Luận văn thạc sĩ khoa học vũ thị huệ k23 hóa học

So với phương pháp phân tích truyền thống để định lượng hoạt chất thuốc là sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC thì định lượng chất bằng phương pháp quang phổ hồng ngoại gần và trung bình có ư

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS TẠ THỊ THẢO

Hà Nội – 2015

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Tạ Thị

Thảo đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn

thành luận văn này

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc sự hộ trợ kinh phí và thiết bị

máy móc từ đề tài nghị định thư với Cộng hòa Pháp Lotus 2014- 2016, mã

số 39/2014/HD- NĐT

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân cùng các

thầy cô, cán bộ trong bộ môn Hóa phân tích, các anh chị em học viên K23

chuyên ngành Hóa phân tích đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi rất nhiều trong

suốt quá trình nghiên cứu

Mục Lục

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về thuốc giả và hiện trạng sử dụng thuốc tại Việt Nam………….2

1.1.1 Định nghĩa về thuốc giả 2

1.1.2 Hiện trạng sử dụng thuốc giả 2

1.2 Tổng quan về thuốc kháng sinh nhóm Sulfamid……….3

1.2.1 Lịch sử ra đời nhóm Sulfamid 3

1.2.2 Cấu tạo chung của nhóm Sulfamid 4

1.2.3 Tính chất vật lý và hóa học của các sulfamid 6

1.2.4 Phân loại sulfamid 6

1.2.5 Dược động học 7

1.2.6 Độc tính của sulfamid 7

1.2.7 Giới thiệu về Sulfaguanidin, Sulfamethoxazol và Trimethoprim 8

1.3 Tổng quan về phương pháp phân tích các hoạt chất nhóm sulfamid 10

1.3.1 Phương pháp định tính sulfamid 10

1.3.2 Phương pháp định lượng 11

1.3.1.1 Phương pháp chuẩn độ thể tích 11

1.3.1.2 Phương pháp trắc quang 12

1.3.1.3 Phương pháp trắc quang kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến 12

1.3.1.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 13

1.4 Phương pháp quang phổ kế hồng ngoại gần và trung bình kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến 14

1.4.1 Sơ lược về phương pháp quang phổ hồng ngoại 14

1.4.1.1 Lịch sử ra đời của phương pháp phân tích phổ hồng ngoại 14

1.4.1.2 Nguyên tắc của phép đo phổ hồng ngoại 14

1.4.1.3 Điều kiện hấp thụ bức xạ hồng ngoại 16

1.4.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu đo phổ hồng ngoại 16

1.4.1.5 Các kỹ thuật chuẩn bị mẫu và đo phổ hồng ngoại 17

1.4.1.6 Một số ứng dụng của phương pháp phổ hồng ngoại 18

1.4.2 Định lượng các chất bằng phương pháp phổ hồng ngoại gần và trung bình kết hợp với chemometrics 19

1.4.2.1 Cơ sở lý thuyết của phương pháp hồi quy đa biến 19

1.4.2.2 Xác định đồng thời các chất bằng phương pháp quang phổ hồng ngoại gần và trung bình kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến 27

CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM 30

2.1 Nội dung và phương pháp nghiên cứu……… 30

2.1.1 Nội dung nghiên cứu 30

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu 30

2.2 Phương pháp phân tích đối chứng xác định các sulfamid 32

2.2.1 Phương pháp đối chứng xác định Sulfaguanidin 32

2.2.2 Phương pháp đối chứng xác định Sulfamethoxazol và Trimethoprim 32

2.3 Hóa chất và thiết bị………34

2.3.1 Hóa chất 34

2.3.2 Thiết bị và phần mềm máy tính 34

2.4 Chương trình máy tính của các phương pháp hồi quy đa biến 35

2.4.1 Phương pháp bình phương tối thiểu thông thường (CLS) 35

2.4.2 Phương pháp bình phương tối thiểu nghịch đảo ( ILS) 36

2.4.3 Phương pháp bình phương tối thiểu từng phần (PLS) 37

2.4.4 Phương pháp hồi qui cấu tử chính (PCR) 38

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

3.1 Khảo sát điều kiện tối ưu xác định đồng thời sulfaguanidin, sulfamethoxazol và trimethoprim trong cùng hỗn hợp 41

3.1.1 Khảo sát phổ hấp thụ của các hoạt chất 41

3.1.2 Khảo sát tỷ lệ khối lượng mẫu / KBr 44

3.1.3 Khảo sát độ lặp lại của quá trình ép viên 44

3.1.4 Khảo sát ảnh hưởng của các tá dược 45

3.2 Phương pháp hồi quy đa biến tuyến tính xác định riêng từng hoạt chất nhóm

sulfamid khi có mặt các tá dược……… 48

3.2.1 Xây dựng mô hình hồi quy đa biến gồm hoạt chất sulfaguanidin và các tá dược……… 48

3.2.2 Đánh giá phương pháp phân tích sulfaguanidin 50

3.3 Phương pháp hồi quy đa biến tuyến tính PCR xác định đồng thời sulfaguanidin, sulfamethoxazol và trimethoprim……….58

3.3.1 Xây dựng phương trình đường chuẩn đa biến xác định sulfaguanidin, sulfamethoxazol và trimethoprim bằng phương pháp PCR 58

3.3.2 Đánh giá tính phù hợp của phương trình hồi quy đa biến 61

3.3.3 Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp hồi quy cấu tử chính xác định đồng thời SFG, SFM, TMP và tá dược 64

3.4 Ứng dụng phân tích mẫu thực tế………65

3.4.1 Phương pháp xác định một số hoạt chất thuốc kháng sinh thuộc nhóm Sulfamid bằng phương pháp phổ kế hồng ngoại gần và trung bình 66

3.4.1.1 Định tính mẫu thực tế 66

3.4.2 Định lượng mẫu thực tế 72

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN 76

TÀI LIỆU THAM KHẢO………83

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1: Phổ hồng ngoại của Sulfaguanidin trên hai loại thiết bị khảo sát 41

Hình 3.2: Phổ hồng ngoại của Sulfamethoxazol tren hai thiết bị khảo sát 42

Hình 3.3: Phổ hồng ngoại của Trimethoprim trên hai loại thiết bị khảo sát 42

Hình 3.4: Phổ hồng ngoại của ba hoạt chất Sulfaguanidin, sulfamethoxazol và trimethoprim 43

Hình 3.5: Phổ hồng ngoại của Canxiphosphat 46

Hình 3.6: Phổ hồng ngoại của Tinh bột sắn 46

Hình 3.7: Phổ hồng ngoại của Maltodextrin 46

Hình 3.8: Phổ hồng ngoại của Magie Stearat 47

Hình 3.9: Phổ hồng ngoại của Talcum 47

Hình 3.10: Đồ thị score plot và đồ thị loading plot của tín hiệu phân tích 25 mẫu chuẩn 54

Hình 3.11: Đồ thị score plot và đồ thị loading plot của tín hiệu phân tích 30 mẫu chuẩn 60

Hình 3.12: Phổ hồng ngoại của Sulfaguanidin 66

Hình 3.13: Phổ hồng ngoại của Sulfamethoxazol 66

Hình 3.14: Phổ hồng ngoại của Trimethoprim 67

Hình 3.15: Kết quả định tính mẫu tự tạo 67

Hình 3.16: Kết quả định tính mẫu thực tế S1 68

Hình 3.17: Kết quả định tính mẫu thực tế S2 68

Hình 3.18: Kết quả định tính mẫu thực tế S3 69

Hình 3.19: Kết quả định tính mẫu thực tế S4 69

Hình 3.20: Kết quả định tính mẫu thực tế ST1 70

Hình 3.21: Kết quả định tính mẫu thực tế ST2 70

Hình 3.22: Kết quả định tính mẫu thực tế ST3 71

Hình 3.23: Kết quả định tính mẫu thực tế ST4 71

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Công thức cấu tạo của một số Sulfamid phổ biến 5

Bảng 3.1: Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ khối lượng mẫu/KBr đến độ hấp thụ quang tại các số sóng đặc trưng 44

Bảng 3.2: Kết quả khảo sát độ lặp lại giữa các lần ép viên 45

Bảng 3.3: Ma trận hàm lượng bốn cấu tử SFT, Tbot, Malt, Ca3(PO4)2 trong hỗn hợp 49

Bảng 3.4: Ma trận nồng độ các mẫu tự tạo chứa SFG, Tbot, Ca3(PO4)2 và Malt để đánh giá tính phù hợp của phương trình hồi quy 50

Bảng 3.5: Hàm lượng SFG tìm được trong các hỗn hợp mẫu kiểm tra 51

Bảng 3.6: Hàm lượng Tbot tìm được trong các hỗn hợp mẫu kiểm tra 52

Bảng 3.7: Hàm lượng Ca3(PO4)2 tìm được trong các hỗn hợp mẫu kiểm tra 52

Bảng 3.8: Hàm lượng Malt tìm được trong các hỗn hợp mẫu kiểm tra 53

Bảng 3.9: Hàm lượng SFG và ba tá dược tìm được trong hỗn hợp các mẫu kiểm tra 56

Bảng 3.10: Hàm lượng SFG và tổng tá dược tìm được trong các hỗn hợp mẫu kiểm tra theo phương pháp PCR 57

Bảng 3.11: Ma trận chuẩn hàm lượng bốn cấu tử SFG, SFM, TMP và tá dược trong hỗn hợp 59

Bảng 3.12: Ma trận nồng độ các mẫu tự tạo chứa SFG, SFM, TMP và tá dược để đánh giá tính phù hợp của phương trình hồi quy 62

Bảng 3.13: Hàm lượng SFT, SFM, TMP và tổng tá dược tìm được trong các hỗn hợp mẫu kiểm tra theo phương pháp PCR 63

Bảng 3.14: Giá trị LOD, LOQ của phương pháp hồi quy cấu tử chính xác định đồng thời SFG, SFM, TMP và tá dược 65

Bảng 3.15: Mẫu thực tế 65

Bảng 3.16: Khối lượng bột viên và tá dược tinh bột trộn thêm vào các mẫu 73

Bảng 3.17: Hàm lượng (mg/viên) của SFG trong các mẫu thực tế 74

Bảng 3.18: Hàm lượng (mg/viên) của SFM và TMP trong các mẫu thực tế 74

BẢNG KÍ HIỆU NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

Bình phương tối thiểu thông thường

Bình phương tối thiểu nghịch đảo

Bình phương tối thiểu từng phần

Cấu tử chính (Principal component) PC

Hồi qui cấu tử chính (principal component regression)

 Ghi chú: Trong luận văn này chúng tôi sử dụng các tên hóa chất và hoạt

chất theo quy định trong Dược điển Việt Nam 4 [1]

MỞ ĐẦU

Từ xưa đến nay, việc sử dụng thuốc trong phòng, chữa bệnh và tăng cường sức khỏe đã trở thành nhu cầu tất yếu quan trọng đối với đời sống con người Cùng với sự tiến bộ và phát triển của xã hội loài người các loại mặt hàng thuốc được nghiên cứu, sản xuất và đưa ra thị trường cũng ngày một phong phú và đa dạng Tuy nhiên bên cạnh các loại thuốc chính hãng đảm bảo chất lượng thì trên thị trường thuốc cũng tồn tại không ít các mặt hàng thuốc giả, thuốc kém chất lượng của một bộ phận các cá nhân hay doanh nghiệp đưa ra thị trường vì mục đích trục lợi Việc kiểm soát chất lượng của các loại mặt hàng này thường đòi hỏi thời gian dài với nhiều công đoạn phức tạp và chi phí kiểm định khá cao Vì vậy ngày nay thế giới đang có xu hướng tìm kiếm những phương pháp và thiết bị cho phép kiểm định nhanh thuốc đang lưu thông trên thị trường

So với phương pháp phân tích truyền thống để định lượng hoạt chất thuốc là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thì định lượng chất bằng phương pháp quang phổ hồng ngoại gần và trung bình có ưu điểm đơn giản trong quá trình tiền xử lý mẫu, phân tích trực tiếp mẫu rắn nhanh, giá thành rẻ do không tốn dung môi và nếu kết hợp với thuật toán hồi qui đa biến thì không phải tách riêng các chất trước khi phân tích nên có thể phân tích đồng thời các thuốc trong cùng nhóm thuốc Đây

chính là lí do chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu định lượng một số hoạt chất

thuốc kháng sinh thuộc nhóm Sulfamid bằng phương pháp phổ kế hồng ngoại gần

và trung bình” Luận văn này là một phần trong chương trình hợp tác quốc tế giữa

Việt Nam và Pháp với mục đích nghiên cứu phát triển phương pháp quang phổ hồng ngoại gần và trung bình kết hợp với các phương pháp hồi quy đa biến tuyến tính để kiểm định nhanh chất lượng thuốc Nghiên cứu này sẽ góp phần khẳng định

xu hướng đưa các phép phân tích ra khỏi nghiên cứu đơn thuần và áp dụng nhanh trong thực tế, đồng thời cho phép tiết kiệm thời gian, hóa chất và đặc biệt là tăng tính thời sự của công tác giám định chất lượng

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về thuốc giả và hiện trạng sử dụng thuốc tại Việt Nam

1.1.1 Định nghĩa về thuốc giả

Theo định nghĩa của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), thuốc giả là sản phẩm được sản xuất và dán nhãn dưới dạng thuốc với ý đồ lừa đảo về nguồn gốc và lai lịch sản phẩm Các sản phẩm giả mạo có thể có dược chất sai hoặc không có dược chất, không đủ lượng dược chất hoặc bao gói giả mạo [38]

Theo định nghĩa của Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ (FDA): Thuốc giả bao gồm bất kỳ dược phẩm nhái hoặc kém chất lượng nào không đáp ứng được tiêu chuẩn của FDA nhưng cố tình che giấu sự thật [36] Thuốc giả có thể có một hoặc nhiều hay tất cả các yếu tố sau:

- Quá mạnh hoặc quá yếu

- Thiếu các thành phần chính

- Được sản xuất từ các thành phần nguy hiểm

- Nhiễm chất lạ, thậm chí có chất độc

- Được sản xuất trong điều kiện mất vệ sinh hoặc không vô trùng

- Được tạo ra theo các tiêu chuẩn không an toàn

- Được dán nhãn, cất giữ hay bảo quản không đúng cách

- Quá hạn sử dụng (hết hạn)

1.1.2 Hiện trạng sử dụng thuốc giả

Theo thống kê của WHO, đã có sự bùng nổ thuốc giả trên phạm vi toàn cầu Thuốc giả chiếm tới 10% thị trường dược phẩm thế giới với doanh thu 45 tỉ euro/năm, trung bình mỗi năm có khoảng 200.000 người tử vong do thuốc giả [35]

Tại Việt Nam, theo Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, năm 2011, trong

số hơn 31.000 mẫu thuốc được kiểm tra gần đây thì đã có hơn 1.000 mẫu không đạt tiêu chuẩn chất lượng như nhiễm khuẩn, không đủ độ hòa tan, không đủ định lượng Nguồn tin từ Bộ Y tế cũng cho biết, trong hơn 10 ngày đầu tháng 2/2012, hầu như ngày nào Bộ cũng phát hiện thuốc giả, thuốc kém chất lượng.[3]

Các thuốc giả, thuốc nhái có thể chứa bất cứ thành phần nào từ phấn bảng, bê-tông nghiền, acid boric hoặc những gì tệ hơn thế và được bán như thuốc thật Thuốc giả không chỉ đánh lừa người tiêu dùng, chúng còn vô hiệu hóa các liệu pháp điều trị để cứu sống bệnh nhân Trong rất nhiều trường hợp thuốc giả gây ra tác hại

to lớn như gây ra các phản ứng dị ứng, nhiễm độc kim loại nặng cũng như làm bệnh nhân dễ kháng thuốc [23] Tuy nhiên, việc phát hiện thuốc giả lưu thông trên thị trường gặp rất nhiều khó khăn Thông thường, do doanh số bán (lượng tiêu thụ) của một mặt hàng thuốc nào đó giảm nghiêm trọng, nhà sản xuất hoặc nhà phân phối hàng chính hãng mới đặt vấn đề với cơ quan chức năng về hiện tượng làm giả thuốc này và khi đó cơ quan chức năng mới tiến hành xác minh (kiểm tra đột xuất tại các

cơ sở sản xuất kinh doanh; niêm phong mẫu và đem phân tích theo các phương pháp tiêu chuẩn trong phòng thí nghiệm, rồi đưa ra kết luận) [3] Quá trình này thường rất tốn kém và mất thời gian, do đó đòi hỏi cần phải nghiên cứu tìm ra một phương pháp kiểm nghiệm mới, nhanh chóng, đơn giản và tiết kiệm để kiểm định nhanh được chất lượng thuốc ngoài hiện trường

1.2 Tổng quan về thuốc kháng sinh nhóm Sulfamid

1.2.1 Lịch sử ra đời nhóm Sulfamid

Ngay từ những năm đầu thế kỉ các nhà khoa học nhận thấy rằng các phẩm nhuộm có tác dụng kháng khuẩn, tuy nhiên các phẩm nhuộm thường rất độc Trong những cố gắng tìm những thuốc kháng khuẩn trên cơ sở các thuốc nhuộm năm

1913, người ta đã tìm thấy phẩm azoic cryzoidin có tác dụng diệt khuẩn và tương đối ít độc [28] Đồng thời khi thêm nhóm –SO2NH2 các phẩm nhuộm thường rất bền vì gắn chặt vào protein, vì vậy người ta cũng gắn thêm vào phân tử cryzoidin nhóm sulfamido, kết quả là cho một chất có khả năng chống tụ cầu và liên cầu prontosil Đây là chất kháng khuẩn đầu tiên thu được bằng phương pháp tổng hợp toàn phần Prontosil khó tan trong nước nên người ta thêm vào đó nhóm COOH từ

đó có thể tạo muối dễ tan Năm 1935, Domagk, Trefouel và Levaditikhisi dùng prontosil kháng khuẩn thì nhận thấy: mặc dù có kết quả tốt trên liên cầu trên in vivo nhưng lại không có tác dụng trên in vitro, như vậy có thể khi vào cơ thể, prontosil

đã chuyển hóa thành chất khác có tác dụng kháng khuẩn [15] Khi phân tích công thức của prontosil ta thấy đó là các azoic được điều chế bằng cách diazo hóa p-amino benzene sulfonamid(sulfanilamid) ngưng tụ với m-phenylendiamin Khi thay m-phenylendiamin bằng các amin hoặc các phenol khác chúng ta thu được các dẫn chất có tác dụng kháng khuẩn nhưng khi thay sulfanilamid bằng các anilin khác nhau thì thu được các chất không có tác dụng kháng khuẩn Như vậy, có thể các sulfanilamid là phần có tác dụng kháng khuẩn Thật vậy, khi thử tác dụng của sulfanilamid cho thấy có tác dụng kháng khuẩn tốt Khi kiểm tra nước tiểu của người uống prontosil thấy có mặt sulfanilamid dưới dạng acetyl hóa [6, 13]

Sulfanilamid đã trở thành sulfamid đầu tiên trong lịch sử Việc phát hiện ra prontosil và sulfanilamid đã mở ra một kỉ nguyên mới cho việc hóa trị liệu các bệnh nhiễm khuẩn Dựa trên cấu trúc của sulfanilamid người ta đã tổng hợp rất nhiều sulfamid, trong đó có khoảng 40 loại được sử dụng làm thuốc Ngày nay, việc ra đời của các kháng sinh có tác dụng kháng khuẩn rất mạnh nên các sulfamid được sử dụng ít hơn Tuy nhiên việc sử dụng các sulfamid có ưu điểm:

 Có thể sản xuất lớn, giá thành rẻ

 Nhiều sulfamid có tác dụng khác: lợi tiểu, hạ đường huyết

 Các tác dụng phụ của sulfamid đã được khắc phục tốt

1.2.2 Cấu tạo chung của nhóm Sulfamid

Các sulfamid kháng khuẩn là dẫn chất của p- aminobenzensulfonamid, có công thức cấu tạo chung là:

Sulfamid có công thức cấu tạo gần giống với PABA (para amino benzoic acid) là nguồn nguyên liệu cần thiết cho vi khuẩn tổng hợp acid folic để phát triển

Do đó sulfamid tranh chấp với PABA ngăn cản quá trình tổng hợp acid folic của vi khuẩn Ngoài ra, sulfamid còn ức chế dihydrofolat synthetase, một enzym tham gia tổng hợp acid folic Về mặt lý thuyết, phổ kháng khuẩn của sulfamid rất rộng, gồm hầu hết các cầu khuẩn, trực khuẩn gram (+) và (-) Hiện nay, tỷ lệ kháng thuốc và kháng chéo giữa các sulfamid đang rất cao nên đã hạn chế việc sử dụng sulfamid rất nhiều Mặt khác do có nhiều độc tính và đã có kháng sinh thay thế, sulfamid ngày càng ít dùng một mình, thường dùng dạng phối hợp sulfamethoxazol với trimethoprim để tăng khả năng điều trị của thuốc Dưới đây là công thức cấu tạo của một số sulfamid phổ biến

Bảng 1.1: Công thức cấu tạo của một số Sulfamid phổ biến

CH3

-H

Sulfadoxin C12H14N4O4S

NN

-H

1.2.3 Tính chất vật lý và hóa học của các sulfamid

 Tính chất vật lý

Sulfamid ở dạng tinh thể màu trắng hoặc màu vàng nhạt trừ prontosil, không mùi, thường ít tan trong nước, benzen, chloroform Sulfamid tan trong dung dịch acid vô cơ loãng và hydroxyd kiềm (trừ sulfaguanidin) [6] Các sulfamid có các thông số xác định về: độ chảy, phổ IR, phổ UV (do có chứa nhân thơm)

 Tính chất hóa học

Hầu hết các Sulfamid đều có tính chất lưỡng tính: [6]

- Tính acid (trừ sulfaguanidin): do có H ở N- amid linh động

- Tính bazơ: Có tính kiềm do có nhóm amin thơm tự do, nên tan trong dung dịch acid

Các sulfamid có thể tham gia phản ứng diazo hoá do có nhóm amin thơm tự

do (có thể tham gia phản ứng ghép đôi với 2-naphtol/kiềm để cho sản phẩm màu đỏ

da cam)

Tác dụng với một số muối kim loại (CuSO4, CoCl2) tạo thành phức màu tủa với Cu2+, Co2+ đặc trưng cho từng sulfamid, nên thường được dùng để phân biệt các sulfamid với nhau Đốt khô trong ống nghiệm, sulfamid bị phân huỷ, để lại cặn có màu điển hình cho từng sulfamid, ví dụ, đốt sunfanilamid sẽ giải phóng ammoniac

và cho cặn màu xanh tím

1.2.4 Phân loại sulfamid

Sulfamid là một trong những kháng sinh tổng hợp đầu tiên được loài người phát hiện và sử dụng Việc tìm thấy sulfamid đã mở ra một kỷ nguyên mới của các thuốc chống nhiễm khuẩn trước khi có penicilin Khi phân loại kháng sinh theo tác dụng, nhóm sulfamid được xếp vào nhóm các loại kháng sinh có tác dụng kìm khuẩn Do tác dụng của sulfamid đều giống nhau, việc điều trị dựa vào dược động học của thuốc cho nên người ta chia các sulfamid làm 4 loại: Loại hấp thu nhanh, thải trừ nhanh: nồng độ tối đa trong máu sau uống là 2 - 4h t1/2 =6-8h, thải trừ 95% trong 24h Dùng điều trị nhiễm khuẩn theo đường máu như sulfadiazin, sulfisoxazol (Gantrisin), sulfamethoxazol (Gantazol) Loại hấp thu rất ít: dùng chữa viêm ruột,

viêm loét đại tràng như sufaguanidin (Ganidan) Loại thải trừ chậm: duy trì được nồng độ điều trị trong máu lâu, t1/2 có thể tới 7 - 9 ngày nên chỉ cần uống 1 lần/ngày Hiện dùng sulfadoxin (Fanasil), phối hợp với pyrimethamin trong Fansidar để dự phòng và điều trị sốt rét kháng cloroquin Loại để dùng tại chỗ: ít hoặc khó tan trong nước Dùng điều trị các vết thương tại chỗ (mắt, vết bỏng) dưới dạng dung dịch hoặc kem Có sulfacetamid, silver sulfadiazin, mafenid [2]

Hiện nay hầu hết các vi khuẩn đều kháng với sulfamid nên thuốc này rất ít được sử dụng Để khắc phục nhược điểm này người ta thường dùng sulfamid ở dạng phối hợp Dạng phối hợp phổ biến nhất của sulfamid là việc kết hợp giữa sulfamethoxazol và trimethoprim với tỉ lệ 1 trimethoprim và 5 sulfamethoxazol nhằm tạo ra kháng sinh có khả năng kháng khuẩn, tăng hiệu quả điều trị và giảm tỉ

lệ kháng thuốc của vi khuẩn, thuốc hấp thu tốt qua đường tiêu hóa, t/2 của thuốc từ 9-11 giờ [2]

1.2.5 Dược động học

Các sulfamid được hấp thu nhanh qua dạ dày và ruột (trừ loại sulfaguanidin),

70 - 80% liều uống vào được máu, gắn với protein huyết tương 40 - 80%, nồng độ tối đa đạt được sau 2- 4 giờ Từ máu, sulfamid khuếch tán rất dễ dàng vào các mô, vào dịch não tuỷ (bằng 1/2 hoặc tương đương với nồng độ trong máu), qua rau thai, gây độc Các quá trình chuyển hóa chủ yếu ở gan của sulfamid gồm: Phản ứng liên hợp với acid glucuronic thành dạng bất hoạt nhưng có tính hòa tan Phản ứng acetyl hóa tạo thành dạng bất hoạt và không tan nên thường gây độc (hình thành dạng tinh thể ở thận) Sau đó các sulfamid được bài thải qua thận là chủ yếu (trừ các sulfamid kháng khuẩn đường ruột), một ít qua phân, sữa [2]

1.2.6 Độc tính của sulfamid

Tác dụng phụ khi sử dụng sulfamid là khoảng 5% khác nhau đối với mỗi cá thể và đối với mỗi loại sulfamid Dưới đây là một số tác dụng có thể gặp khi sử dụng sulfamid:

Rối loạn hệ thống tạo máu: cơ chế tác dụng rất khác nhau, có trường hợp là

do mẫn cảm, trường hợp khác do sự tan huyết liên quan đến sự hoạt hóa glucose- 6

photsphat dehydrogenase Phản ứng này không phụ thuộc vào nồng độ sulfamid mà vào từng cá thể Phản ứng thường xảy ra trong tuần đầu dùng thuốc Triệu chứng có thể là: buồn nôn, sốt, chóng mặt, vàng da, xanh xao, trong trường hợp nặng có thể là thiếu máu bất sản Một số trường hợp có thể gây tím tái do tạo methemoglobin

Thận: đây là trường hợp không mong muốn thường gặp nhất khi sử dụng sulfamid Sulfamid có thể gây kết tinh ở thận, gây tổn thương thận, viêm thận, sỏi thận, đái ra máu Nhược điểm này đã được khắc phục dần do tìm được những sulfamid ít acetyl hóa, ít kết tinh…

Phản ứng tăng nhạy cảm: phản ứng rất khác nhau với từng loại sulfamid và với từng người, thường xuất hiện khi sử dụng các loại sulfamid tác động chậm Triệu chứng có thể là nổi ban đỏ, xuất huyết…Khi dùng ngoài da có thể gây nám da

do sự kích thích sự nhạy cảm của da khi tiếp xúc với tia tử ngoại [2]

1.2.7 Giới thiệu về Sulfaguanidin, Sulfamethoxazol và Trimethoprim

Trong số những kháng sinh nhóm sulfamid đã được tổng hợp, sulfaguanidin

và sulfamethoxazol là một trong những hoạt chất được sử dụng phổ biến nhất hiện nay Tuy nhiên, do khả năng kháng thuốc của vi khuẩn ngày càng tăng nên hiện nay người ta thường sử dụng dạng phối hợp của sulfamid với trimethoprim như sulfamethoxazol, sulfadiazin với trimethoprim để tăng thêm hiệu quả điều trị [2]

Do đó trong luận văn này chúng tôi đã tiến hành đi sâu nghiên cứu ba hoạt chất là: sulfaguanidin, sulfamethoxazol (thuộc nhóm sulfamid) và trimethoprim (dạng phối hợp phổ biến với sulfamid)

 Giới thiệu về Sulfaguanidin

Công thức: C7H10N4O2S

KLPT: 214,2 Sulfaguanidin là (4-aminophenylsulfonyl)guanidin, tồn tại ở dạng bột kết tinh mịn màu trắng hoặc gần như trắng Rất khó tan trong nước và ethanol 96 %,

khó tan trong aceton, thực tế không tan trong methylen clorid, tan trong dung dịch acid vô cơ loãng [6]

Sulfaguanidin được sử dụng để trị các bệnh đường ruột như tả, lỵ, viêm ruột

Là kháng sinh ít tan trong kiềm, không hấp thu ở ruột, ít độc nên có thể dùng với liều cao Tuy nhiên sulfaguanidin có ảnh hưởng tới vi khuẩn đường ruột, nên khi dùng nên uống thêm men tiêu hóa và uống kèm vitamin B1

 Giới thiệu về Sulfamethoxazol

Công thức: C10H11N3O3S

KLPT: 253,3 Sulfamethoxazol là 4-amino-N-(5-methylisoxazol-3-yl)benzensulfonamid, tồn tại ở dạng bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng Thực tế không tan trong nước, dễ tan trong aceton, hơi tan trong ethanol 96 %, tan trong dung dịch natri hydroxyd loãng và dung dịch acid loãng [6]

Sulfamethoxazol là sulfamid có tác động trung gian dùng trị nhiễm trùng đường tiểu, sinh dục, nhiễm trùng da

 Giới thiệu về Trimethoprim

Công thức: C14H18N4O3

KLPT: 290,3 Trimethoprim là 2,4 diamino-5-(3,4,5-trimethoxybenzyl) pyrimidin, tồn tại ở dạng bột trắng hoặc trắng hơi vàng Rất khó tan trong nước, khó tan trong ethanol

96 %, hơi tan trong cloroform, thực tế không tan trong ether [6]

Triemthoprim được sử dụng trong các trường hợp điều trị đợt cấp của viêm phế quản mạn, dự phòng lâu dài nhiễm khuẩn tiết niệu tái phát, nhiễm khuẩn tiết niệu dưới cấp tính nhạy cảm với trimethoprim, viêm phổi do Pneumocystis carinii

Hiện nay so khả năng kháng các thuốc nhóm sulfamid ngày càng cao nên người ta thường sử dụng dạng phối hợp giữa sulfamethoxazol và trimethoprim để tăng cường khả năng kháng khuẩn của thuốc Bản chất của sulfamethoxazol là một sulfonamid, ức chế cạnh tranh sự tổng hợp acid folic của vi khuẩn Trimethoprim là một dẫn chất của pyrimidin, ức chế đặc hiệu enzym dihydrofolat reductase của vi khuẩn Khi phối hợp trimethoprim và sulfamethoxazol như vậy sẽ ức chế hai giai đoạn liên tiếp của sự chuyển hóa acid folic, do đó ức chế có hiệu quả việc tổng hợp purin, thymin và cuối cùng DNA của vi khuẩn Sự ức chế nối tiếp này có tác dụng diệt khuẩn Cơ chế hiệp đồng này cũng chống lại sự phát triển vi khuẩn kháng thuốc

và làm cho thuốc có tác dụng ngay cả khi vi khuẩn kháng lại từng thành phần của thuốc [2]

1.3 Tổng quan về phương pháp phân tích các hoạt chất nhóm sulfamid 1.3.1 Phương pháp định tính sulfamid

 Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Phương pháp sắc ký lớp mỏng là một phương pháp khá đơn giản được sử dụng để định tính các sulfamid Trong phương pháp này người ta thường sử dụng các hệ dung môi khai triển như dicloromethan- methanol- acid formic khan (70:20:10) để định tính sulfaguanidin; hệ cloroform - methanol - dimethylformamid (20 : 2 : 1), hoặc cloroform - methanol (19 :1) để định tính sulfamethoxazol; hệ heptan - cloroform - dung dịch methanol 5 % (v/v) trong ethanol - acid acetic băng

tỷ lệ (4 : 4 : 4 : 1) để định tính sulfadoxin [1] Tiến hành chấm riêng biệt mỗi dung dịch lên bản mỏng silica gel GF254 Triển khai sắc ký tới khi dung môi đi được khoảng 15 cm, lấy bản mỏng ra để ở nhiệt độ phòng Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm Vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải phù hợp về vị trí, màu sắc và kích thước với vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu

 Phương pháp phổ hồng ngoại

Phương pháp phổ hồng ngoại cho phép nhận dạng sự xuất hiện và có mặt của các nhóm chức đặc trưng [13, 7] Cụ thể, xác định sự có mặt nhóm sulfoamid bậc 2 (-SO2-NH-) cho các băng sóng hấp thu ở gần 3265 cm-1, dị vòng isoxazol có băng sóng hấp thụ dao động trong vùng 3500- 3200 cm-1, băng sóng hấp thụ ở 3335 cm-1

thuộc về dao động hóa trị của nhóm N-H (amin bậc 2) Băng sóng hấp thụ ở vùng 3100- 3000 cm-1 thuộc về dao động hóa trị của nhóm C-H thuộc vòng aren. Các dao động hóa trị của C=N- thuộc vùng 1250-1020 cm-1

, vùng 1360- 1250 cm-1 là dao động hóa trị của C-N (vòng thơm), vùng 1340-1250 cm-1 là vùng dao động hóa trị của nhóm N-H (amin thơm bậc một)

Để định tính các mẫu thuốc, tiến hành đo phổ IR của các mẫu thử sau đó so

sánh với phổ IR của mẫu chuẩn trong các thư viện phổ tham chiếu

1.3.2 Phương pháp định lượng

1.3.1.1 Phương pháp chuẩn độ thể tích

- Dựa trên cơ sở phản ứng diazo hóa các sulfamid trong môi trường acid các Sulfamid được xác định theo phương pháp chuẩn độ nitrit chậm, điểm tương đương được phát hiện bằng phương pháp chuẩn độ điện thế [1] Đây là một phương pháp định lượng rất nhanh chóng, đơn giản, tiết kiệm được áp dụng phổ biến để xác định các Sulfamid trong dược phẩm

- Nhóm tác giả D Amin, B Shaba và các cộng sự đã sử dụng dung dịch brôm làm thuốc thử để xác định các sulfamid trong dược phẩm bằng phương pháp chuẩn độ gián tiếp [17] Theo đó phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng của các sulfamid với một lượng dư nước brom bão hòa để tạo thành các dẫn xuất N- bromo tương ứng, quá trình này giải phóng một lượng tương đương của iot khi phản ứng với iot Iot tự do có thể được xác định bằng phương pháp chuẩn độ vởi natri thiosulfat, sử dụng hồ tinh bột làm chỉ thị Hiệu suất thu hồi của phương pháp là từ 97,8- 102,1 %, hệ số biến thiên là từ 0,1- 2,2 % tùy thuộc vào hàm lượng của các sulfamid trong dược phẩm

1.3.1.2 Phương pháp trắc quang

Nhóm tác giả Nagaraja P1, Naik SD và cộng sự đã tìm ra một phương pháp đơn giản, có độ nhạy cao dùng để xác định một số sulfamid trong các chế phẩm dược [30] Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng diazo hóa của sulfacetamid, sulfadiazin, sulfaguanidin, sulfamerazin, sulfamethazin, sulfamethoxazol và các liên kết của chúng với 8-hydroxyquinolin trong môi trường kiềm tạo ra sản phẩm màu

đỏ có độ hấp thụ cực đại tại bước sóng 500 nm Nồng độ tuân theo định luật Beer từ 0,1 đến 7,0 mg/ml Giới hạn phát hiện và giới hạn đinh lượng của phương pháp lần lượt là 0,03- 0,05 và 0,11-0,18 mg/ml Độ chính xác của phương pháp là từ 97,3- 100,8 % Phương pháp này khá thành công trong việc định lượng các sulfamid trong các mẫu dược phẩm

Cũng trên cơ sở phản ứng diazo hóa các sulfamid các tác giả Padmarajaiah Nagaraja, Hemmige S Yathirajan, Kallanchira R Sunitha, Ramanathapura A Vasantha [31] lại đưa ra phương pháp xác định các sulfamid như sulfathiazol, sulfadiazine, sulfacetamid, sulfamethoxazol, sulfamerazin, sulfaguanidin và sulfamethazin trong dược phẩm dựa trên phản ứng diazo hóa các sulfamid trên, sau

đó tiến hành tạo phức với dopamine trong sự có mặt của ion molybdat trong môi trường acid H2SO4 tỷ lệ (1:1) Sản phẩm của phản ứng này là dung dịch có màu đỏ

có độ hấp thụ trong vùng từ 490-510 nm, các dung dịch này có độ bền trong 48 giờ tại 27C Nồng độ tuân theo định luật Beer từ 0,04 đến 8,0 µg/ml Phương pháp này được áp dụng thành công trong việc xác định các sulfamid trong các sản phẩm thuốc viên và thuốc nhỏ mắt Các tá dược trong thuốc không ảnh hưởng đến kết quả

đo Do đó đây là phương pháp khá đơn giản, nhanh chóng, kinh tế và có độ nhạy cao áp dụng để phân tích các sulfamid tron dược phẩm mà không cần chiết tách hay gia nhiệt

1.3.1.3 Phương pháp trắc quang kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến

Phương pháp trắc quang kết hợp với các thuật toán hồi quy đa biến như: bình phương tối thiểu thông thường (CLS), bình phương tối thiểu từng phần (PLS ), hồi qui cấu tử chính ( PCR) là một phương pháp khá đơn giản, nhanh chóng và tiết

kiệm để xác định đồng thời các thuốc kháng khuẩn như sulfamid và trimethoprim trong dược phẩm Tập hợp các dung dịch mẫu được hòa tan và pha loãng với dung dịch ethanol pH = 9,9 đến nồng độ thích hợp và đo phổ hấp thụ trong vùng bước sóng từ 200- 350 nm Tiến hành nghiên cứu trên 5 hoạt chất: sulfadiazin, sulfadimidin, sulfamethoxazol, sulfanilamid and trimethoprim xác định được khoảng tuyến tính của các đường chuẩn đơn biến đều nằm trong khoảng nồng độ từ 1,0 – 24,0 mg/l, giới hạn phát hiện là 0,2 – 1,0 mg/l Mô hình chuẩn của ba phương pháp đa biến được xây dựng trên cơ sở dữ liệu phổ của các mẫu hỗn hợp chứa đồng thời các hoạt chất trên Kết quả phân tích cho thấy độ thụ hồi của hai mô hình PCR

và PLS xấp xỉ 100 %, trong khi mô hình CLS có độ thu hồi kém hơn hẳn Mô hình PCR dựa trên ma trận dữ liệu thô đã được lựa chọn áp dụng cho việc phân tích xác định hàm lượng năm hoạt chất nghiên cứu trong các loại thuốc thành phẩm [39]

1.3.1.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp phổ biến có độ chính xác, độ nhạy cao, giới hạn phát hiện thấp được áp dụng rộng rãi để xác định các sulfamid trong các sản phẩm dược phẩm

Theo đó Sulfadoxin (trong viên nén Sulfadoxin và pyrimethamin) được định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng với hệ pha động là: Dung dịch đệm pH 5,9 - acetonitril (4 : 1) Dung dịch đệm pH 5,9: Thêm 1 ml triethylamin và 200 ml acetonitril vào 700 ml nước, điều chỉnh đến pH 5,9 bằng dung dịch acid acetic 1 %, sau đó thêm nước vừa đủ 1000 ml, trộn đều, lọc Điều kiện sắc ký: Cột thép không

gỉ (30 cm × 3,9 mm) được nhồi pha tĩnh B (5 m) với detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 230 nm, tốc độ dòng: 2,0 ml/phút, thể tích tiêm: 20 l [1]

Theo dược điển Mỹ USP 34- NF 29 [37] Sulfamethoxazol (trong hỗn hợp thuốc chứa Sulfamethoxazol và trimethoprim) được xác định với điều kiện sắc ký: Cột C 18 (250 x 4,6 mm; 5µm), detector UV: 254 nm, tốc độ dòng: 1,8 ml/ phút, thể tích tiêm: 20 µl Pha động: 700ml nước + 200ml Acetonitril + 1ml triethylamin (điều chỉnh pH 5,9 ± 0,1 bằng dung dịch acid acetic 1% hoặc dung dịch natri hydroxyd 0,2N, thêm nước vừa đủ 1000 ml

Nhóm tác giả Cemal Akay, Sibel A Ozkan [16] đã tiến hành nghiên cứu thành công quy trình định lượng Sulfamethoxazol (trong hỗn hợp thuốc chứa Sulfamethoxazol và trimethoprim) theo phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với pha động là hỗn hợp của methanol : nước (60: 40) điều chỉnh đến pH=3,0 bằng acid phosphoric 10 % Điều kiện sắc ký: Cột C18, detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 213 nm, tốc độ dòng 1,8 ml/min, thể tích tiêm 10 l Khoảng tuyến tính của phương pháp là từ 2,0-10,0 µg/ ml đối với trimethoprim và từ 10,0- 50,0 0 µg/ ml đối với sulfamethoxazol Giới hạn phát hiện tương ứng với trimethoprim và sulfamethoxazol lần lượt là 0,45 và 1,21 µg/ ml

1.4 Phương pháp quang phổ kế hồng ngoại gần và trung bình kết hợp với

thuật toán hồi quy đa biến

1.4.1 Sơ lược về phương pháp quang phổ hồng ngoại

1.4.1.1 Lịch sử ra đời của phương pháp phân tích phổ hồng ngoại

Quang phổ hồng ngoại gần lần đầu tiên được sử dụng vào năm 1881 bởi Abney và Festing khi làm việc với các tấm ảnh [25] Họ đã phát hiện ra sự tồn tại của các bức xạ nhiệt ở ngoài vùng phổ của ánh sáng nhìn thấy và chứng minh được

sự hấp thụ của các bức xạ này có liên quan đến các thành phần hóa học trong các hợp chất nghiên cứu Wiliam W.Coblentz là một trong những người tiên phong đầu tiên nghiên cứu về quang phổ hồng ngoại Năm 1905, ông công bố kết quả nghiên cứu của các hợp chất mà ông ghi lại từ 1000 nm đến 16.000 nm Việc Coblentz công bố kết quả đã tạo ra một bước đột phá mới cho các nhà nghiên cứu, có liên quan đến quang phổ của các nhóm nguyên tử trong phân tử, liên quan đến sự hấp thụ ở giữa (2500-50,000nm) Từ đó, chúng ta có thể hiểu về liên kết hóa học như dao động giữa hai hay nhiều nguyên tử, các liên kết sẽ dao động và khi năng lượng được bổ sung thì các dao động này sẽ mạnh hơn Dao động hóa trị đòi hỏi năng lượng cao hơn so với dao động biến dạng

1.4.1.2 Nguyên tắc của phép đo phổ hồng ngoại

Phương pháp phân tích theo phổ hồng ngoại là một trong những kĩ thuật phân tích rất hiệu quả Một trong những ưu điểm quan trọng nhất của phương pháp

phổ hồng ngoại vượt hơn những phương pháp phân tích cấu trúc khác (nhiễu xạ tia

X, cộng hưởng từ điện tử…) là phương pháp này cung cấp thông tin về cấu trúc phân tử nhanh, không đòi hỏi các phép tính toán phức tạp.[27]

Kỹ thuật này dựa trên hiệu ứng đơn giản là: các hợp chất hóa học có khả năng hấp thụ chọn lọc bức xạ hồng ngoại Sau khi hấp thụ các bức xạ hồng ngoại, các phân tử của các hợp chất hóa học dao động với nhiều vận tốc dao động và xuất hiện dải phổ hấp thụ gọi là phổ hấp thụ bức xạ hồng ngoại [7]

Các đám phổ khác nhau có mặt trong phổ hồng ngoại tương ứng với các nhóm chức đặc trưng và các liên kết có trong phân tử hợp chất hóa học Bởi vậy, phổ hấp thụ hồng ngoại là phổ dao động quay vì khi hấp thụ bức xạ hồng ngoại thì

cả chuyển dộng dao động và chuyển động quay đều bị kích thích Bức xạ hồng ngoại (IR) là một vùng phổ bức xạ điện từ rộng nằm giữa vùng trông thấy và vùng viba, vùng này có thể chia thành ba vùng nhỏ:

 Hồng ngoại gần (near infrared): 14000- 4000 cm-1 (0,8- 2,5µm)

 Hồng ngoại trung (medium infrared): 4000- 400 cm-1

(25- 2,5μm)

 Hồng ngoại xa (far infrared): 400- 10 cm-1 (50-100µm)

Hầu hết các nhóm nguyên tử trong các hợp chất hữu cơ hấp thụ ở vùng 650cm-1 Vùng phổ từ 4000-1500 cm-1 được gọi là các vùng nhóm chức vì chứa hầu hết các vân hấp thụ của các nhóm chức như OH, NH, C=O, C=N, C=C…Vùng phổ nhóm chức tập trung làm bốn vùng mà mỗi vùng, tần số đặc trưng nhóm có giá trị thay đổi phụ thuộc vào cấu tạo phân tử Vùng 3650-2400 cm-1 chứa các vân dao động hóa trị của X-H (X:O, N, C, S, P…); vùng từ 2400-1900 cm-1

gồm các vân dao động hóa trị của các nhóm mang liên kết ba hoặc hai liên kết đôi kề nhau; vùng 1900-1500 cm-1 chứa các vân dao động hóa trị của các nhóm mang liên kết đôi và

do dao động biến dạng của nhóm –NH2 Vùng phổ từ 1500-700 cm-1, mặc dù chứa các vân hấp thụ đặc trưng cho dao động hóa trị của các liên kết đơn như C-C, C-N, C-O…và các vân do dao động biến dạng của các liên kết C-H, C-C… nhưng thường được dùng để nhận dạng toàn phân tử hơn là để xác định các nhóm chức, vì ngoài các vân hấp thụ trên còn có nhiều vân hấp thụ xuất hiện do tương tác mạnh giữa các

dao động Các vân hấp thụ này đặc trưng cho chuyển động của các phân tử chứ không thuộc riêng nhóm nguyên tử nào, và vì vậy, vùng phổ này thường được gọi là vùng chỉ vân tay Vùng phổ từ 650-250 cm-1 cung cấp các thông tin có giá trị đối với hợp chất vô cơ và phức chất, vì chứa các vân phổ liên quan đến dao động hóa trị của C-Br, C-I và M-X(M- kim loại;O,N,S,C…) nhưng không phải máy hồng ngoại nào cũng đo được ở vùng này.[7]

1.4.1.3 Điều kiện hấp thụ bức xạ hồng ngoại

Không phải bất kỳ phần tử nào cũng có khả năng hấp thụ bức xạ hồng ngoại Mặt khác bản thân sự hấp thụ đó cũng có tính chất chọn lọc Một phân tử chỉ có khả năng hấp phụ bức xạ hồng ngoại khi chúng phải thỏa mãn 2 yếu tố sau [7] Một là tần số dao động tự nhiên của một phần phân tử (các nguyên tử hoặc nhóm nguyên

tử cấu tạo nên phân tử đó) bằng chính tần số dao động cùng tần số của bức xạ tới Hai là phân tử đó phải có momen lưỡng cực, vì khi phân tử lưỡng cực được giữ trong điện trường, các điện tích trái dấu sẽ chịu ảnh hưởng bởi các lực theo những chiều ngược nhau, và làm các nguyên tử tích điện này dao dộng, chúng hấp thụ bức

xạ hồng ngoại Vì vậy các phân tử như O2, N2 không xuất hiện phổ hấp thụ hồng ngoại

1.4.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu đo phổ hồng ngoại

Tín hiệu đo phổ hồng ngoại đặc trưng cho tần số dao động của phân tử [7]

Do đó phổ hồng ngoại bị ảnh hưởng bởi các yếu tố chính như sau:

Ảnh hưởng do cấu trúc của phân tử: do tần số dao động của phân tử phụ thuộc vào sự bền vững của liên kết, các hiệu ứng electron, hiệu ứng không gian và liên kết nội phân tử

Ảnh hưởng do tương tác giữa các phân tử: ở trạng thái khí các phân tử chuyển động tự do và hầu như không có tương tác với nhau nên phổ hồng ngoại của các chất ở thể kí phản ánh khá trung thực cấu trúc của phân tử Tuy nhiên kỹ thuật

đo mẫu ở thể khí lại rất phức tạp, do đó thường đo mẫu hồng ngoại ở dạng rắn hoặc dạng lỏng Các phân tử ở dạng rắn có thế tồn tại dưới dạng các tinh thể khác nhau,

do đó phổ hồng ngoại của chúng có thể sẽ bị thay đổi do tương tác giữa cấc phân tử

khi thay đổi mạng tinh thể Khi phân tử tồn tại ở các hệ dung môi khác nhau thì hấp thụ hồng ngoại cũng khác nhau, nguyên nhân là do sự tạo thành liên kết hidro giữa các phân tử làm dịch chuyển số sóng và mở rộng các vân hấp thu

Ảnh hưởng của cường độ và hình dạng vân phổ hồng ngoại: Phương pháp định lượng bằng phổ hồng ngoại có độ chính xác không cao còn do hệ số hấp thu mol ít lặp lại giữa các lần đo Ngoài ra khi trong quá trình ép viên mẫu rất khó có thể xác định chính xác được độ dày viên mẫu (do mỗi viên mẫu chỉ có kích thước tầm vài µm) Bên cạnh đó trạng thái vật lý, dung môi, nhiệt độ, đều đóng góp vào ảnh hưởng đến cường độ, hình dạng peak của hợp chất [18]

1.4.1.5 Các kỹ thuật chuẩn bị mẫu và đo phổ hồng ngoại

 Các kỹ thuật đo phổ hồng ngoại

Hiện nay có hai phương pháp chính để đo phổ hồng ngoại là phương pháp đo hấp thụ và phương pháp đo phản xạ Hai phương pháp này được đặc trưng bởi hai loại phổ kế là: phổ kế tán sắc và phổ kế biến đổi Fourier Kỹ thuật đo phổ tán sắc làloại phổ biến trước đây, máy ghi phổ quét trong cả vùng từ 4000 cm-1 đến 200 cm-1, tốc độ quét khoảng 1 phút/ mẫu nhanh hơn nhiều so với loại máy hồng ngoại sơ khai đầu tiên nhưng vẫn rất chậm để phân tích thời gian thực Phổ kế hồng ngoại hiện đại là loại phổ kế biến đổi Fourier Loại phổ kế mới này khác loại phổ kế tán sắc cũ là thay bộ đơn sắc (lăng kính hoặc cách tử) bằng một giao thoa kế Michelson cho phép khe sáng rộng hơn nên cường độ bức xạ vào detector cũng sẽ lớn hớn Tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) tăng lên nhờ giảm được nhiễu do đó phổ nhận được có chất lượng tốt hơn, đặc biệt thời gian ghi phổ nhanh, chỉ khoảng 30 giây Khi kết hợp với sự hỗ trợ của máy tính kết nối giúp cho việc đo phổ được tự động hóa ở mức cao và phổ có thể được lưu trữ và đối chiếu với phổ chuẩn có trong thư viện của máy [7]

 Các kỹ thuật chuẩn bị mẫu

Phép đo phổ hồng ngoại cho phép đo các chất ở thể rắn, thể lỏng tinh khiết, trong dung dịch hoặc thể hơi Đối với mỗi thể khác nhau chúng ta có các cách chuẩn bị mẫu tương ứng như sau:[7, 12]

- Mẫu ở thể rắn: có hai cách đo khi mẫu ở thể rắn

Phương pháp Nujol: trộn mẫu với parafin lỏng, nghiền kỹ và đều rồi bôi một lớp mỏng lên mặt tấm cửa sổ, sau đó đặt vào giá cuvet để đo trên máy

Phương pháp ép KBr (film): trộn mẫu thật đồng đều với bột KBr theo tỷ lệ khối lượng/ khối lượng là 1:10 đến 1:100, nghiền kỹ bằng cối mã não Ép mẫu thành màng mỏng gần như trong suốt bằng bộ ép viên cầm tay hoặc máy ép thủy lực, đặt mẫu vào giá đỡ cuvet để đo

- Mẫu ở thể lỏng tinh khiết: chuẩn bị mẫu bằng cách ép một lượng nhỏ chất lỏng giữa hai tấm NaCl để có một màng mỏng dày khoảng 0,01- 0,1 mm

- Mẫu trong dung dịch: Thông thường dung dịch 1-5% của hợp chất được đưa vào cuvet đặc biệt có độ dài 0,1 -1 mm và được làm bằng NaCl Để loại bỏ các chất hấp thụ của dung môi, một cuvet so sánh có chứa dung môi tinh khiết được đặt ở tia sáng

- Mẫu ở thể hơi: Hơi hay khí được đưa vào trong cuvet đặc biệt thường có độ dài 10 cm và có thành làm bằng NaCl cho phép bức xạ IR truyền qua Trong thực tế

để phân tích các chất hữu cơ phức tạp, người ta thường sử dụng máy hồng ngoại được ghép với máy sắc ký khí, khi đó mỗi hợp phần sau khi được tách ra từ hệ sắc

ký khí sẽ được ghi phổ hồng ngoại và được lưu giữ lại trong máy tính

1.4.1.6 Một số ứng dụng của phương pháp phổ hồng ngoại

Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật phương pháp đo phổ hồng ngoại ngày càng chứng minh được tính ưu việt của mình và dần trở thành phương pháp ứng dụng trong nhiều lĩnh vực Dưới đây là một số những ứng dụng chính của phương pháp này trong phân tích dược phẩm

- Xác định kích thước hạt: sự khác nhau về kích thước hạt thường được quan sát thấy dưới dạng một đường nền dốc, tăng lên về phía các bước sóng dài Năm

1985, tác giả Ciurczak đã chứng minh rằng có sự liên hệ tuyến tính giữa độ hấp thụ tại bất kì bước sóng nào với kích thước hạt [21]

- Độ ẩm: hàm lượng nước trong các mẫu là nguyên nhân chính gây ra hệ số suy giảm cường độ hấp thụ trong phổ hồng ngoại của các vật liệu dược phẩm Dựa

vào đặc tính này J Luypaert và các đồng nghiệp đã sử dụng NIR để xác định hàm lượng nước thông qua việc xác định độ ẩm của mẫu với nhiều loại hoạt chất [25]

- Độ cứng: đây là một trong các ứng dụng quan trọng của phương pháp hồng ngoại trong quá trình quản lý chất lượng của quá trình sản xuất Phương pháp IR có thể xác định được độ cứng của viên thuốc trong quá trình ép viên mà không cần phá mẫu Sự thay đổi về độ cứng của thuốc có thể dược quan sát dưới dạng đường phổ nền dốc dịch chuyển khi độ cứng tăng lên thì độ hấp thụ cũng tăng lên Điều này rõ rệt hơn ở các bước sóng dài bởi hiệu ứng tán xạ của ánh sáng [25, 29]

- Định lượng các hoạt chất trong dung môi hay trong hỗn hợp [7]: Cơ sở của phương pháp này dựa trên phương trình định luật Lambert – Beer biểu hiện mối quan hệ giữa sự hấp thụ ánh sáng và nồng độ chất:

Log = Theo phương trình trên, ở một bước sóng xác định, sự hấp thụ ánh sáng tỷ lệ với nồng độ C, chiều dày cuvet d và bản chất của chất mẫu Như vậy, khi phân tích một chất, đo ở một bước sóng xác định với một cuvet có chiều dày d đã biết thì độ hấp thụ quang A chỉ còn tỷ lệ với nồng độ C của mẫu chất Do phương trình trên chỉ chính xác với dung dịch có nồng độ loãng nên phương pháp phân tích định lượng bằng phổ hồng ngoại chỉ áp dụng đo trong dung dịch, còn theo phương pháp ép mẫu rắn (ép KBr) thì chỉ phân tích bán định lượng do tín hiệu độ hấp thụ quang bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như tính chất vật lý, nhiệt độ, độ ẩm, độ dày viên mẫu Phương pháp phổ hồng ngoại chỉ có thể áp dụng để phân tích định lượng hỗn hợp các mẫu khi sử dụng các thuật toán hồi quy chemometris

1.4.2 Định lượng các chất bằng phương pháp phổ hồng ngoại gần và trung

bình kết hợp với chemometrics

1.4.2.1 Cơ sở lý thuyết của phương pháp hồi quy đa biến

Chemometrics được định nghĩa là việc ứng dụng các phương pháp toán học, thống kê, đồ hoạ,… để qui hoạch thực nghiệm, tối ưu hoá các thông tin hoá học trích ra từ tập số liệu phân tích và đưa ra tối đa những thông tin hữu ích từ tập số

liệu ban đầu [8] Ra đời từ những năm đầu của thập kỉ 70, cho tới nay Chemometrics đã xác lập được một vị trí quan trọng cho mình trong ngành hoá học, đặc biệt là trong hoá học phân tích hiện đại Một mảng lớn trong Chemometrics phát triển nhanh gắn liền với toán học và tin học là hồi qui đa biến – kỹ thuật đa biến được dùng rộng rãi trong phòng thí nghiệm hoá học giúp giải quyết các bài toán xác định đồng thời nhiều cấu tử cùng có mặt trong hỗn hợp mà không cần tách loại trước Về nguyên tắc, chỉ cần xây dựng dãy mẫu chuẩn có mặt tất cả các cấu tử cần xác định với nồng độ biết trước trong hỗn hợp (các biến độc lập x), đo tín hiệu phân tích của các dung dịch này dưới dạng một hay nhiều biến phụ thuộc y và thiết lập mô hình toán học mô tả quan hệ giữa hàm y (tín hiệu đo) và các biến độc lập x (nồng độ các chất trong hỗn hợp) Dựa trên mô hình này có thể tìm được nồng độ của các cấu tử trong cùng mẫu định phân khi có tín hiệu phân tích của dung dịch đó

Trong luận văn này chúng tôi đã sử dụng phương pháp phổ hồng ngoại gần

và trung bình kết hợp với các thuật toán hồi quy đa biến tuyến tính để định lượng các sulfamid Tùy thuộc vào đặc điểm của hàm phụ thuộc, có thể chia các phương pháp hồi qui đa biến tuyến tính thành 2 nhóm chính: các phương pháp hồi qui đa biến tuyến tính sử dụng phổ toàn phần như phương pháp CLS, PLS, và phương pháp sử dụng dữ liệu phổ riêng phần như ILS

 Phương pháp bình phương tối thiểu thông thường (classical least CLS)

- Từ dạng tổng quát y = XK +e (1)

K là vecto hệ số của phương trình hồi qui K là ma trận (kx1) nếu y là véc tơ cột biểu diễn tín hiệu đo của một dung dịch chuẩn với y là vecto (mx1), X là ma trận (mxk), và e là vecto số dư (mx1) K là ma trận (kxp) nếu y là số liệu dạng ma trận (mxp) biểu diễn tín hiệu của dung dịch chuẩn được đo tại nhiều thời điểm (ví

dụ đo độ hấp thụ quang tại p bước sóng)

 Phương pháp bình phương tối thiểu nghịch đảo (inverse least ILS)

squares-Phương pháp bình phương tối thiểu nghịch đảo (ILS) hay còn gọi là phuơng pháp ma trận P được xây dựng trên giả thiết rằng nồng độ của tín hiệu phân tích là hàm của tín hiệu đo [4, 5, 8]:

C = P A Trong phương pháp hồi qui đa biến, phương trình trên có thể khai triển thành:

C1 = P11A1 + P12A2 + … + P1mAm

C2 = P21A1 + P22A2 + … + P2mAm

…

Cx = Px1A1 + Px2A2 + … + PxmAm Trong đó:

Am : Giá trị tín hiệu đo ở thời điểm m

Pxm : Giá trị hệ số hồi qui của cấu tử thứ x tại thời điểm m

Cx : Nồng độ cấu tử thứ x

Các bước tính toán trong mô hình ILS bao gồm

* Xây dựng các ma trận dữ liệu chuẩn:

Để xây dựng đường chuẩn sử dụng kĩ thuật ILS ta cần xác định ma trận hệ số hồi qui P từ mẫu chuẩn có ma trận nồng độ C và ma trận tín hiệu đo A P là ma trận chứa hệ số hồi qui của phương trình, trong đó mỗi hàng chứa hệ số hồi qui của một cấu tử, vì vậy số hàng của P là số cấu tử, số cột là số thời điểm đo

Do trong tập số liệu C và A đều có chứa sai số ngẫu nhiên nên để P mô tả chính xác quan hệ giữa C và A ta cần xác định P bằng phương pháp bình phương tối thiểu (tổng bình phương của sai số giữa giá trị tính theo mô hình và giá trị thực nghiệm là nhỏ nhất)

* Xác định công thức tính P:

C = A P

AT C= AT A P [AT A]-1 AT C = [AT A]-1 [AT A] P [AT A]-1 AT C = P

Để ma trận nghịch đảo của [AT A] - nghịch đảo giả của A - tồn tại, A cần có

số hàng tối thiểu bằng số cột Mỗi hàng trong A là tín hiệu của một mẫu, mỗi cột là tín hiệu của các mẫu ở một thời điểm nhất định Vì vậy, trong phương pháp ILS số mẫu không được ít hơn số thời điểm đo Do yêu cầu về số mẫu tối thiểu như trên nên để tiến hành sử dụng phương pháp này, ta cần lựa chọn số thời điểm đo tối thiểu đặc trưng nhất trên toàn dải phổ, vì vậy, phương pháp ILS còn được gọi là phương pháp phổ riêng phần Các điểm đo đặc trưng này thường là những điểm thỏa mãn các yêu cầu sau:

- Giá trị tín hiệu đo tại các thời điểm này lớn so với các điểm đo khác để tăng

độ nhạy

- Tín hiệu của các cấu tử khác nhau tại mỗi điểm đo được lựa chọn phải biến đổi khác nhau tức là có sự khác biệt lớn về tín hiệu đo tại mỗi điểm của các cấu tử

- Tại các điểm này, tín hiệu của các ion cản trở phép đo là nhỏ nhất

* Dự đoán thông tin của mẫu chưa biết:

Với mẫu chưa biết nồng độ, từ ma trận tín hiệu đo Aunk của mẫu sẽ xác định được nồng độ các chất dựa vào ma trận P đã tính:

Cunk = Aunk P

 Phương pháp bình phương tối thiểu từng phần (partial least square-PLS )

PLS là phương pháp đa biến dùng để mô hình hoá mối quan hệ giữa biến độc lập X và biến phụ thuộc Y, từ đó có thể đoán được thông tin trong Y khi đã biết các thông tin của X và ngược lại PLS sẽ tối ưu hoá giá trị đồng phương sai (covariance) giữa ma trận X và Y Hai ma trận X và Y được phân tích thành một ma trận số (score matrices) T chung và ma trận nạp (loading matrices) P và Q

Hay X= T x P + E

Y= T x Q + F

Tính chất quan trọng của PLS là chúng ta có thể nhận được một ma trận T

chung cho cả 2 phương trình [4, 8]

 Phương pháp hồi qui cẩu tử chính (principal component regression-PCR)

PCR - phương pháp hồi quy cấu tử chính, gồm 2 quá trình: Phân tích cấu tử

chính chuyển sang tập dữ liệu mới, chứa một số ít các yếu tố quan trọng, cần thiết

Sau đó sử dụng phương pháp bình phương tối thiểu nghịch đảo để phân tích tập dữ

liệu mới này

Trước tiên, chiếu tập số liệu tín hiệu phân tích đó lên không gian có ít chiều

hơn theo PCA mà không làm mất đi các thông tin quan trọng và tiến hành phân tích

hồi qui đa biến trên không gian mới này Nó giả thiết rằng mỗi thành phần trong tập

số liệu có thể được gán một giá trị định lượng đầu tiên cần tạo mô hình PCA cho tập

số liệu và sử dụng giá trị riêng của các biến ảo (score) để xây dựng phương trình hồi

qui đa biến tuyến tính trong đó giá trị y là giá trị hàm mục tiêu

Cũng cần lưu ý rằng, do phương pháp này phát triển trên cơ sở của phương

pháp ILS nên để sử dụng được các phương pháp này trong phân tích phổ hồng

ngoại chúng ta cần số mẫu chuẩn tối thiểu phải bằng số thời điểm sử dụng trong

đường chuẩn mã hóa, tức là số mẫu chuẩn không nhỏ hơn số PC lựa chọn Lấy một

ví dụ cụ thể, khi đo phổ của 15 mẫu chuẩn tại 100 bước sóng, để sử dụng phương

pháp ILS, chúng ta cần phải giảm kích thước phổ xuống số bước sóng không quá

15 Cách đơn giản nhất là chọn ít hơn 15 bước sóng để đo độ hấp thụ nhưng sai số

sẽ lớn nếu không chọn được các bước sóng đặc trưng cho phổ các chất Với mô

hình PCR ta có thể sử dụng toàn phổ để tính các PC, sau đó chọn số PC nhỏ hơn 15

để tính toán tiếp Thông thường, với một tập số liệu có mức độ tập trung tốt thì chỉ

có một số ít các PC đầu tiên là có nghĩa (có tổng phương sai tích lũy đủ lớn để coi

rằng chúng đã chứa toàn bộ thông tin hữu ích đặc trưng của tập số liệu) Như vậy,

sử dụng mô hình PCR có thể giảm được kích thước tập số liệu mà không làm mất

thông tin đồng thời có thể loại được tín hiệu nhiễu của dữ liệu gốc [4, 8]

* Các bước chính của PCR bao gồm:

1 Xử lý ban đầu (không bắt buộc)

Nội dung chính của bước này là chuẩn hóa tập số liệu

2 Các xử lý cần thiết:

Với một tập số liệu đã chuẩn hóa hoặc chưa chuẩn hóa, trước khi sử dụng đều cần bước bình phương toàn tập dữ liệu - đây là yêu cầu bắt buộc đối với hầu hết các hàm tính vectơ riêng

D = AT A Trong đó A là ma trận số liệu biểu diễn độ hấp thụ quang theo các thời điểm đo của các dung dịch chuẩn và AT là ma trận chuyển vị của ma trận A

3 Xác định các vectơ riêng hay các PC:

Có thể tính toán các vectơ riêng của tập số liệu bằng nhiều hàm toán học khác nhau

Có 3 hàm chính, thường sử dụng là hàm NIPALS (hàm phi tuyến lặp sử dụng kĩ thuật bình phương tối thiểu riêng phần), hàm SVD (hàm phân tách các giá trị riêng)

và hàm Princomp (hàm tính các cấu tử chính) Cần lưu ý rằng, tất cả các hàm này đều tính toán và đưa ra tất cả các cấu tử nhưng thường không sử dụng tất cả mà chỉ

sử dụng N cấu tử đầu đủ để xác định không gian mới :

NIPALS là hàm lặp thường sử dụng cho các tập số liệu kích thước lớn hoặc

có độ đa cộng tuyến cao Với tập số liệu có kích thước nhỏ, quá trình tính lặp trong hàm NIPALS sẽ làm khuếch đại sai số của tập số liệu nên thông thường người ta không sử dụng hàm này để tính các PC

SVD là hàm tính PC sử dụng phương pháp tách tập số liệu ban đầu thành các nhân tố Các vectơ riêng và trị riêng của ma trận dữ liệu đều là những tập con riêng của các nhân tố trong SVD Hàm SVD sử dụng hình thức chéo hóa cho phép khống chế thang đo một cách hợp lí nên giảm thiểu được sai số do làm tròn Vì vậy hàm này sử dụng được với các kiểu tập số liệu rộng rãi hơn hàm NIPALS

Princomp là hàm tính toán trực tiếp các cấu tử chính (PC) có vai trò tương đương các vectơ riêng Tuy nhiên, so với hàm SVD thì việc sử dụng hàm Princomp với tập số liệu lớn có ưu điểm là phương sai tập trung không cao nên vị trí các PC

sẽ chênh lệch không quá lớn, do đó sai số trong quá trình làm tròn số và chuyển hóa tập số liệu sẽ nhỏ hơn

Các hàm toán học trên đều đưa ra một ma trận cột chứa các vectơ riêng - Vc -

là ma trận trong đó mỗi cột là một vectơ hay nhân tố mới - PC - của ma trận dữ liệu

và số hàng ma trận là số thời điểm đo Mỗi nhân tố hay vectơ này lại là tổ hợp bậc nhất của các điểm phổ ban đầu, phần đóng góp của các điểm này vào mỗi vectơ là khác nhau tùy thuộc vào giá trị hàm phụ thuộc tại điểm đó Những điểm có giá trị đóng góp lớn vào các PC chứa phương sai lớn sẽ là những điểm đo có ảnh hưởng quyết định tới kết quả tính ma trận hệ số hồi qui và kết quả hồi qui sau đó Ma trận kết quả thứ hai cũng rất quan trọng là ma trận phương sai của các PC: đó là dạng ma trận chéo đối với hàm SVD, là một vectơ cột đối với hàm NIPALS và hàm Princomp

4 Lựa chọn các vectơ có nghĩa

Đây là bước có ảnh hưởng đặc biệt quan trọng đến bước xử lý tiếp theo Nếu giữ lại nhiều vectơ hơn số cần dùng thì những vectơ đó sẽ chứa cả tín hiệu nhiễu và như vậy, kết quả hồi qui sẽ mắc phải sai số Nếu giữ lại không đủ số vecto cần thiết

sẽ làm mất đi thông tin có ích từ tập dữ liệu, điều này cũng sẽ gây nên sai lệch giữa

mô hình hồi qui thu được và mô hình thực Vì vậy, việc đánh giá và lựa chọn các vectơ có nghĩa là rất quan trọng Dưới đây là một số phương pháp phổ biến để xác định số PC có nghĩa :

 Dùng các hàm chỉ thị: Có rất nhiều hàm chỉ thị khác nhau như CPV (tính phần trăm phương sai tích lũy), hàm IEF,

 Tính toán PRESS (tổng bình phương sai số dự đoán) để đánh giá thông tin từ dữ liệu

 Phương pháp đánh giá chéo

 Phương pháp đánh giá Xu – Kailath

 Đánh giá theo tiêu chuẩn Akaike

 Tính phương sai của sai số tái lập VRE

Các phương pháp này đều có những ưu điểm riêng khi sử dụng và kết quả đánh giá tương đối thống nhất với nhau Phương pháp được sử dụng rộng rãi để lựa chọn các PC có nghĩa khi các PC này được tính bằng hàm SVD hay Princomp là phương pháp tính và đánh giá qua phần trăm phương sai tích lũy của các PC đó Cách tính này đơn giản hơn và các hàm tính PC trên đã cho sẵn dữ liệu để có thể đánh giá nhanh

5 Tính toán lại

Sau khi loại bỏ các vectơ riêng không có nghĩa, chúng ta cũng loại được tín hiệu nhiễu của dữ liệu gốc và cần tính lại dữ liệu sau khi loại bỏ sai số Như vậy, khi tính toán ở hệ tọa độ mới ta đã loại bỏ được tín hiệu nhiễu trong tập dữ liệu ban đầu

6 Xây dựng đường chuẩn

Khi xây dựng đường chuẩn PCR theo phương pháp ILS, điểm khác biệt duy nhất là tập số liệu sử dụng

Các bước tiến hành bao gồm:

- Xác định phép chiếu trong hệ tọa độ mới:

Aj = A Vc Trong đó:

Aj: ma trận số liệu ở hệ tọa độ mới A: ma trận gốc

Vc: ma trận các vectơ riêng có nghĩa

- Thay thế A bằng Aj trong phương trình hồi quy

C = Aj F , trong đó F được tính theo công thức:

F = (AjT Aj)-1 AjT C Nồng độ chất phân tích trong mẫu chưa biết được tính theo công thức:

Cx = Ax Vc F = Ax Fcal

với Fcal = Vc F đóng vai trò tương tự ma trận P trong phương trình của ILS

Ưu điểm của phương pháp PCR:

- Hội tụ đầy đủ các ưu điểm của phương pháp ILS đồng thời khắc phục được các nhược điểm của phương pháp ILS do tiến hành tính toán trên toàn phổ

- Phương pháp này cho phép loại bỏ sai số nhiễu phổ và sai số ngẫu nhiên trong quá trình đo khi lựa chọn được số PC phù hợp

- Đối với trường hợp sử dụng phổ toàn phần, khi dùng các phương pháp khác như CLS, kết quả tính cuối cùng là kết quả tính trung bình trên toàn phổ nên kém chính xác hơn trường hợp dùng phổ chọn lọc Khi sử dụng mô hình PCR, tuy kết quả vẫn tính trên tất cả các điểm nhưng đóng góp của các điểm đo sẽ khác nhau tùy theo lượng đóng góp của từng điểm này vào các PC được chọn mà lượng đóng góp này lại được phân tích dựa trên tín hiệu đo tại từng điểm của các mẫu chuẩn

Do có sự phân biệt và chọn lọc trong đánh giá mỗi điểm đo nên kết quả thu được sẽ chính xác hơn phương pháp tính trung bình trên toàn phổ ở các phương pháp phổ toàn phần khác [4, 8]

1.4.2.2 Xác định đồng thời các chất bằng phương pháp quang phổ hồng

ngoại gần và trung bình kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến

Trong vòng hai thập kỷ trở lại đây NIR đã trở thành một trong những công

cụ hữu ích ứng dụng trong phân tích công nghiệp Đây là một kỹ thuật phân tích rất nhanh: chỉ với cần một máy quang phổ hồng ngoại ta có thể đo phổ hồng ngoại chỉ trong vòng một vài giây [22] So với phương pháp phân tích truyền thống để định lượng hoạt chất thuốc là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thì định lượng chất hữu

cơ trong phổ hồng ngoại gần và trung bình có ưu điểm nổi trội về đơn giản trong quá trình tiền xử lý mẫu, lượng mẫu phân tích ít, quá trình chuẩn bị mẫu đơn giản, chi phí thấp do đó có thể hạn chế được các sai số trong quá trình chuẩn bị mẫu [25] Tuy nhiên, NIR có một số nhược điểm như: giới hạn phát hiện cao do đó không phù hợp với các phép phân tích lượng vết, không đưa ra được các thông tin đặc trưng nếu chỉ đo tại một bước sóng Kết quả đo phổ hồng ngoại chịu ảnh hưởng mạnh mẽ của các thông số như điều kiện vật lý của mẫu, môi trường đo mẫu, độ dày của viên mẫu, tỷ lệ ép viên Vì thế NIR thường không được sử dụng như một kỹ thuật phân tích trực tiếp

Việc sử dụng phổ hồng ngoại kết hợp với các thuật toán hồi quy đa biến đã góp phần đưa phương pháp phổ hồng ngoại tham gia vào các quá trình định lượng mẫu Năm 2011, Mafalda Cruz Sarraguca và các cộng sự [27] đã nghiên cứu thành công phương pháp định lượng nhanh aminoglycosides bằng phép đo hồng ngoại gần Không giống như các phương pháp định lượng truyền thống là dựa trên cơ sở các phản ứng dẫn xuất hay phương pháp xét nghiệm vi sinh để định lượng aminoglycosides [34, 37], trong nghiên cứu này các tác giả đã đưa ra một phương pháp hoàn toàn mới để xác định các hoạt chất này Theo đó, phương pháp này đã được phát triển dựa trên nền mẫu thuốc thương mại có chứa neomycin sulphate và

ba tá dược là lactose, bột talc và magnesi stearat Các mẫu tổng hợp và mẫu thêm đã được chế tạo cho mục đích này, đồng thời họ cũng đã sử dụng ba lô mẫu thuốc rắn thương mại để thực hiện việc nghiên cứu xác định neomycin sulphate Mẫu được tiến hành đo phổ hồng ngoại gần với chế độ đo phản xạ sử dụng biến đổi Fourier Phương pháp hồi quy đa biến đã được sử dụng để hiệu chỉnh phổ hồng ngoại gần phù hợp với hàm lượng neomycin sulphate Nhóm nghiên cứu đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để kiểm tra hàm lượng neomycin sulphate trong các mẫu thương mại Kết quả thu được cho thấy neomycin sulphate đã được xác định thành công bằng phương pháp đo phổ hồng ngoại gần với sai số 6,6%

Đối với roxithromycin thông thường người ta sẽ sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với các loại detector khác nhau để xác định Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi một lượng lớn hóa chất, dung môi để xử lý và chạy sắc ký S.T.H Sherazi [33] đã sử dụng phương pháp hồng ngoại biến đổi Fourier để xác định roxithromycin từ phổ của mẫu thuốc kết hợp với phương pháp hồi quy phân tích thống kê đa biến Phương pháp này cho phép rút ngắn thời gian phân tích xuống còn khoảng 3 phút nên rất phù hợp để áp dụng kiểm tra nhanh các mẫu

Thêm một ứng dụng thành công của phương pháp đo phổ hồng ngoại gần kết hợp với kỹ thuật thống kê đa biến cho phép giám sát liên tục để phân tích đồng thời glycerol và clavulanic acid trong một hỗn hợp kháng sinh phức tạp [32]

Phương pháp phổ hồng ngoại kết hợp với chemometric đã mở ra một kỷ nguyên mới cho phép phân tích nhanh, hiệu quả, thân thiện với môi trường- công nghệ hóa học xanh Tuy nhiên, đây vẫn là một hướng nghiên cứu khả mới mẻ trên thế giới Hiện nay, tại phòng thí nghiệm Hóa phân tích thuộc AgroParisTech (Pháp), nhóm nghiên cứu đã ứng dụng các thuật toán để xử lý các tín hiệu phân tích của hỗn hợp các chất trong sự tương tác phức tạp đa biến và đưa ra các kết quả của từng biến đã có rất nhiều nghiên cứu thu được kết quả tốt [20, 22, 24] Đặc biệt, việc áp dụng các thuật toán đã mở ra những phương pháp đo nhanh có thể đưa các phép phân tích ra khỏi phòng thí nghiệm Tại các nước như Mỹ, Anh cũng có giới thiệu các thiết bị cầm tay để xác định thuốc giả Các máy này đều có ưu điểm là khá gọn nhẹ, nhưng có hạn chế là khi đo chất trong các nền khác nhau thường không đưa ra được các kết quả có độ chính xác cao Phần mềm và cơ sở dữ liệu của chúng lại không cho phép can thiệp nên khó khăn trong việc bổ sung thêm cơ sở dữ liệu Do

đó việc nghiên cứu phát triển phương pháp quang phổ hồng ngoại gần và trung bình kết hợp với các thuật toán hồi quy đa biến để kiểm tra nhanh chất lượng thuốc là một vấn đề vô cùng cần thiết

Hiện tại chưa có một nghiên cứu nào về định lượng nhanh nhóm Sulfamid bằng phương pháp quang phổ hồng ngoại gần và trung bình được công bố Đây chính là cơ sở để chúng tôi lựa chọn tiến hành nghiên cứu định lượng một số hoạt chất thuốc kháng sinh thuộc nhóm Sulfamid bằng phương pháp quang phổ kế hồng ngoại gần và trung bình Kết quả thu được từ nghiên cứu này mở ra hướng nghiên cứu mới sử dụng các thiết bị đơn giản để xác định nhanh các chất trong mẫu đo phức tạp mà không cần phá mẫu hoặc xử lý nhanh tại chỗ, tạo điều kiện đưa phép phân tích ra khỏi phòng thí nghiệm

CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM

2.1 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Nội dung nghiên cứu

Để xây dựng qui trình phân tích định lượng nhanh ba hoạt chất sulfaguanidin, sulfamethoxazol và trimethoprim bằng phương pháp phổ hồng ngoại kết hợp với chemometrics cần giải quyết các vấn đề sau:

- Nghiên cứu lựa chọn các điều kiện tối ưu để đo phổ IR trong vùng hồng ngoại gần và trung bình của các hoạt chất sulfaguanidin, sulfamethoxazol và trimethoprim

- Nghiên cứu xây dựng thuật toán hồi qui đa biến tuyến tính, lựa chọn các thông số tối ưu của các mô hình trên cơ sở của mẫu chuẩn

- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu đo độ hấp thụ của chất phân tích trong vùng hồng ngoại gần và trung bình

- Nghiên cứu xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp hồi quy đa biến xác định đồng thời các hoạt chất trên

- Ứng dụng phương pháp nghiên cứu được để định lượng nhanh thành phần hoạt chất trong các mẫu thuốc đang lưu thông trên thị trường So sánh kết quả tìm được với phương pháp tiêu chuẩn qui định trong dược điển

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu

Cơ sở của phương pháp nghiên cứu là dựa vào phổ hấp thụ của ba hoạt chất

là sulfaguanidin, sulfamethoxazol (thuộc nhóm sulfamid) và trimethoprim (thường dùng kết hợp với sulfamethoxazol để tăng cường khả năng kháng khuẩn của thuốc) trong vùng phổ hồng ngoại từ 3600- 3000 cm-1 để định lượng nhanh các hoạt chất trên trong dược phẩm bằng phương pháp hồi quy đa biến

Tiến hành xây dựng mô hình hồi quy đa biến xác định một hoạt chất và các

tá dược gồm 25 mẫu chuẩn và 10 mẫu kiểm tra, mô hình hồi quy đa biến xác định

cả ba hoạt chất và các tá dược gồm 30 mẫu chuẩn và 15 mẫu kiểm tra bằng cách chuẩn bị các mẫu chuẩn, mẫu kiểm tra theo như quy trình như dưới đây:

- Bước 1: chuẩn bị các mẫu chuẩn, mẫu kiểm tra chứa đồng thời các hoạt chất là sulfaguanidin, sulfamethoxazol, và trimethoprim cùng với ba tá dược là tinh bột sắn, maltodextrin, Ca3(PO4)2 với tỷ lệ thay đổi trong khoảng nồng độ khảo sát sao cho tín hiệu độ hấp thụ thay đổi trong vùng tuyến tính

- Bước 2: Nghiền và trộn từng mẫu trong 15 phút để hỗn hợp được đồng nhất

- Bước 3: Lấy 2 mg chất vừa trộn được trộn với 98 mg KBr rồi tiến hành nghiền mịn đồng nhất mẫu trong cối mã não trong 10 phút

- Bước 4: Lấy khoảng 15 mg lượng bột vừa nghiền được cho vào bộ ép viên

để thu được viên mẫu đem đo phổ hồng ngoại trong vùng phổ nghiên cứu từ

3600-3000 cm- 1, ghi lại độ hấp thụ quang của từng mẫu, xuất số liệu thu được dưới dạng ASCII và chuyển toàn bộ dữ liệu vào phần mềm matlab để tính toán kết quả

- Bước 5: Đường chuẩn đa biến và các bộ dữ liệu dự đoán được xây dựng trên ma trận độ hấp thụ quang của các mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra đã chuẩn bị ở phần trên Nhập số liệu ma trận nồng độ các mẫu chuẩn, ma trận các mẫu kiểm tra

và các ma trận tín hiệu đo tương ứng vào phần mềm Matlab, chạy chương trình tính toán ma trận hệ số hồi qui theo 4 phương pháp CLS, ILS, PLS và PCR trên phần mềm và sử dụng ma trận này để tìm nồng độ mỗi hoạt chất trong từng mẫu So sánh sai số tương đối của mỗi phương pháp, lựa chọn ra phương pháp tối ưu nhất để tiến hành định lượng các mẫu thực tế

- Bước 6: Tiến hành định lượng các mẫu thực tế bằng cách trộn một lượng bột viên với tá dược để pha loãng nồng độ hoạt chất về nồng độ nằm trong ma trận chuẩn đã xây dựng, đo phổ của các mẫu này, ghi lại phổ và chuyển dữ liệu thu được vào phần mềm Matlab để tính toán kết quả Từ đó tiến hành tính toán hàm lượng hoạt chất trong các mẫu thuốc viên theo công thức dưới đây: