Với sự hỗ trợ của chỉ thị Marker phân tử, hàng nghìn QTLs liên kết với tính trạng nông sinh học, gen phục hồi, bất dục đực mẫn cảm nhiệt độ, chống chịu sâu bệnh, chịu hạn.... Trên trang
Trang 1NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG TẠO DÒNG PHỤC HỒI PHỤC VÔ CÔNG TÁC CHỌN TẠO
GIỐNG LÚA LAI 3 DÒNG
Lê Hùng Lĩnh 1 , guyễn Trí Hoàn 2 , guyễn Thị Hằng 2 , Hồ Hữu hị 2 , Lê Duy Đức 1
SUMMARY
Validation of molecular markers linked to fertility restorer gens and aplication
marker-assisted selection to create restorer lines
The present study was carried out with the objective to validate the molecular markers, which have been previously reported to be linked to fertility restorer gene for WA-CMS lines of rice An advanced segregating F 2 population derived from a cross between IR58025A as a WA-CMS parent and R100 as a restorer line The 40 F 2 plants were evaluated for fertility restorer trait and the genotypes of the 40 F 2 plants were determined using SSR markers Using the marker-trait segregation data derived from analysis of the mapping population, a local linkage map of the genomic region around fertility restorer gene, a major fertility restoration locus on Chromosome 10 was constructed interval between SSR marker RM258 and RM171
Using marker-assisted selection for fertility restoration in segregating populations and identification of restorer, 12 restorer lines was bred including: BB13/R838, R7, IR35, RV114, BB4/4492, CC/R838, BB11/R23, IR78, BB14/R242, BB15/TR64, BC15, BB11/R23 Through the present study, we have established the usefulness of the marker-assisted selection method
to create new rice varieties
Keywords: Hybrid rice, molecular markers and restorer gen
I §ÆT VÊN §Ò
Lúa lai có thể cho năng suất tăng hơn
20-30% so với lúa thường trong điều kiện
trồng thâm canh ở Trung Quốc Dòng bất
dục đực tế bào chất CMS kết hợp với dòng
phục hồi R là công cụ di truyền quý giá để
khai thác tiềm năng ưu thế lai Đến nay,
hơn 90% lúa lai vẫn sử dụng dòng bất dục đực tế bào chất kiểu WA (wild abortive)
(Yao et al., 1997) Các nhà khoa học
Trung Quốc, IRRI và các nước khác đã tạo ra hàng trăm dòng CMS và hàng ngàn
dòng R có đặc điểm di truyền khác nhau với nền di truyền đa dạng và phong phú, trên cơ sở đó tạo ra được nhiều các tổ hợp
1
Phòng Sinh học phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp
2
Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Lúa lai, Viện Cây lương thực và Cây thực phNm
Trang 2lai thích ứng cho nhiều vùng sinh thái
khác nhau
Gần đây, công nghệ sinh học được coi
như là phương tiện hữu hiệu để giải quyết
những vấn đề khó khăn mà công tác chọn
giống cổ truyền không thể thực hiện được
Thành tựu của kỹ thuật chỉ thị phân tử
DN A và kỹ thuật lập bản đồ gen là những
công cụ mới góp phần trợ giúp đắc lực cho
công tác chọn tạo các giống cây trồng Với
sự hỗ trợ của chỉ thị Marker phân tử, hàng
nghìn QTLs liên kết với tính trạng nông
sinh học, gen phục hồi, bất dục đực mẫn
cảm nhiệt độ, chống chịu sâu bệnh, chịu
hạn đã được phát hiện
Gen phục hồi bất dục tế bào chất đã
được xác định, lập bản đồ cho các loại bất
dục tế bào chất tại các locus/gen khác nhau
trên các nhiễm sắc thể khác nhau
(Gramene website) Trên trang Gramene
website những gen phục hồi bất dục đực tế
bào chất Rf đã được công bố với vị trí trên
nhiễm sắc thể và được kí hiệu từ Rf1 đến
Rf17 Bharaj et al., (1995) xác định được
genes viz Rf4 1) and Rf6
(Rf-WA-2) trên nhiễm sắc thể 7 và 10 Zhang et al.,
(1997) xác định gen Rf3 gene liên kết chỉ
thị RFLP markers trên nhiễm sắc thể 1
Yao et al., (1997) xác định hai gen phục
hồi bất dục đực tế bào chất kiểu WA CMS
trên nhiễm sắc thể 1 (Rf3) và 10 (Rf6)
Việc chọn tạo ra các dòng phục hồi để sử
dụng trong công tác chọn giống lúa lai 3
dòng là vô cùng quan trọng, xuất phát từ
cơ sở đó chúng tôi đã thực hiện đề tài
" ghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử
trong việc tạo dòng phục hồi phục vụ công
tác chọn giống lúa lai 3 dòng"
II VËT LIÖU Vµ PH¦¥N G PH¸P N GHI£N
CøU
1 Vật liệu nghiên cứu
- Dòng mẹ IR58025A là dòng bất dục đực tế bào chất được chọn tạo tại IRRI Dòng bố R100, dòng phục hồi được nghiên cứu chọn lọc tại Trung tâm N ghiên cứu Lúa lai và 34 dòng triển vọng ở thế hệ F5 giữa dòng phục hồi và dòng mang gen chống chịu sâu bệnh
2 Phương pháp nghiên cứu
- Bố trí thí nghiệm và đánh giá các chỉ tiêu theo phương pháp nghiên cứu lúa lai của Viện N ghiên cứu Lúa Quốc tế (IRRI)
- Tách chiết DN A tổng số từ mẫu lá
theo phương pháp CTAB cải tiến Kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide Kỹ thuật làm phản ứng PCR với các loại mồi SSR
Kỹ thuật thu thập dữ liệu và phân tích dữ liệu theo các phần mềm POPGEN E, MAPMAKER và các phương pháp phân tích thống kê khác
III KÕT QU¶ Vµ TH¶O LUËN
1 Kết quả phân tích di truyền của tính trạng phục hồi hữu dục
Sự di truyền tính trạng phục hồi bất dục đực tế bào chất được đánh giá thông qua sự phân ly kiểu hình (bất dục/hữu dục) của các
cá thể trong quần thể phân ly Trong thí nghiệm này, 100 cá thể F2 đã được sử dụng phân tích di truyền Hai bông của mỗi cá thể được bao cách ly bằng giấy bóng kính
để ngăn chặn phấn lạ bay vào nhằm đánh giá khả năng tự đậu hạt N goài sự đánh giá
tỷ lệ đậu hạt, các cá thể đã được đánh giá hạt phấn thông qua nhuộm IKI 1% và quan sát dưới kính hiển vi quang học Bảng 1 là kết quả nhận được trong thí nghiệm đánh
Trang 3giá di truyền tính trạng phục hồi bất dục đực tế bào chất
Bảng 1 Kết quả phân tích sự di truyền của tính trạng phục hồi
Đối tượng theo dõi Số cây hữu dục Số cây bất dục
Quần thể F2 của tổ hợp lai
IR58025A/R100
Kết quả bảng 1 cho thấy sự phân ly các
cá thể hữu dục và bất dục trong quần thể F2
tuân theo quy luật của Menden với tỷ lệ 3
hữu dục : 1 bất dục, với chỉ số X 2 = 0,48
Như vậy, tính trạng phục hồi bất dục đực tế
bào chất là tính trạng đơn gen
2 Kết quả xác định chỉ thị phân tử liên
kết gen phục hồi hữu dục đực tế bào chất
Trong thí nghiệm này, đã thu ngẫu
nhiên mẫu lá của 40 cá thể thuộc quần thể
F2 cùng với dòng mẹ IR58025A và dòng bố
R100 Những chỉ thị phân tử cho đa hình
giữa dòng mẹ IR58025A và dòng bố R100
được sử dụng chạy kiểm tra di truyền các cá
thể trong quần thể F2 để xác định liên kết
của chỉ thị phân tử với gen phục hồi bất dục
đực tế bào chất Kết quả phân tích sự đồng
phân ly giữa kiểu hình và kiểu gen của các chỉ thị SSR cho gen phục phục hồi bất dục đực tế bào chất trong quần thể F2 cho thấy
40 cá thể F2 chia thành hai nhóm rõ rệt 29
cá thể hữu dục và 11 cá thể bất dục Hai nhóm kiểu hình này đồng phân ly kiểu gen tại chỉ thị phân tử SSR RM258 và RM171
Tỷ lệ 3:1 (29:11) cho tính trạng hữu dục và bất dục đã khẳng định gen phục hồi bất dục đực tế bào chất là một gen trội Từ kết quả này cho ta thấy chỉ thị phân tử SSR RM258
và RM171 liên kết với gen phục hồi bất dục đực Dựa vào kết quả trên chúng tôi đã xác định vị trí locus mang gen phục hồi bất dục đực tế bào chất nằm trên nhiễm sắc thể số
10, với hai chỉ thị phân tử lµ RM258 và RM171 (www.gramene.org) (hình số 4)
Trang 41: Dòng IR58025A 2: Dòng R100
Hình 1 Kết quả chạy đa hình của các chỉ thị với bố mẹ
Hình 2 Kết quả chạy đa hình của các chỉ thị với bố mẹ
1=IR58025A, 2= Dị hợp tử, 3=R100
Hình 3 Kết quả kiểm tra di truyền với marker RM258
Trang 5Hình 4 Bản đồ chỉ thị phân tử SSR liên kết với gen phục hồi trên nhiễm sắc thể số 10
3 Ứng dụng chỉ thị phân tử chọn lọc các
dòng phục hồi triển vọng
Để xác định những dòng phục hồi triển
vọng, đã đã thu thập được 34 dòng ở thế hệ
F5 từ tổ hợp lai giữa dòng phục hồi và
dòng có các đặc tính mong muốn để kiểm
tra bằng các chỉ thị phân tử Các mẫu lá
non, khỏe mạnh, không có sâu bệnh được thu từ 34 dòng khác nhau ngoài đồng ruộng Sử dụng các chỉ thị RM258 và RM171 liên kết gen phục hồi kiểm tra các dòng triển vọng mang gen phục hồi Kết quả chúng tôi đã chọn lọc được 12 dòng mang gen phục hồi (bảng 4)
Bảng 4 Các dòng mang gen phục hồi được chọn lọc bằng chỉ thị phân tử
STT Tên dòng Stt Tên dòng
Trang 6Tạp chí khoa học và công nghệ nông nghiệp Việt Nam
6
IV KếT LUậN
- Kết quả nghiên cứu cho thấy gen phục hồi là gen trội và có hai chỉ thị phõn tử SSR: RM258 và RM171 liờn kết chặt với locus mang gen này trờn nhiễm sắc thể số 10
- Với việc sử dụng các chỉ thị phõn tử đấ xác định ở trên đó đó sàng lọc được cỏc dũng lúa: BB13/R838, R7, IR35, RV114, BB4/4492, CC/R838, BB11/R23, IR78, BB14/R242, BB15/TR64, BC15, BB11/R23 mang gen phục hồi
- Kết hợp với các đặc tính nông học trong số 12 dòng trên kết quả cho thấy có 4 dòng: BC15, BB13/R838, RV114 và BB4/4492 là tốt nhất có độ thuần, −u thế lai cao, và chống chịu bênh tốt
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Bharaj TS, Virmani SS, Khush GS, 1995 Chromosomal location of fertility restoring
genes for wild abortive cytoplasmic male sterility using primary trisomics in rice Euphytica 83:169-173
Linh L.H, Hang T., Kang K.H, Lee Y.T, Kwon S.J, Ahn S ., 2008 Introgression of a quantitative trait locus for spikelets per panicle from Oryza minuta to the O sativa
cultivar Hwaseongbyeo Plant Breeding doi:10.1111/j.1439-0523.2007.01462.x
Linh L.H, Jin F.X, Kang K.H, Lee Y.T, Kwon S.J, Ahn S ., 2006 Mapping quantitative
trait loci for heading date and awn length using an advanced backcross line from a
cross between Oryza sativa and O minuta Breeding Science 56: 341-349
Virmani S.S., 2003 Advances in hybrid rice research and development in the tropics In:
Virmani SS, Mao CX, Hardy B (eds) Hybrid rice for food security, poverty alleviation, and environmental protection Proceedings of the 4th International Symposium on Hybrid Rice, 14-17 May 2002, Hanoi, Vietnam International Rice Research Institute, Manila, Philippines, pp 7-20
Yao F Y., Xu C G., Yu S B., Li J X., Gao Y J., Li X H and Zhang Q., 1997 Mapping
and genetic analysis of two fertility restorer loci in the wild abourtive cytoplasmic
male sterility system of rice (O sativa L.); Euphytica 98, 183 - 187
Zhang G.; Bharaj T.S.; Virmani S.S and Huang ., 1997 Mapping of the RFLP - 3
nuclear fertility restoring gene for WA cytoplasmic male sterility in rice using RAPD and RFLP markers; Theor Appl Genet 83, 495 - 499
PGS TS Nguyễn Văn Viết
...1 Vật liệu nghiên cứu
- Dòng mẹ IR58025A dòng bất dục đực tế bào chất chọn tạo IRRI Dòng bố R100, dòng phục hồi nghiên cứu chọn lọc Trung tâm N ghiên cứu Lúa lai 34 dòng triển...
& #34 ; ghiên cứu ứng dụng thị phân tử
trong việc tạo dòng phục hồi phục vụ cơng
tác chọn giống lúa lai dịng& #34 ;
II VậT LIệU Và PHƯƠN G PHáP... đồ thị phân tử SSR liên kết với gen phục hồi nhiễm sắc thể số 10
3 Ứng dụng thị phân tử chọn lọc
dòng phục hồi triển vọng
Để xác định dòng phục hồi triển
vọng,
