Trimethyltin (TMT) đã được chứng minh gây ức chế biểu hiện của yếu tố dinh dưỡng thần kinh nguồn gốc từ não (Brain-derived neuophic factor-BDNF) trên mô hình chuột nhắt trắng. Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá sự thay đổi hàm lượng BDNF, biểu hiện của Tropomyosin receptor kinase B (TrkB), BDNF và mRNA BDNF trong vùng hồi hải mã thuộc não chuột được tiêm TMT.
Trang 1TỔN THƯƠNG TẾ BÀO THẦN KINH THÔNG QUA CON ĐƯỜNG
PHOSPHOINOSITIDE-3-KINASE/ PROTEIN KINASE B
DO TRIMETHYLTIN TRÊN CHUỘT NHẮT
Trần Phi Hoàng Yến 1 , Dương Phước An 1
TÓM TẮT
Mục tiêu: Trimethyltin (TMT) đã được chứng minh gây ức chế biểu hiện của yếu tố dinh dưỡng thần kinh
nguồn gốc từ não (Brain-derived neuophic factor-BDNF) trên mô hình chuột nhắt trắng Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá sự thay đổi hàm lượng BDNF, biểu hiện của Tropomyosin receptor kinase B (TrkB), BDNF và mRNA BDNF trong vùng hồi hải mã thuộc não chuột được tiêm TMT
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu: Chuột nhắt trắng, giống đực, Swiss
albino Phương pháp nghiên cứu: Chuột được tiêm liều duy nhất TMT 2,4 mg/kg, tiêm phúc mạc (i.p) hoặc nước muối sinh lý (sal.) Chuột được mổ tại 3 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 1 ngày, 2 ngày, 3 ngày và 7 ngày sau khi tiêm TMT, tách lấy vùng hồi hải mã để đánh giá biểu hiện protein TrkB, phospho-TrkB và BDNF bằng kỹ thuật Western blot
và phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase sao chép ngược để định lượng m-RNA BDNF
Kết quả: Kết quả cho thấy hàm lượng BDNF giảm sau 6 giờ tiêm TMT (27,1 ± 2,2 pg/mg) và kéo dài đến 7
ngày (16,3 ± 2,4 pg/mg) sau khi tiêm TMT khi so với nhóm sal (32,2 ± 2,5 pg/mg) Bằng kỹ thuật Western blot, kết quả cho thấy biểu hiện của BDNF và phospho-TrKB giảm từ 6 giờ sau khi tiêm TMT và tiếp tục giảm cho đến 7 ngày
Kết luận: Kết quả có thể chứng minh sự tổn thương và gây chết tế bào thần kinh do TMT gây ra thông qua
ức chế BDNF/TrkB receptor, từ đó ức chế con đường tín hiệu Phosphoinositide-3-kinase/ protein kinase B (PI3K/Akt)
Từ khóa: Trimethyltin, BDNF, TrKB, PI3K/Akt
ABSTRACT
NEURODEGENERATION VIA PHOSPHOINOSITIDE-3-KINASE/ PROTEIN KINASE B SIGNALING
PATHWAY CAUSED BY TRIMETHYLTIN IN MICE
Tran Phi Hoang Yen,Duong Phuoc An
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol 25 - No 6 - 2021: 29 - 34
Objectives: Trimethyltin (TMT) has been demonstrated to inhibit the expression of brain-derived
neurotrophic factor (BDNF) in a white mouse model This study was performed by assessing the changes in BDNF content and expression of Tropomyosin receptor kinase B (TrkB) in the hippocampus of the brain of TMT-induced mice
Materials and methods: Animals for this research is male mice, Swiss albino Methods: Mice were given a
single dose of TMT at a dose of 2.4 mg/kg, peritoneal injection (i.p) or saline (sal.) Mice were operated at 3 hours,
6 hours, 12 hours, 1 day, 2 days, 3 days and 7 days after TMT injection, hippocampus was separated to evaluate the expression of TrkB and BDNF proteins by Western blot analysis and reverse transcription polymerase chain synthesis (RT-PCR) to quantify m-RNA BDNF
Results: The results showed that TrkB protein expression and BDNF content decreased 6 hours after TMT
injection (27.1 ± 2.2 pg/mg) after single dose of 2.4 mg/kg TMT, i.p and lasted up to 7 days (16.3 ± 2.4 pg/mg)
1 Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Trang 2after TMT injection as compared to sal group (32.2 ± 2.5 pg/mg) By Western blot, the results showed that the expression of BDNF and phospho-TrKB decreased from 6 hours after TMT injection and continued to decrease until 7 days
Conclusion: The results may demonstrate TMT-induced neuronal cell death and injury through inhibition
of the BDNF/TrkB receptor, which in turn inhibits the Phosphoinositide-3-kinase/protein kinase B (PI3K/Akt) signaling pathway
Keywords: Trimethyltin, BDNF, TrKB, PI3K/Akt
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trimethyltin (TMT) - hợp chất hữu cơ của
thiếc, thường tồn tại với vai trò là chất ổn định
plastic Đây là hợp chất đã được nhiều nghiên
cứu trên thế giới công bố về độc tính trên tế
bào thần kinh, gây suy giảm trí nhớ; hoặc có
thể gây co giật và tử vong Nhiều nghiên cứu
trong và ngoài nước đã thực hiện nhằm chứng
minh cơ chế gây độc tính, làm thoái hóa tế bào
thần kinh của TMT(1-3), hướng đến việc tìm
kiếm thuốc mới điều trị cho các bệnh liên quan
đến thoái hóa tế bào thần kinh và suy giảm trí
nhớ Tuy nhiên cho đến nay, cơ chế gây tổn
thương tế bào thần kinh do TMT gây ra vẫn
chưa được chứng minh đầy đủ Một số nghiên
cứu đã chứng minh rằng Brain-derived
neurotrophic factor (BDNF), một yếu tố dinh
dưỡng thần kinh nội sinh và Tropomyosin
receptor kinase B (TrkB), receptor của BDNF
có thể tương tác với các con đường tín hiệu và
đồng điều chỉnh các chức năng sống còn của tế
bào(4,5) Tại Việt Nam, một nghiên cứu trên
chủng chuột Swiss albino đã chứng minh rằng
TrkA/B trong vùng hồi hải mã có biểu hiện
giảm sau khi tiêm liều duy nhất TMT 2,4
mg/kg(6) Nghiên cứu này được thực hiện
nhằm đánh giá ảnh hưởng của TMT đối với
BDNF và TrkB trên chủng chuột Swiss albino,
chủng chuột được sử dụng phổ biến trong các
nghiên cứu in vivo trên chuột tại Việt Nam
nhằm góp phần vào nghiên cứu về cơ chế gây
độc tính trên tế bào thần kinh của TMT
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Chuột nhắt trắng, giống đực, Swiss albino,
mỗi lô từ 6-8 con, cân nặng 24-26 g khoẻ mạnh,
không có biểu hiện bất thường do viện Vaccin và
Sinh Phẩm Y tế Nha Trang cung cấp Chuột được
nuôi ổn định 5-7 ngày trước khi tiến hành thử nghiệm trong phòng nuôi có chu trình 12h sáng tối (6:00 – 18:00), chuột được cung cấp đầy đủ thức ăn viên (do viên Pasteur TP Hồ Chí Minh cung cấp) và nước uống trong suốt quá trình thử nghiệm Chuột được tiêm một liều duy nhất TMT (Sigma Aldrich) liều 2,4 mg/kg, tiêm phúc mạc
(i.p) hoặc nước muối sinh lý (saline - sal.)
Chuột được giết sau khi gây mê bằng urethane (1,2 g/kg chuột, i.p) tại các thời điểm 3 giờ (3h), 6 giờ (6h), 12 giờ (12h), 1 ngày (1d), 2 ngày (2d), 3 ngày (3d) và 7 ngày (7d) sau khi tiêm TMT, sau đó được mổ và tách lấy vùng hồi hải mã Việc tách để lấy vùng hồi hãi mã được thực hiện trên đá gel, sau đó được đặt vào ống eppendorf 1,5 ml và cho ngay vào nitơ lỏng, chuẩn bị thực hiện các thử nghiệm định lượng Các mẫu mô ngay sau đó được sử dụng để đánh giá biểu hiện protein TrkB và BDNF bằng
kỹ thuật Western blot; định lượng BDNF bằng ELISA test và bằng phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase sao chép ngược để định lượng mRNA BDNF
Phương pháp định lượng để xác định hàm lượng protein tổng
Mô vùng hồi hải mã được nghiền đồng thể
với PBS (1:20) tạo dịch đồng thể, ly tâm 10.000g
ở nhiệt độ 4 oC trong 1 phút Phần trong suốt sau khi ly tâm sẽ được sử dụng cho các thử nghiệm hoá sinh và để định lượng protein bằng máy đo huỳnh quang Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen (REF Q32866; SN 1104001835), sử dụng kít Qubit Protein assay
Q33212, Lot.No 977974
Trang 3Phương pháp định lượng BDNF bằng ELISA test
Hàm lượng BDNF trong mô được xác định
bằng bộ Aviva Systems Biology BDNF ELISA
Kit (mouse) (OKBB00129) dựa trên công nghệ
xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với
enzym sandwich tiêu chuẩn Phản ứng enzym
xảy ra với chất nền tetramethylbenzidin được
xúc tác bởi enzym horseradish peroxidase để tạo
ra sản phẩm màu xanh lam Ủ hỗn hợp trong 10
phút ở điều kiện tránh ánh sáng Sau đó, thêm
dung dịch làm dừng phản ứng có tính acid
(Stop solution), hỗn hợp phản ứng sẽ chuyển
sang màu vàng, đo độ hấp thu ở bước sóng
450 nm Kết quả được tính toán dựa trên việc
xây dựng đường chuẩn BDNF có nồng độ
BDNF protein thay đổi từ 0, 62,5, 125, 250, 500,
1.000, 2.000 và 10.000 pg/ml và biểu diễn bằng
số pg BDNF/mg protein(7)
Phương pháp phân tích biểu hiện protein bằng
kỹ thuật Western blot
Thực hiện sắc ký điện di trên gel sodium
dodecyl sulfate-polyacrylamid, chuyển sang
màng lai nitrocellulose; Ủ kháng thể đặc hiệu ở
điều kiện 4 oC từ 18-24 giờ: β-actin (1:10000);
anti-TrkB (Ab-705) antibody (1:1000);
phospho-TrkB (Tyr705) polyclonal antibody (1:400) hoặc
BDNF polyclonal antibody (1:500) Rửa với
TBS-Tween 10 phút x 5 lần trên máy lắc Ủ kháng thể
thứ cấp anti-Rabbit IgG - Horseradish
Peroxidase (1:1000, Sigma-PM0100) Phát hiện
huỳnh quang trên phim X quang với thuốc thử
làm tăng tín hiệu huỳnh quang (Enhanced
chemiluminescence - Amersham, Arlington
Heights, IL, USA) Kết quả được phân tích dựa
trên mật độ hiển thị bằng phần mềm PhotoCapt
MW (Phiên bản 10.01 for Windows; Vilber
Lourmat, Marne la Vallée, France)(8)
Phương pháp phân tích định lượng mRNA
BDNF bằng kỹ thuật RT-PCR (Reverse
Phân tích định lượng RT-PCR được thực
hiện để định lượng mRNA BDNF trong vùng
hồi hải mã RNA tổng được chiết xuất từ vùng
mô phân lập bằng cách sử dụng RNeasy Mini kit
(Qiagen, Valencia, CA, USA) Quá trình phiên
mã ngược được thực hiện trong 1 giờ ủ ở 37 oC,
sử dụng 1 mg RNA cho mỗi phản ứng Khuếch đại PCR được thực hiện trong 35 chu kỳ: biến tính ở 94 oC trong 1 phút, ủ ở 60 oC trong 2 phút
và kéo dài ở 72 oC trong 1 phút Cặp mồi cho
antisense: 5'-TTCAGTTGGCCTTTTGATACC-3',
ACAGTCCATGCCATC-3' và antisense: 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' Sản phẩm PCR được hiển thị trên gel agarose 2% có chứa ethidium bromid Kết quả được phân tích mật
độ hiển thị bằng phần mềm PhotoCapt MW (Phiên bản 10.01 for Windows; Vilber Lourmat, Marne la Vallée, France)(9)
Phân tích dữ liệu và xử lý thống kê
Dữ liệu được phân tích bằng ANOVA một yếu tố và phép kiểm Fischer’s PLSD Giá trị P nhỏ hơn 0,05 được xem là có ý nghĩa thống kê
KẾT QUẢ
Phân tích định lượng BDNF bằng ELISA test
Kết quả định lượng xác định hàm lượng của BDNF trong vùng hồi hãi mã bằng ELISA test cho thấy hàm lượng BDNF giảm có ý nghĩa giai đoạn sớm sau 6 giờ tiêm TMT và giảm mạnh ở thời điểm 2 ngày, và kéo dài cho đến 7 ngày sau khi tiêm TMT
Hình 1 Sự thay đổi hàm lượng của BDNF (pg/mg
protein) trong vùng hồi hải mã ở các nhóm: chứng (sal.), và sau khi tiêm TMT 3h, 6h, 12h, 1d, 2d, 3d và 7d * p<0,05 và **p<0,01 so với nhóm sal
Trang 4Phân tích BDNF protein bằng kỹ thuật
Western blot
BDNF protein trong vùng hồi hải mã được
phân tích bằng kỹ thuật Western blot cũng cho
thấy kết quả phù hợp với kết quả định lượng
hóa sinh, thời điểm bắt đầu giảm rõ rệt BDNF
protein là 6 giờ sau khi tiêm TMT, và giảm kéo
dài cho đến 7 ngày sau khi tiêm TMT(Hình 2A)
Phân tích định lượng mRNA BDNF bằng kỹ
polymerase chain reaction)
Định lượng mRNA BDNF bằng kỹ thuật
RT-PCR cho thấy mRNA của BDNF trong vùng hồi
hải mã giảm mạnh từ 6 giờ cho đến 7 ngày sau
khi tiêm TMT (Hình 3A)
Phân tích TrKB và phospho-TrKB protein bằng
kỹ thuật Western blot
Phân tích cho thấy TrkB protein gần như
không thay đổi tại tất cả các thời điểm sau khi
tiêm TMT Tuy nhiên, dạng hoạt hóa của TrkB
(phospho-TrKB) trong vùng hồi hải mã giảm
mạnh sau 12 giờ và tiếp tục giảm cho đến 7 ngày
(Hình 4A)
Hình 2(A) Sự thay đổi biểu hiện của BDNF protein
trong vùng hồi hải mã ở các nhóm: chứng (sal.), và
sau khi tiêm TMT 3h, 6h, 12h, 1d, 2d, 3d và 7d; (B)
Sự thay đổi tỷ lệ mật độ của BDNF/ actin trong
vùng hồi hải mã ở các nhóm: chứng (sal.), và sau khi
tiêm TMT 3h, 6h, 12h, 1d, 2d, 3d và 7d * p<0,05
;**p<0,01 và ***p<0,001 so với nhóm sal
Hình 3(A) Sự thay đổi biểu hiện của mRNA BDNF
trong vùng hồi hải mã ở các nhóm: chứng (sal.), và
sau khi tiêm TMT 3h, 6h, 12h, 1d, 2d, 3d và 7d; (B)
Sự thay đổi tỷ lệ mật độ của mRNA BDNF/GAPDH trong vùng hồi hải mã ở các nhóm: chứng (sal.), và sau khi tiêm TMT 3h, 6h, 12h, 1d, 2d, 3d và 7d * p<0,05 ;**p<0,01 và ***p<0,001 so với nhóm sal
Hình 4(A) Sự thay đổi biểu hiện của TrkB và
phospho-TrkB trong vùng hồi hải mã ở các nhóm: chứng (sal.) , và sau khi tiêm TMT 3h, 6h, 12h, 1d,
2d, 3d và 7d; (B) Sự thay đổi tỷ lệ mật độ của TrkB/
actin và phospho-TrkB/ actin trong vùng hồi hải mã ở các nhóm: chứng (sal.) và sau khi tiêm TMT 3h, 6h, 12h, 1d, 2d, 3d và 7d.*p<0,05 và **p<0,01 so
với nhóm sal
Trang 5BÀN LUẬN
Một nghiên cứu trên giống chuột C57BL/6J (7
tuần tuổi) đã chứng minh rằng biểu hiện mRNA
và protein BDNF gia tăng trong vùng hồi hải mã
sau 1 ngày tiêm TMT liều 2,6 mg/kg (i.p), kết quả
này giúp lý giải sự hồi phục dấu hiệu sống của tế
bào sau 2 ngày tiêm TMT biểu hiện bằng sự
giảm số lượng tế bào biểu hiện dương với phép
nhuộm Terminal deoxynucleotidyl transferase
(TdT) dUTP Nick-End (TUNEL)(10) Nhiều
nghiên cứu áp dụng mô hình TMT nhằm hướng
tới tác động gây thoái hóa tế bào thần kinh và
suy giảm trí nhớ đã được thực hiện trên giống
chuột Swiss albino với liều hiệu quả là 2,4 mg/kg
(i.p) và tiềm thời thể hiện tế bào chết là 2 ngày,
dấu hiệu hồi phục sự sống tế bào bắt đầu thể
hiện từ 7 ngày cho đến 14 ngày(11,12) Trên cơ sở
đó, chúng tôi đã chọn khảo sát các thời điểm
sớm 3h, 6h, 12h, 1d và thời điểm muộn nhất
trong khảo sát là 7d để đánh giá tác động của
TMT đối với của thay đổi của BDNF protein và
TrkB Tuy nhiên, kết quả từ nghiên cứu hiện tại
của chúng tôi chưa chứng minh được sự gia tăng
tín hiệu BDNF dù khảo sát đến thời điểm 7 ngày
sau khi tiêm TMT Lượng mRNA BDNF và
BDNF protein đều giảm rõ rệt từ giai đoạn sớm
từ 6 giờ và sự giảm này kéo dài cho đến ngày
thứ 7 sau khi tiêm liều duy nhất TMT (2,4
mg/kg, i.p) mRNA BDNF giảm dẫn tới giảm
sinh tổng hợp BDNF protein Phát hiện biểu hiện
của TrKB và phospho-TrKB trong vùng hồi hải
mã bằng kỹ thuật Western blot đã cho thấy TMT
không ảnh hưởng đến biểu hiện của TrKB trong
khi dạng hoạt hóa của TrkB là phospho-TrkB (tại
Tyr705) thì giảm rõ rệt từ 12 giờ cho đến 7 ngày
Điều này có thể gợi ý TMT làm giảm hoạt hoá
TrkB và BDNF do đó gây kích hoạt con đường
tổn thương và thoái hoá tế bào thần kinh
Những nghiên cứu trước đây của nhóm nghiên
cứu chúng tôi cũng đã chứng minh TMT gây ra
sự ức chế các tín hiệu protein như: ức chế
phosphoryl hóa PI3K đã dẫn đến ức chế
phosphoryl hóa 3-phosphoinositide-dependent
protein kinase-1 (PDK1) và từ đó ức chế
phosphoryl hóa Akt, dẫn đến kết quả ức chế quá trình chuyển nhân và hoạt hóa của cAMP response element-binding protein (CREB)(3,6), cuối cùng gây thoái hóa tế bào thần kinh và gây suy giảm trí nhớ Như vậy, mặc dù chưa chứng minh được vai trò của BDNF trong sự hồi phục tín hiệu sống của tế bào sau 7 ngày, nhưng bước đầu đã chứng minh TMT làm giảm BDNF và receptor của nó (TrkB) dẫn đến sự ức chế con đường tín hiệu PI3K/Akt Từ những phân tích này, chúng tôi có thể phác họa tác động gây độc tính của TMT thông qua con đường tín hiệu biểu diễn bằng sơ đồ dưới đây:
Hình 5 Tác động gây độc tính của TMT thông qua
con đường tín hiệu BDNF/TrkB và P3K/Akt
KẾT LUẬN
Nghiên cứu đã chứng minh Trimethyltin (TMT) làm giảm hàm lượng BDNF trong vùng hồi hải mã thuộc não chuột nhắt ở giai đoạn sớm (từ 6h hoặc 12 giờ) và sự giảm này kéo dài đến thời điểm thử nghiệm 7 ngày sau khi tiêm liều duy nhất TMT (2,4 mg/kg, i.p) thông qua kết quả định lượng hóa sinh (ELISA test), biểu hiện protein đặc hiệu bằng kỹ thuật Western blot và kết quả định lượng mRNA bằng kỹ thuật RT-PCR Ngoài ra, phospho-TrKB, dạng hoạt hoá của TrkB, một receptor tyrosine kinase của BDNF cũng đã được chứng minh bắt đầu giảm từ 3 giờ sau khi tiêm liều duy nhất TMT và giảm mạnh cho đến 3 ngày và 7 ngày sau khi tiêm TMT
Lời cảm ơn
Nghiên cứu này được thực hiện dưới sự tài trợ của Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Ngoài ra, chúng tôi xin đặc biệt cảm ơn Giáo sư
Trang 6Hyoung-Chun Kim (Đại học Quốc gia Kangwon-
Hàn Quốc) đã quyên góp một số hóa chất và hỗ
trợ một số kỹ thuật cho nghiên cứu này
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Sohi K, Wooseok A, Sung-Ho K, Jong-Choon K, Taekyun S,
Hongbing W, Changjong M (2016) Involvement of BDNF/ERK
signaling in spontaneous recovery from trimethyltin-induced
hippocampal neurotoxicity in mice Brain Res Bull, 121:48–58
Ogita (2014) Khảo sát tế bào thần kinh ở một số vùng não suy
thoái và sự thay đổi yếu tố hỗ trợ dinh dưỡng thần kinh BDNF
do trimethyltin (tmt) trên chuột nhắt trắng Y Học Thành Phố Hồ
Chí Minh, 18(2):162-168
Nguyen Thi Thu Van (2014) Downregulation of CREB
expressions in trimethyltin-induced hippocampus caused
memory dysfunction in mice Bul Env Pharmaco Life Sci,
3(5):141-149
PI3K-mTOR pathways: cross-talk and compensation Trends Biochem
Sci, 36(6):320–328
and Wnt/beta-catenin pathways are involved in
Wnt3a-induced proliferation J Cell Sci, 118(2):313–322
(2014) Neurodegeneration caused by Trimethyltin via
inhibition of Tropomyosin Receptor Kinase A/B and
pathway Bull Env Pharmacol Life Sci, 3(2):269-274
brain-derived neurotrophic factor is required for basal neurogenesis and mediates, in part, the enhancement of neurogenesis by dietary restriction in the hippocampus of
adult mice Journal of Neurochemistry, 82(6):1367–1375
E (2009) Differential expression of neurotrophins in postnatal
C57BL/6 mice stria- tum Int J Biol Sci, 5(2):118-127
of BDNF gene deficiency to the memory impairment and brain pathology of APPswe/PS1DE9 mouse model of alzheimer’s
disease PLoS ONE, 8(7):e68722
10 Lee S, Kang S, Kim J, Yoon S, Kim SH, Moon C (2016) Enhanced expression of immediate-early genes in mouse
hippocampus after trimethyltin treatment Acta Histochem,
118(7):679-684
11 Trần Phi Hoàng Yến, Dương Phước An, Nguyễn Thị Thu Vân
(2011) Khảo sát mô hình gây thoái hóa tế bào thần kinh do
trimethyltin trên chuột nhắt trắng Dược Học, 428(51):35-38
12 Trần Phi Hoàng Yến, Dương Phước An, Trần Lê Tuyết Châu
(2012) Khảo sát mô hình gây suy giảm trí nhớ do trimethyltin
trên chuột nhắt trắng Dược Học, 431(52):41-45
Ngày nhận bài báo: 13/08/2021 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 17/09/2021 Ngày bài báo được đăng: 20/12/2021
