Luận văn thạc sỹ sinh học nguyễn thị giang

Trong tự nhiên, hầu hết các tế bào vi sinh vật thường liên kết với nhau tạo thành một cộng đồng và bám dính trên các bề mặt giá thể thông qua mạng lưới các hợp chất ngoại bào, hình thành

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

_ _

Nguyễn Thị Giang

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, KHẢ NĂNG

SỬ DỤNG NITƠ CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN TẠO BIOFILM PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

_ _

Nguyễn Thị Giang

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, KHẢ NĂNG

SỬ DỤNG NITƠ CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN TẠO BIOFILM PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mãsố : 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Quang Huy

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ BIOFILM 2

1.1 Giới thiệu chung về Biofilm 2

1.2 Các dạng tồn tại của biofilm 3

1.2.1 Trong tự nhiên 3

1.2.2 Trong hệ thống thiết bị nhân tạo 4

1.2.3 Trong cơ thể sinh vật 4

1.3 Thành phần và cấu trúc của biofilm 4

1.3.1 Thành phần của biofilm 4

1.3.1.1 Các hợp chất ngoại bào 4

Bảng 1 Vai trò của các thành phần trong EPS 6

1.3.1.2 Lông, roi, tiêm mao và các phân tử bám dính 6

1.3.2 Cấu trúc của biofilm 8

1.4 Quá trình hình thành màng sinh vật 9

1.4.1 Các yếu tố ảnh hưởng tới sự hình thành màng sinh vật 9

1.4.2 Các giai đoạn của quá trình hình thành màng sinh vật 11

1 5 Vai trò của màng sinh vật 16

1.5.1 Vai trò của việc hình thành biofilm với vi sinh vật 16

1.5.1 1 Bảo vệ tế bào khỏi các điều kiện bất lợi của môi trường 16

1.5.1.2 Tận dụng nguồn dinh dưỡng của môi trường 17

1.5.1.3 Mối quan hệ hợp tác giữa các loài 17

1.5.1.4 Trao đổi vật chất di truyền 17

1.5.2 Ảnh hưởng của biofilm đến đời sống con người 18

1.6 Vấn đề xử lý nước thải 19

1.6.1 Thực trạng ô nhiễm nguồn nước 19

1.6.3 Xử lý nước thải chăn nuôi 21

1.6.3.1 Phương pháp cơ học 21

1.6.3.2 Phương pháp hóa lý 21

1.6.3.3 Phương pháp sinh học 22

1.7 Chu trình nitơ trong tự nhiên 23

1.7.1 Khái quát về chu tr nh nitơ 23

1.7.2 Quá trình nitrat hóa 24

1.7.3 Quá trình phản nitrat hóa 25

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Nguyên liệu 26

2.2 a chất, thiết bị 27

2.2.1 Môi trường nuôi cấy 27

2.2.2 Hóa chất 27

2.2.3 Máy móc thiết bị 28

2.3 Phương pháp nghiên cứu 28

2.3.1 Phương pháp ph n lập vi khu n 28

2.3.2 Phương pháp đánh giá khả năng h nh thành biofilm 29

2.3.3 Phương pháp chụp ảnh tr n k nh hiển vi điện tử qu t 29

2.3.4 Phương pháp đánh giá các yếu tố ảnh hưởng tới sự hình thành biofilm 30 2.3.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 30

2.3.4.2 Ảnh hưởng của pH 30

2.3.4.3 Phương pháp nhuộm Gram 30

2.3.5 Phương pháp đánh giá khả năng chuyển hóa các hợp chất nitơ 30

2.3.5.1 Phương pháp thử khả năng chuyển hóa amoni 31

2.3.5.2 Phương pháp thử khả năng chuyển hóa nitrit 31

2.3.6 Phương pháp ph n loại dựa trên phân tích gen 16S rRNA 33

3.1 Kết quả phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng tạo biofilm 35

3.2 Đánh giá khả năng hình thành biofilm 37

3.2.1 Khả năng tạo biofilm tr n môi trường Winogradski 1 37

3.2.2 Khả năng tạo biofilm tr n môi trường Winogradski 2 39

3.3 Đặc điểm hình dạng của các chủng vi khuẩn phân lập được 41

3.4 Khả năng phát triển và tạo màng sinh vật của các chủng nghiên cứu 42

3.4.1 Khả năng phát triển và tạo màng nổi 42

3.4.2 Ảnh hiển vi màng nổi của các chủng nghiên cứu 43

3.4.3 Khả năng tạo biofilm bề mặt 44

3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo biofilm của các chủng phân lập 45 3.5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 45

3.5.2 Ảnh hưởng của pH 47

3.6 Phân loại các chủng vi khuẩn dựa trên gen 16S rRNA 48

3.7 Khả năng chuyển h a nitơ 51

3.7.1 Khả năng chuyển hóa amoni 52

3.7.2 Khả năng chuyển hóa nitrit 53

KẾT LUẬN 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

PHỤ LỤC 63

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

nông thôn

EPS Extracellular Polymeric Substances Mạng lưới ngoại bào

PVC Polyvinyl chloride Nhựa polyvinyl chloride

SEM Scanning Electron Microscope Ảnh hiển vi điện tử quét

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Vai trò của các thành phần trong EPS 6Bảng 2 Số lƣợng vi khu n phân lập đƣợc tại các địa điểm nghiên cứu 36

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Màng sinh vật của Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonia và

Flavobacterium spp trên bề mặt thép không gỉ 8

H nh 2 Các giai đoạn chính hình thành màng biofilm 12

H nh 3 Các giai đoạn của sự tạo thành biofilm 15

Hình 4 Hoạt động trao đổi chất bên trong biofilm 15

Hình 5 Chu tr nh nitơ trong tự nhiên 24

Hình 6 Các vị trí lấy mẫu 26

Hình 7 Khả năng phát triển và tạo màng sinh vật của các chủng vi khu n phân lập từ trại nuôi lợn xã T n Ước tr n môi trường Winogradski 1 37

Hình 8 Khả năng phát triển và tạo màng sinh vật của các chủng vi khu n phân lập từ hệ thống thoát nước xã Dương Nội tr n môi trường Winogradski 1 38

Hình 9 Khả năng phát triển và tạo màng sinh vật của các chủng vi khu n phân lập từ trại nuôi vịt xã Trung Tú tr n môi trường Winogradski 1 39

Hình 10 Khả năng phát triển và tạo màng sinh vật của các chủng vi khu n phân lập từ trại nuôi lợn xã T n Ước tr n môi trường Winogradski 2 40

Hình 11 Khả năng phát triển và tạo màng sinh vật của các chủng vi khu n phân lập từ hệ thống thoát nước xã Dương Nội tr n môi trường Winogradski 2 40

Hình 12 Khả năng phát triển và tạo màng sinh vật của các chủng vi khu nphân lập từ trại nuôi vịt xã Trung Tú trên môi trường Winogradski 2 41

Hình 13: Hình dạng các chủng vi khu n nghiên cứu 42

Hình 14 Khả năng tạo biofilm nổi của các chủng nghiên cứu 43

Hình 15 Ảnh hiển vi màng nổi của các chủng vi khu n 44

Hình 16 Khả năng tạo biofilm trên vật liệu nhựa 45

Hình 17 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tạo biofilm 46

Hình 18 Ảnh hưởng của pH đến khả năng tạo biofilm 48

Hình 19 Vị trí phân loại chủng T2.2 với các loài có quan hệ họ hàng gần 49

Hình 20 Vị trí phân loại chủng H2.2 với các loài có quan hệ họ hàng gần 50

Hình 21 Vị trí phân loại chủng T4.1 với các loài có quan hệ họ hàng gần 51

Hình 22 Khả năng chuyển hóa amoni của các chủng H2.2 và T4.1 52

Hình 23 Khả năng chuyển hóa nitrit của chủng LD2.2 và T2.2 53

MỞ ĐẦU

Nước thải có hàm lượng nitơ cao quá mức cho phép khi được thải ra sông, hồ

sẽ gây ra hiện tượng phú dưỡng làm nước có màu, mùi khó chịu ảnh hưởng đến môi

trường sinh thái cũng như sức khoẻ cộng đồng Do vậy, việc phải loại bỏ nitơ đến

mức tối thiểu từ các nguồn nước ô nhiễm trước khi đưa ra môi trường là cần thiết

Trong số các loại nước thải ô nhiễm, nước thải chăn nuôi là một trong những loại

nước thải có hàm lượng nitơ cao, có khả năng g y ô nhiễm môi trường và là sinh

sống phát triển của nhiều nhóm sinh vật gây bệnh và cũng là loại nước thải ô nhiễm

khó xử lý

Có nhiều phương pháp xử lý nitơ khác nhau như áp dụng các phương pháp

hoá học, vật lý nhưng phương pháp xử lý mang tính bền vững, thân thiện với môi

trường vẫn là các phương pháp sinh học với sự tham gia của các nhóm vi sinh vật

trong tự nhiên

Trong tự nhiên, hầu hết các tế bào vi sinh vật thường liên kết với nhau tạo

thành một cộng đồng và bám dính trên các bề mặt giá thể thông qua mạng lưới các

hợp chất ngoại bào, hình thành cấu trúc màng sinh vật (biofilm) Biofilm giúp cho

vi sinh vật tồn tại và quan hệ hợp tác giữa các loài khác nhau trong hệ thống màng

sinh vật, có thể tận dụng được nhiều nguồn dinh dưỡng

Việc nghiên cứu khả năng phát triển và tạo màng sinh vật của các chủng vi

sinh vật phân giải nitơ trong nước thải nói chung và nước thải chăn nuôi nói riêng là

một hướng đi mới nhằm nâng cao hiệu quả trong xử lý ô nhiễm môi trường cũng

như góp phần tìm hiểu sự đa dạng sinh học trong tự nhiên

Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm

sinh học, khả năng sử dụng nitơ của một số chủng vi khuẩn tạo biofilm phân

lập tại Việt Nam ”

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ BIOFILM

Khái niệm màng sinh vật được hiểu là tập hợp các quần xã vi sinh vật bám dính và phát triển trên bề mặt các môi trường khác nhau thông qua mạng lưới chất ngoại bào do chính chúng tạo ra [32], [57] Màng sinh vật có thể hình thành trên bề mặt môi trường vô sinh hay hữu sinh và là một hiện tượng phổ biến xuất hiện trong

tự nhiên, trong đời sống hay trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau Các tế bào

vi sinh vật trong một màng sinh vật khác biệt với các tế bào sống trôi nổi tự do bởi việc tổng hợp các chất ngoại bào giúp các tế bào bám dính với nhau trên bề mặt, sự giảm tỷ lệ tăng trưởng, và sự điều hòa tăng hoặc giảm của các gen đặc biệt nào đó Khả năng bám d nh của vi sinh vật là một quá trình phức tạp được điều hòa bởi các đặc điểm khác nhau về môi trường nuôi cấy, chất nền ngoại bào và bề mặt tế bào [56] Vi khu n bắt đầu quá trình tạo màng sinh vật để đáp ứng với những tác động

cụ thể từ môi trường sống như nguồn chất dinh dưỡng và oxy

Quá trình tạo thành màng sinh vật cũng trải qua các biến đổi động học trong việc chuyển từ đời sống tự do sang dạng sống bám dính trong cấu trúc màng sinh vật, bao gồm cả việc sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp và gia tăng các chất chống lại các tác nhân vật lý, hóa học và sinh học gây hại [82]

Sự hình thành màng sinh vật được coi là một trong số những cơ chế tồn tại của vi sinh vật, tại đó vi khu n tận dụng được các nguồn dinh dưỡng và nhận được sự bảo vệ trong các điều kiện bất lợi như khô hạn, bức xạ cực tím hoặc những chất độc hại Mặt khác có thể coi hệ thống màng sinh vật là một mạng lưới nhiều gen, tại đó các vật liệu di truyền có thể dễ dàng được trao đổi qua lại giữa các tế bào vi sinh vật [65]

Biofilm có thể được hình thành bởi tập hợp các tế bào của một hoặc nhiều loài vi sinh vật khác như nấm, tảo, xạ khu n, vi khu n Trong biofilm các tế bào tập hợp thành các đơn vị cấu trúc là các vi khu n lạc Thành phần này đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành biofilm đặc biệt là ở giai đoạn đầu bởi nó quy định đặc tính hình thành biofilm cho từng loài vi sinh vật, đảm nhiệm chức năng tiết các hợp chất ngoại bào cũng như có chứa các yếu tố phụ trợ tế bào như lông roi, lông nhung hỗ trợ cho việc bám dính của các tế bào khác lên bề mặt giá thể

1.2 Các dạng tồn tại của biofilm

Biofilm là một dạng tồn tại của sinh vật không chỉ xuất hiện ở trong phòng

thí nghiệm mà còn có ở nhiều nơi khác nhau Biofilm thường được tìm thấy trên bề

mặt các vật liệu rắn (đất, đá, các vật liệu dạng rắn…) nơi ngập nước hoặc bề mặt

nơi tiếp xúc với dung dịch nước Biofilm có thể h nh thành tương tự như mảng nổi

trên bề mặt chất lỏng và trên bề mặt của lá, đặc biệt là ở nơi có độ m cao Với đầy

đủ các nguồn dinh dưỡng cho quá tr nh sinh trưởng, một biofilm sẽ nhanh chóng

phát triển đạt k ch thước lớn (có thể quan sát phát hiện thấy bằng mắt thường)

Biofilm có thể được tạo thành bao gồm chỉ một loài vi sinh vật hoặc cũng có thể

gồm nhiều loài vi sinh vật khác nhau, như vi khu n, nấm và tảo; mỗi nhóm thực

hiện chức năng trao đổi chất ri ng, nhưng có quan hệ chặt chẽ với nhau Do vậy

trong thực tế có thể bắt gặp nhiều dạng biofilm được tạo thành từ các vi sinh vật

khác nhau [54]

1.2.1 Trong tự nhiên

Biofilm có thể tồn tại ở khắp nơi Chúng thường được thấy ở những sinh

cảnh có nước, chất dinh dưỡng và bề mặt Từ những sa mạc băng ở Nam Cực đến

những khe đá s u hàng ngàn kilomet dưới lòng đất cũng có sự xuất hiện của màng

sinh vật [67]

Các rừng mưa nhiệt đới, nơi có độ m cao là điều kiện thuận lợi cho sự

phát triển phong phú của màng sinh vật, như r u và những cặn bám dưới đáy ao,

hồ, hay những mảng r u, địa y bám trên thân cây, hay những váng nổi trên bề

mặt ao, hồ… [67]

Màng sinh vật còn có thể được tìm thấy ở sa mạc Một trong những hình

thức phổ biến của dạng màng sinh vật sa mạc được gọi là vec-ni sa mạc (varnish

desert), một thuật ngữ mô tả hiện tượng những hòn đá, vách núi có màng sinh vật

phát triển xuất hiện những vết màu [67]

Đối với thực vật, một số loài thực vật cộng sinh với vi khu n có trong màng

sinh vật bám ở rễ cây Màng sinh vật được tạo ra bởi vi khu n cố định nitơ

Rhizobium trong rễ cây có thể giúp ngăn ngừa bệnh cho cây trồng [82]

1.2.2 Trong hệ thống thiết bị nhân tạo

Trong các thiết bị nhân tạo, màng sinh vật thường xuất hiện ở các dụng cụ dẫn nước và chứa nước gây tắc nghẽn đường ống, rò rỉ nước hay ô nhiễm môi trường

Biofilm làm giảm nhiệt trong hệ thống làm mát hoặc hệ thống sưởi nước [21].Biofilm trong hệ thống kỹ thuật biển, chẳng hạn như ống dẫn dầu ngoài khơi, ống dẫn ga công nghiệp có thể dẫn đến sự ăn mòn đáng kể Ăn mòn chủ yếu là do các yếu tố vô sinh Tuy nhiên, ít nhất 20% nguy n nh n g y ra ăn mòn là do các vi sinh vật đã bám vào bề mặt kim loại [72]

1.2.3 Trong cơ thể sinh vật

Màng sinh vật có trong rất nhiều bệnh nhiễm trùng của cơ thể, ước tính khoảng 80% các bệnh nhiễm trùng [61]

Các quá trình truyền nhiễm có li n quan đến biofilm như nhiễm trùng đường tiết niệu, nhiễm trùng ống thông, nhiễm trùng tai giữa, hình thành các mảng bám răng, vi m nướu, nhiễm trùng trong bệnh xơ nang [68],[44]

Một số nghiên cứu ghi nhận rằng màng sinh vật có thể giúp chữa lành vết thương ở da và giảm tại chỗ hiệu quả kháng khu n trong chữa bệnh hoặc điều trị nhiễm trùng vết thương da [28]

Màng sinh vật cũng có thể xuất hiện trên các bề mặt của các thiết bị cấy ghép như các ống thông, van tim nhân tạo…[52]

1.3.1 Thành phần của biofilm

Về cơ bản màng sinh vật được cấu tạo gồm rất nhiều tế bào của cùng một loài hay từ các loài vi sinh vật khác, khối lượng tế bào vi sinh vật chiếm 2-5% tổng khối lượng biofilm, 97% là nước, 3-6% còn lại là các hợp chất polymer ngoại bào (EPS) và ion [13]

polysaccharide và protein là các thành phần chính của EPS và rất khác nhau về

thành phần, cấu trúc, tính chất [35]

Phần lớn các polysaccharide của EPS là polyanion bởi sự có mặt của cả axit

uronic (v dụ như D - glucuronic, D - galacturonic, và axit mannuronic)và liên kết

ceton của pyruvate [74] Ở những protein ngoại bào, nhiều axit amin khác nhau

mang điện t ch m Có nhiều nhóm chức hóa học như carboxyl, phosphate, sulfate

trong các axit amin [79] T nh chất này rất quan trọng bởi nó cho ph p các ph n tử

polysaccarit ngoại bào li n kết được với các ion dương hóa trị II như Ca2+ và Mg2+

Từ đó h nh thành li n kết ch o giữa các sợi polymer và tạo ra lực li n kết lớn hơn

trong cấu trúc màng sinh vật Trong trường hợp của một số vi khu n gram dương

như Staphylococcus, thành phần hóa học của mạng lưới ngoại bào có thể hoàn toàn

khác nhau và gồm chủ yếu là các ion dương

Sutherland đã ghi nhận hai thuộc t nh quan trọng của mạng lưới ngoại bào

Thứ nhất, thành phần và cấu trúc của các polysaccarit xác định cấu tạo ch nh của

mạng lưới ngoại bào V dụ, cấu trúc bộ khung của mạng lưới ngoại bào ở nhiều vi

khu n chứa nhiều li n kết 1,3 hoặc 1,4-β-D-fructan và có xu hướng làm cho nó

cứng chắc hơn, t bị biến dạng và trong một số trường hợp trở n n k m hòa tan hoặc

không hòa tan Các li n kết khác trong ph n tử polysaccarit như li n kết 1,2 hoặc

1,6- β -D-glucan giúp cấu trúc mạng lưới ngoại bào trở n n linh hoạt hơn Thứ hai,

mạng lưới ngoại bào của màng sinh vật thường không đồng nhất, có thể thay đổi

theo không gian và thời gian [74]

Leriche và cộng sự [53] đã sử dụng liên kết đặc hiệu của lectin với một loại

đường đơn để đánh giá sự phát triển của màng sinh vật ở các vi sinh vật khác nhau

Kết quả nghiên cứu cho thấy các sinh vật khác nhau sản xuất một lượng chất ngoại

bào khác nhau và lượng chất ngoại bào này tăng l n theo thời gian EPS có thể liên

kết với các ion kim loại, các cation hóa trị hai hay các đại ph n tử khác như protein,

ADN, lipid…[36] Điều kiện dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy cũng được chứng

minh là có ảnh hưởng đến sự sản xuất chất ngoại bào Nghiên cứu cho thấy sự dư

thừa nguồn carbon sẵn có và sự thiếu hụt hàm lượng nitơ, kali, photpho trong môi

trường nuôi cấy đã thúc đ y quá trình tổng hợp EPS [74]

EPS cung cấp thành phần gel ngậm nước cao mà nhờ đó các tế bào vi sinh

vật có thể thiết lập những liên kết hiệp đồng bền vững Sự t ch nước trong mạng

lưới chất ngoại bào là rất lớn, do đó nó ngăn chặn sự khô hạn của màng sinh vật trong tự nhiên Toàn bộ sự gắn kết và bám d nh cũng như h nh thái, cấu trúc, chức năng sinh học và những đặc t nh khác như cơ chế ổn định, sự lan truyền, sự thấm hút bề mặt và những đặc tính quang học của vi khu n được quyết định bởi EPS, nhờ vậy các sinh vật tạo màng chống lại tác nhân bất lợi từ môi trường

Mạng lưới chất ngoại bào cũng góp phần vào đặc t nh kháng kháng sinh của màng sinh vật bằng cách cản trở sự vận chuyển lượng chất kháng sinh qua màng và nguy n lý có thể thông qua việc liên kết trực tiếp với các chất này [34]

Bảng 1 Vai trò của các thành phần trong EPS [37]

Kênh dẫn Polysaccharide t ch điện hoặc

Hoạt hóa Các enzym ngoại bào Phân hủy các hợp chất hữu cơ

Hoạt hóa bề mặt

Chất lưỡng cực Tương tác bề mặt

Thông tin di truyền

1.3.1.2 Lông, roi, tiêm mao và các phân tử bám dính

Cơ sở phân tử nào mà các tế bào có thể bám để tạo thành màng biofilm và các cơ chế phân tử nào quyết định tính ổn định của biofilm còn chưa được sáng tỏ

Sự phức tạp này là do có nhiều yếu tố cấu thành nên biofilm như EPS, ADN,

protein, lông, roi, tiêm mao…

Các polysaccharide ngoại bào được tổng hợp để gắn kết vi khu n và kết nối

chúng trên bề mặt nhưng bằng chứng thực nghiệm đã chứng tỏ rằng những protein

như protein ngoài màng, lông, các enzyme cần thiết cho giai đoạn đầu của sự gắn vi

khu n lên bề mặt

Chức năng ch nh của lông, roi trong sự h nh thành màng sinh vật là giúp cho

vi sinh vật di chuyển trong môi trường nước tốt hơn, tạo n n những tương tác ban

đầu giữa bề mặt và tế bào

De Flaun, De Weger cùng các cộng sự [29], [31] đã chứng minh sự thiếu

vắng của lông roi làm suy giảm khả năng x m nhiễm của Pseudomonas fluorescens

l n rễ c y khoai t y, lúa m và làm giảm độ bám d nh tế bào của P aeruginosa và P

fluorescens l n bề mặt polystyrene [63] Tương tự, nghi n cứu tr n các chủng

Vibrio cholerae và Escherichia coli đột biến thiếu lông roi đã cho thấy không có sự

h nh thành màng sinh vật như ở các dạng hoang dại của chúng vẫn thực hiện tr n bề

mặt nhựa polyvinylchloride (PVC) [77]

Ti m mao và các ph n tử bám d nh li n kết với ti m mao cũng có vai trò

quan trọng trong sự bám d nh và x m nhiễm bề mặt Nghi n cứu của Schmoll và

cộng sự [71] tr n chủng vi khu n g y bệnh E coli cho thấy biểu hiện của gen sfaA,

một gen mã hóa cho các ph n tử bám d nh ti m mao, được điều hòa tăng cường khi

có sự tiếp xúc của vi khu n với bề mặt Ở E coli, khả năng bám d nh bề mặt giảm

đi khi có sự đột biến ở gen sinh tổng hợp csgA và gen sinh tổng hợp ti m mao type I

fim H, một loại ti m mao chứa các ph n tử đặc hiệu với mannose [66] Tương tự,

đột biến gen tổng hợp ti m mao hemagglutinin có độ nhạy cao với mannose ở V

cholerae cũng làm giảm độ bám d nh bề mặt [76]

Như vậy, có thể nói rằng các loài vi sinh vật có lông roi và ti m mao cũng sẽ

có ưu thế hơn trong việc di chuyển đến một bề mặt giá thể xác định - nơi có điều

kiện thuận lợi cho việc h nh thành màng sinh vật, đồng thời giúp cho việc bám d nh

ban đầu của tế bào với bề mặt tốt hơn [33]

1.3.2 Cấu trúc của biofilm

Tolker-Nielsen và Molin chỉ ra rằng mỗi cộng đồng vi khu n tạo màng là duy nhất [76] mặc dù một vài cấu trúc tạo nên có thể không tương đồng Theo cách hiểu đó, thuật ngữ biofilm đã bị nhầm lẫn vì biofilm không phải là một lớp chất cặn liên tục trên bề mặt Thay vào đó, các biofilm rất không đồng dạng, gồm có các vi khu n lạc của các tế bào vi khu n được bọc trong một màng EPS và tách riêng với các vi khu n lạc khác bởi các kênh dẫn truyền nước [54] H nh 1 cho thấy biofilm

của Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonia và Flavobacterium spp hình

thành trên một bề mặt bằng thép trong hệ thống nước sạch của phòng thí nghiệm Hình 1 mô tả một cách rõ ràng các k nh nước và t nh không đồng nhất của một biofilm với sự tham gia của các vi sinh vật khác nhau

Hình 1 Màng sinh vật của Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonia và

Flavobacterium spp trên bề mặt thép không gỉ [32]

Mạng lưới chất ngoại bào quy định sự sắp xếp tế bào và tạo nên những kênh dẫn truyền nước bên trong màng sinh vật Chính nhờ cấu trúc này mà các chất dịch, nước có thể lưu thông qua màng sinh vật tạo điều kiện cho các chất dinh dưỡng được khuếch tán, phân phối đến khắp các tế bào trong màng, đồng thời loại đi những chất thải không cần thiết

Các sinh vật tạo biofilm cũng có thể có ảnh hưởng rõ rệt đến cấu trúc biofilm Jame và cộng sự [46] cho rằng độ dày của biofilm có thể bị ảnh hưởng bởi số lượng sinh vật cấu thành Trong môi trường tinh khiết, màng sinh vật của

P aeruginosa và K pneumoniae có thể dày từ 15 – 30 μm Trong khi đó, màng

sinh vật của cùng một loài th dày 40 μm

Cấu trúc biofilm không đồng nhất cả về không gian và thời gian Nó liên tục

thay đổi bởi các quá trình xảy ra ở cả bên trong và ngoài màng Tolker – Nielsen và

cộng sự đã nghi n cứu vai trò của các tế bào chuyển động trong cấu trúc biofilm

trong dòng tế bào bằng cách kiểm tra sự tương tác của P aeruginosa và P putida

trên kính hiển vi laser quét Khi bổ sung 2 chủng này vào dòng tế bào, mỗi vi khu n

ban đầu tạo thành các vi khu n lạc Theo thời gian, các khu n lạc có sự xâm lấn vào

nhau Từ cấu trúc nhỏ gọn của vi khu n lạc biến đổi sang cấu trúc lỏng lẻo hơn,

người ta quan sát thấy các tế bào bên trong khu n lạc đang chuyển động Sự chuyển

động cuối cùng dẫn đến sự phân tán khu n lạc, phá vỡ cấu trúc biofilm[75]

1.4 Quá trình hình thành màng sinh vật

1.4.1 Các yếu tố ảnh hưởng tới sự hình thành màng sinh vật

Mặt phân cách rắn – lỏng giữa một bề mặt và một môi trường lỏng (như

nước, máu) tạo một môi trường lý tưởng cho sự gắn và phát triển của các vi sinh

vật Sự gắn kết không thể diễn ra nếu không xem xét tới ảnh hưởng của giá thể, đặc

tính của môi trường lỏng và tính chất của tế bào

Ảnh hưởng của giá thể

Bề mặt rắn có thể có vài đặc điểm quan trọng trong quá trình gắn

Characklis đã lưu ý rằng mức độ quần tụ của vi khu n tăng khi độ thô ráp của bề

mặt tăng Điều này được giải th ch là do ở bề mặt thô nhám, lực tương tác giữa

các tế bào với bề mặt giảm đi và diện t ch tiếp xúc được tăng l n đáng kể so với

các bề mặt trơn nhẵn [22]

Tính chất hóa lý của bề mặt vật liệu cũng ảnh hưởng mạnh mẽ đến tốc độ và

mức độ bám d nh của tế bào l n bề mặt Hầu hết các nghi n cứu cho thấy rằng các

vi sinh vật gắn kết với một bề mặt kị nước, không ph n cực như teflon và nhựa

nhanh hơn và tốt hơn so với bề mặt một vật liệu ưa nước như thủy tinh hay kim loại

Ngay cả khi những kết quả nghi n cứu vào các thời điểm khác nhau có m u thuẫn

v không tồn tại một phương pháp chu n nào để xác định bề mặt kỵ nước[19], [40]

Đặc tính của môi trường lỏng

Các đặc tính của môi trường lỏng như pH, mức độ dinh dưỡng, nồng độc ion, nhiệt độ đóng vai trò quan trọng ảnh hưởng đến tỷ lệ các vi sinh vật gắn vào giá thể

Lớp gang ở bên trong của ống dẫn nước bị thôi ra theo thời gian và điều kiện nhiệt độ Tỷ lệ hình thành màng sinh vật li n quan đến ảnh hưởng của mùa và tốc

độ của dòng chảy Nhiệt độ nước ở các mùa là khác nhau Tỷ lệ hình thành màng sinh vật cao nhất xảy ra ở điều kiện nước ấm (từ 15 – 250C)[32]

Fletcher và cộng sự [38], [39] cũng đã chứng minh sự gia tăng nồng độ của một số cation (Na+, Ca2+, Fe3+, La+) ảnh hưởng đến khả năng bám d nh của chủng

Pseudomonas fluorescens l n bề mặt thủy tinh, bằng cách làm giảm lực tương tác

giữa các tế bào vi khu n với bề mặt k nh Nghi n cứu của Cowan và cộng sự cho thấy sự gia tăng nồng độ chất dinh dưỡng tỷ lệ thuận với số lượng gắn kết của các tế bào vi khu n l n bề mặt [26]

đã được chứng minh là có liên quan tới việc bám của các vi khu n này vào các tế bào động vật [23]

Những vi sinh vật có lông roi, lông nhung sẽ giúp cho việc di chuyển trong môi trường nước tốt hơn n n có hiệu quả tạo biofilm cao hơn Th nghiệm so sánh

giữa hai Pseudomonas fluorescens cho thấy chủng di động có khả năng h nh thành

biofilm nhanh hơn so với chủng không di động [49] Đối với loài có lông roi, lông nhung cúng sẽ có ưu thế trong việc di chuyển đến một bề mặt giá thể xác định nơi

có điều kiện thuận lợi cho việc h nh thành biofilm đồng thời giúp cho việc bám d nh

ban đầu của tế bào với bề mặt

Tuy nhi n một số loài không có phần phụ trợ tế bào nhưng vẫn có khả năng

h nh thành biofilm mạnh dựa vào khả năng tự tổng hợp sẵn các chất ngoại bào như

lipopolysaccharide, glycoprotein tạo thành cấu trúc màng giáp (capsule), màng nhày

(slime) hay lớp cơ chất bao quanh tế bào [1] Đặc t nh này tạo t nh tự kết d nh kết

d nh cho tế bào và chủ yếu có những loài vi sinh vật g y bệnh như Streptococcus

mutans, Streptococcus salivarius, Xanthomonas, Bacillus anthracis [11]

1.4.2 Các giai đoạn của quá trình hình thành màng sinh vật

Sự hình thành màng sinh vật là một quá trình phát triển mà vi khu n chuyển

từ trạng thái động đơn bào sang một trạng thái tĩnh đa bào Ở đó, sự sinh trưởng,

phát triển của vi khu n có những đặc trưng ri ng Kết quả nghi n cứu sự h nh thành

biofilm ở nhiều loài vi khu n khác nhau cho ph p đưa ra một mô h nh giả thuyết

chung về quá tr nh h nh thành biofilm Mô h nh giả thiết cũng được điều chỉnh để

phù hợp với cả hai dạng sống cơ bản của vi sinh vật là di động và không di động

Dựa tr n các phương pháp ph n t ch di truyền học, proteomic và sinh học

phân tử, cùng với những phân tích về mặt cấu trúc, hóa học màng sinh vật, các nhà

khoa học đã đưa ra một mô hình cấu trúc màng sinh vật cơ bản [25].Trong mô hình

này, vi khu n hình thành nên các vi khu n lạc và được bao quanh bởi một mạng

lưới chất ngoại bào giúp các thành phần tế bào liên kết với nhau một cách có trật tự

đảm bảo sự trao đổi thông tin liên tục diễn ra giữa các tế bào đồng thời tạo nên

những kênh dẫn truyền dịch ngoại bào bên trong màng sinh vật Nhờ đó, dịch tế bào

có thể đi qua màng sinh vật tạo điều kiện cho việc khuếch tán, phân phối chất dinh

dưỡng đến khắp các tế bào trong màng cũng như loại bỏ các chất thải [73]

Hình 2 Các giai đoạn chính hình thành màng biofilm [27].

1.Giai đoạn gắn kết lên bề mặt, 2 Hình thành lớp tế bào trên bề mặt, 3 Hình thành mạng lưới ngoại bào, 4 Hình thành biofilm hoàn chỉnh, 5 Quá trình tách rời

Sự tạo thành màng sinh vật, được mô tả ở hình 2, cũng giống như một quá trình phát triển của vi sinh vật và cần phải trải qua một số bước bao gồm: sự gắn kết của các tế bào vi sinh vật trôi nổi tự do lên một bề mặt, sự tăng trưởng và liên kết các tế bào thành vi khu n lạc, sự tạo thành màng sinh vật trưởng thành (hoàn chỉnh), và cuối cùng là sự tách rời của các tế bào vi sinh vật thành dạng dịch lỏng tế bào

Giai đoạn 1: Gắn kết thuận nghịch

Màng sinh vật được bắt đầu hình thành khi các vi khu n cảm nhận được sự thay đổi của điều kiện môi trường gây ra sự di chuyển lên bề mặt Những tín hiệu từ môi trường là rất khác nhau đối với từng loài vi khu n P aeruginosa và P fluorescens sẽ tạo thành biofilm dưới mọi điều kiện mà chúng sinh trưởng được [64] Một số chủng Escherichia coli K- 12 và Vibrio cholerae sẽ không tạo thành

biofilm ở môi trường tối thiểu trừ khi được cung cấp th m các axit amin [66], [77] Ngoài các yếu tố về dinh dưỡng của môi trường, các yếu tố khác như nhiệt độ, pH, oxy, ion kim loại…cũng ảnh hưởng tới sự h nh thành màng sinh vật

Trước khi vi sinh vật bám dính lên bề mặt, các phân tử hữu cơ, protein, glycoprotein đã tiếp xúc và hình thành nên một màng điều kiện, đó là một khu vực giàu dinh dưỡng giúp thuận lợi cho sự trao đổi chất của các tế bào vi sinh vật [16] Các bề mặt trong môi trường thủy sinh thường đạt được điều kiện cho sự hấp thụ

của các chất vô cơ và hữu cơ Dưới một số điều kiện nhất định và tùy thuộc đặc tính

lý hóa, các vi khu n có thể di chuyển hướng đến bề mặt bởi chuyển động Brown

hay hóa ứng động và hình thành mối tương tác tạm thời với bề mặt thông qua các

lực tương tác yếu như lực Van der Waals, lực hút tĩnh điện, liên kết hydro Nhờ khả

năng di chuyển độc lập bằng co rút tế bào hay sử dụng các tiêm mao cũng như khả

năng tiết các chất ngoại bào đã giúp cho các tế bào riêng rẽ được bao bọc trong một

mạng lưới và bắt đầu sự hình thành màng sinh vật [64]

Tuy nhiên sự liên kết các tế bào này chưa thật sự chặt chẽ do đó giai đoạn

đầu hình thành màng sinh vật một số tế bào có thể tách rời khỏi bề mặt để tiếp tục

đời sống tự do riêng lẻ Armitage trong nghiên cứu của mình đã chỉ ra rằng vi khu n

Rhodobacter sphaeroides không hoạt động ri ng lẻ để tạo h nh dạng màng sinh vật

như các một số loài mà chúng có thể tập hợp lại trong những chuỗi dài giúp khởi

động sự tạo thành màng ở những giai đoạn đầu [47]

Giai đoạn 2: Gắn kết không thuận nghịch

Sau khi gắn kết thuận nghịch ban đầu lên một bề mặt, vi sinh vật không

những phải giữ liên kết với bề mặt giá thể mà còn phải tăng trưởng để hình thành

một màng sinh vật hoàn chỉnh Vì vậy, giai đoạn tiếp theo là sự sản xuất các chất

ngoại bào nhằm làm tăng t nh bám d nh ổn định thông qua các cầu nối hữu cơ giữa

tế bào và giá thể Việc chuyển từ giai đoạn bám dính thuận nghịch sang giai đoạn

bám dính không thuận nghịch được thực hiện nhờ lông roi, tiêm mao vào các sợi

bám dính Trong khi sự vận động thông qua trung gian lông roi được đánh giá là

quan trọng trong bước đầu thiết lập sự bám dính của vi sinh vật lên bề mặt thì vận

động co rút được chỉ ra là cần thiết cho sự trưởng thành của màng sinh vật trong

điều kiện tĩnh

Cụ thể, nhu động co rút giúp cho sự hình thành nên các vi khu n lạc trong

màng sinh vật bằng cách tạo điều kiện thuận lợi cho tương tác giữa các vi khu n với

bề mặt để hình thành nên các nhóm tế bào, qua đó giúp tăng cường mức độ bám

dính với bề mặt [64]

Giai đoạn 3: Hình thành mạng lưới ngoại bào

Các hợp chất polymer ngoại bào tiếp tục được tạo ra bởi các tế bào để liên

kết các tế bào với nhau một cách có tổ chức đồng thời tạo thành cầu nối giữa các vi

khu n lạc Chúng cũng có vai trò trong việc thu hút các tế bào sống trôi nổi (có thể

là từ nhiều loài khác nhau) trong môi trường Kết quả là mật độ tế bào trong một màng sinh vật cũng như lượng các polymer ngoại bào tạo ra tăng l n Một mạng lưới màng sinh vật dần được hình thành [73]

Giai đoạn 4: Hình thành một biofilm hoàn chỉnh

Khi tế bào vi sinh vật bám dính không thuận nghịch lên bề mặt thì quá trình trưởng thành của màng sinh vật bắt đầu Trong suốt quá trình này, sự phân chia của các tế bào vi sinh vật bám dính không thuận nghịch là nguyên nhân giúp các tế bào

ph n chia để lan rộng và phát triển dần lên từ các điểm gắn kết để hình thành các vi khu n lạc hay các cụm tế bào Từ một phạm vi ban đầu biofilm có thể mở rộng về không gian cũng như độ phức tạp tùy thuộc vào điều kiện môi trường Một biofilm hoàn chỉnh có cấu trúc giống như tháp h nh nấm được bao quanh bởi các kênh vận chuyển nước có tính th m thấu cao tạo điều kiện cho việc vận chuyển chất dinh dưỡng và oxy vào b n trong biofillm cũng được quan sát Các biofilm phát triển khá chậm thường cần vài ngày để đạt được cấu trúc hoàn chỉnh Một biofilm trưởng thành được coi như một tổ chức tiên tiến luôn có sự thích nghi liên tục với môi trường bao quanh, điều này cũng có nghĩa là khi điều kiện môi trường bất lợi vi khu n có thể tách rời khỏi biofilm để tìm một môi trường mới phù hợp hơn [41]

Màng hoàn chỉnh là một cấu trúc phức tạp không đồng nhất của các khu n lạc ưu thể và hoạt động sinh trưởng mạnh cùng với các ezyme, các sản ph m bài tiết

và các kênh nhỏ tạo thành một phần của cấu trúc tổng thể Trong những trường hợp nhất định, biofilm sẽ tạo thành dạng cột như được nhìn thấy ở hình 3 Vi khu n chuyển động hóa ứng động và sử dụng tín hiệu cảm biến để kết nối thông tin với nhau Các loài khác nhau sử dụng các phân tử khác nhau cho sự kết nối này Cũng

có những bằng chứng cho thấy các khu n lạc ở gần bề mặt màng sinh vật hoạt động khác với những khu n lạc khác trong màng Điều đó chỉ ra rằng, các khu n lạc bị đột biến mất khả năng cảm biến hoặc chuyển động hóa ứng động không tốt sẽ mất cấu trúc màng [47]

Hình 3 Các giai đoạn của sự tạo thành biofilm [47]

Khu vực ngoài màng sinh vật thường tập trung nhiều oxy hơn vùng bên trong

hoàn toàn kỵ khí Điều đó cho thấy, hoạt động trao đổi chất của vi khu n ở ngoài

màng cao hơn những vùng nhiều chất dinh dưỡng ở trong màng (gần hoặc tiếp xúc

với dòng chất lỏng) Nhưng số lượng vi khu n trong khu vực này thì khá nhỏ

Ngược lại, phần lớn vi khu n nằm b n trong màng được tìm thấy thường hướng về

khu vực phía trong và không hoạt động (hình 4)

Hình 4 Hoạt động trao đổi chất bên trong biofilm [47]

Giai đoạn 5: Tách rời

Khả năng phát triển của màng sinh vật giới hạn trong điều kiện dinh dưỡng

của môi trường nuôi cấy và biểu hiện của các phân tử cảm ứng mật độ tế bào Các

phân tử này được giải phóng ra nhằm đáp ứng với những hạn chế về dinh dưỡng, sự

tích tụ các sản ph m độc hại và một số nhân tố khác, bao gồm các yếu tố pH, nguồn

cung cấp cacbon, oxy Trong một số trường hợp, khi màng sinh vật đạt đến khối

lượng và một mức cân bằng động tối đa th các tế bào trong đó sẽ tự tách rời và cùng với các tế bào của một màng khác hình thành nên các vi khu n lạc [62]

Một phần của hướng nghiên cứu về biofilm là tìm hiểu cơ chế của quá trình tách rời Một trong những tín hiệu của quá trình này là hiện tượng đói của tế bào, dù vậy vấn đề này vẫn chưa được nghiên cứu kỹ Boyd và Chakrabarty cho rằng enzyme lyase ph n giải alginate có thể đóng vai trò quan trọng trong giai đoạn tách

rời của P aeruginosa [10] Họ đã cho thấy sự biểu hiện quá mức của enzyme phân

giải alginate có thể tăng tốc độ tách rời và làm bong các tế bào ra khỏi biofilm [19]

Một nghi n cứu của Allison và cộng sự đã chỉ ra rằng màng sinh vật của P fluorescens giảm khi giai đoạn ủ được k o dài và điều đó có thể là mất EPS [15]

1 5 Vai trò của màng sinh vật

1.5.1 Vai trò của việc hình thành biofilm với vi sinh vật

Biofilm được h nh thành và xem như là một hình thức tồn tại phổ biến của nhiều loài vi sinh vật trong điều kiện tự nhiên bởi nó đem lại những lợi ích nhất định cho sự tồn tại và phát triển của chính bản thân vi sinh vật

1.5.1 1 Bảo vệ tế bào khỏi các điều kiện bất lợi của môi trường

Các tế bào phải trải qua một số các thay đổi về h nh thái, đặc tính sinh lý khi chuyển sang dạng biofilm và một trong những thay đổi quan trọng là việc hình thành mạng lưới các chất ngoại bào bao quanh Mạng lưới này giúp giữ lại chất hữu cơ không hòa tan từ môi trường nước xung quanh tạo điều kiện cho vi sinh vật sinh trưởng, phát triển và mở rộng biofilm Đồng thời nó cũng có vai trò trong việc kiến tạo cấu trúc không gian 3 chiều đặc trưng cho biofilm bằng cách tạo nên một mức độ ổn định, một sự cân bằng nội môi cho các vi sinh vật sinh sống trong biofilm [78]

Bên cạnh đó một vai trò quan trọng của mạng lưới ngoại bào là đem lại khả năng chống lại các tác nhân kháng khu n cho các tế bào sinh sống trong biofilm Theo Flemming vi khu n sống trong một biofilm có thể có khả năng kháng đối với các tác nhân gây hại (chất kháng sinh, chất hoạt động bề mặt ) cao gấp 1000 lần so với tế bào sống trôi nổi [35]

Mạng lưới các hợp chất ngoại bào cũng được ghi nhận có khả năng giúp tế bào chống lại tác động của kim loại nặng, các ion và chất độc, giúp tế bào tránh

khỏi rất nhiều yếu tố stress từ môi trường như tia UV, pH, sốc th m thấu và sự khô

hạn [35]

1.5.1.2 Tận dụng nguồn dinh dưỡng của môi trường

Những kênh vận chuyển nước nằm xen kẽ trong cấu trúc biofilm giữa các

vùng bao quanh vi khu n lạc được v như là một hệ thống tuần hoàn nguyên thủy

Chúng hoạt động hiệu quả trong quá tr nh trao đổi chất với môi trường xung quanh,

do đó làm tăng hiệu quả trong việc sử dụng nguồn dinh dưỡng cũng như loại bỏ các

sản ph m chuyển hóa có khả năng g y độc hại Nhờ vậy quá trình chuyển hóa trong

biofilm cũng mang những đặc trưng khác so với dạng sống tự do [14]

Mặt khác biofilm được hình thành giúp vi sinh vật tận dụng được nguồn chất

hữu cơ bám d nh tr n bề mặt giá thể cũng như các cơ chất, chất dinh dưỡng tạo ra từ

các loài vi sinh vật khác sống chung

1.5.1.3 Mối quan hệ hợp tác giữa các loài

Một biofilm có thể được hình thành do sự hợp tác cùng chung sống của

nhiều loài vi sinh vật để tạo một cộng đồng có cấu trúc không gian phức tạp Các

loài vi sinh vật cùng tồn tại trong biofilm thích nghi với những điều kiện về dinh

dưỡng, nồng độ khác nhau tạo nên những “vi ổ sinh thái” trong biofilm Chẳng hạn

như những vi sinh vật nằm phía ngoài biofilm thích nghi với điều kiện hiếu khí cao

trong khi những loài nằm ph a trung t m biofilm có xu hướng chịu được nồng độ

oxy thấp (vi hiếu khí)

Khả năng th ch nghi với nhiều điều kiện dinh dưỡng khác nhau giúp các loài

vi sinh vật trong biofilm tận dụng được nguồn dinh dưỡng từ môi trường đồng thời

hỗ trợ lẫn nhau theo hướng cùng có lợi trong quá trình chuyển hóa vật chất

Mối quan hệ hợp tác giữa các loài trong biofilm cũng có ảnh hưởng lớn đến

chu trình tuần hoàn của các nguyên tố trong tự nhiên Hầu hết các quá trình trong tự

nhi n đòi hỏi sự phối hợp của nhiều nhóm vi khu n có cơ chế trao đổi chất khác

nhau để cùng phân giải một hợp chất hữu cơ và việc các vi sinh vật thuộc nhiều

nhóm khác nhau cùng cư trú trong biofilm sẽ góp phần thúc đ y các quá trình này

diễn ra nhanh hơn [39]

1.5.1.4 Trao đổi vật chất di truyền

Quá trình truyền gen ngang (horizontal gene transfer) đóng vai trò quan

trọng trong việc thúc đ y sự tiến hóa của các cộng đồng vi sinh vật Trong đó cơ

chế truyền gen phổ biến ở vi sinh vật là truyền gen thông qua plasmid và cầu tiếp hợp Tuy nhiên từ những hiểu biết rằng hầu hết các vi khu n trong tự nhi n định cư dưới dạng biofilm, liên kết với nhau bởi mạng lưới các chất ngoại bào thì việc tiếp hợp giống như là cơ chế mà nhờ đó vi khu n trong biofilm có thể truyền gen từ tế bào này sang tế bào khác [50]

1.5.2 Ảnh hưởng của biofilm đến đời sống con người

Biofilm tác động đến rất nhiều lĩnh vực trong cuộc sống hàng ngày do đó các nghiên cứu về biofilm có ý nghĩa thực tiễn quan trọng và ngày càng thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học Bên cạnh một số nhóm vi sinh vật gây bệnh có khả năng h nh thành biofilm th một số loài vi sinh vật tạo biofilm mang lại nhiều lợi ích cho con người

Ứng dụng trong việc xử lý nước thải

Một trong những ứng dụng của biofilm li n quan đến những vẫn đề làm

sạch nguồn nước thải, nguồn nước ngầm Ứng dụng này bắt nguồn từ thực tế là bản thân vi sinh vật có khả năng ph n hủy các chất hữu cơ trong môi trường tự nhiên thành các chất vô cơ đơn giản Từ đó đã có nhiều phương pháp xử lý nước thải bao gồm những giai đoạn xử lý mà trong đó nước thải được lọc qua các biofilm nhằm mục đ ch tách và đồng hóa các hợp chất hữu cơ có hại Trong biofilm, vi khu n thường loại bỏ các hợp chất hữu cơ, trong khi đó, protoza và trùng đế giày có trách nhiệm chính trong việc loại bỏ các chất cặn bã ở thể rắn gồm có tác nhân gây bệnh và các vi sinh vật khác Quá trình phân hủy các chất cũng tỏ ra hiệu quả hơn khi thường sản ph m của chủng này lại là cơ chất cho một chủng khác trong mạng lưới biofilm [14]

Biofilm có thể giúp tăng nhanh quá tr nh phân hủy từ những sự cố tràn dầu trên biển Dầu được loại bỏ bởi các vi khu n phân hủy hydrocarbon Các vi khu n được sử dụng có thể được thả trực tiếp xuống vùng dầu tràn hoặc có thể thả ở vùng ven bờ mà dầu tràn bị sóng đánh vào Ở cả hai vị trí thì việc hình thành màng biofilm giúp làm tăng đáng kể hiệu quả xử lý Lý do chính ở đ y là biofilm giúp tăng hiệu quả lọc nước và làm tăng độ kết dính của vi sinh vật với bề mặt giá thể nơi có dầu tràn [82]

Ứng dụng trong công nghiệp lên men

Trong các bể lên men ở qui mô công nghiệp biofilm là hình thức hiệu quả để

giữ lại sinh khối vi sinh vật B nh thường các tế bào ở dạng tự do khó có khả năng

được giữ lại trong các bồn lên men sau mỗi mẻ xử lý Khi đó để tiếp tục một qui

trình mới lại phải bổ sung thêm một lượng sinh khối nhất định và đợi thời gian để vi

sinh vật có thể sinh trưởng, phát triển tới một nồng độ nhất định mới Qui trình này

gây tốn kém ở khâu nguyên liệu đầu vào cũng như mất thời gian vận hành Ngược

lại khi đã được bám giữ trên bề mặt giá thể bằng mạng lưới biofilm sinh khối vi

sinh vật có thể được giữ lại một cách có hiệu quả sau mỗi mẻ xử lý Những giá thể

có sẵn mạng lưới biofilm có thể được tái sử dụng ở những lần xử lý tiếp theo mà

không phải bổ sung thêm vi sinh vật cũng như đợi thời gian phát triển [42]

1.6 Vấn đề xử lý nước thải

1.6.1 Thực trạng ô nhiễm nguồn nước

Tr n b nh diện toàn cầu, nước là một tài nguy n vô cùng phong phú nhưng

nước chỉ hữu dụng với con người khi nó ở đúng nơi, đúng chỗ, đúng dạng và đạt

chất lượng theo yêu cầu Hơn 99% trữ lượng nước trên thế giới nằm ở dạng không

hữu dụng đối với đa số các mục đ ch của con người do độ mặn (nước biển), địa

điểm, dạng (băng hà)

Trong nước thải chứa 2 loại dinh dưỡng cần quan t m hàng đầu là các hợp

chất có nitơ và photpho Các sinh vật đều cần hai dưỡng chất này để phát triển Tuy

nhiên, nếu chúng hiện diện với số lượng lớn sẽ làm mất cân bằng dinh dưỡng trong

các thủy vực, dẫn đến một số loài phát triển nhanh, một số loài giảm về số lượng cá

thể hoặc bị tiêu diệt hoàn toàn Các nguồn chính của hai loại dưỡng chất này từ

nước thải sinh hoạt, ph n bón, nước thải các nhà máy chế biến thực ph m [3]

Khi thải loại nước này vào nguồn tiếp nhận thường xảy ra các hiện tượng

phú dưỡng hóa (eutrophication), tức là tảo và các thực vật khác phát triển rất

nhanh, mật độ lớn Hiện tượng này biến động liên tục và khi nguồn tiếp nhận

nước thải ngày càng dư thừa chất dinh dưỡng tăng mạnh làm cho động vật thủy

sinh sống trong môi trường nước khó có thể tồn tại và phát triển dẫn đến hệ sinh

thái bị phá hủy [3]

Hiện tượng ô nhiễm hữu cơ xảy ra còn ảnh hưởng lớn đến đời sống con

người Tại các vùng ô nhiễm hữu cơ thường xuyên có mùi hôi thối khó chịu, ảnh

hưởng nghiêm trọng đến sinh hoạt, sức khỏe con người do tại các nguồn ô nhiễm này, hàm lượng các hợp chất nitơ như NH4+, NO3-, NO2- Các hợp chất này có tính độc cao, ảnh hưởng đến sức khỏe con người và đặc biệt nghiêm trọng là khi nhiễm vào nguồn nước ngầm khiến cho việc xử lý nước sinh hoạt gặp nhiều khó khăn [11]

Vì vậy các nhà nghiên cứu luôn t m cách để loại bỏ các ion này, đưa chúng

về dạng t độc hại là dạng N2 tự do

1.6.2 Ô nhiễm nguồn nước do nước thải chăn nuôi

Trong thành phần chất rắn của nước thải thì hợp chất hữu cơ chiếm 70-80% gồm các hợp chất hydratcarbon, protit, axit amin, chất béo và các dẫn xuất của chúng có trong phân và thức ăn thừa Hầu hết các chất hữu cơ dễ bị phân hủy Các chất vô cơ chiếm 20-30% gồm cát, đất, muối, urê, ammonium, muối clorua…Các hợp chất trong ph n và nước thải đều dễ dàng bị phân hủy [2]

Nước thải chăn nuôi bao gồm hỗn hợp nước tiểu, nước rửa chuồng, nước tắm vật nuôi Nước thải chăn nuôi chứa nhiều chất rắn lơ lửng, chất hữu cơ, nitơ, photpho và các thành phần khác, đặc biệt là số lượng lớn các vi sinh vật gây bệnh [12] Nước thải chăn nuôi là một loại nước đặc trưng, có khả năng g y ô nhiễm môi trường cao do có hàm lượng lớn các chất hữu cơ, cặn lơ lửng, nitơ, photpho và các

vi sinh vật gây bệnh [2] Đồng thời, nước là môi trường thuận lợi cho sự sinh sôi, phát triển và lan truyền các vi sinh vật gây bệnh

Theo kết quả điều tra đánh giá hiện trạng môi trường của Viện chăn nuôi (2006) tại các cơ sở chăn nuôi lợn có quy mô tập trung thuộc Hà Nội, Hà Tây, Ninh

B nh, Nam Định, Quảng Nam, B nh Dương, Đồng Nai cho thấy đặc điểm của nước thải chăn nuôi [2]

 Các chất hữu cơ: hợp chất hữu cơ chiếm 70–80% bao gồm cellulose, protit, axit amin, chất béo, hidrat carbon và các dẫn xuất của chúng, thức ăn thừa Các chất vô cơ chiếm 20–30% gồm cát, đất, muối, ure, ammonium, muối chlorua, SO42-…

và P của các loài gia súc, gia cầm rất k m, n n khi ăn thức ăn có chứa N và P thì chúng sẽ bài tiết ra ngoài theo ph n và nước tiểu Trong nước thải chăn nuôi heo thường chứa hàm lượng N và P rất cao Hàm lượng N-tổng số dao động trong

khoảng 200 – 350 mg/l trong đó N-NH4+ chiếm khoảng 80-90%; Hàm lượng P tổng

số trong khoảng 60-100 2mg/l

Theo thống k năm 2010 của Cục chăn nuôi, tại các trang trại chăn nuôi tập

trung, mặc dù phần lớn đã có hệ thống xử lý chất thải nhưng hiệu quả xử lý chưa

triệt để, số trang trại chăn nuôi có hệ thống xử lý chất thải bằng biogas khoảng 67%;

số trang trại có đánh giá tác động môi trường chiếm chưa đầy 14%; 37,2% hộ chăn

nuôi thâm canh và 36,2% chăn nuôi thời vụ không có biện pháp xử lý chất thải

Tình trạng tr n đã g y ra ô nhiễm nghiêm trọng môi trường đất, nước, không khí ở

nông thôn Ước tính, hiện có tới 80% các bệnh nhiễm trùng ở nông thôn có liên

quan tới nguồn nước bị nhiễm vi sinh vật như giun sán, tả, bệnh ngoài da, mắt [4]

1.6.3 Xử lý nước thải chăn nuôi

Đặc trưng của nước thải chăn nuôi là có hàm lượng lớn các chất hữu cơ, nitơ,

photpho và các vi sinh vật gây bệnh Tùy theo quy mô sản xuất, điều kiện kinh tế,

mục đ ch sử dụng nước thải, chất thải chăn nuôi mà có thể đưa ra phương pháp xử

lý nước thải phù hợp

1.6.3.1 Phương pháp cơ học

Nước thải công nghiệp cũng như nước thải sinh hoạt thường chứa các chất

tan và không tan ở dạng hạt lơ lửng Các tạp chất lơ lửng có thể ở dạng rắn và lỏng,

chúng tạo với nước thành hệ huyền phù Để tách các hạt lơ lửng ra khỏi nước thải,

người ta thường sử dụng các quá trình thủy cơ (gián đoạn hoặc liên tục) như: lọc

qua song chắn hoặc lưới, lắng dưới tác dụng của lực trọng trường hoặc lực ly tâm và

lọc Việc lựa chọn phương pháp xử lý tùy thuộc vào k ch thước hạt, tính chất hóa lý,

nồng độ hạt lơ lửng, lưu lượng nước thải và mức độ làm sạch cần thiết [10]

Hàm lượng cặn lơ lửng trong nước thải chăn nuôi khá cao và dễ lắng nên cần

lắng sơ bộ trước rồi đưa sang các công trình xử lý khác Sau khi tách, nước thải

được đưa vào các công tr nh xử lý phía sau, còn chất rắn tách được có thể đem ủ

làm phân bón

1.6.3.2 Phương pháp h a lý

Nước thải chăn nuôi có nhiều chất hữu cơ và vô cơ với các thành phần, kích

thước khác nhau nên khó lắng, khó tách Khi sử dụng phương pháp cơ học sẽ tốn

nhiều thời gian, cho hiệu quả không cao

Phương pháp keo tụ dùng các chất như phèn nhôm, phèn sắt, phèn bùn kết hợp với sử dụng polymer trợ keo tụ giúp tăng hiệu quả của quá trình này

1.6.3.3 Phương pháp sinh học

Nguyên tắc của phương pháp sinh học là lên men phân hủy các chất hữu cơ nhờ hoạt động của vi sinh vật hiếu khí hoặc kỵ khí Sản ph m cuối cùng là là chất khí (CO2, N2, CH4, H2S), các chất vô cơ và tế bào mới Phương pháp này khi áp dụng sẽ cho hiệu quả kinh tế cao, rẻ tiền và tận dụng được các sản ph m phụ làm phân bón (bùn hoạt tính) hoặc tái sử dụng năng lượng

Phương pháp xử lý sinh học có thể ph n thành 2 phương pháp

- Phương pháp kị khí sử dụng nhóm vi sinh vật kị khí, hoạt động trong điều kiện không có oxy

- Phương pháp hiếu khí sử dụng nhóm vi sinh vật hiếu khí, hoạt động trong điều kiện cung cấp oxy liên tục

Trong nhiều năm qua, chất thải vật nuôi trong nông hộ được xử lý bằng các biện pháp chủ yếu là: thải trực tiếp ra k nh mương, ao, hồ; được ủ làm phân bón cho cây trồng; và được xử lý bằng công nghệ khí sinh học (biogas) Ngoài ra, còn

có một số phương pháp khác như xử lý chất thải bằng sinh vật thủy sinh (cây muỗi nước, bèo lục bình )

 Hệ thống Biogas

Biogas là một loại kh đốt sinh học được tạo ra khi phân hủy yếm khí phân thải ra của gia súc Các chất thải của gia súc được cho vào hầm kín (hay túi ủ), ở đó các vi sinh vật sẽ phân hủy chúng thành các chất mùn và kh , kh này được thu lại qua một hệ thống đường dẫn tới lò để đốt, phục vụ sinh hoạt của gia đ nh Các chất thải ra sau quá trình phân hủy trong hầm kín (hay túi ủ) gần như sạch và có thể thải

ra môi trường, đặc biệt nước thải của hệ thống Biogas có thể dùng tưới cho cây trồng [81]

 Xử lý nước thải bằng cây thủy sinh

Nước thải từ các trại chăn nuôi chứa rất nhiều nitơ, photpho và những hợp chất vô cơ có thể hoà tan được Rất khó tách những chất thải này khỏi nước bằng cách quét rửa hay lọc thông thường Tuy nhiên một số loại cây thủy sinh như bèo

lục bình, cỏ muỗi nước có thể xử lý nước thải, vừa ít tốn kinh phí lại thân thiện với

môi trường [83]

 Màng sinh học

Việc sử dụng vi sinh vật dính bám trên các vật liệu lọc để xử lý các chất hữu

cơ trong nước thải đang là hướng nghiên cứu được quan tâm Vi sinh vật có thể

dính bám lên các giá thể vì có nhiều loại vi sinh vật có khả năng tiết ra các polyme

sinh học giống như keo d nh tạo biofilm vào giá thể, tạo thành màng Lớp màng này

dày lên và có khả năng oxy hóa, hấp phụ: chất hữu cơ, cặn lơ lửng Đồng thời việc

hình thành màng sinh học này làm tăng khả năng lọc nước thải giúp quá trình xử lý

nước thải được triệt để hơn Các vi sinh vật tạo biofilm cả hiếu khí và kị khí có thể

có mật độ rất cao so với các vi sinh vật đơn lẻ do khả năng tận dụng nguồn dinh

dưỡng cũng như chống lại các điều kiện bất lợi của môi trường

Vì vậy việc phân lập các chủng vi sinh vật vừa có khả năng chuyển hóa nitơ

cũng như một số chất khác gây ô nhiễm môi trường nước lại vừa có khả năng tạo

biofilm đang là một hướng nghiên cứu mới mẻ và hứa hẹn sẽ có nhiều tiềm năng

cho việc xử lý nước thải

1.7 Chu trình nitơ trong tự nhiên

1.7.1 Khái quát về chu trình nitơ

Nitơ là một thành phần ch nh trong rất nhiều hợp chất trong cơ thể sinh vật

Nitơ chiếm phần lớn trong kh quyển nhưng hầu hết các sinh vật không thể hấp thu

trực tiếp Chỉ khi được biến đổi từ kh N2 thành NH3 th nó mới trở n n dễ hấp thụ

cho những sinh vật sản xuất đầu ti n, thường là thực vật Khi đó, nitơ tồn tại ở nhiều

dạng hợp chất vô cơ (NH3, NO-3 .), hữu cơ (ADN, protein, axit amin ) Do đó,

nitơ được biến đổi thành nhiều dạng khác nhau trong hệ sinh thái nhờ các sinh vật

khác nhau Sự biến đổi qua lại của nitơ giữa các dạng hợp chất hóa học của nó được

gọi là chu tr nh nitơ Việc biến đổi này có thể được tiến hành bởi cả hai quá tr nh

sinh học và phi sinh học Quá tr nh quan trọng trong chu tr nh nitơ bao gồm sự cố

định nitơ, khoáng hóa, nitrat hóa và phản nitrat hóa

Nitơ trong môi trường tồn tại ở nhiều dạng hóa học khác nhau như amoni

(NH4+), nitrit (NO2-), nitrat (NO3-), đi nitơ oxyt (N2O), nitơ oxyt (NO), kh nitơ (N2)

Nitơ hữu cơ có thể tồn tại trong các sinh vật sống hoặc các sản ph m trung gian của

quá tr nh ph n hủy các vật chất hữu cơ Các quá tr nh trong chu tr nh nitơ chuyển đổi nitơ từ một dạng này sang dạng khác Một số quá tr nh này được tiến hành bởi các vi khu n, qua quá tr nh đó hoặc để chúng lấy năng lượng hoặc để t ch tụ nitơ thành một dạng cần thiết cho sự phát triển của chúng H nh 5 thể hiện cách mà các quá tr nh này tương th ch với nhau để tạo ra chu tr nh nitơ

Hình 5 Chu trình nitơ trong tự nhiên [82]

Các dạng nitơ hữu cơ từ nguồn động thực vật sau khi chết được các vi khu n amoni hóa chuyển hóa thành dạng amoni; sau đó amoni được chuyển hóa thành nitrit nhờ vi khu n nitrit hóa; nitrit sinh ra được nhóm sinh vật nitrat hóa chuyển hóa thành nitrat; cuối cùng nitrat được nhóm sinh vật kỵ kh chuyển thành dạng nitơ

ph n tử nhờ quá tr nh phản nitrat hóa Ngoài ra còn có nhóm vi sinh vật cộng sinh trong nốt sần của các c y họ đậu tham gia qua tr nh cố định nitơ

1.7.2 Quá trình nitrat hóa

Nitrat hóa là một quá trình tự dưỡng Năng lượng cho sự phát triển của vi khu n được lấy từ các hợp chất oxy hóa của nitơ Nitrat hóa là sự kết hợp của quá trình oxy hóa amoni và quá trình oxy hóa nitrit thành nitrat Các vi khu n chuyển

hóa amoni như Nitrosomonas, Nitrosococcus chuyển hóa amoni thành nitrit theo phản ứng (1) Các vi khu n oxy hóa nitrit như Nitrobacter, Nitrocytis sau đó chuyển

hóa nitrit thành nitrat theo phản ứng (2)

15 CO2 + 13 NH4+  10 NO2- + 3 C5H7NO2 + 23 H+ + 4 H2O (1)

5 CO2 + NH4+ + 10 NO2- + 2 H2O  10 NO3- + C5H7NO2 + H+ (2) Các vi khu n của quá trình nitrat hóa thích hợp với pH trên 6 và hoạt động

tốt ở khoảng nhiệt độ là 30oC

Các vi khu n Nitrosomonas và Nitrobacter sử dụng năng lượng lấy từ các

phản ứng tr n để tự duy trì hoạt động sống và tổng hợp sinh khối Cùng với quá

tr nh thu năng lượng, C5H7NO2 tạo thành dùng để tổng hợp nên sinh khối mới cho

tế bào vi khu n

Quá trình nitrat hóa là giai đoạn cuối cùng của quá trình khoáng hóa các chất

hữu cơ có chứa nitơ Nitrat hóa là quá trình hoàn thiện của các công trình xử lý

nước thải bằng phương pháp sinh học Quá trình này tạo nên sự t ch lũy oxy trong

các hợp chất nitơ để các quá trình oxy hóa sinh hóa các chất hữu cơ tiếp theo có thể

xảy ra khi lượng oxy hòa tan trong nước rất ít hoặc đã hết

1.7.3 Quá trình phản nitrat hóa

Khi thiếu oxy và tồn tại nitrat hóa sẽ xảy ra quá tr nh ngược lại: Tách oxy

khỏi nitrat và nitrit để sử dụng lại trong các quá trình oxy hóa các chất hữu cơ khác

Quá tr nh này được thực hiện nhờ các vi khu n phản nitrat hóa (vi khu n yếm khí

tùy tiện) Trong điều kiện không có oxy tự do mà môi trường vẫn còn chất hữu cơ

cacbon, một số loại vi khu n khử nitrat hoặc nitrit để lấy oxy cho quá trình oxy hóa

các chất hữu cơ Quá tr nh khử nitrat được biểu diễn theo phương tr nh phản ứng:

4 NO3- + 5Chữu cơ + 4 H+  5 CO2 + 2 N2 + 2 H2O

Nhóm vi khu n phản nitrat hóa gồm có: Pseudomonas, Achromobacter,

Bacillus…

Phản nitrat hóa là một quá trình quan trọng giúp chuyển nitơ cố định (NO3-)

thành dạng tự do (N2) giải phóng vào khí quyển Trong xử lý nước thải, quá trình

này đem lại một lợi ích lớn bởi nó loại dạng nitrat không mong muốn ra khỏi nước

thải Do đó làm giảm những khả năng mà nước thải từ các nhà máy xử lý sẽ gây nên

những hiện tượng không mong muốn (như tảo nở hoa)

Xuất phát từ các nghiên cứu về vi sinh vật tạo màng, từ yêu cầu thực tiễn xử

lý nước thải chứa nitơ cũng như vai trò chuyển hóa nitơ trong tự nhiên, chúng tôi

tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học, khả năng sử dụng nitơ của một

số chủng vi khuẩn tạo biofilm phân lập tại Việt Nam”

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Ngu ên liệu

Cơ sở chọn địa điểm nghiên cứu là những khu trang trại chăn nuôi tập trung, những hộ chăn nuôi nhỏ lẻ tr n địa bàn thành phố Hà Nội

Các địa điểm lấy mẫu gồm:

- Nước thải của trại chăn nuôi lợn tại xã T n Ước – Huyện Thanh Oai –

Hình 6 Các vị trí lấy mẫu (A): Trại nuôi vịt xã Trung Tú, (B): Cống thoát nước xã

Dương Nội, (C): Trại nuôi lợn xã Tân Ước

- NaCl 10g

- Nước cất 1lit Các môi trường đều được khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong thời gian 120

phút Các hóa chất khác đều đạt độ tinh sạch cho mục đ ch nghi n cứu

Các hóa chất được hòa tan, làm lạnh về nhiệt độ phòng rồi định mức đến 100ml với nước khử ion

Dung dịch Sunfanilamide: Hòa tan 0,6 g sunfanilamide (H2NC6H4SO2NH2) trong 50 ml nước cất khử ion nóng, làm lạnh, thêm 40ml dung dịch HCl đặc và định mức đến 100ml

Dung dịch Naphtylendiamide dihydrochloride được chu n bị: Hòa tan 0,1g Naphtylendiamide dihydrochloride (C10H7NHCH2NH2.2HCl) trong 100ml nước cất khử ion

Các dung dịch thuốc thử đều được bảo quản ở điều kiện nhiệt độ thấp và tránh ánh sáng

2.2.3 Máy móc thiết bị

- Nồi khử trùng (ALP–Nhật)

- Máy lắc (Satorius–Đức)

- Box cấy vi sinh vật (Aura vertical– )

- Máy đo mật độ quang học (Bionate–Anh)

- Máy đo pH (Horiba–Nhật Bản)

- Cân Kern (Satorius–Đức)

- Cân phân tích (Presica, Ý)

1 và 2 Nuôi cấy các khu n lạc ở tủ ấm 37oC trong vòng 3 ngày đến khi xuất hiện các khu n lạc

2.3.2 hương pháp đánh giá hả năng hình thành biofilm

Nguyên tắc: trong điều kiện dinh dưỡng thích hợp và môi trường nuôi cấy

tĩnh các chủng vi sinh vật hình thành biofilm trên bề mặt giá thể Phát hiện, quan sát

biofilm bằng cách nhuộm với tím kết tinh – là chất có khả năng bắt màu với tế bào

sống Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp của Morikawa và cộng sự [57] Các

chủng vi khu n được lắc kích hoạt trong bình tam giác chứa môi trường LB trong

24 giờ ở 37oC sao cho mật độ tế bào OD620 ở vào khoảng 0,2-0,3 Hút 100 µl dịch

nuôi cấy vi khu n bổ sung vào 700µl LB lỏng trong các ống effendorf đã khử trùng

và ủ trong điều kiện tĩnh ở 37oC

Sau 24 giờ các dịch nuôi cấy được loại bỏ khỏi các ống effendorf Đánh giá

mật độ tế bào sống trôi nổi trong môi trường bằng phương pháp đo OD620 dịch

nuôi cấy vi khu n

Quan sát khả năng h nh thành biofilm: Mỗi ống effendorf được rửa sạch 2

lần bằng nước cất khử trùng Bổ sung vào mỗi ống effendorf 1 ml dung dịch tím kết

tinh 1% và giữ trong 25 phút ở nhiệt độ phòng Loại bỏ dung dịch nhuộm và quan

sát sự bắt màu của các tế bào bám trên trên thành ống với tím kết tinh

Đánh giá mật độ tế bào trong biofilm: Sau khi rửa sạch 2 lần bằng

nước cất khử trùng các tinh thể tím bám trên thành effendorf đươc hòa tan

trong 1ml etanol 70o Mật độ tế bào trong biofilm được xác định bằng cách đo

độ hấp thụ OD570

2.3.3 hương pháp ch p ảnh trên nh hiển vi điện tử qu t

- Chu n bị mẫu biofilm nổi: bổ sung dịch nuôi cấy lắc vi khu n vào bình tam giác chứa 20ml môi trường LB Nuôi cấy tĩnh 24 giờ ở 37oC

- Gắn mẫu biofilm l n lamen, hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn để cố định mẫu