NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH DI TRUYỀN LOÀI LAN HÀI ĐỐM Paphiopedilum concolor Pfitzer BẢN ĐỊA CỦA VIỆT NAM Khuất Hữu Trung1, Kiều Thị Dung1, Nguyễn Thuý Điệp1, Bùi Thị Thu Hương2, Trần Duy Dươn
Trang 1NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH DI TRUYỀN LOÀI LAN HÀI ĐỐM
(Paphiopedilum concolor Pfitzer) BẢN ĐỊA CỦA VIỆT NAM
Khuất Hữu Trung1, Kiều Thị Dung1, Nguyễn Thuý Điệp1, Bùi Thị Thu Hương2, Trần Duy Dương1, Đặng Trọng Lương1
Summary
Studying on genetic diversity of native Paphiopedilum concolor speciesin Vietnam
The native Paphiopedilum concolor Pfitzer species in Vietnam is very various Sixteen accessions
Paphiopedilum concolor collected from many ecological areas have difference morphological characteristics In molecular DNA level, twenty-four primers were used in the RAPD analysis to
distinguish, by comparing differences in DNA banding patterns A total of 1738 DNA bands were amplified, and 91 of which (62,3%) were polymorphic The average of the bands that was amplified
by 17 primers was 102,2 bands per primer Genetic similarity coefficients of sixteen accessions
Paphiopedilum concolor in each pair were ranging from 0,56- 0,94 According to these results, sixteen accessions of Paphiopedilum concolor were divided into six groups based on their genetic
similarity coefficients The phylogenetic tree derived from the RAPD results were complemented with morphological characteristics useful for studying the genetic relationships between accessions
of Paphiopedilum concolor Pfitzer
Keywords: Paphiopedium concolor, native, genetic diversity, RAPD marker
I ĐẶT VẤN ĐỀ
Lan Hài (Paphiopedilum) là một
nhóm rất khác biệt Chúng có thể dễ dàng
nhận ra bởi cấu trúc hoa khác thường với
cánh môi hình túi sâu trông giống một
chiếc hài nằm ở vị trí thấp nhất của hoa,
tạo nên một vẻ bề ngoài rất đặc sắc Chính
vì vậy “Hài” trở thành tên chung của
nhóm lan này Mỗi loài lan Hài khác nhau
đều có những đặc điểm đặc trưng riêng về
kích thước, màu sắc của lá, hoa và từng
cánh hoa [2] Ở Việt Nam, lan Hài được
chứng minh là rất phong phú và có độ đa
dạng cao hơn bất cứ nơi nào khác trên thế
giới Nhiều loài của Việt Nam không chỉ
rất hiếm mà còn là loài đặc hữu hẹp của
Việt Nam và trên thế giới [1], [6]
Để góp phần tạo lập cơ sở dữ liệu
về các đặc điểm hình thái và ở mức phân tử ADN, phục vụ công tác phân loại dưới loài, nhận dạng, gọi tên chính xác, khẳng định chủ quyền quốc gia về
concolor), chúng tôi thực hiện đề tài:
“ghiên cứu đa hình di truyền loài lan Hài đốm (Paphiopedilum concolor Pfitzer) bản địa của Việt am”.
II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1 Vật liệu
Vật liệu được sử dụng trong các thí nghiệm bao gồm 16 mẫu lan Hài thuộc loài
1 Viện Di truyền Nông nghiệp; 2 Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội
Trang 2Hài đốm (Paphiopedilum concorlor
Pfitzer) được thu thập từ nhiều vùng sinh
thái ở Việt Nam (Lạng Sơn, Hòa Bình,
Thanh Hóa, Đắk Lắk ) hiện đang được
trồng lưu giữ tại vườn lan Tam Đảo và
vườn lan Văn Giang của Viện Di truyền
Nông nghiệp (bảng 2)
24 mồi khác nhau sử dụng trong các
phản ứng RAPD-PCR có độ dài từ 9-10
nucleotit thuộc nhóm OPA, OPC, UBC,
BIO và nhóm S của hãng Bioneer (bảng 1)
- Phương pháp mô tả hình thái (theo
phương pháp mô tả chi tiết các đặc điểm
hình thái của Pellegrino và cộng sự, 2005)
[5]: Sử dụng mắt thường quan sát, từ đó mô
tả hình thái, màu sắc của lá, hoa; dùng
thước đo chiều dài, chiều rộng của lá, chiều
dài và đường kính hoa; thống kê, so sánh số
lượng hoa trên một ngồng hoa
- Tách chiết AD tổng số: Lá bánh tẻ
của các mẫu được thu thập, xử lí và tách chiết ADN tổng số theo phương pháp của Obara-Okeyo & Kako (1998) có cải tiến; ADN tổng số được xác định nồng độ bằng phương pháp đo quang phổ và kiểm tra trên gel agarose 0,8% [3], [4]
- Chạy PCR: Các phản ứng PCR được
thực hiện theo chương trình: 940C (5 phút), 40-45 chu kì [940C (1 phút); 330C - 360C (30s), 720C (2 phút)] và kết thúc ở 720C (5 phút); sản phNm PCR được điện di trên gel agarose 1-1,2%
- Phân tích số liệu: Kết quả được thống kê dựa vào sự xuất hiện hay không xuất hiện của các băng ADN Số liệu được xử lí, phân tích bằng chương trình EXCEL version 5.0 và phần mềm
N TSYSpc 2.1
Bảng 1 Trình tự nucleotit của các primer được sử dụng
trong các phản ứng RAPD-PCR
Trang 3III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1 Một số đặc điểm hình thái của 16 mẫu
Hài đốm
Kết quả đo đếm, thống kê một số đặc điểm hình thái của các mẫu Hài đốm nghiên cứu chỉ ra ở bảng 2
Bảng 2 Đặc điểm hình thái của các mẫu lan Hài đốm
Ký
hiệu
mẫu
Số
lá
/cây
Chiều
dài lá
(cm)
Chiều rộng
lá (cm)
Chiều dài ngồng (cm)
Đường kính ngồng (cm)
Chiều dài cánh môi (cm)
Đường kính cánh môi (cm)
Chiều dài cánh bên (cm)
Chiều rộng cánh bên (cm)
Chiều dài cánh trên (cm)
Chiều rộng cánh trên (cm)
Đường kính hoa (cm)
Qua bảng 2 cho thấy: Các mẫu Hài
đốm có số lá dao động từ 3 lá/cây (TD45,
TD41) đến 7 lá/cây (TD49) Chiều dài lá
rất khác nhau, dao động từ 6,4 cm (TD37)
đến 15,2 cm (TD49) Chiều rộng lá dao
động từ 2,2 cm (HTD13) đến 4,1 cm
(TD40) Đặc điểm lá của các mẫu thuộc
loài này thường ngắn, xanh đậm hoặc xanh
nhạt, mặt trên lá có nhiều đốm trắng như
da báo, mặt dưới lá đỏ tía, một số mẫu mép
lá màu tím đỏ và có răng cưa Các mẫu Hài
đốm có chiều dài ngồng hoa dao động từ
4 cm (TD46) đến 10 cm (GL2, TD33)
Đường kính ngồng hoa dao động từ 0,3 cm
(GL2, HTD13, TD39, TD47) đến 0,5 cm
(TD41, TD45) Chiều dài cánh môi dao
động từ 1,8 cm (TD47) đến 4 cm (GL2,
TD34, TD37, TD42) Đường kính cánh môi dao động từ 1,2 cm (TD36) đến 2,5 cm (GL2) Chiều dài cánh bên dao động khá lớn từ 2,9 cm (HTD13) đến 6 cm (TD36) Chiều rộng cánh bên dao động từ 2 cm (HTD23) đến 3,8 cm (TD46) Chiều dài cánh trên dao động từ 2,4 cm (HTD13) đến
5 cm (TD40) Chiều rộng cánh trên dao động từ 2,3 cm (HTD13) đến 4,5 cm (GL2, HTD5) Đường kính hoa dao động rất lớn
từ 4,1 cm (TD49) đến 10 cm (TD36) Cánh hoa thon, tròn ở đầu Cánh môi hình bầu dục hoặc hình trứng hẹp, cánh môi rất dày
và có mép uốn cong Hoa Hài đốm màu vàng nhạt, vàng đến vàng đậm, có các đốm
đỏ tía hoặc nâu trên khắp bề mặt cánh, hoa
có mùi thơm ngọt đặc trưng
Trang 4Hình 1 Ảnh các mẫu lan Hài đốm
2 Kết quả phản ứng RAPD-PCR
ADN tổng số của 16 mẫu lan Hài tách
chiết theo phương pháp Okeyo & Kako
(1998) có chất lượng khá tốt Kết quả kiểm
tra bằng phương pháp điện di trên gel
agarose 0,8% cho thấy các mẫu ADN có nồng độ tương đối cao, không bị đứt gãy hay lẫn tạp (hình 2)
Hình 2 Ảnh điện di AD tổng số của 16 mẫu Hài đốm
Kết quả phân tích RAPD-PCR của 16
mẫu lan Hài với tổng số 24 mồi thuộc các
nhóm OPA, OPC, BIO, UBC và nhóm S
Trong đó, có 17 mồi cho đa hình rõ rệt là:
OPC4, OPC5, OPC10, OPC11, OPC15,
S201, S202, S208, S239, S256, S279, S285,
S300, UBC709, UBC728, OPA18 và
BIO24 Các mồi còn lại cho kết quả đơn
hình hoặc đa hình không rõ ràng Thống kê
kết quả phân tích với 17 mồi được trình bày
ở bảng 3
Các số liệu thu được ở bảng 3 cho thấy: Với 272 phản ứng PCR nhân lên được tổng
số 1738 băng thuộc 146 loại băng có kích cỡ khác nhau Trong đó có 91 băng cho đa hình (chiếm 62,3%) và 55 băng đơn hình (chiếm 37,7%) Kích thước băng nhỏ nhất khoảng
250 bp và kích thước băng lớn nhất khoảng
2500 bp Xuất hiện 6 băng cá biệt (chỉ xuất hiện duy nhất ở một mẫu) và khuyết 6 băng
ở một mẫu duy nhất còn xuất hiện ở 15 mẫu còn lại Mồi OPC5 nhân lên được số băng
Trang 5nhiều nhất (218 băng) và ở mẫu HTD7
khuyết 2 băng ở vị trí có kích thước khoảng
500 bp và 300 bp Mồi OPC10 nhân lên
được 114 băng trong đó ở mẫu HTD7
khuyết băng ở vị trí có kích thước khoảng
2500 bp; mẫu TD36 khuyết băng ở vị trí có
kích thước khoảng 1200 bp; mẫu HTD13
xuất hiện một băng cá biệt ở vị trí có kích
thước khoảng 350 bp Mồi UBC709 nhân
được 101 băng và ở mẫu HTD13 khuyết 1
băng ở vị trí có kích thước khoảng 500 bp
Mồi UBC728 nhân được 152 băng và ở mẫu
TD45 khuyết băng ở vị trí có kích thước
khoảng 750 bp Mồi BIO24 nhân lên được
93 băng trong đó mẫu HTD13 có 1 băng cá biệt ở vị trí có kích thước khoảng 1500 bp Mồi S201 nhân lên được 159 băng và ở mẫu HTD13 khuyết băng ở vị trí có kích thước khoảng 100 bp Mồi S285 nhân lên được 88 băng và ở mẫu HTD13 xuất hiện băng cá biệt có kích thước khoảng 800 bp Mồi S239 nhân lên được số băng ít nhất (31 băng) và ở mẫu TD41 xuất hiện 2 băng cá biệt có kích thước khoảng 1000 bp và 1500 bp Số băng nhân lên trung bình cho cả 17 mồi là 102,2 băng/mồi
Bảng 3 Số băng AD thu được của các mẫu lan Hài nghiên cứu với 17 mồi RAPD
Mồi
Mẫu
OPC
4
OPC
5
OPC
10
OPC
11
OPC
15
S
201
S
202
S
208
S
239
S
256
S
279
S
285
S
300
UBC
709
UBC
728
BIO
24
OPA
18 Tổng
TD36 4 14 5 3 5 12 10 5 2 7 6 5 5 8 11 7 6 115 TD37 4 14 10 6 6 10 9 5 2 10 9 6 5 8 12 7 6 129
TD40 4 14 7 3 6 10 10 5 2 8 5 6 4 6 10 7 3 110 TD41 4 14 7 3 6 8 10 5 6 10 7 6 4 6 10 7 5 118 TD42 4 14 6 7 5 13 8 5 4 10 6 6 4 7 10 7 5 121
TD49 4 14 7 6 4 13 10 5 2 5 6 4 5 4 10 5 6 110 Tổng 64 218 114 80 72 159 128 74 31 113 100 88 72 101 152 93 79 1738
Hình 3 Kết quả điện di sản phGm RAPD-PCR
(a) Mồi OPC10; (b) Mồi S279 (M: Marker 1kb)
Trang 63 Hệ số tương đồng di truyền giữa các
mẫu Hài đốm
Dựa trên kết quả thống kê các băng
ADN thu được, kết quả thiết lập bảng hệ số
tương đồng di truyền và sơ đồ hình cây
quan hệ di truyền của 16 mẫu Hài đốm chỉ
ra ở bảng 4 và hình 4
Qua kết quả bảng 4 cho thấy hệ số
tương đồng di truyền của 16 mẫu Hài đốm
dao động từ 0,56 đến 0,94 Hai cặp mẫu
(HTD7 - TD33) và (HTD7 - TD42) có mức
sai khác di truyền lớn nhất (hệ số tương
đồng di truyền nhỏ nhất là 0,56) Ở mức
hình thái, hai cặp mẫu này có nhiều đặc
điểm hình thái khác nhau: Mẫu HTD7 có lá
màu xanh đậm, mặt dưới có đốm đỏ nâu, mẫu TD33 có lá màu xanh nhạt, mặt dưới màu đỏ tía đậm, còn mẫu TD42 lá bóng, to bản, mặt dưới có nhiều đốm đỏ nâu dày đặc; màu sắc hoa cũng khác nhau: Mẫu HTD7 hoa có màu vàng nhạt, còn 2 mẫu TD33 và TD42 hoa màu vàng đậm
Cặp mẫu (TD46 - TD47) có hệ số tương đồng di truyền cao nhất là 0,94 Mẫu TD46 và TD47 có hình thái lá và hoa khá giống nhau, ở cánh trên và 2 cánh bên hoa đều màu vàng, có nhiều đốm đỏ nhỏ li ti trên khắp cánh hoa Hai mẫu này chỉ khác nhau ở màu sắc của hoa: Mẫu TD46 hoa có màu vàng nhạt, còn mẫu TD47 hoa có màu vàng đậm hơn
Bảng 4 Hệ số tương đồng di truyền giữa các mẫu Hài đốm
GL2 HTD5 HTD7 HTD13 TD33 TD34 TD36 TD37 TD39 TD40 TD41 TD42 TD45 TD46 TD47 TD49 GL2 1,00
HTD5 0,88 1,00
HTD7 0,63 0,65 1,00
HTD13 0,76 0,75 0,58 1,00
TD33 0,71 0,68 0,56 0,65 1,00
TD34 0,84 0,84 0,63 0,72 0,78 1,00
TD36 0,86 0,84 0,61 0,72 0,74 0,86 1,00
TD37 0,81 0,80 0,60 0,71 0,77 0,89 0,85 1,00
TD39 0,76 0,71 0,70 0,65 0,68 0,78 0,77 0,81 1,00
TD40 0,82 0,77 0,63 0,74 0,71 0,81 0,88 0,84 0,82 1,00
TD41 0,79 0,75 0,57 0,66 0,72 0,78 0,83 0,82 0,77 0,88 1,00
TD42 0,81 0,80 0,56 0,70 0,70 0,80 0,84 0,82 0,75 0,85 0,88 1,00
TD45 0,69 0,72 0,69 0,63 0,64 0,74 0,69 0,73 0,77 0,76 0,69 0,76 1,00
TD46 0,79 0,80 0,63 0,70 0,75 0,84 0,79 0,84 0,80 0,83 0,79 0,83 0,83 1,00
TD47 0,79 0,78 0,63 0,74 0,70 0,81 0,77 0,80 0,76 0,87 0,79 0,82 0,82 0,94 1,00
TD49 0,85 0,88 0,65 0,74 0,68 0,84 0,84 0,80 0,74 0,80 0,76 0,82 0,76 0,85 0,84 1,00
Trang 7Hình 4 Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền của 16 mẫu Hài đốm
Trang 8T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
8
Dựa vào sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa các mẫu Hài đốm (hình 4) cho thấy mức tương đồng 80% có thể chia 16 mẫu Hài đốm thành 6 nhóm:
Nhóm I: Bao gồm 9 mẫu GL2, HTD5, TD49, TD34, TD37, TD36, TD40, TD41 và TD42, được chia làm 2 nhóm phụ:
Nhóm 1.1: Gồm 6 mẫu GL2, HTD5, TD49, TD34, TD37 và TD36 Hệ số tương đồng dao động từ 0,80 (TD37 - TD49) và (TD37 - HTD5) đến 0,89 (TD34 và TD37) Nhóm 1.2: Gồm 3 mẫu TD40, TD41 và TD42 Hệ số tương đồng giữa 2 cặp mẫu (TD41 - TD40) và (TD41 - TD42) đều là 0,88; giữa TD40 và TD42 là 0,85
Nhóm II: Gồm 3 mẫu TD45, TD46 và TD47, hệ số tương đồng giữa TD45 và TD46
là 0,83; giữa TD45 và TD47 là 0,82; giữa TD46 và TD47 là 0,94
Nhóm III: Gồm duy nhất mẫu TD39 có hệ số tương đồng với 15 mẫu còn lại dao động từ 0,65 (TD39 và HTD13) đến 0,82 (TD39 và TD40)
Nhóm IV: Gồm duy nhất mẫu TD33 có hệ số tương đồng với các mẫu còn lại dao động từ 0,56 (TD33 và HTD7) đến 0,78 (TD33 và TD34)
Nhóm V: Gồm 1 mẫu HTD13 có hệ số tương đồng với các mẫu còn lại dao động từ 0,58 (HTD7 và HTD13) đến 0,76 (HTD13 và GL2)
Nhóm VI: Gồm duy nhất mẫu HTD7 có hệ số tương đồng di truyền với 15 mẫu còn lại dao động từ 0,56 (HTD7 - TD42) và (HTD7-TD33) đến 0,70 (HTD7 - TD39)
IV KẾT LUẬN
1 Kết luận
- Loài lan Hài đốm (Paphiopedium concolor Pfitzer) bản địa của Việt Nam rất đa
dạng và phong phú Các mẫu giống thu thập tại các vùng sinh thái khác nhau đều có các đặc điểm đặc trưng riêng về hình thái
- Ở mức phân tử ADN, kết quả phân tích bằng kỹ thuật RAPD-PCR chỉ ra hệ số tương đồng di truyền của các mẫu Hài đốm dao động từ 0,56 đến 0,94; 16 mẫu Hài đốm nghiên cứu được phân thành 6 nhóm khác nhau
- Phương pháp mô tả các đặc điểm hình thái và phương pháp đánh giá đa hình di truyền ở mức độ ADN có thể bổ sung và hỗ trợ lẫn nhau để công việc phân loại dưới loài trở nên chính xác hơn, phục vụ cho công tác bảo tồn, khai thác và sử dụng một cách có hiệu quả các nguồn gen lan Hài bản địa của Việt Nam
2 Đề nghị
Tiếp tục điều tra, thu thập thêm các giống lan Hài phục vụ cho công tác phân loại, bảo tồn và chọn tạo giống mới Nghiên cứu sâu hơn ở mức phân tử để xác định các marker/chỉ thị nhận dạng chính xác các nguồn gen lan Hài của Việt Nam
Trang 9T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
9
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Trần Hợp, 1998 Phong lan Việt am, Nhà xuất bản Nông nghiệp, 703 trang
2 Leonid Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc, guyễn Tiến Hiệp, 2004 Lan Hài
Việt Nam, Nhà xuất bản Giao thông vận tải, 308 trang
3 Li D M., Sheng Y Q, and Zhu G F., 2007 “Analysis of the Germ plasm Resources and Genetic Relationships Among Hybrid Cymbidium Cultivars and Native Species
with RAPD Markers”, Agricultural Sciences in China, 6 (8), pp 922-929
4 Obara-Okeyo P and S Kako, 1998 “Genetic diversity and identification of
cymbidium cultivars as measured by random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers”, Euphytica, 99, pp 95-1001
5 Pellegrino G., Musacchio A., oce M E., Palermo A M and Widmer A., 2005
“Reproductive Versus Floral Isolation Among Morphologically Similar Serapias L species (Orchidaceae)”, Journal of Heredity, 96 (1), pp 15-23
6 Trần Duy Quý, 2005 Sổ tay người Hà Nội chơi lan, Nhà xuất bản Nông nghiệp, tr
105-107
<gười phản biện: Trần Duy Qúy
