- là các sợi có đường kính 5- 7nm và dài 1-2

µm nằm quanh cơ thể Các lông này hoạt động như tay chèo giúp cho vi khuẩn lam

hoạt động Spirulina platensis có khả năng tạo ra các không bào khí nhỏ (gas

vesicle) có đường kính cỡ 70 nm và được cấu trúc từ các sợi protein bện lại

Hình 2.10 Hình ảnh tảo S.Platensis 1, S.Platensis 3, S.Platensis 5 được chụp

dưới kính hiển vi 2.6.2 Hoạt chất sinh học có trong Spirulina platensis

Hàm lượng protein trong Spirulina platensis thuộc vào loại cao nhất trong các

thực phẩm hiện nay, 56-77% trọng lượng khô, cao hơn 3 lần thịt bò, cao hơn 2 lầntrong đậu tương, hàm lượng vitamin rất cao Cứ 1 kg tảo xoắn Spirulina platensis

chứa 55 mgvitamin B1, 40 mg vitamin B2, 3 mg vitamin B6, 2 mg vitamin B12,

113 mg vitamin PP, 190 mg vitamin E,4.000 mg caroten trong đó β-Caroten khoảng

1700 mg (tăng thêm 1000% so với cà rốt), 0,5 mg acid folic, inosit khoảng

500-1000 mg Hàm lượng khoáng chất có thể thay đổi theo điều kiện nuôi trồng, thôngthường sắt là 580–646 mg trong 1kg tảo xoắn Spirulia platensis (tăng thêm 5.000%

so với rau chân vịt), mangan là 23–25 mg, Mg là 2.915-3.811mg, selen là 0,4 mg,canxi, kali, photpho đều khoảng là 1.000-3.000 mg hoặc cao hơn (hàm lượng canxi

tăng hơn sữa 500%) Phần lớn chất béo trong Spirulina platensis là acid béo không

no, trong đó acid linoleic 13.784 mg, γ-linoleic 11.980 mg trên 1 kg tảo xoắn

Spirulina platensis Đây là điều hiếm thấy trong các thực phẩm tự nhiên khác Hàm

lượng cacbon hydrat khoảng 16,5%, hiện nay đã có những thông tin dùng glucoza

chiết xuất từ tảo Spirulina platensis để tiến hành những nghiên cứu chống ung thư.

Trong những năm gần đây, ngày càng có nhiều nghiên cứu về hiệu quả củacác hợp chất tự nhiên có hoạt tính chống oxy hóa, đồng thời việc sử dụng các chấtchống oxy hóa tổng hợp đã bị hạn chế do các nguy cơ gây ngộ độc và ung thư

Spirulina platensis và các thành phần của nó đã được chứng minh có những lợi ích

tích cực về việc cải thiện sức khỏe con người từ suy dinh dưỡng đến các đặc tính

chống oxy hóa Cao chiết Spirulina platensis từ cồn có khả năng ức chế quá trình

peroxide hóa lipid đáng kể (65%) so với các chất chống oxy hóa hóa học như tocopherol (35%), hydroxyanisol butylated (45%) và β-carotene (48%) Cao chiết từ