HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc H ọ và tên tác giả luận văn : Hoàng Thị Lan Anh Đề tài luận văn: Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hiệu lực phòng trừ
TỔ NG QUAN
T ổ ng quan v ề th ự c v ậ t
1.1.1 Th ực vật họ Đậu (Fabaceae)
Họ Đậu, tên khoa học Fabaceae (Leguminosae), là một họ thực vật có hoa rất phổ biến với khoảng 770 chi và 19.500 loài Đây là một họ thực vật lớn và đa dạng nhất, gồm từ các cây thảo mộc, cây bụi, cây thân leo cho đến các cây thân gỗ lớn Họ Đậu phân bố khắp thế giới, chủ yếu ở khu vực ôn đới và nhiệt đới.
HọĐậu được phân thành 3 phân họ(đôi khi coi là các họ riêng biệt) là:
• Mimosoideae (phân họ Trinh nữ)
• Faboideae (Papilionoideae) (phân họĐậu) Đặc điểm chung nhất của các cây họ Đậu là các lá thường là lá kép, hoa thường có 5 cánh và thường là đơn tính, hình thái quả rất đặc trưng Rễ của nhiều cây họ Đậu thường có mối liên hệ cộng sinh đặc trưng với “vi khuẩn cố định đạm” (Rhizobium spp.) gây lên các nốt sần rất đặc trưng (chủ yếu thấy ở phân họ Đậu – Faboideae), nhờ đó thực vật được cung cấp chất dinh dưỡng và đất trồng cũng được cải tạo [2]
Các cây họ Đậu giữ một vai trò quan trọng trong hệsinh thái cũng như nền kinh tế nông nghiệp Một số loài được sử dụng làm thực phẩm (Arachis hypogaea – đậu phộng (lạc), Glycine max – đậu nành (đậu tương), Lens culinaris
– đậu lăng, Pisum sativum – đậu Hà Lan) sử dụng làm nguồn hương liệu
Ceratonia siliqua, hay còn gọi là cây carob, là nguồn thức ăn cho gia súc và là cây có khả năng cải tạo đất nhờ vi khuẩn cố định đạm Đồng thời, cây carob cho dầu, cung cấp gỗ và được sử dụng làm thuốc nhuộm cũng như diệt côn trùng.
Ở Việt Nam, các cây họ Đậu có khoảng 90 chi và trên 450 loài phân bố từ Bắc vào Nam, giữ vai trò quan trọng trong nông nghiệp Tiêu biểu có lạc (đậu phộng) Arachis hypogaea, đậu Hà Lan Pisum sativum, đậu xanh Vigna radiata, đậu nành Glycine max và nhiều loài khác được sử dụng rộng rãi trong sản xuất nông nghiệp.
2 dụng với rất nhiều mục đích khác nhau như làm cảnh, nguồn hương liệu, cung cấp thức ăn cho gia súc, một sốít được dùng để chữa bệnh…
1.1.2 Th ực vật chi Pachyrhizus
Chi CủĐậu – Pachyrhizus gồm tất cả 5 loài được công nhận (trong tổng số hơn 30 loài được ghi chép lại) với tên khoa học lần lượt là:
Ba loại được thuần hóa để canh tác nông nghiệp là Pachyrhizus erosus, Pachyrhizus ahipa và Pachyrhizus tuberosus Đặc điểm chung của chi Pachyrhizus là cây leo hoặc thảo mọc thẳng, một số loài sống lâu năm có rễ củ phát triển thành một hoặc nhiều rễ củ; lá kép mọc xen kẽ trên thân; hoa có đài hoa hình ống và tràng hoa hình thoi Hạt có vỏ hạt tương tự hạt đậu và có màu xanh lá cây, nâu đỏ hoặc đen.
Rễ củ bao gồm một lớp vỏ mỏng màu nâu sẫm, cùi trắng, giòn [4]
1.1.3 Cây c ủ Đậu Pachyrhizus erosus (L.) Urban
1.1.3.1 Giới thiệu chung về cây
Cây Củ đậu có tên khoa học là Pachyrhizus erosus (L.) Urban, thuộc chi
Pachyrhizus, a genus in the Fabaceae family, is commonly referred to as Củ Đậu The plant has several alternative names and synonyms, including Cacara bulbous Thouars, Pachyrhizus articulatus (Lam.) Duch & Walp, Pachyrhizus bulbosus (L.) Kurz, and Pachyrhizus erosus var palmatilobus (Moc & Sessé ex DC.) R T Clausen.
Pachyrhizus erosus là cây bản địa Trung Mỹ, từ Nam Mexico đến Nicaragua và Costa Rica, và đã được du nhập, nhân giống trên nhiều quốc gia nhằm mở rộng vùng trồng trọt, điển hình ở Ấn Độ, Myanmar, Malaysia, Indonesia, Philippines và Việt Nam, đồng thời được trồng ở nhiều nước nhiệt đới ở Nam Mỹ, châu Phi và châu Úc.
3 sử dụng ở các nước trên thế giới như: Kuzuimo (Nhật Bản); Fagiolo Patata, Dolico Bulboso (Italia); Jicama, Yam Bean, Jiquima (Mexico)…
Tại Việt Nam, tên gọi "cây Củ đậu" được dùng chủ yếu ở miền Bắc; ở miền Nam cây được gọi là "củ sắn" hoặc "củ sắn nước" Cây được trồng ở nhiều vùng trên cả nước, nhưng phân bố chủ yếu ở vùng trung du Bắc Bộ và Bắc Trung Bộ.
Cây Củ Đậu (Pueraria lobata) là cây thân thảo leo, có thể dài từ 2–5 m Lá kép gồm 3 lá chét, hình tam giác nhọn hoặc mũi mác, dài 4–8 cm và rộng 4–12 cm Hoa màu tím nhạt, khá lớn, mọc thành chùm dài ở kẽ lá Quả có lông, không cuống, dài khoảng 12 cm và rộng 12 mm, ở khe các hạt hơi lõm xuống Trong quả có tới 9 hạt, đường kính khoảng 7 mm và hình thấu kính Hạt cứng, khó giã nhỏ.
Cây phát triển mạnh trong điều kiện khí hậu nhiệt đới ẩm, với nhiệt độ tối ưu từ 20–28 °C và ở những vùng có lượng mưa vừa phải Cây phù hợp với ánh sáng mặt trời đầy đủ và đất ẩm có khả năng thoát nước tốt, giúp cây phát triển khỏe mạnh.
Hình 1: Cây CủĐậu – Pachyrhizus erosus (L.) Urban
1.1.4 Công d ụng của cây Củ đậu
Cây củđậu được trồng nhiều ở vùng nhiệt đới và vùng cận nhiệt đới, vừa là một loài cây lương thực, vừa là một cây thuốc cổ truyền
Củ đậu có phần củ giòn, chứa nhiều tinh bột và đường, được dùng làm thực phẩm; theo y học cổ truyền, củ đậu được dùng để điều trị mất ngủ [7] và giải nhiệt cho người bị sốt [8] Hạt và lá có độc tính cao đối với cá và côn trùng gây hại, nhưng độc vừa phải với động vật có vú Hạt được nghiền thành bột để làm thuốc trừ sâu ở Việt Nam và các nước nhiệt đới khác Bột từ hạt củ đậu dùng để điều trị một số bệnh phát ban trên da [9,10] Trong dân gian, hạt củ đậu còn được dùng làm thuốc trị chứng mất ngủ [11] Lá củ đậu cũng được dùng trong dân gian để chữa bệnh ngoài da Nước ép của lá được sử dụng để điều trị bệnh tiểu đường, chữa lở loét và bổ gan [12,13].
Các nghiên cứu gần đây cho thấy cây Củ đậu có nhiều công dụng sức khỏe quan trọng, từ chống oxy hóa đến điều hòa miễn dịch Chất chống oxy hóa trong củ đậu giúp bảo vệ tế bào khỏi sự tổn thương do gốc tự do và stress oxy hóa Củ đậu còn được cho là có tác dụng điều hòa miễn dịch, hỗ trợ cân bằng hệ miễn dịch cho cơ thể Ngoài ra, các bằng chứng cho thấy khả năng chống ung thư, cùng với tác dụng hỗ trợ kiểm soát đường huyết và chống tiểu đường Củ đậu cũng được cho là giúp tăng cường sức khỏe xương, giảm nguy cơ loãng xương, và có tác dụng kháng virus cũng như chống lão hóa Nhìn chung, các nghiên cứu gần đây gợi ý nhiều lợi ích sức khỏe từ cây Củ đậu cho người dùng.
Các thành phần hoạt tính từ củ đậu có khả năng chống oxy hóa và ức chế quá trình hình thành hắc tố, mang lại tác dụng làm trắng da Nhờ khả năng bảo vệ da khỏi gốc tự do và ức chế sản sinh melanin, chúng được ứng dụng trong các sản phẩm chăm sóc da như kem chống nắng và trong các sản phẩm thực phẩm chức năng nhắm tới làm đẹp da Việc đưa chiết xuất củ đậu vào công thức mỹ phẩm giúp tăng cường khả năng bảo vệ da trước tác động của môi trường và hỗ trợ làm sáng da tự nhiên.
Có thể nói ngoài giá trị dinh dưỡng, cây Củ đậu có nhiều lợi ích và tiềm năng trong ngành công nghiệp thực phẩm, y tế, mỹ phẩm
1.2 Tình hình nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của cây củ Đậu (P erosus)
1.2.1 Tình hình nghiên c ứu hóa học
Củ P erosus có thành phần dinh dưỡng chủ yếu là nước 82%, carbohydrate 14,9%, dầu 1,4%, protein 1,2% và lipid 0,1%, đồng thời chứa một số axit béo, axit amin và khoáng chất vi lượng [14] Hàm lượng protein của hạt P erosus đạt 28,27%, lipid 26,8%, carbohydrate thô 26,85% và chất xơ 6,2%, với Fe và Ca cao hơn so với các hạt cây họ đậu khác [15] Hàm lượng dầu trong hạt dao động khoảng 20-28%, gồm các axit béo palmitic, stearic, oleic và linoleic.
[16] Hạt P erosus là nguồn protein chất lượng tốt nhưng có độc (rotenone) nên ít được sử dụng
Mẫu thực vật
Đối tượng nghiên cứu là mẫu lá cây Củ đậu (Pachyrhizus erosus), được thu hái vào năm 2020 tại xã Cẩm La, huyện Kim Thành, tỉnh Hải Dương Tên khoa học của cây là Pachyrhizus erosus.
Pachyrhizus erosus (L.) Urban là loài thuộc chi Pachyrhizus, họ Fabaceae, được xác định bởi Tiến sĩ Nguyễn Thị Phương Anh tại Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam (VAST).
- Thu hái mẫu và giám định tên khoa học
- Xử lý mẫu tạo dịch chiết tổng và dịch chiết phân đoạn
- Đánh giá hoạt tính kháng nấm bệnh cây trồng của các phân đoạn chiết từ lá cây Củđậu
- Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất.
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Thu hái và x ử lý mẫu
Mẫu thực vật thu hái về, đem cắt nhỏ, phơi và sấy khô ở 40 o C, xay nhỏ
Quá trình chiết xuất bột lá cây (1 kg) được thực hiện bằng methanol (MeOH) 5 lần, có sự hỗ trợ của sóng siêu âm ở nhiệt độ 40–45°C Dịch chiết MeOH được cô đặc và loại bỏ dung môi, sau đó chiết phân tầng theo thứ tự tăng dần độ phân cực bằng các dung môi như n-hexane, dichloromethane và ethyl acetate nhằm tách các hợp chất có độ phân cực khác nhau.
EtOAc Cất loại dung môi bằng máy cô quay giảm áp thu được các cao chiết tương ứng
2.2.2 Phương pháp sắc ký để phân lập chất
Phân lập các hợp chất tinh khiết từcác phân đoạn chiết bằng phương pháp sắc ký cột (CC) kết hợp với sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký cột (CC) ứng dụng các chất hấp phụ khác nhau, bao gồm silicagel pha thường và silicagel pha đảo (RP-18), cùng Sephadex LH-20, và được giải hấp bằng các hệ dung môi phù hợp để tách chiết hiệu quả Quá trình này cho phép tách và tinh chế hợp chất mục tiêu, sau đó hợp chất được tinh chế bằng cách lặp lại sắc ký cột và kết tinh lại để đạt độ tinh khiết mong muốn.
2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được
Sử dụng kết hợp các phương pháp phổ:
Khối phổ phân giải cao (HR-ESI-MS)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 ( 13 C-NMR) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều (2D-NMR) như HSQC,
2.2.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống nấm invitro
Hoạt tính kháng nấm của các chất đối với cây trồng được đánh giá bằng phương pháp poisoned food technique trên môi trường thạch khoai tây PDA Thí nghiệm được tiến hành tại Trung tâm Nghiên cứu Triển khai các Hoạt chất sinh học, Viện Hóa học Công nghiệp Việt Nam, nhằm xác định khả năng ức chế sự phát triển của nấm gây hại Quy trình thử nghiệm gồm chuẩn bị môi trường PDA, bổ sung các hợp chất ở nồng độ quy định và theo dõi sự tăng trưởng của nấm so với nhóm đối chứng trong điều kiện kiểm soát Kết quả từ thí nghiệm sẽ cung cấp dữ liệu phục vụ cho ứng dụng các hoạt chất sinh học trong kiểm soát nấm bệnh cây trồng.
D ụ ng c ụ thi ế t b ị và hóa ch ấ t
Sắc kí cột thường (CC): cột thủy tinh kích cỡ thích hợp, sử dụng chất hấp phụ là silica gel 60 (0.040 – 0.063 mm, Merk), RP-C18 silicagel (150àm, YMC)
Sắc ký gel sử dụng để tách các chất có trọng lượng phân tử khác nhau Pha tĩnh sử dụng là gel Sephadex LH20 (25-100àm, Sigma-Aldrich)
Sắc ký bản mỏng phân tích (TLC): sử dụng bảng nhôm tráng sẵn silica gel
Trên đĩa TLC, hai loại đế 60 F254 và RP-18F254s có độ dày 0,2 mm (Merk) được sử dụng cho phân tích Quá trình theo dõi các hợp chất diễn ra bằng đèn huỳnh quang UV ở bước sóng 254 nm, sau khi nhúng mẫu vào thuốc thử vanillin-H2SO4, và bản mỏng được sấy ở 100 °C trong khoảng 1–2 phút để hiển thị các vết phân tích dưới ánh sáng UV.
Phổ HR-ESI-MS ghi máy X500 QTOF (MA-USA)
Các phổ 1H-NMR và 13C-NMR được ghi trên máy Bruker Avance-500, dùng tetramethylsilane (TMS) làm chất nội chuẩn và thể hiện độ dịch chuyển hoá học δ bằng ppm Dung môi đo phổ gồm Me2CO-d6 và DMSO-d6.
Tất cả các phổ đều đo tại Viện Hóa-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (VAST)
Các thiết bị sử dụng: máy cô quay giảm áp, bể chiết siêu âm, bộchưng cất dung môi,…
Trong quá trình nghiên cứu, danh mục hóa chất bao gồm n-hexane, EtOAc (ethyl acetate), MeOH (methanol), dichloromethane, chloroform, ethanol, acetone, H2SO4, CH3COOH và vanillin Các dung môi dùng cho sắc ký được cất lại trước khi sử dụng nhằm đảm bảo an toàn, giảm thiểu ô nhiễm và tăng tính tái sử dụng.
- Đèn UV (bước sóng 254-366 nm).
Chi ế t m ẫ u th ự c v ậ t
Lá Củđậu sau khi thu hái được phơi và sấy khô, sau đó nghiền thành bột
Bột lá Củđậu (1,0 kg) được ngâm chiết siêu âm bằng MeOH (5 lần x 5 lít) ở 45 °C trong 1 giờ Dịch chiết tổng MeOH được cất loại dung môi đến 1 lít, sau đó chiết phân bố với n-hexane (5 lần x 1 lít) Dịch chiết tổng n-hexane sau khi cô quay loại dung môi thu được 51,5 g phân đoạn chiết n-hexane Phần dịch chiết còn lại.
Sau quá trình chiết với n-hexane và sấy cô quay ở áp suất giảm, 213 g cao chiết được thu Phần cao chiết này được hòa tan trong 1 L dung dịch MeOH/H2O để chuẩn bị cho các bước xử lý tiếp theo.
2, v/v) và tiếp tục chiết phân bố trong EtOAc bão hoà (5 lần x 1 lit) Dịch chiết
EtOAc và phần dịch nước còn lại được cất loại dung môi thu được 38 g phân đoạn chiết EtOAc và 87 g cao nước
Quy trình chiết mẫu lá cây Củđậu được trình bày ởsơ đồ:
Sơ đồ 1: Sơ đồ chiết mẫu lá Củđậu P.erosus
Phân l ậ p tinh ch ế các h ợ p ch ấ t t ừ cao chi ế t EtOAc c ủ a lá cây C ủ đậ u
3.3.1 Quy trình phân l ập chất
Quá trình sắc ký cột được thực hiện bằng cột thủy tinh đường kính 6 cm, chiều dài 80 cm, với silica gel nhồi ướt ở tỉ lệ chất trên silica gel 1/5 cho 35 g cao chiết EtOAc Hệ rửa giải được điều chỉnh theo D/A với acetone tăng dần từ 0% đến 100%, sau đó chuyển sang hệ D/M ở tỉ lệ 10:1 đến 1:1 (v/v) Quá trình rửa giải được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng TLC với các hệ dung môi thích hợp Các ống nghiệm có vết giống nhau trên TLC được gộp lại thành các phân đoạn lớn và sau khi cô quay dung môi thu được 9 phân đoạn, được đánh số từ P1 đến P9.
3.2.1.1 Phân đoạn P-1 (hợp chất EPE12, EPE3.1, EPE7)
Phân đoạn P1 (600mg) được tiếp tục phân tách bằng cột sắc ký pha đảo RP-
C18 silica gel được rửa giải bằng dung môi MeOH/H2O (3:1, v/v) để thu được ba phân đoạn nhỏ P1.1 đến P1.3 Phân đoạn P1.1 và P1.3 được tinh chế tiếp bằng sắc ký bản mỏng trên silica gel, sử dụng hệ dung môi n-hexane/acetone (2:1, v/v), thu được các hợp chất EPE12 (2 mg) và EPE3.1 (34,3 mg) Phân đoạn P1.2 được tinh chế bằng sắc ký cột silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexane/acetone (5:1, v/v) và thu được hợp chất EPE7 (29,5 mg).
3.2.1.2 Phân đoạn P5 (hợp chất EPE2)
Phân đoạn P5 (630 mg) được tách bằng sắc ký cột Sephadex LH-20 rửa giải bằng dung môi MeOH, thu được hai phân đoạn con là P5.1 và P5.2 Phân đoạn P5.2 được tinh chế bằng sắc ký pha đảo RP-C18 trên silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi MeOH/H2O (2:3, v/v) để thu được hợp chất EPE2 (2,7 mg) ở dạng bột màu trắng, Rf = 0,24 trong hệ D/M = 9/1.
3.2.1.3 Phân đoạn P6 (hợp chất WPE8)
Phân đoạn P6 (450 mg) được phân tách bằng sắc ký cột Sephadex LH‑20 và rửa giải bằng dung môi MeOH, cho thu được phân đoạn chứa một chất chính Phân đoạn này được tinh chế thêm bằng sắc ký cột RP‑C18 silica gel với hệ dung môi rửa giải MeOH/H2O (1:1,5, v/v), thu được hợp chất WPE8 (70,8 mg).
Sơ đồ 2: Sơ đồ phân lập chất từ cao chiết EtOAc của lá cây Củđậu P Erosus
3.3.2 D ữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được:
2 mg hợp chất EPE12 thu được từ phân đoạn P1.1 ở dạng bột, màu vàng chanh, có R f = 0,25 trong hệ dung môi H/A = 2/1
Phổ HR-ESI-MS (positive): m/z = 361,1055 [M+Na] + (khối lượng tính toán 361,1046, C20H18O5Na) Công thức phân tử C20H18O5
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR (500MHz, CD3OD): δ (ppm) 7,96 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-6’), 7,83 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-β), 7,66 (1H, d, J = 16,0
Hz, H-α), 7,65 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2, 6), 6,87 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3, 5), 6,51 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-5’), 6,24 và 5,88 ( mỗi vị trí 1H , s, H-4”a và H-4”b), 4,09 (2H, s, H2-1”), 1,91 (3H, s, H3-5”)
Phổ 13 C-NMR (125MHz, CD3OD): δ (ppm): 201,9 (C-2”), 193,7 (C-β’), 165,3 (C-4’), 164,0 (C-2’), 161,5 (C-4), 145,6 (C-β), 145,5 (C-3”), 131,8 (C-2, C-6), 131,5 (C-6’), 127,9 (C-1), 125,6 (C-4”), 118,4 (C-α), 116,9 (C-3, C-5), 114,5 (C-1’), 111,1 (C-3’), 108,1 (C-5’), 33,3 (C-1”), 17,9 (C-5”)
34,3 mg hợp chất EPE3.1 thu được từ phân đoạn P1.3 ở dạng bột màu vàng, có R f = 0,28 trong hệ dung môi H/A = 2/1
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR (CD3OD, 500MHz): δ (ppm) 7,85 (1H, d, J = 15,5, H-β), 7,73 (1H, d, J = 9, H-6’), 7,56 (2H, d, J = 8,5, H-2,6), 7,47 (1H, d, J = 15, H-α), 6,88 (2H, d, J = 8,5, H-3,5), 6,42 (1H, d, J = 8,5, H-5’), 5,31 (1H, t , J = 7,25, H-2”), 3,48 (2H, d, J = 7, H-1”), 1,84 (3H, s, H-4”), 1,77 (3H, s, H-5”)
Phổ 13 C-NMR (CD3OD, 125MHz): δ (ppm): 192,2 (C-β’), 163,9 (C-2’), 161,5 (C-4’), 158,1 (C-4), 144,0 (C-β), 135,8 (C-3”), 130,5 (C-2, C-6), 129,2 (C- 6’), 127,8 (C-1), 121,2 (C-2”), 118,1 (C-α), 116,0 (C-3, C-5), 114,2 (C-1’), 107,7 (C-5’), 25,8 (C-5”), 21,8 (C-1”), 17,9 (C-4”)
29,9 mg hợp chất EPE7 thu được từ phân đoạn P1.2 ở dạng bột màu trắng, có R f = 0,2 trong hệ dung môi H/A = 2/1
Phổ HR-ESI-MS (positive): m/z = 339,1209 [M + H] -+ (khối lượng tính toán 339,1227, C20H19O5), tương ứng với công thức phân tử C20H18O5
1H-NMR (CDCl3, 500MHz): δ (ppm) 7,83 (1H, s, H-2); 6,39 (1H, s, H-8); 7,39 (2H, brd, J = 8,5Hz, H2’, 6’); 6,89 (2H, brd, J = 9,0Hz, H3’, 5’); 3,46 (2H, d, J = 7,0Hz, H-1”); 5,28 (1H, t, J = 2,5Hz, H-2”); 1,78 (1H, s, H-4”); 1,84 (1H, s, H-4”); 13,21(1H, s, 5-OH), 6,26 (1H, s, OH), 5,12 (1H, s, OH)
2,7 mg hợp chất EPE2 thu được từphân đoạn P5 ở dạng bột màu trắng, có
R f = 0,24 trong hệ dung môi CH2Cl2/CH3OH = 9/1
1H-NMR (CD3OD, 500MHz) δ (ppm) 5,40 (1H, brd, J = 15,0Hz, H-2),
3,19 (1H, dd, J = 13,0 H, H-3a), 2,78 (1H, dd, J = 3,0, 17,0 Hz, H-3b); 6,21 (1H, brs, H-6); 6,23 (1H, brs, H-8); 7,33 (2H, d, J = 8,5Hz, H-2’, 6’); 6,83 (2H, d, J 8,5Hz, H-3’, 5’); 5,00 (1H, d, J = 6.0Hz, H-1”); 3,46-3,5 (3H, m, H2”, 3”, 4”); 3,41 (1H, dd, J = 9,5, 7,0Hz, H-5”); 3,89 (1H, d, J = 11,0Hz, H-6”a); 3,71 (1H, m, H-6”b)
13C-NMR (CD3OD, 125MHz) δ (ppm) 80,7 (C-2); 44,1 (C-3); 198,6 (C- 4); 164,6 (C-5); 98,0 (C-6); 167,0 (C-7); 96,9 (C-8); 165,1 (C-9); 104,9 (C-10); 130,9 (C-1’); 129,1 (C-2’, 6’); 116,3 (C-3’, 5’); 159,1 (C-4’); 101,3 (C-1”); 74,6 (C-2”); 78,2 (C-3”); 71,1 (C-4”); 77,8 (C-5”); 62,3 (C-6”)
70,8 mg hợp chất WPE8 thu được từphân đoạn P6 ở dạng bột màu vàng, có R f = 0,35 trong hệ dung môi M/W = 1/1 (TLC-RP18)
1H-NMR (DMSO-d6, 500MHz) δ (ppm) 8,01 (2H, d, J = 8,5Hz, H-2’, 6’), 6,90 (2H, d, J = 8,5Hz, H-3’, 5’), 6,75 (1H, s, H-3), 6,27 (1H, s, H-6), 4,70 (1H, d, J = 9,5Hz, H-1’’), 3,16-3,85 (6H, m, H2’’-H6’’)
3.4 Đánh giá hoạt tính chống nấm in vitro của các phân đoạn chiết
Hai chủng nấm bệnh cây trồng được sử dụng để thử nghiệm bao gồm:
Loài nấm Phytophthora capsici gây bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu Chúng được phân lập từ các mô bị nhiễm ở lá và thân của hồ tiêu đen trồng tại miền Trung Việt Nam.
+ Chủng nấm Magnaporthe grisea là tác nhân gây bệnh đạo ôn trên cây lúa, được cung cấp bởi Viện Bảo vệ thực vật Việt Nam
Mẫu thử nghiệm bao gồm các phân đoạn chiết n-hexane (H-PE) và EtOAc
(E-PE) từ lá cây Củ đậu, các mẫu cao chiết được thử nghiệm ở 02 nồng độ 500 và 1000àg.mL -1
Hoạt tính kháng nấm được thử trên đĩa thạch Petri chứa môi trường PDA được chuẩn hóa với khoai tây 250 g, glucose 15 g, agar 15 g, pH 6,8–7 Các chủng nấm bệnh được phân lập và làm thuần; dụng cụ đục lỗ đường kính 4 mm được dùng để tạo vành ngoài quanh vòng lan tản nấm, sau đó đặt lên môi trường đã hòa cao chiết Cao chiết được hòa tan trong DMSO và trộn vào môi trường PDA nóng chảy ở 50°C, rồi tiệt trùng và để nguội trước khi sử dụng Mỗi nồng độ khác nhau được thử lại 3 lần trên PDA Theo dõi sự phát triển của nấm và đánh giá hiệu lực của từng loài bằng đo đường kính tán nấm và tính hiệu quả theo công thức đã mô tả.
Trong đó Dc: đường kính tản nấm trên đĩa petri đối chứng (mm)
Dt: đường kính tản nấm trên đĩa petri trộn mẫu thử (mm)
Bảng 5: Kết quả thử nghiệm hoạt tính chống nấm in vitro
Mẫu thử Phytophthora capsici Magnoporthe grisea
500 àg.mL -1 1000 àg.mL -1 500 àg.mL -1 1000 àg.mL -1 H-PE 29,4 ± 3,6 56,5 ± 3,3 39,4 ± 2,2 55,3 ± 0,5 E-PE 54,2 ± 0,7 89,2 ± 1,9 49,4 ± 0,9 81,2 ± 2,4
KẾ T QU Ả VÀ TH Ả O LU Ậ N
Nguyên li ệ u th ự c v ậ t
Mẫu lá cây Củ đậu (Pachyrhizus erosus) được thu hái vào tháng 03 năm
2020 tại xã Cẩm La, huyện Kim Thành, tỉnh Hải Dương Tên khoa học của cây được xác định là Pachyrhizus erosus (L.) Urban, chi Pachyrhizus, họ Fabaceae
Mẫu lá tươi được cắt nhỏ, phơi trong bóng râm và sấy ở 40°C cho đến khi khối lượng ổn định, thu được 1 kg mẫu lá khô Lá khô được xay nhuyễn và ngâm chiết bằng dung môi để thu được cao chiết tổng; tiếp tục ngâm chiết với các dung môi có độ phân cực tăng dần nhằm tách các phân đoạn nhỏ, phục vụ cho quá trình nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học và phân lập các chất.
Kh ả o sát ho ạ t tính ch ố ng n ấ m in vitro c ủa các phân đoạ n chi ế t
Kết quả ở Bảng 5 trang 25 cho thấy dịch chiết EtOAc có khả năng ức chế sự phát triển của các chủng nấm thử nghiệm tốt hơn dịch chiết n-hexane Cụ thể, dịch chiết EtOAc thể hiện hoạt tính ức chế 89,2% đối với chủng Phytophthora capsici và 81,2% đối với chủng Magnaporthe grisea ở nồng độ 1000 µg/mL Trên cơ sở các kết quả này, luận văn sẽ lựa chọn nghiên cứu phân lập các hợp chất từ dịch chiết EtOAc của lá Củ đậu và tiến tới thử nghiệm hoạt tính chống nấm của các nhóm chất phân lập từ dịch chiết này.
Phân l ậ p ch ấ t
Phân đoạn cao chiết ethyl acetate (EtOAc) từ lá cây Củ đậu được triển khai bằng sắc kí cột với các chất hấp phụ khác nhau (silica gel, Sephadex LH-20, RP18), sau đó tiến hành tinh chế để thu được 5 hợp chất.
Bảng 6: Các hợp chất phân lập từ cao EtOAc của lá cây Củđậu
STT Phân đoạn tinh chế
Ký hiệu hợp chất Trạng thái R f
1 P1.1 EPE12 Dạng bột, màu vàng 0,25 2,00
2 P1.2 EPE7 Dạng bột, màu trắng 0,2 29,5
3 P1.3 EPE3.1 Dạng bột, màu vàng 0,28 34,3
4 P5.2 EPE2 Dạng bột, màu trắng 0,24 2,7
5 P6 WPE8 Dạng bột, màu vàng 0,35 70,8
Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được
Hợp chất EPE12 phân lập được từ phân đoạn chiết EtOAc của lá cây Củ đậu tồn tại ở dạng bột màu vàng chanh
Phổ HR-ESI-MS ion dương cho peak ion giả phân tử tại m/z = 361,1055
[M+Na] + (khối lượng tính toán 361,1046 tương ứng với công thức C20H18O5Na) Như vậy công thức của phân tử của EPE12 được xác định là C20H18O5
Hình 5: Phổ HR-ESI-MS của hợp chất EPE12
Phổ 1 H-NMR của EPE12 chỉ ra các tín hiệu tương ứng với một khung chalcone bao gồm: hai tín hiệu doublet của 2 proton olefinic có cấu hình trans tại δH 7,66 (1H, d, J,0 Hz, Hα) và 7,83 (1H, d, J,0 Hz, Hβ); 2 tín hiệu doublet đặc trưng cho 2 proton thơm của vòng A ở vị trí ortho (J orhtor= 9,0 Hz) tại δH 7,96 (H-6’) và 6,51 (H-5’); và các tín hiệu proton đặc trưng của một hệ spin A2B2 của vòng B đã bị thếở vị trí para tại δH 7,65 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2,6) và 6,87(2H, d, J = 8,5 Hz, H-3,5) Phổ 1 H-NMR của EPE12 còn chỉ ra sự có mặt của một nhóm 2-oxo-3-metylbut-3-enyl với các tín hiệu proton đặc trưng tại δH
Hình 6: Phổ 1 H-NMR của hợp chất EPE12
Hình 7:Phổ 13 C-NMR và DEPT của hợp chất EPE12
Phổ 13 C-NMR và DEPT của EPE12 chỉ ra sự có mặt của 18 tín hiệu carbon bao gồm: 2 carbon cacbonyl ở δC 201,9 và 193,7; 14 tín hiệu trong vùng carbon thơm và carbon olefin, một nhóm methylene ở δC 33,3 và một nhóm metyl ởδ C 17,9 Các dữ liệu phổ 1 H và 13 C NMR của hợp chất EPE12 gợi ý một
29 khung chalcone đã bị thế bởi 3 nhóm hydroxyl và một nhóm 2-oxo-3-methylbut- 3-enyl
Hình 8: Phổ HMBC của EPE12
Vị trí của các nhóm thế trên khung chalcone được xác định thông qua các tương quan trên phổ HMBC của EPE12 Nhóm 2-oxo-3-methylbut-3-enyl được xác định tại vị trí C-3’ của khung chalcone thông qua các mối tương quan HMBC giữa nhóm thế và các nguyên tử cacbon liên quan trong khung.
H2-1” với C-2’, C-4’, và C-3’; giữa H-4”a và H-4”b với C-2”, C-3”, và C-5”; giữa H3-5” với C-2”, C-3”, và C-4”
Phân tích chi tiết dữ liệu phổ của EPE12, kết hợp so sánh với dữ liệu phổ 1H và 13C NMR của xanthoangelol K [55], cho thấy dữ liệu phổ của EPE12 có sự tương đồng đáng kể với xanthoangelol K ở nhiều tín hiệu và đồng thời tiết lộ một số khác biệt ở các vùng tín hiệu đặc trưng Việc đối chiếu này hỗ trợ nhận diện cấu trúc và xác nhận các nhóm chức chính, từ đó củng cố mối liên hệ giữa hai hợp chất về mặt phổ học Dữ liệu 1H NMR và 13C NMR cung cấp cái nhìn tổng quan về môi trường hóa học của các nguyên tử trong EPE12, giúp so sánh với hồ sơ phổ đã được ghi nhận của xanthoangelol K và phục vụ cho quá trình nhận diện và khẳng định tính đồng cấu hoặc liên hệ giữa hai hệ chất.
EPE12 gần như tương đồng với xanthoangelol K, với duy nhất một điểm khác biệt tại vị trí C-4’: nhóm OH trên EPE12 bị thay thế bởi nhóm OCH3 trong xanthoangelol K Do đó, cấu trúc của hợp chất EPE12 được xác định là 2’,4’,4-trihydroxy-3’-[2”-oxo-3”-methylbut-3”-enyl]chalcone Đây là một hợp chất mới và được đặt tên là erosusone.
Hình 9: Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC của hợp chất EPE12
Bảng 7: Dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR của chất EPE12 và xanthoangelol K
5' CH 108,1 6.51 (1H, d, J = 9.0 Hz) 103,1 6,69 (d, J = 8.8 Hz) 6' CH 131,5 7.96 (1H, d, J = 9.0 Hz) 131,7 8,23 (d, J = 8.8 Hz)
5'' CH3 17,9 1.91 (3H, s) 17,9 1,85 (s) α CH 118,4 7.66 (1H, d, J = 16.0 Hz) 118,2 β CH 145,6 7.83 (1H, d, J = 16.0 Hz) 145,5 β' C 193,7 193,4
Hợp chất EPE3.1 thu được từphân đoạn P1.3 ở dạng bột màu vàng, khối lượng 34,3 mg, có R f = 0,28 trong hệ dung môi H/A = 2/1
Hình 10:Phổ 1 H NMR của hợp chất EPE3.1
Phổ 1 H-NMR của hợp chất EPE3.1 tương tự như EPE12 cũng chỉ ra các tín hiệu tương ứng với 1 khung chalcone bao gồm: hai tín hiệu doublet của 2 proton olefinic có cấu hình trans tại δH 7,47 (1H, d, J = 15,0 Hz, Hα) và 7,85 (1H, d, J,5 Hz, Hβ); 2 tín hiệu doublet đặc trưng cho 2 proton thơm của vòng
An ortho-substituted position shows proton resonances at δH 7.73 (H-6') with J = 9.0 Hz and 6.42 (H-5') with J = 8.5 Hz, while the proton signals of an A2B2 spin system on ring B indicate a para-substitution pattern at δH 7.56 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2',6) and 6.88 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-3',5') The 1H-NMR spectrum of EPE3.1 also reveals the presence of a 3-methylbut-2-enyl group with characteristic protons at δH 5.31 (1H, t, H-2''), 3.48 (2H, d, H2-1''), 1.84 (3H, s, H3-4''), and 1.77 (3H, s, H3-5'').
Hình 11 : Phổ 13 C-NMR, DEPT của hợp chất EPE3.1
Phổ 13 C-NMR và DEPT của EPE3.1 chỉ ra sự có mặt của 18 tín hiệu carbon cộng hưởng bao gồm 1 carbon cacbonyl tại δC 192,2 ; 14 carbon thơm hoặc olefin, một nhóm metylen δC 21,8 và hai nhóm metyl ởδC 25,8 và 17,9 Các dữ liệu phổ 1 H và 13 C NMR gợi ý một khung chalcone đã bị thế bởi 3 nhóm hydroxyl và một nhóm 3-methylbut-2-enyl
Hình 12: Phổ HMBC của hợp chất EPE3.1
Phân tích HMBC cho thấy các tín hiệu từ H2-1” tương quan với C-2’, C-4’, C-3”, C2” và C-3’, trong khi tín hiệu từ H3-4” và H3-5” liên kết đến C-2”, C-3”, giúp xác định vị trí gắn của nhóm 3-methylbut-2-enyl ở C-3’ của khung chalcone Việc so sánh dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của mẫu hỗ trợ xác nhận cấu trúc và vị trí nhóm chức, bằng cách đối chiếu các đặc điểm tín hiệu, phân chia và các đặc tính hóa học của các carbon và proton liên quan.
EPE3.1 với tài liệu tham khảo [56] khẳng định hợp chất EPE3.1 là isobavachalcone
Hình 13:Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC của EPE3.1
Bảng 8: Dữ liệu phổ 1 H, 13 C NMR của chất EPE3.1 và isobavachalcone
Vị trí C EPE3.1 (CDCl 3 ) isobavachalcone [56]
Hợp chất EPE7 thu được từphân đoạn P1.2 với khối lượng 29,9 mg, dạng bột trắng, có R f = 0,2 trong hệ dung môi H/A = 2/1
Hình 14: Phổ HR-ESI-MS của hợp chất EPE7
Phổ HR-ESI-MS ion dương cho pic ion giả phân tử tại m/z 339,1209 [M + H]+ cho hợp chất EPE7 xác nhận công thức phân tử là C20H19O5, với khối lượng tính toán 339,12270 Kết hợp với dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), thông tin này xác nhận EPE7 có công thức phân tử C20H19O5.
Phổ 13 C-NMR và DEPT kết hợp với phổ HSQC, HMBC của hợp chất
EPE7 cho thấy 20 tín hiệu carbon đặc trưng cho một bộ khung prenylisoflavone
Bộ khung isoflavone được xác định nhờ 15 tín hiệu carbon, gồm tín hiệu của nhóm α, β-ketone tại δC 180,9 (C-4), 152,6 (C-2), 123,5 (C-3); 7 tín hiệu carbon bậc 4 tại δC 159,7 (C-5), 110,2 (C-6), 161,4 (C-7), 156,2 (C-9), 106,0 (C-10), 123,2 (C-1’), 155,9 (C-4’); và 5 tín hiệu carbon thơm, trong đó có 2 tín hiệu có cường độ gấp đôi các tín hiệu còn lại tại δC 130,4 (C-2’, 6’) và 115,6 (C-3’, 5’), gợi ý bộ khung isoflavone có vòng B dạng đối xứng Nhánh isoprenyl với 5 tín hiệu carbon được đặc trưng bởi các tín hiệu tại trường cao của 2 nhóm.
CH3 (C-4”, C-5”) tại δC 25,8 và 17,9, cùng với các tín hiệu carbon của nối đôi tại δC 121,0 và 136,1 (C-2”, C-3”) và nhóm methylen tại 21,5 (C1”)
Hình 15: Phổ 13 C-NMR, DEPT của hợp chất EPE7
Hình 16: Phổ 1 H-NMR của hợp chất EPE7
Phổ 1 H-NMR của hợp chất EPE7 cho tín hiệu singlet tại δH 6,39 (H-8) gợi ý các vị trí C-5, C-6, C-7 đã bị thế Tín hiệu singlet của proton trong nhóm α,β - ketone xuất hiện tại δH 7,83 (H-2) Cấu trúc đối xứng ở vòng B của EPE7 cũng được khẳng định ở các tín hiệu proton tại δH 7,39 (brd, H-2’, 6’); 6,89 (brd, H-3’, 5’) với hằng sốtương tác J = 9,0 Hz chứng tỏ vị trí C-4’ trong vòng B đã bị thế
Hình 17: Phổ HMBC của hợp chất EPE7
Dữ liệu phổ HMBC của hợp chất EPE7 cho thấy các tương quan giữa proton H-1” (δH 3,46) với các carbon C-5 (δC 159,7), C-6 (δC 110,2) và C-7 (δC 161,4) Kết quả đối chiếu với dữ liệu tham khảo [57] cho phép xác định nhánh isoprenyl được gắn vào khung isoflavone ở vị trí C-6.
Phân tích phổ chi tiết của hợp chất EPE7 và đối chiếu với tài liệu tham khảo [57] cho kết luận EPE7 là wighteone (5,7,4'-trihydroxy-6-prenylisoflavone) Đây là lần đầu tiên hợp chất này được phân lập từ loài P erosus.
Hình 18: Cấu trúc hoá học và các tương tác HMBC của hợp chất EPE7
Bảng 9: Dữ liệu phổ 1 H, 13 C NMR, DEPT của hợp chất EPE7 và Wighteone
Hợp chất EPE2 thu được từphân đoạn P5.2 tồn tại ở dạng bột trắng
Phổ 13 C-NMR và DEPT của EPE2 xuất hiện 21 tín hiệu carbon trong đó có 15 tín hiệu carbon đặc trưng cho phần aglycone và 6 tín hiệu carbon đặc trưng cho 1 đơn vị đường hexose Phần aglycone được xác định có khung flavane thông qua các tín hiệu của 1 nhóm carbonyl tại δC 198,5 (C-4), 1 nhóm methylen tại δC 44,1 (C-3), 1 nhóm oximethine tại δC 80,7 (C-2), 6 tín hiệu carbon thơm bậc 4 tại δC 164,6 (C-5), 167,0 (C-7), 165,1 (C-9), 104,9 (C-10), 130,9 (C-1’),
2’, 6’ CH 130,4 7,39 (brd, J = 8,5Hz) 130,7 7,44 (d, J = 8.5Hz) 3’, 5’ CH 115,6 6,89 (brd, J = 9,0Hz) 112,7 6,89 (d, J = 8.0Hz)
1’’ CH2 21,5 3,46 (d, J = 7,0Hz) 21,9 3,35 (brd, J = 8.0Hz) 2’’ CH 121,0 5,28 (t, J = 2,5Hz) 122,8 5,27 (brt, J = 8.0Hz)