Trang 67 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2 1 Nguyên liệu và hóa chất Các hóa chất như carbazole, diethyl phosphite, amine thơm, tất cả các dung môi và chất xúc tác Polyethylen glycol 400 (code 202398 250G) mua từ Công ty Hóa chất Aldrich Tất cả các phản ứng được thực hiện trong điều kiện khí quyển và ở nhiệt độ môi trường Điểm nóng chảy được xác định trên thiết bị điểm chảy Mel Temp (IA9100) Phổ hồng ngoại đã được ghi lại trên máy quang phổ Bruker FT IR (Tensor 37), dạng viên nén KBr Phổ 1H, 13.
Trang 1CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Nguyên liệu và hóa chất
Các hóa chất như carbazole, diethyl phosphite, amine thơm, tất cả các dung môi và chất xúc tác - Polyethylen glycol-400 (code: 202398-250G) mua từ Công ty Hóa chất Aldrich Tất cả các phản ứng được thực hiện trong điều kiện khí quyển và ở nhiệt độ môi trường Điểm nóng chảy được xác định trên thiết bị điểm chảy Mel-Temp (IA9100) Phổ hồng ngoại đã được ghi lại trên máy quang phổ Bruker FT-IR (Tensor 37), dạng viên nén KBr Phổ 1H, 13C-NMR và 31P được đo trên máy quang phổ Varian Gemini-2000 (200 MHz) Các độ dời hóa học cho 1H, 13C NMR và 31P đã được báo cáo trong đơn vị ppm, nội chuẩn TMS Mueller Hinton Agar (MHA), Potato Dextrose Agar (PDA), Becton,
Công ty Dickinson Các vi sinh vật đã sử dụng Bacillus subtilis (KCTC 1022), Staphylococcus aureus (KCTC 1916), Escherichia coli (KCTC 2441), Candida albicans (ATCC 1023) và Saccharomyces
cerevisiae (KCTC 7904) Các đối chứng dương Fluconazole và Ampicillin dưới dạng thương mại từ
Sigma Aldrich Các dung dịch Fluconazole, 1 mg/mL và Ampicillin, 2 mg/mL) đã được điều chế theo khuyến nghị của nhà sản xuất Dung dịch đệm phosphate, MTT (3 (4,5dimethylthiazol2yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) và DPPH (1,1-Diphenyl-1-2 picrylhydrazyl) được cung cấp từ PBS, Gibco, Hoa Kỳ Thuốc kháng tế bào ung thư chuẩn là Camptothecin, Aldrich Sigma Thiết bị
sử dụng cho thử độc tính tế bào theo phương pháp MTT đã được thực hiện trên ELISA Bio-Rad Các dòng tế bào chống ung thư được hỗ trợ bởi Giáo sư Jeong-Hyung Lee- Đại học Gangwon quốc tế, Hàn Quốc
2.2 Qui trình
2.2.1 Qui trình tổng hợp các hợp chất, 3a-j
Sơ đồ 2 Tổng hợp các sản phẩm, 3a-j a) Et-Br, KOH, DMSO khô, đung hồi lưu 24 h, 91% 1; b)
Vilsmeier Haack: DMF (khan) trong CH2Cl2; POCl3 trong ClCH2CH2Cl, N2, đun hồi lưu, 48 h, NaOH, 95% 2; c) Kabachnik-Fields: 9–ethyl–9H–carbazole–3–carbaldehyde (1 mmol), diethyl phosphite (1.3 mmol), analogue primary aromatic amine (1 mmol), PEG–400 catalyst (0.38 %
mol), 100 oC, 6–7 h, 3a-j: 84-91%
Trang 22.2.1.1 Tổng hợp 9–Ethyl–9H–carbazole (1)
Carbazole (5 g, 0,03 mol) đã được thêm vào huyền phù KOH (4,1 g, 0,073 mol) trong 15 mL DMSO trong môi trường khí nitơ Sau 1h khuấy mạnh, bromoethane (3,4 mL, 0,045 mol) đã được thêm vào Hỗn hợp phản ứng có thể khuấy qua đêm, sau khi phản ứng kết thúc, đổ vào nước đá và chất rắn kết tủa được lọc ra Chất rắn được rửa bằng nước và sấy khô Sản phẩm thô được kết tinh lại trong ethanol 95% và sấy khô trong không khí
2.2.1.2 Tổng hợp 9–ethyl–9H–carbazole–3–carbaldehyde (2)
Cho dung dịch 9-ethyl-9H-carbazole (5 g, 26 mmol) và DMF khô (2,89 mL, 39 mmol) trong 15 mL (0,235 mol) CH2Cl trong bể nước đá, (3,49 mL, 39 mmol) POCl3 trong 1,2-dichloroethane được thêm vào từng giọt trong điều kiện làm lạnh bằng nước đá Sau đó đun nóng hoàn lưu qua đêm, dung dịch NaOH loãng được thêm vào và chiết bằng 3 lần (3 x100 mL) dichloromethane Lớp hữu cơ được làm khô bằng natri sulfat khan và sau đó loại bỏ dung môi, phần rắn được làm sạch bằng sắc ký cột, thu được chất rắn màu vàng
2.1.1.3 Quy trình chung để điều chế hợp chất (3a-j) [5]
Hỗn hợp 9–ethyl–9H–carbazole–3–carbaldehyde (3) (3 mmol) đã được thêm vào PEG-400 (3,3 g,
8,25 mmol, 0,83% mol) và hỗn hợp này được đun nóng đến 100 °C và khuấy trong 6-7 giờ Sau khi hoàn thành phản ứng như được theo dõi bởi TLC, hỗn hợp này sau đó được pha loãng với nước lạnh
và kết tủa thu được được lọc và rửa bằng nước Phần dư được sấy khô và tinh chế bằng sắc ký cột trên silicagel (hexane: ethyl acetate, V:V = 6: 4) để tạo ra α-amino phosphonate tinh khiết Trong trường hợp các sản phẩm dầu hoặc nhựa nó được chiết xuất bằng ethyl acetate, rửa sạch bằng nước
và sấy khô qua natri sulfat Loại bỏ dung môi sau khi tinh chế trên sắc ký cột trên silicagel cho α-amino phosphonate tinh khiết
2.2.1.4 Quy trình ngắn gọn được thực hiện để tái sử dụng chất xúc tác PEG-400
Hỗn hợp phản ứng trong bình thủy tinh sau khi hoàn thành phản ứng (kiểm tra TLC) được rót vào phễu chiết 1000 mL 250 mL Chloroform đã được thêm vào phễu chiết và 250 mL nước cũng được thêm vào Hỗn hợp trong phễu chiết được giữ và tách thành 2 pha bao gồm pha nước (dietyl photphat, PEG-400) và pha của sản phẩm thô Pha của sản phẩm thô trong CHCl3 là lớp dưới cùng của phễu chiết và pha nước là lớp trên Pha nước được thêm 250 mL dung môi toluene và lắc vài phút Pha toluene và nước được tách thành 2 pha Lớp toluene được làm bay hơi dưới thiết bị bay hơi chân không để thu hồi xúc tác PEG-400 và dung môi toluene
2.2.2 Hoạt tính sinh học
2.2.2.1 Hoạt tính kháng khuẩn và nấm [36]
Trang 3Hoạt tính kháng khuẩn: các ester amino phosphate đã được thử nghiệm về hoạt tính kháng khuẩn
bằng phương pháp khuếch tán đĩa kháng lại các vi sinh vật Bacillus subtilis (KCTC 1022),
Staphylococcus aureus (KCTC 1916), Escherichia coli (KCTC 2441), Candida albicans (ATCC
1023) và Saccharomyces cerevisiae (KCTC 7904) Các sinh vật thử nghiệm được nuôi trong môi
trường dinh dưỡng trong 24 giờ ở 37 °C Muller-Hinton agar (MHA) được sử dụng làm môi trường thạch cho vi khuẩn hoặc Potato Dextrose agar (PDA) cho nấm Các giếng có đường kính 6 mm được tạo trên đĩa gel PDA hoặc các đĩa giấy có đường kính 8 mm được đặt trên đĩa gel MHA Mỗi chủng được làm đều vào đĩa riêng bằng bông vô trùng Sử dụng micropipette vô trùng cho 30 μL mẫu của
các hợp chất ester amino phosphate, (3a- j) hoặc dung dịch đối chứng dương được rót vào từng giếng
hoặc đĩa giấy Sau khi ủ ở 35oC trong 24 giờ, các mức độ ức chế khác nhau được đo bằng thước
2.2.2.2 Độc tính tế bào [37]
Thử độc tính tế bào của các hợp chất 3a-j đã được thực hiện bằng phương pháp MTT trên ba dòng tế
bào ung thư ở người như MCF-7 (dòng tế bào ung thư vú), A-549 (dòng tế bào ung thư phổi ở người)
và HeLa (dòng tế bào ung thư cổ tử cung ở người) trong vitro mà không có thay đổi đáng kể nào
Phương pháp đánh giá độc tế bào
Phương pháp MTT (3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) là một phương pháp so màu, đo độ giảm màu vàng của MTT MTT tham gia phản ứng oxy hoá khử với ty thể của tế bào và tạo thành các formazan dạng tinh thể Có thể dùng một số dung môi hữu cơ (isopropanol) để vừa phá huỷ màng tế bào và hoà tan các tinh thể formazan, sau đó đo độ hấp thụ quang học của các dung dịch này ở 570nm
Chuẩn bị các dòng tế bào
Các dòng tế bào ung thư được cung cấp bởi GS Jeong-Hyung Lee, trường ĐHQG Kangwon, Hàn Quốc Tế bào ung thư được nuôi cấy theo phương pháp Mosmann và cs Các dòng tế bào nuôi cấy ở 37oC trong môi trường RPMI 1640 hoặc DMEM có bổ sung huyết thanh nhau phôi bò 10% (FBS), 100U/ml penicillin và 100mcg/ml streptomycin trong tủ nuôi cấy CO2 5% trong 48 giờ
Các bước tiến hành:
Tế bào được nuôi cấy 48 giờ trong môi trường RPMI 1640 hoặc DMEM ở 37oC, 5% CO2 với 10% FBS, penicillin (100 units/mL) và streptomycin (100µg/mL) Sau đó chúng được nuôi cấy trong giếng phiến 96 với thể tích là 200 µl, mật độ 2-5 x 105 tế bào/giếng (tuỳ từng loại tế bào) Sau 24 giờ, chúng được thử với hợp chất pha sẵn ở các nồng độ khác nhau trong DMSO Sau 72h, cho phản ứng với 0.5 mg/mL µl MTT, ủ 4h ở 37oC và 5% CO2 Sau đó hút bỏ hết môi trường trên bề mặt, kết tủa formazan được hòa tan trong isopropanol Độ hấp thụ được đo ở 570 nm Camptothecin được sử dụng làm đối chứng dương
Trang 4Tính kết quả
Tính giá trị CS % (% Cell Survival)
Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ ban đầu của mẫu thử, mẫu nào cho giá trị
CS ≤ 50% thì được đánh giá là có hoạt tính
Giá trị CS(%) được tính theo công thức:
𝐶𝑆% = [OD (mẫu thử) – OD ( ngày 0)
OD (DMSO) – OD ( ngày 0) × 100] ± 𝜎 Trong đó: OD: mật độ quang σ: độ lệch tiêu chuẩn
σ được tính theo công thức: 𝜎 = √(∑ 𝑥𝑖 −𝑥̅) 2
𝑛−1 ; Trong đó: xi : giá trị OD tại giếng i
x ̅: giá trị OD trung bình
n: số giếng thử lặp lại
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS ≤ 50% ± σ) sẽ được chọn ra cho thử nghiệm bước tiếp theo hòa tan trong isopropanol Độ hấp thụ được đo ở 570 nm
2.2.3 In silico Molecular docking
Các hợp chất đích, 3a-j cho thấy hoạt tính cao trong vitro đã tiếp tục được thực hiện các nghiên cứu trong silico molecular docking model là 3c, 3h và 3b để giải thích hoạt tính ức chế nấm và vi khuẩn
mạnh Phần mềm AutoDockTools phiên bản 1.5.6rc3 đã được sử dụng để tính toán docking ligand
và receptor Các cấu trúc tinh thể của các receptor Candida albicans (PDB: 6TZM, có độ phân giải 1.714 Å, DOI: 10.2210/pdb6TZM/pdb), Saccharomyces cerevisiae (3ET5, 2.5 Å, DOI: 10.2210/pdb3TE5/pdb) và Bacillus megaterium (6NVW, 2.203 Å, DOI: 10.2210/pdb6NVW/pdb) đã
được download từ ngân hàng dữ liệu Protein và vẫn còn hiệu lực Trong quá trình tính toán xử lý docking, các receptor đã được tiến hành loại bỏ các phân tử nhỏ như phân tử nước, phối tử nhỏ và dị
tố và lưu file trong định dạng (receptor.pdb), được thực hiện bởi gói phần mềm Discovery Studio
2019 Client (DSC).[38] Đối với ligand, chúng được tối ưu hóa bằng phương pháp cơ học phân tử & trường lực (MMFF94), được thực hiện bởi gói phần mềm Avogadro Cấu dạng tối ưu của ligand đã được chọn lọc để tính toán docking Phần mềm AutoDock 4.2 được sử dụng để tính toán receptor và
ligand (hợp chất tổng hợp có hoạt tính kháng khuẩn, nấm mạnh hoặc toàn bộ các cấu trúc (3a-j) với
tính toán độc tính tế bào).[39] Đối với các protein mục tiêu, điện tích Kollman và liên kết hydrogen phân cực được thêm vào tất ở tất cả các nguyên tử Trong trường hợp ligand, nó đã được thêm tất cả hydrogens phân cực, điện tích Gasteiger được tính toán, trộn lẫn các liên kết hydrogen không phân cực và file lưu ở định dạng *.pdbqt Khoảng cách điểm lưới, số lượng điểm lưới là tham số thay đổi
Trang 5và tọa độ của điểm lưới trung tâm của bản đồ lưới đã được cài đặt các giá trị 0,375Å, (60 x 60 x 60) hoặc (120x120x120) và (X = 38.324, Y = 10.387, Z = 94.100), tương ứng Một một phối tử được liên kết vào một receptor bằng phương pháp sử dụng giải thuật di truyền Lamarckian Giá trị âm tối đa của năng lượng tự do liên kết đã được chọn tương ứng với cấu trúc ổn định nhất sau 2.500.000 đánh
giá năng lượng và chạy 200 lần cho các receptor của vi khuẩn và nấm, hoặc các dòng tế bào ung
thư.[38,40-44] Các gói phần mềm Discovery Studio 2019 Client và Molegro (MMV) đã được sử dụng
để xây dựng mô hình và trình bày kết quả dưới dạng bảng và hình