PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ ISOLATES VI KHUẨN GÂY BỆNH HÉO XANH HẠI LẠC Ralstonia solanacearum Smith VÀ TUYỂN CHỌN GIỐNG KHÁNG BỆNH Nguyễn Thị Vân, Nguyễn Thị Bình, Nguyễn Huy C
Trang 1PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ ISOLATES VI KHUẨN
GÂY BỆNH HÉO XANH HẠI LẠC (Ralstonia solanacearum Smith)
VÀ TUYỂN CHỌN GIỐNG KHÁNG BỆNH
Nguyễn Thị Vân, Nguyễn Thị Bình, Nguyễn Huy Chung, Lê Tuấn Tú, Nguyễn Mạnh Hùng, Đinh Thị Phòng,
Đỗ Tiến Phát
Summary
Analyzing genetic polymorphism of isolates of groundnut bacterial wilt disease agent
Ralstonia solanacearum Smith and selection of varieties resistant to disease
A number of plant pathogenic isolates of R solanacearum Smith derived from various groundnut
growing provinces in Northern Vietnam have been identified and analyzed Of 11 isolates analyzing their DNA polymorphism there are 10 primers gave the better characterization data at molecular basis Primary result of the DNA analysis has showed significant polymorphism of plant pathogen
R solanacearum Smith indicating wider host plant range and will serve as the scientific platform for
further breeding and selection of disease resistant cultivars The genetic similarity index of those strains of bacterium R solanacearum Smith showed a certain molecular variation between them, ranging from 2% to 34%
It has been screened 94 groundnut lines/varieties against bacterial wilt and selected 2 varieties with highly resistance; 3 with moderate resistance and 10 with a little susceptible to bacterial wilt disease Among those tested lines/varieties of groundnut, the promising variety TK 10 has showed the best performance in disease resistance, grain yield, good adaptation, and seed quality compared to common variety MD7
Key word: Groundnut, Ralstonia solanacearum, PCR - RADP, polymorphism analysis, plant
resistance
I ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh héo xanh hại lạc được xác định là
do vi khuNn Ralstonia solanacearum Smith
gây ra, là một trong những bệnh gây tổn
thất khá lớn cho các vùng sản xuất lạc ở
hầu hết các nước trên thế giới Ở Việt N am
bệnh có thể làm giảm năng suất từ 5% -
80%, ở Trung Quốc bệnh có thể làm mất
năng suất hoàn toàn, ở Indonesia từ 5% -
65%, Thái Lan trên 50%
Do mức độ nguy hại của bệnh nên
nhiều cơ quan như Viện Khoa học Kỹ thuật
N ông nghiệp Việt N am, Viện Bảo vệ thực
vật, Viện Di truyền N ông nghiệp, Trường
Đại học N ông nghiệp I Hà N ội và Viện Công nghệ sinh học đã nghiên cứu ảnh hưởng của bệnh đến năng suất lạc, tuyển chọn nguồn gen kháng, nghiên cứu đa dạng
di truyền của nguồn ký sinh gây bệnh ở một
số vùng trọng điểm sản xuất lạc ở Việt
N am Trong những năm gần đây Bộ môn Miễn dịch thực vật Viện Bảo vệ thực vật đã tiến hành phân tích đa dạng di truyền của một số isolates vi khuNn héo xanh lạc thu thập từ nhiều vùng sinh thái khác nhau, dựa trên cơ sở đó tuyển chọn gen kháng bệnh phục vụ cho chọn tạo giống kháng bệnh
Trang 2II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠN G PHÁP
N GHIÊN CỨU
1 Vật liệu
- Mẫu vi khuNn: Bao gồm 11 isolates vi
khuNn Ralstonia solanacearum Smith gây
bệnh héo xanh lạc được phân lập tại Viện
Bảo vệ thực vật Các mẫu bệnh được thu
thập từ Hà Tây, Bắc Giang, Hải Phòng,
Ninh Bình, Hòa Bình và Nghệ An
- Hoá chất và thiết bị máy móc: máy đo
quang phổ Diod Array Spectrophotometer (Mỹ), máy ly tâm AvantiTM30, máy PCR
- Thermal Cycler PTC 100, Tag
ADNpolymeraza (Perkin - Elmer) và các hoá chất nghiên cứu sinh học phân tử khác
- Các mồi sử dụng trong phản ứng
RADP: Trình tự của 10 mồi sử dụng trong
phản ứng RADP được thể hiện trong bảng 1
Bảng 1 Trình tự các nucleotide của 10 mồi được sử dụng trong nghiên cứu
94 mẫu giống lạc đánh giá khả năng
kháng bệnh HXVK được cung cấp từ Trung
tâm Tài nguyên di truyền thực vật, từ nguồn
giống nhập nội và một số giống đang phát
triển trong sản xuất
2 Phương pháp nghiên cứu
- Phân tích đa dạng di truyền các isolates
vi khuNn bằng phương pháp RADP Tách
chiết ADN tổng số dựa theo phương pháp của
Murray và Thompson, 1980 có cải tiến Phân
tích số liệu theo qui ước: 1 = phân đoạn ADN
xuất hiện, 0 = phân đoạn ADN không xuất
hiện, khi điện di sản phNm RAPD với các
đoạn mồi ngẫu nhiên Xác định hệ số di
truyền giống nhau theo phương pháp của Nei
và Li 1979 (hệ số di truyền Jacar)
2a
Sij
2a b c
=
+ +
Trong đó: Sij: Hệ số giống nhau giữa
hai cá thể i và j; a: Số phân đoạn ADN xuất
hiện ở cả cá thể i và j; b: Số phân đoạn
ADN xuất hiện ở i và không xuất hiện ở j;
c: Số phân đoạn ADN xuất hiện ở j và không xuất hiện ở i
- Phân tích đánh giá hệ số tương quan kiểu hình theo 3 phương pháp: SM, Dice và Jaccard và 4 phương pháp phân nhóm: UPGMA (phân tích các nhóm phân tử không cùng trọng lượng), WPGMA (các nhóm phân
tử có cùng trọng lượng), liên kết hoàn toàn (complete linkage), liên kết đơn lẻ (single linkage) Lập biểu đồ hình cây dựa vào giá trị phân tích của tương quan kiểu hình cao nhất trong chương trình NTSYS
* Hàm lượng thông tin tính đa hình (Polymorphism Information Content = PIC) của mỗi cặp mồi xác định theo công thức:
PICi = 1 - ΣP ij2
Trong đó: Pij là tần số allen thứ j của kiểu gen i được kiểm tra
-Đánh giá khả năng kháng nhiễm bệnh
trên nền Sicplot theo phương pháp nhiễm
hạt nứt nanh Đối chứng là giống chuNn nhiễm quốc tế: ICGV 3704 và giống chuNn
Trang 3kháng là MD7 tại nhà lưới - Viện Bảo vệ
thực vật Đánh giá khả năng kháng nhiễm
bệnh HXVK của các mẫu giống theo thang
điểm 6 cấp, từ kháng cao đến nhiễm nặng
III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1 Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái
vi khu/n gây bệnh héo xanh
Đặc điểm của khuNn lạc vi khuNn gây
bệnh héo xanh trên môi trường TZC là có
dạng tròn không đều, màu hồng, tâm màu
đỏ Trên môi trường SPA đều có khuNn lạc
màu trắng sữa Nhiệt độ thích hợp nhất cho
khuNn lạc phát triển từ 28 - 300C
Hình 1 KhuNn lạc vi khuNn héo xanh trên
môi trường TZC
Căn cứ vào đặc điểm hình thái của
khuNn lạc có thể kết luận 11 isolates vi
khuNn này là vi khuNn héo xanh hại lạc
Ralstonia solanacearum
2 Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền
các isolates vi khu/n héo xanh lạc
ADN của 11 issolates vi khuNn đã được phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên Đánh giá tính đa hình thông qua giá trị PIC (giá trị PIC càng lớn thì tính đa hình của cặp mồi
đó càng cao), khoảng cách di truyền giữa các isolates được xác định thông qua hệ số tương đồng và sơ đồ hình cây
Tổng số phân đoạn ADN của 11 isolates vi khuNn khi phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên là 83 phân đoạn Trong đó số phân đoạn đa hình là 41 phân đoạn (chiếm 49%) và không đa hình là 42 phân đoạn (51%) Mồi OPF10 cho tính đa hình cao nhất (100%), hai mồi OPQ13 và RA143 không cho tính đa hình (0%)
Kết quả này cũng phù hợp khi phân tích hàm lượng thông tin đa hình bằng giá trị PIC (bảng 2): Giá trị PIC của mồi OPQ13
và RA143 là 0 (không đa hình) và giá trị PIC của mồi OPF10 là 0,74 (đa hình cao nhất)
Bảng 2 Hàm lượng thông tin tính đa hình (PIC) của 11 isolates vi khu4n
Kết quả cho thấy phần lớn các mồi đều
cho tính đa hình không cao (PIC < 0,5) mặc
dù vậy với 10 cặp mồi RAPD ngẫu nhiên
này cũng đã cho thấy tính đa hình ADN của
11 isolates vi khuNn Ralstonia solanacearum
mà chúng tôi nghiên cứu
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
OPP19
400bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
OPH04
1500bp
250bp
1500bp
Trang 4M Thang AD8 chu4n 1000bp; thứ tự từ 1 - 11 ứng với các chủng P1 - P11
Hình 2 Kết quả điện di sản ph4m RAPD của các isolates vi khu4n
với mồi OPP19, OPH04, OPF10 và RA46
Các số liệu phân tích PCR - RAPD
được xử lý và phân tích trong chương trình
NTSYSpc version 2.0 nhằm tìm ra khoảng
cách di truyền giữa các mẫu khuNn nghiên
cứu thông qua hệ số tương đồng di truyền
và biểu đồ hình cây (hình 2)
Để kiểm tra phương pháp phân nhóm,
chúng tôi đã tiến hành xác định giá trị tương
quan kiểu hình theo ba phương pháp tính hệ
số di truyền giống nhau (phương pháp của Jaccard, của N ei & Li, của Sokal) với bốn kiểu phân nhóm (WPGMA, UPGMA, liên kết hoàn toàn và liên kết đơn lẻ) (bảng 3) Biểu đồ hình cây được thiết lập dựa trên giá trị tương quan cao nhất với các giá trị khi r ≥ 0,9: Tương quan rất chặt, r = 0,8 - 0,9: Tương quan chặt, r = 0,7 - 0,8: Tương quan tương đối chặt, r≤0,7: Tương quan không chặt
Bảng 3 Giá trị tương quan kiểu hình (r)
Kết quả cho thấy, với ba cách tính hệ số
di truyền giống nhau và bốn kiểu phân nhóm
đều phản ánh mối tương quan kiểu hình của
11 mẫu vi khuNn héo xanh lạc là rất chặt (hệ
Trang 5số r đạt từ 0.96398 tới 0.97982) Trong đó
giá trị tương quan kiểu hình (r) lớn nhất
0.97982 khi tính theo hệ số di truyền Jaccard
và kiểu phân nhóm UPGMA Vì vậy, sơ đồ
hình cây được thiết lập theo hệ số di truyền
giống nhau Jaccard và kiểu phân nhóm
UPGMA Các số liệu phân tích PCR - RAPD được xử lý và phân tích trong chương trình NTSYSpc version 2.0 nhằm tìm ra khoảng cách di truyền giữa các mẫu khuNn nghiên cứu thông qua hệ số tương đồng di truyền và biểu đồ hình cây (hình 2)
Hình 3 Biểu đồ hình cây về mối quan hệ di truyền của các isolates vi khu4n theo hệ số
của Jaccard và kiểu phân nhóm UPGMA
Phân tích sự sai khác về hệ số di truyền
của 11 isolates vi khuNn với 10 mồi ngẫu
nhiên chia thành 2 nhánh cây chính: N hánh 1
chỉ có một isolates P1, có sự sai khác so với
10 isolates vi khuNn còn lại là 34% N hánh
còn lại bao gồm 10 isolates P2, P3, P4, P5,
P6, P7, P8, P9, P10 và P11, trong đó bốn
isolates (P2, P6, P7, P9) không có sự khác
nhau về mặt di truyền, 6 mẫu còn lại có sự
sai khác di truyền từ 2% (P5) tới 18% (P4)
3 Đánh giá tính kháng bệnh héo xanh vi
khu/n của các giống lạc
Kết quả nghiên cứu 94 dòng giống lạc
cho thấy chỉ có 2 giống kháng đạt 2,1%
(TK10, LH3 - 1 - 1); Kháng trung bình có 3
giống chiếm 3,2% (Sen N ghệ An ), còn lại
chủ yếu là các giống nhiễm 50 giống chiếm 53,2% và nhiễm nặng 29 giống chiếm 36,9% Dựa vào kết quả đánh giá trên chúng tôi đã tuyển chọn, đánh giá giống lạc TK10 có nguồn gốc nhập nội từ Trung Quốc và sản xuất thử nghiệm với diện tích
2 ha nơi thường xuyên diễn ra dịch hại tại hợp tác xã Sơn Đông - Thị xã Sơn Tây - Hà Tây Bước đầu cho thấy dòng được tuyển chọn từ giống TK10 có đặc tính nông học tốt, có khả năng kháng bệnh HXVK trên vùng đất chuyên canh gò đồi có nguồn bệnh HXVK nặng trong vụ xuân và vụ thu đông
2007 tương đương giống MD7 và hơn hẳn giống địa phương, được nông dân đánh giá cao, N ăng suất trung bình vụ xuân đạt 26 -
33 tạ/ha
Trang 6IV KẾT LUẬN
1 Kết quả phân tích đa dạng di truyền
của 11 isolates vi khuNn héo xanh cho thấy
đã có tính đa hình ở mức độ phân tử Các
mẫu isolates P1 thu thập ở Đông Phương
Yên - Hà Tây có sự khác biệt di truyền rõ
rệt so với 10 chủng còn lại Bốn isolates P2,
P6, P7, P9 không có sự sai khác về mặt di
truyền khi phân tích bằng 10 mồi ngẫu
nhiên trong nghiên cứu này
2 Đã đánh giá được khả năng kháng
bệnh HXVK của 94 dòng giống lạc trong
đó có 2 giống kháng (TK10, LH3 - 1 - 1), 3
giống kháng trung bình (Sen N ghệ An ),
10 giống nhiễm trung bình, 50 giống nhiễm,
29 giống nhiễm nặng
3 Giống lạc TK10 nhập nội từ Trung
Quốc có tiềm năng năng suất cao, kháng
bệnh HXVK, bước đầu đã được sản xuất
thử nghiệm trên vùng dịch bệnh đạt năng
suất từ 26 - 33 tạ/ha, cần nhân rộng ra sản
xuất phục vụ cho nhiều vùng dịch bệnh
khác hiện đang sử dụng giống nhiễm bệnh
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Đỗ Tấn Dũng, 1999 Nghiên cứu bệnh
héo xanh vi khuNn hại một số cây trồng
cạn ở ngoại thành Hà N ội và vùng phụ
cận, Luận án Tiến sĩ khoa học N ông
nghiệp, Trường ĐHN N I, Hà N ội
2 Đoàn Thị Thanh, 8guyễn Xuân Hồng,
Vũ Triệu Mân 1995 N ghiên cứu vi
khuNn Pseudomonas solanacearum trên
một số cây ký chủ ở miền Bắc - Việt
N am Tuyển tập công trình nghiên cứu
của nghiên cứu sinh, Quyển 5, N XB
N ông nghiệp, Hà N ội
3 Lê Lương Tề, 1997 Bệnh héo xanh vi
khuNn Ralstonia solanacearum Smith
Tạp chí BVTV số 6, tr 45 - 46
4 Hazarika, D.K, Das, K.K, 1999 Incidence
of bacterial wilt of Sesamum in relation to diffeirent sowing dates and varieties Plant Disease Reseach, 14: 2, 130 - 135
5 8.W.Schaad, J.B.Jones and W Chun,
1999 Plant Pathogenic Bacteria
:gười phản biện: :guyễn Văn Tuất
Trang 7T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
7
