BÁO cáo môn THÍ NGHIỆM hóa SINH tên bài ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJENDAHL

Bài số 3 Điểm Tên bài: ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG BẰNG PHƯƠNGPHÁP KJENDAHL Ngày thí nghiệm: 29/06/2022 I.Nguyên tắc Qua 2 giai đoạn: • Giai đoạn vô cơ hoá: Nitơ tổng số là tất cả các dạng nitơ

Trang 1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG – Bm CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN THÍ NGHIỆM HÓA SINH

Người hướng dẫn: Ph.D Trần Thị Tuyết Nhung Lớp: 20060302

Tp Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2022

TIEU LUAN MOI download : skknchat123@gmail.com

Trang 3

Bài số 3 Điểm Tên bài: ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG BẰNG PHƯƠNG

PHÁP KJENDAHL Ngày thí nghiệm: 29/06/2022 I.Nguyên tắc

Qua 2 giai đoạn:

• Giai đoạn vô cơ hoá:

Nitơ tổng số là tất cả các dạng nitơ có trong mẫu Khi đót nóng mẫu cần phân

tích với H2SO4 đậm đặc có mặt của chất xúc tác, nitơ tất cả các dạng đạm có

trong mẫu đều biến thành dạng vô cơ (NH4)2SO4 tan trong dung dịch

II.2.1 Rửa sạch bình Parnas-Wagner

• Cho nước vào bình A khoảng nửa bình, thêm vài giọt methyl đỏ; thêm dung dịch

H2SO4 2N cho đến khi nước trong bình hóa đỏ, khóa van (1)

• Cho nước qua ống sinh hàn D, khóa van (2) và (3)

• Đun cho A sôi đều, cho vào C một ít nước cất, mở van (2) cho nước chảy nitơ xuống B(lưu ý: không bao giờ cho nước chảy xuống hết mà giữ lại một ít để hệ thống luôn luôn kín) Hơi nước ở A sẽ từ từ qua E, để như vậy cho tới khi E được khoảng 5 ml Tắt bếp ở A, hơi nước trong máy sẽ nguội làm giảm áp suất ở A và

B do đó nước ở B sẽ rút qua G Khi nước rút hết thêm nước vào C, mở van (2)nước sẽ bị rút hết qua G Ta có thể làm như vậy vài ba lần Nếu nước ở G đầy,

mở van (3) xả hết Xong khóa van (1), (2), (3) Chú ý: khi để erlen E vào hoặc

lấy ra không được để hệ thống bị hở, đặc biệt là các vị trí nối 4,5,6

II.2.2 Cất đạm

Trang 4

Cho vào ống Kjendahl 2mL nước mắm và lắp vào thiết bị vô

cơ hoá mẫu

Bổ sung từ từ 15 mL dung dịch H2SO4 đậm đặc vào ống

Kjeldahl

Thêm 10mL HClO4 làm xúc tác

Đun khoảng 2h đến dung dịch bình trong suốt

Chuyển dung dịch mẫu vào bình định mức 100mL và định

mức vừa đủ 100mL

Lấy 20mL dung dịch sau pha loãng cho vào bình cầu

Lắp ráp bộ thiết bị và bổ sung 20mL H2SO4 vào erlen

Bổ sung vào bình cầu lượng NaOH đậm đặc dư (khoảng

7-10mL)

Đun và cất đạm đến khi NH3 giải phóng hoàn toàn

Cho 5 giọt phenolphtalein vào bình

Định phân dung dịch H2SO4 dư bằng dd NaOH 0.1N

Tính toán hàm lượng (%) nitơ có trong mẫu

Trang 5

II.3 Tính toán:

II.3.1 Tính hệ số hiệu chuẩn F của dung dịch NaOH

• Lấy 10 ml H2SO4 0,1N chuẩn cho vào erlen, định phân bằng NaOH 0,1N

• Tính nồng độ thực tế của dung dịch NaOH đem định phân

• F là tỉ số giữa nồng độ thực tế và nồng độ lý thuyết của NaOH

b: số ml NaOH 0,1N tiêu tốn khi chuẩn độ H2SO4 thừa

V: số ml mẫu đem vô cơ hóa 0,0014: lượng gam nitơ ứng với 1 ml H2SO4 0,1NF: hệ số hiệu chỉnh nồng độ dd NaOH 0,1 N

Tính hàm lượng protein thô thông qua hàm lượng nitơ tổng

• Nitơ trong vật liệu sinh học chủ yếu là nitơ protein ngoài ra còn có một lượng nhỏ nitơ trong các thành phần khác gọi là nitơ phi protein

Nitơ tổng = Nitơ protein + Nitơ phi protein

• Hàm lượng protein trong các vật liệu sinh học được tính bằng cách nhân hàm

lượng nitơ protein với một hệ số chuyển đổi xác định do hàm lượng nitơ có tỉ lệ

ổn định từ 15 đến 18% protein, đại đa số protein là 16%

Trang 6

• Trong các nguyên vật liệu sinh học do hàm lượng nitơ phi protein nhỏ và việc tách riêng rất phức tạp nên theo quy ước người ta tính hàm lượng protein theo

nitơ tổng và gọi là protein thô hay protein tổng Công thứ tính hàm lượng phầntrăm protein thô có trong đại đa số các nguyên liệu là:

Protein (%) = Nitơ (%) x 6,25

Riêng ngũ cốc và đậu có hệ số chuyển đổi là 5,7

Sữa có hệ số chuyển đổi là 6,38

III.1 Kết quả thí nghiệm:

Khi chuẩn độ ta thấy dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt với thể tích

chuẩn độ là 9.7mL

Hình III.1: Kết quả sau khi chuẩn độ

Trang 7

III.2 Kết quả tính toán.

III.2.1 Tính hệ số chuẩn F của dung dịch NaOH:

b: số ml NaOH 0,1N tiêu tốn khi chuẩn độ H2SO4 thừa V: số ml mẫu đem vô cơ hóa

0,0014: lượng gam nitơ ứng với 1 ml H2SO4 0,1N

F: hệ số hiệu chỉnh nông độ dd NaOH 0,1 N

Hàm lượng protein thô là: Protein (%) = Nitơ (%) x 6,25 = 28,36 x 6.25 = 177,25

%

IV Biện luận:

Trang 8

IV.1 Giải thích hiện tượng, các công đoạn chính các thông số thí nghiệm:

-Việc bổ sung từ từ 20mL dung dịch H2SO4 đậm đặc vào ống Kjendahl để vô cơhoá mẫu để tránh hiện tượng háo nước nhanh làm bắn nước tung toé Ta dùng

H2SO4 đậm đặc vì H2SO4 đậm đặc là một chất oxi hoad mạnh không bay hơi ở nhiệt độ phòng mà chỉ bay hơi ở nhiệt độ 450oC-500oC nên hạn chế việc nhiễm độc và tránh thất thoát Ngoài ra H2SO4 là một nguyên liệu dễ kiếm và giá thànhkhông quá mắc

- Ta bổ sung HClO4 để làm tăng nhiệt độ sôi của hỗn hợp giúp quá trình xảy

ra nhanh hơn

- Khi ta nhìn thấy bình trong suốt chứng tỏ sản phẩm đã vô cơ hoá hoàn toàn tạo ramuối (NH4)2SO4 Vì đay là quá trình phân tích và cũng như tiết kiệm hoá chất nên ta chỉpha dung dịch mẫu với nước và lấy một lượng nhỏ để phân tích Sau

đó ta thêm NaOH đậm đặc và đun nóng để đuổi NH3 trong muối (NH4)2SO4 ra

ngoài

- Ta định phân dung dịch bằng NaOH 0.1N Trước đó dung dịch có bổ sung vài giọt phenolphtalein để biết điểm dừng định phân Khi dung dịch vừa chuyền sang màu hồng nhạt bền vững thì quá trình này hoàn tất

IV.2 Nhận xét:

- Kết quả thí nghiệm thu được nhỏ hơn số liệu mà sản phẩm cung cấp

- Đánh giá kết quả: chấp nhận được nếu có do kết quả bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khách quan

-Nguyên nhân ảnh hướng đến kết quả thí nghiệm:

• Do phương pháp đo: phương pháp kjendahl có mức độ sai số nhất định

Trang 9

• Do dụng cụ đo: mỗi dụng cụ đo có một mức độ sai số khác nhau, nếu sai số của thiết bị lớn thì kết quả bị ảnh hướng nhiều.

• Do cách tiến hành đo: các thao tác tiến hành do người thực hiện nên quá trìnhđong vẫn chưa đạt đến độ chính xác cao, các thao tác sẽ bị hạn chế nhất định

-Các phương pháp giảm thiểu sai số:

• Sử dụng các phương pháp khác có độ chính xác cao hơn

• Sử dụng các dụng cụ đong đo chính xác hươn nếu có kinh phí có thể đầu tư các loại máy tự động giúp con người giảm thao tác trực tiếp vào thí nghiệm

• Nâng cao tay nghề của người thực hiện bằng việc luyện tập nhiều lần

-Mở rộng vấn đề: thực tế phương pháp kjendahl đo lượng nitơ tổng khá chính

xác và được áp dụng khác phổ biến trong phòng thí nghiệm Một sooss phương pháp khác cũng được áp dụng nhiều trong việc xác định nitơ tổng là phương

pháp Dumas, phương pháp Biuret, phương pháp Lowly

Bài số 8 Tên bài: ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C VÀ KHẢO SÁT

CÁC ENZY

Trang 10

ME HÔ HẤP

Trang 11

I ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C: I.1 Nguyên tắc:

- Acid ascorbic (vitamin C) là một hợp chất chưa no có chứa nhóm endiol Acid ascorbic bị phá hủy rất nhanh dưới tác dụng của các chất oxy hóa và bền trong môi

trường acid

- Phương pháp dựa trên nguyên tắc acid ascorbic có khả năng oxy hóa thuận nghịch nhờ trong phân tử của nó có nhóm endiol – C(OH) = (OH)C – Ta xác

định acid ascorbic bằng phương pháp chuẩn độ KIO3/KI theo các phản ứng sau

- Lượng iod tạo ra ở phương trình (1) sẽ oxy hóa acid ascorbic thành acid

dehydroascorbic, phương trình (2) Khi hết acid ascorbic, iod thừa sẽ làm

chỉ thị hồ tinh bột hóa xanh

I.2 Cách tiến hành:

I.2.1 Chuẩn bị mẫu:

+ Nếu mẫu rắn: cân m (g) mẫu (sao cho trong 10ml dịch chiết dùng định phân chứa

từ 0,15 – 0,20 mg vitamin C, các nguyên liệu giàu vitamin C như chanh, ớt, khoai tây cân

3 – 5g, rau quả khác cân 10 – 50g; sản phẩm đóng hộp cân 5 – 10g tùy loại) Cho mẫu vào cối, đổ HCl 1% ngập mẫu, khi lấy mẫu

Trang 12

tránh dùng dụng cũ bằng sắt hoặc đồng Nghiền mẫu (không quá 10 phút),

lọc chuyển vào bình định mức, định phân đến vạch bằng HCl 15

+ Nếu mẫu lỏng, chuyển thẳng vào bình định mức, định phân đến vạch bằng HCl 1%

I.2.2 Tiến hành:

+ Hút 10ml dịch chứa vitamin C từ bình định mức vào erlen 100ml, thêm vào vài giọt hồ tinh bột 1% rồi định phân bằng KIO3/KI 0,01N cho đến khi xuất hiện màu xanh (định phân 3 lần, kết quả định phân không sai lệch quá 0,03ml)

+ Tiến hành song song các mẫu kiểm chứng, thay dịch chứa vitamin C bằng dung dịch HCl 1%

I.3 Kết quả:

I.3.1 Kết quả thí nghiệm:

Định phân lần 1, lần 2 và lần 3: Đều xuất hiện màu xanh với chỉ thị hồ tinh bột ở0,3ml KIO3/KI

Định phân mẫu kiểm chứng

Mẫu định phân Mẫu kiểm chứng

Hình I.3.1 Kết quả mẫu sau khi định phân và mẫu kiểm chứng

I.3.2 Kết quả tính toán:

a = 0,3 ml

b = 0,1 ml

Trang 13

Dehydrogenase là nhóm các enzyme oxi hóa khử xúc tác cho phản ứng tách

H trực tiếp từ cơ chất ở giai đoạn đầu của chuỗi hô hấp Có vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp

II.1.2 Cách tiến hành:

Bước 1: Cho vào ống nghiệm vài lát củ cải đã cắt mỏng cỡ 2x2x1mm (dài x rộng

x dày) đến 1/3 ống nghiệm

Bước 2: Thêm dung dịch xanh Methylene 0,01% cho đến khi ngập củ cải 1 cm

Bước 3: Đổ lên trên một lớp dầu lửa để cho kín khí Để Dehydrogenase khôngtác dụng với O2 trong không khí

Bước 4: Đặt ống nghiệm vào nước ấm 40°C trong 30 phút

Trang 14

Bước 5: Làm ống kiểm chứng không chứa củ cải.

Bước 6: Quán sát kết quả, nhận xét và giải thích

II.1.3 Kết quả:

II.1.3.1 Kết quả thí nghiệm

Hình II.1.3.1 Kết quả thu được của thí nghiệm

Chú thích:

+ Ống thí nghiệm bên trái: sau 30 phút, không có thấy hiện tượng xảy ra

+ Ống thí nghiệm bên phải: sau 30 phút, thấy hiện tượng dung dịch Methylene bị

mất màu và chuyển từ màu xanh sang màu xanh trắng

II.1.4 Bàn luận:

+ Ống thí nghiệm bên phải: chứa củ cải dung dịch có nhạt màu hơn Vì

Dehydrogenase oxi hóa khử màu xanh của Methylene và do quá trình sinh tổng hợp của enzyme Dehydrogenase trong củ cải

+ Ống thí nghiệm bên trái: không chứa củ cải thì không có hiện tượng xảy ra

Trang 15

II.2 Catalase II.2.1 Nguyên tắc

Catalase là loại enzyme Hemoprotein Ở tế bào thực vật catalase chứa một nhóm

Hem, khi enzyme xúc tác Fe nhóm ngoại không thay đổi hóa trị

II.2.2 Cách tiến hành

• Nghiền kỹ 10g khoai tây

• Thêm 10ml nước cất nghiền đều → Lọc vào ống nghiệm

• Hút 0,5ml dịch lọc cho vào một ống nghiệm đã có chứa 2ml H2O2 1%, lắc nhẹ

II.2.3: Kết quả thí nghiệm:

Hình II.2.3.1: Hình khoai tây sau khi đã lọc Hình II.2.3.2: Sau khi cho H2O2 1%

vào thì xuất hiện sủi bọt khí II.4 Bàn luận:

- Có hiện tượng sủi bọt và sủi bọt khí càng nhiều khi lắc nhiều là do khí oxi bay lên trong quá trình khoai tây phản ứng với H2O2 1%

Trang 16

Trang 17

Bài số 4:

Tên bài: ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG NITƠ ACID

AMIN Ngày thí nghiệm: 29/06/2022

Sau đó diceto oxyhydidren, NH3 mới tạo thành tiếp tục phản ứng với phân tửninhydrin thứ hai tạo phức hợp có màu xanh tím

I.2 Cách tiến hành:

Lấy 2 ống nghiệm rồi tiến hành như sau:

Trang 18

Ống nghiệm Protein trứng Ninhydrin Gia nhiệt

I.3 Kết quả:

I.3.1 Kết quả thí nghiệm:

Hình I.3.1: Hai ống nghiệm ban đầu Hình I.3.2: Kết quả ống nghiệm sau khi đun

I.4 Bàn luận:

Ta có thể thấy sau khi ống nghiệm đem đi đun nóng một thời gian thì dung dịch

tạo phức có màu xanh tím và có kết tủa lắng xuống đáy ống nghiệm

Có xuất hiện kết tủa là do protein trứng khi ở nhiệt độ cao sẽ có hiện tượng đông

tụ tạo thành tủa

Do ninhydrin ở nhiệt độ cao các acid amin bị dezamin hóa Oxy hóa nhóm

COOH tạo thành NH3 và aldehyde tương ứng ninhydrin bị khử tạo thành diceto

oxyhydidren NH3 mới tạo thành tiếp tục phản ứng với phân tử ninhydrin thứ hai

tạo phức hợp có màu xanh tím

Trang 19

II ĐỊNH LƯỢNG NITƠ ACID AMIN THEO PHƯƠNG PHÁP

SORENSEN II.1 Nguyên tắc:

Dưới tác dụng của formaldehyde (formol) các nhóm amin bị methylene hóa tạo thành các dẫn xuất methylene của các acid amin (Còn gọi là phương pháp chuẩn

độ formol)

R─CH─COOH + HCHO → R─CH─COOH

Các hợp chất tạo thành là những acid mạnh hơn các acid amin tự do, dễ dàng

định phân bằng kiềm qua đó gián tiếp tính được lượng nitơ amin của các acid

amin có trong nguyên liệu

Khi dùng phương pháp này cần chú ý những điểm sau:

❖ Để cho phản ứng tạo dẫn xuất methylene tiến hành hoàn toàn, cần có dư một ít dung dịch formaldehyde và phản ứng trung hòa hoàn toàn các nhóm cacboxyl được thực hiện khi pH môi trường đạt tới 9,2 – 9,5

❖ Arginin không phản ứng với formaldehyde cho nên không tính khi chuẩn bằng kiềm

❖ Tirozin cho kết quả cao hơn vì ngoài nhóm cacboxyl, nhóm phenol cũng

có tác dụng với kiềm Một số acid amin cho kết quả ít hơn như prolin

❖ Nếu trong dung dịch có chứa nhiều NH3, nhất là trong các dịch thủy phân protein thì phải loại bỏ NH3 trước trong chân không ở nhiệt độ

40°C

Trang 20

❖ Các muối amon như NH4Cl, (NH4)2SO4 cũng tác dụng với formaldehyde tạo thành hexamethylene tetramin và acid Acid này sau đó được trung hòa bởi kiềm:

2(NH4)2SO4 + 6CH2O → (CH2)6N4 + 2H2SO4 + 6H2O4NH4Cl + 6CH2O → (CH2)6N4 + 4HCl + 6H2O

❖ Dung dịch nghiên cứu có màu đậm phải pha thật loãng vì nếu màu đậm thìrất khó nhận biết sự thay đổi màu khi chuẩn độ

❖ Dùng phương pháp này thì kết quả chỉ thật đúng với trường hợp acid

monoamino monocacboxylic Để kết quả đúng hơn với mọi trườnghợp (khi trong dung dịch ngoài các acid monoamino monocacboxylic

ra còn có chứa các acid monoamino dicacboxylic và diamino monocacboxylic) cần phải trung hòa dung dịch đến pH 7 trước khi phân tích

❖ Để xác định điểm bắt đầu (pH 7) và điểm kết thúc (pH 9,2), người ta dùng phương pháp so màu Tạo ra hai thang màu chuẩn ở pH 7 và pH 9,2 rồi đưa pH của mẫu về 7(so sánh màu với màu chuẩn pH 7) sau đó định phân đến pH 9,2 (so sánh màu với màu với

pH 9,2)

II.2 Cách tiến hành:

II.2.1 Chuẩn bị thang màu có pH 7 và pH 9,2:

Lấy 2 bình erlen có dung tích như nhau

Cho vào bình thứ nhất: 20mL dung dịch có pH 7 và 5 giọt Bromthymol Blue

0.04%

Trang 21

Cho vào bình thứ 2: 20mL dung dịch có pH 9,2; 5 giọt Bromthymol Blue

0.04% và 3 giọt phenolphtalein 0.5%

Bình thứ hai

Hình II.2.1 Hai bình erlen sau khi pha mẫu

Khi đó dung dịch trong bình thứ nhất có màu xanh lục nhạt, dung dịch trong bình 2 có màu tím xanh

II.2.2 Chuẩn bị dung dịch formol trung tính

Cho vào erlen một luợng formol cần dùng, cho vào 3 giọt phenolphtalein 0.5%.;nhỏ từ từ dung dịch NaOH cho đến khi màu hồng nhạt xuất hiện Đậy nắp erlen.Lưu ý tránh formol xộc vào mũi, mắt

Hình II.2.2 Dung dịch formol sau khi pha

Trang 22

II.3 Tiến hành địnnh phân mẫu:

Xác định lượng nitơ amin trong nước mắm Nước mắm là một dung dịch thủyphân protein có thể định lượng bằng phương pháp chuẩn độ formol

Pha loãng 100 lần 1ml nước mắm bằng nước cất

Lấy vào erlen 20ml mẫu pha loãngThêm 5 giọt Bromthymol Blue

Nếu dung dịch có màu xanh dương: thêm từng giọt HCl hay H2SO4 0.05N

Nếu dung dịch có màu vàng: thêm từng giọt NaOH 0.05N

Dung dịch có màu ứng với màu bình 1 (pH 7)Thêm 5 giọt phenolphtalein 0.5% + 5 mL formol trung tính

Hình II 3.1 Kết quả theo pH 7

Trang 23

Chuẩn độ bằng NaOH cho đến khi dung dịch

có màu ứng với màu của bình 2 (pH 9,2)

Hình II 3.2 Kết quả theo pH 9,2

• Mẫu kiểm chứng: Thay mẫu nước mắm pha loãng bằng mẫu nước cất

Hình II 3.3 Kết quả mẫu kiểm chứng pH 7 Hình II.3.4 Kết quả mẫu kiểm chứng pH 9,2

II.4 Kết quả:

20 ×

Trong đó: x: lượng gam Nitơ acid amin có trong 1L nước mắm

a: số mL NaOH 0.05N dùng để chuẩn dung dịch thí nghiệm

b: số mL NaOH 0.05N dùng để chuẩn dung dịch kiểm chứng

T: hệ số hiệu chỉnh nồng độ của dung dịch NaOH đem dùng so với nồng độ

chuẩn

Tiêu đề	Định Lượng Nitơ Tổng Bằng Phương Pháp KjendaHL
Tác giả	Người hướng dẫn: Ph.D Trần Thị Tuyết Nhung, Nhóm: S4-N2
Người hướng dẫn	Ph.D Trần Thị Tuyết Nhung
Trường học	Trường Đại học Tôn Đức Thắng
Chuyên ngành	Hóa Sinh
Thể loại	Báo cáo môn Thí nghiệm Hóa Sinh
Năm xuất bản	2022
Thành phố	TP. Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	24
Dung lượng	1,69 MB