Luận văn thạc sỹ khoa học chuyên ngành di truyền học

Sơ đồ hình cây biểu hiện mối quan hệ phả hệ dựa trên trình tự đoạn gen thu được của SLGL trong nghiên cứu với SLGL ở một số nước trong khu vực và trên thế giới ..... Việc xác định loài s

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN THỊ HOÀNG YẾN

ÁP DỤNG HÌNH THÁI HỌC VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ

TRONG ĐỊNH LOẠI SÁN LÁ GAN LỚN TẠI MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC – VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN THỊ HOÀNG YẾN

ÁP DỤNG HÌNH THÁI HỌC VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ

TRONG ĐỊNH LOẠI SÁN LÁ GAN LỚN TẠI MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC – VIỆT NAM

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được khóa luận cao học này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của các cá nhân, tổ chức

Tôi xin chân thành cảm ơn:

Các thầy/cô Phòng Sau đại học và Bộ môn Di truyền học - khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN

Ban giám đốc Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương, Khoa Dịch

tễ Sốt rét đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân và TS Nguyễn Thu Hương - hai người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp

đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS TS Trịnh Đình Đạt, PGS TS Lê Thanh Hòa, TS Nguyễn Thị Hương Bình, TS Nguyễn Thị Hồng Ngọc, TS Trương Văn Hạnh, TS Lê Xuân Hợi và các anh/chị em Khoa Ký sinh trùng, Khoa Sinh học phân tử, Khoa Dịch tễ sốt rét đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài cũng như đóng góp những ý kiến quý báu cho luận văn của tôi

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn các bạn lớp cao học K21 Sinh học, bạn

bè, đồng nghiệp và gia đình đã luôn giúp đỡ, động viên và chia sẻ những vui buồn với tôi trong suốt thời gian qua

Hà Nội, tháng 12 năm 2014

Học viên

Nguyễn Thị Hoàng Yến

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tình hình nhiễm sán lá gan lớn ở người và động vật 3

1.1.1 Bệnh sán lá gan lớn trên thế giới 3

1.1.2 Bệnh sán lá gan lớn tại Việt Nam 4

1.2 Đặc điểm sinh học của sán lá gan lớn 7

1.2.1 Phân loại sinh học 7

1.2.2 Hình thể sán trưởng thành 7

1.2.3 Hình thể trứng 9

1.3 Chu kỳ phát triển của sán lá gan lớn 9

1.4 Các vật chủ của sán lá gan lớn 11

1.4.1 Vật chủ chính 11

1.4.2 Vật chủ trung gian 11

1.4.3 Vật chủ tình cờ 12

1.5 Các yếu tố nguy cơ của bệnh sán lá gan lớn 12

1.5.1 Thói quen ăn uống 12

1.5.2 Môi trường 13

1.5.3 Tuổi và giới 13

1.6 Đặc điểm của bệnh do sán lá gan lớn 14

1.6.1 Đặc điểm lâm sàng 14

1.6.2 Đặc điểm cận lâm sàng 14

1.7 Tính đa dạng di truyền của Fasciola spp 16

1.7.1 Các yếu tố tác động đến đa dạng di truyền của Fasciola spp 16

1.7.2 Vai trò của việc xác định loài và phân tích đa hình sán lá gan lớn 17

1.8 Các phương pháp xác định loài sán lá gan lớn 18

1.8.1 Phương pháp hình thái 18

1.9 Thuốc điều trị sán lá gan lớn tại Việt Nam 23

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 25

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 25

2.2 Dụng cụ, trang thiết bị chung 25

2.3 Hóa chất 27

2.4 Phương pháp nghiên cứu 28

2.4.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 28

2.4.2 Cỡ mẫu phân tích 29

2.4.3 Phương pháp xác định kích thước các chỉ số hình thái 29

2.4.4 Các phương pháp định loài bằng kỹ thuật sinh học phân tử 31

2.5 Xử lý số liệu nghiên cứu 33

2.6 Đạo đức nghiên cứu 33

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 34

3.1 Kết quả về hình thái của sán lá gan lớn tại các địa điểm nghiên cứu 34

3.1.1 Kích thước sán lá gan lớn ở động vật 34

3.1.2 Các chỉ số trứng SLGL thu được trên động vật (vật kính 40x) 42

3.2 Kết quả định loại bằng phương pháp sinh học phân tử 44

3.2.1 Kết quả nhân đoạn gen ITS-2 bằng kỹ thuật PCR 44

3.2.2 Kết quả PCR - RFLP 45

3.2.3 Kết quả so sánh sự sai khác, tỷ lệ tương đồng của trình tự ITS-2 49

3.2.4 Kết quả mối tương quan trên cây phả hệ 58

KẾT LUẬN 61

KIẾN NGHỊ 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC

CHỮ VIẾT TẮT

ADN : Axit deoxyribonucleic

ARN : Axit ribonucleic

BL : Body length (chiều dài cơ thể)

bp : Base pair (cặp bazơ)

BR : Body roundness (chu vi cơ thể)

BW : Body width (chiều rộng cơ thể)

Buffer : Dung dịch đệm

CL : Cone length (Chiều dài đầu sán)

CW : Cone width (chiều rộng đầu sán)

CT : Côn trùng

dATP : Deoxy adenosine triphosphate

dCTP : Deoxy cytosine triphosphate

dGTP : Deoxy guanidine triphosphate

dTTP : Deoxy thymidine triphosphate

dNTP : Deoxy nucleotide triphosphate

FAO : Food and Agriculture Organization (Tổ chức

lương thực và nông nghiệp Liên Hiệp quốc) GOT : Glutamic oxaloacetic transaminase

GPT : Glutamic pyruvic transaminase

ITS : Internal Transcribed Spacer (đoạn giao gen) KST : Ký sinh trùng

Marker : Thang đo trọng lượng phân tử

NA : Nghệ An

OS : Oral sucker (giác miệng)

PBS : Phosphate buffered saline (dung dịch đệm) PCR : Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi

Polymerase) RFLP : Restriction fragment length polymorphism (đa

hình chiều dài đoạn cắt giới hạn) Primer : Mồi

VS : Ventral sucker (giác bụng)

VS-P : Khoảng cách giữa giác miệng và điểm cuối thân Vit-P : Khoảng cách từ cuối tuyến hoàng thể đến cuối

thân WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế thế

giới)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Tỷ lệ nhiễm SLGL ở trâu/bò tại huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam [13] 5

Bảng 2.1 Kết quả dự đoán sản phẩm ADN bằng các kỹ thuật PCR và PCR - RFLP 33

Bảng 3.1 Kích thước chiều dài và chiều rộng của sán lá gan lớn 34

Bảng 3.2 Tỷ lệ chiều dài và chiều rộng của sán lá gan lớn 35

Bảng 3.3 Chu vi giác bụng và giác miệng 36

Bảng 3.4 Kích thước chiều rộng cổ và chiều dài đầu sán 37

Bảng 3.5 Kích thước khoảng rộng và dài tinh hoàn 37

Bảng 3.6 Kích thước đoạn từ giác bụng đến cuối thân và đoạn từ giao điểm của tuyến hoàng thể đến cuối thân 38

Bảng 3.7 Sự phù hợp về loài sán theo chỉ số BL/BW và VS-P 39

Bảng 3.8 Các chỉ số kích thước trứng thu trên động vật 42

Bảng 3.9 Tỷ lệ chiều dài và chiều rộng của trứng sán lá gan lớn thu trên động vật 43 Bảng 3.10 Vị trí biến đổi của nucleotide của vùng gen ITS-2 của mẫu sán [11] 56

Bảng 3.11 Sự sai khác và mức độ tương đồng về nucleotide của các mẫu SLGL tại điểm nghiên cứu với F gigantica của Niger 57

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình thể sán lá gan lớn trưởng thành 8

Hình 1.2 Cấu tạo cơ quan của sán lá gan lớn 8

Hình 1.3 Hình thể trứng sán lá gan lớn 9

Hình 1.4 Chu kỳ phát triển của sán lá gan lớn 11

Hình 1.5 Tổn thương gan do sán lá gan lớn trên siêu âm 15

Hình 1.6 Mô hình cấu trúc ribosome ADN của gen nhân [17] 20

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 28

Hình 2.2 Các chỉ số của sán lá gan lớn trưởng thành [51] 30

Hình 3.1 So sánh tỷ lệ BL/BW của sán lá gan lớn tại 5 tỉnh miền Bắc 35

Hình 3.2 So sánh tỷ lệ VS-P của sán lá gan lớn tại 5 tỉnh miền Bắc 38

Hình 3.3 So sánh sự phù hợp về loài sán theo tỷ lệ (%) BL/BW và VS-P 39

Hình 3.4 Một số hình ảnh con sán lá gan lớn 41

Hình 3.5 Hình thể và kích thước mẫu SLGL tại một số điểm nghiên cứu 41

Hình 3.6 Một số hình ảnh trứng sán lá gan lớn Ảnh chụp trên vật kính 40x (hình a, b) và vật kính 10x (hình c, d), thước đo = 10 µm 42

Hình 3.7 So sánh tỷ lệ chiều dài/chiều rộng của trứng SLGL thu trên động vật 43

Hình 3.8 Kết quả nhân gen mẫu SLGL bằng phản ứng PCR 45

Hình 3.9 Sản phẩm PCR-RFLP của các mẫu sán cho kết quả F gigantica 45

Hình 3.10 Trình tự đoạn ADN thu được với trình tự mồi BD1 của mẫu trứng BGS1 46

Hình 3.11 Sản phẩm PCR-RFLP của mẫu sán cho kết quả F hepatica (mẫu THT2) 46

Hình 3.12 Trình tự đoạn ADN thu được với trình tự mồi BD1 của mẫu trứng THT2 47

Hình 3.13 Sản phẩm PCR-RFLP của các mẫu sán cho kết quả F gigantica/F hepatica (mẫu NA6) 48

Hình 3.14 Trình tự đoạn ADN thu được với trình tự mồi BD1 của mẫu trứng NA6 48

Hình 3.15 Kết quả so sánh trình tự ITS-2 của mẫu THT2 (H5) với trình tự mẫu F hepatica của Niger (AM900370.1) (độ tương đồng 99%) trên GENBANK 50

Hình 3.16 Kết quả so sánh trình tự ITS-2 của mẫu THT2 (H5) với trình tự mẫu F gigantica của Niger (JN828955.1) (độ tương đồng 99%) trên GENBANK 51

Hình 3.17 Kết quả so sánh trình tự ITS-2 của mẫu BGS1 (H3) với trình tự mẫu F

gigantica của Niger (AM900370.1) (độ tương đồng 99%) trên GENBANK 52

Hình 3.18 Kết quả so sánh trình tự ITS-2 của mẫu BGS1 (H3) với trình tự mẫu F

hepatica của Tây Ban Nha (AM709649.1) (độ tương đồng 99%) trên GENBANK 53

Hình 3.19 Kết quả so sánh trình tự ITS-2 của mẫu NA6 (H6) với trình tự mẫu F

hepatica của Tây Ban Nha (AM709499.1) (độ tương đồng 99%) trên GENBANK 54

Hình 3.20 Kết quả so sánh trình tự ITS-2 của mẫu NA6 với trình tự mẫu F

gigantica của Niger (AM850108.1) (độ tương đồng 99%) trên GENBANK 55

Hình 3.21 Sơ đồ hình cây biểu hiện mối quan hệ phả hệ dựa trên trình tự đoạn gen thu được của SLGL trong nghiên cứu với SLGL ở một số nước trong khu vực và trên thế giới 58

MỞ ĐẦU

Bệnh do sán lá gan lớn (SLGL) rất phổ biến ở động vật nhai lại (trâu, bò…),

do Fasciola hepatica và Fasciola gigantica gây ra Người là vật chủ tình cờ của sán

lá gan lớn khi người ăn rau sống hoặc uống nước lã có nang ấu trùng của sán lá gan lớn còn sống Ở người, sán lá gan lớn gây tổn thương chủ yếu ở gan nhưng cũng có thể gây tổn thương ngoài gan khi sán lá gan lớn lạc vị trí ký sinh Tại một số khu vực trên thế giới, tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn ở người rất cao và nhiễm sán lá gan lớn

được xem là vấn đề sức khỏe được cộng đồng đặc biệt quan tâm [53] Mặc dù F

hepatica được coi là có nguồn gốc ở châu Âu, nhưng cho đến nay loài này đã có

mặt và phân bố rộng rãi trên thế giới Hiện nay, loài sán này đã được tìm thấy ở châu Âu, châu Mỹ và châu Đại Dương [37] Ở châu Á, châu Phi nhiễm phối hợp cả

2 loài [37, 27]

Hai loài Fasciola hepatica và Fasciola gigantica có nhiều điểm giống và

khác nhau Để phân biệt 2 loài này, người ta có thể sử dụng phương pháp hình thái học [59] hoặc sinh học phân tử [1] Dựa vào các đặc điểm hình thái như chiều dài, chiều rộng cơ thể, khoảng cách từ giác bụng đến cuối thân và tỷ lệ chiều dài/chiều rộng có thể cho phép xác định loài sán lá gan lớn [59] Phương pháp này đơn giản,

dễ thực hiện, không cần những thiết bị phức tạp và có thể thực hiện ở hầu hết các phòng thí nghiệm Tuy nhiên, nhiều tác giả cho rằng sán lá gan lớn có sự đa hình về hình thái, kích thước Hình dạng của sán lá gan lớn thay đổi phụ thuộc vào vật chủ

ký sinh, số lượng sán nhiễm và tình trạng dinh dưỡng của vật chủ [9, 29] Vì vậy,

chỉ dựa vào hình thái rất khó có thể xác định SLGL là Fasciola hepatica hay

Fasciola gigantica [9, 29] Phương pháp sinh học phân tử đã khắc phục được những

hạn chế của phương pháp hình thái Các kỹ thuật sinh học phân tử cho phép xác

định và phân biệt các loài Fasciola hepatica và Fasciola gigantica Một số kỹ thuật

đã được sử dụng để giám định và phân biệt Fasciola hepatica và Fasciola gigantica

là kỹ thuật đa hình của ADN nhân bản ngẫu nhiên (PCR- RADP), kỹ thuật đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (PCR -RFLP) [35] và kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp

cơ bản (PCR) kết hợp với so sánh giải trình tự gen thu được với ngân hàng gen [46]

Việc xác định loài sán lá gan lớn là cơ sở để lựa chọn, thực hiện các nghiên cứu tiếp theo nhằm tìm hiểu cơ chế bệnh sinh, nghiên cứu tạo ra các kít huyết thanh chẩn đoán, nghiên cứu thuốc điều trị, tình hình kháng thuốc… Qua đó góp phần quan trọng trong công tác phòng chống bệnh do sán lá gan lớn gây ra ở động vật và

ở người phù hợp với điều kiện của từng quốc gia, từng vùng lãnh thổ

Ở Việt Nam, việc xác định loài sán lá gan lớn gây bệnh ở người và động vật

đã được một số tác giả nghiên cứu [5, 22] Tuy nhiên, các nghiên cứu này chỉ dừng lại ở phân tích kích thước chiều dài, chiều rộng và việc xác định loài chỉ ở một vài đặc điểm cụ thể nên các kết luận đưa ra còn rất hạn chế Vì vậy, để có thêm những

dữ liệu về hình thái và sinh học phân tử để góp phần xác định loài sán lá gan lớn nhằm góp phần phòng chống bệnh do sán lá gan lớn gây ra cho động vật và người tại Việt Nam hiệu quả hơn, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Áp dụng hình thái học và sinh học phân tử trong định loại sán lá gan lớn tại một số tỉnh miền Bắc – Việt Nam” nhằm các mục tiêu: Xác định được loài sán lá gan lớn bằng sử dụng chỉ thị hình thái học và chỉ thị phân tử ITS-2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nhiễm sán lá gan lớn ở người và động vật

1.1.1 Bệnh sán lá gan lớn trên thế giới

Bệnh SLGL là một trong những bệnh ký sinh trùng quan trọng ở động vật ăn

cỏ và người Tác nhân gây bệnh thuộc giống Fasciola, họ Fasciolidae Loài sán lá

này được ghi nhận gây bệnh ở người từ thời kỳ đồ đá đến thời kỳ đồ sắt La Mã, khoảng từ 3.500 năm trước công nguyên đến 200 năm sau công nguyên, bằng sự phát hiện ra trứng SLGL trong các xác ướp Ai Cập thời các Pharaon Năm 1379, Jehan de Brie là người đầu tiên liên hệ nguồn gốc của bệnh trên cừu với một loài sán hay gặp ở cừu, sau đó được gọi là sán lá gan cừu Năm 1758, Carl von Linaeus

đã đặt tên cho loài sán lá gan cừu này là Fasciola hepatica [63] Vòng đời và tính chất gây bệnh cho người của F hepatica được làm sáng tỏ vào cuối thế kỷ 19 Năm

1856, Cobbold phát hiện ra F gigantica tại Nhật Bản F gigantica ít gây bệnh cho người hơn so với F hepatica, nhưng vòng đời, sự truyền bệnh, hình thái học, diễn biến lâm sàng, sự truyền nhiễm và điều trị của F gigantica tương tự như F

Âu, châu Mỹ, châu Á, châu Phi và châu Đại dương Tỷ lệ các trường hợp mắc bệnh

ở người ngày càng tăng tại 51 quốc gia của 5 lục địa [55] Một phân tích toàn cầu cho thấy bệnh do SLGL chỉ xuất hiện ở những vùng có mối liên hệ giữa bệnh ở động vật với bệnh ở người và vật chủ trung gian có các điều kiện thuận lợi để phát triển Một số nghiên cứu cho rằng, sự lưu hành bệnh do SLGL ở người không liên quan với bệnh do SLGL ở thú Ví dụ, ở Nam Mỹ, những vùng lưu hành cao (hyperendemic) và lưu hành vừa (mesoendemic) được tìm thấy ở Bolivia và Peru,

nơi vấn đề bệnh SLGL ở động vật ít quan trọng, trong khi ở các quốc gia như Uruguay, Argentina và Chile, bệnh sán lá gan chỉ lẻ tẻ hoặc mức độ vừa [55]

Ở châu Á, bệnh sán lá gan ở vật nuôi tập trung ở một số nước như: Thái Lan, I rắc, I ran, Trung Quốc, Việt Nam, Ấn Độ, Nê pan, Nhật Bản, Hàn Quốc và Phi líp pin Trong đó bệnh SLGL ở người được thông báo nhiều nhất ở I ran, đặc biệt ở tỉnh Gilan, khu vực gần biển Caspian Theo một thống kê, ở I ran đã có trên 10.000 trường hợp bệnh SLGL ở người xuất hiện rải rác Một số trường hợp bệnh SLGL ở người cũng đã được thông báo tại Nhật Bản, Hàn Quốc, Việt Nam và Thái Lan [55], [61]

Hậu quả SLGL gây ra cho người rất khác nhau Khi nang ấu trùng xuyên qua thành ruột hoặc tá tràng gây xuất huyết và viêm, giai đoạn này các tổn thương có thể gây triệu chứng không rõ rệt Quá trình ký sinh ở gan, SLGL gây tiêu hủy tổ chức gan lan rộng, gây chảy máu và phản ứng viêm, phản ứng miễn dịch Sán có thể vào đường mật và ở đây chúng có thể sống vài năm gây viêm nhiễm dẫn tới xơ hóa, dày lên và giãn rộng, có thể chảy máu đường mật [3, 29]

Đặc biệt SLGL có quá trình di chuyển lạc vị trí nên có thể gây bệnh ở các cơ quan ngoài gan Ở người, vị trí tổn thương ngoài gan thường gặp nhất là đường tiêu hóa [29] Các vị trí lạc chỗ khác được thông báo như: mô dưới da, tim, mạch máu, phổi và khoang màng phổi, não, hốc mắt, thành bụng, ruột thừa, tuyến tụy, lách, u vùng háng, cổ… [29] Ở các vị trí lạc chỗ, SLGL không bao giờ phát triển thành con trưởng thành [29] Các biểu hiện thông thường của tổn thương ngoài gan là do dấu vết di cư gây tổn thương mô dẫn tới viêm và xơ hóa Ở các vị trí ký sinh ngoài gan, SLGL có thể bị vôi hóa hoặc tạo thành dạng u hạt Nhìn chung bệnh ngoài gan

do SLGL hiếm gặp và khó chẩn đoán Bệnh thường được chẩn đoán tình cờ (trong khi phẫu thuật) hoặc khi SLGL có lối thoát để bò ra [29]

1.1.2 Bệnh sán lá gan lớn tại Việt Nam

Bệnh sán lá gan lớn ở trâu/bò

Tại Việt Nam, trường hợp đầu tiên của bệnh sán lá gan ở bò đã được báo cáo

vào năm 1938 bởi Houdemer Fasciola spp đã được tìm thấy trong một phạm vi

rộng lớn gồm trâu, bò, dê, hươu, nai Việc xác định bệnh SLGL ở động vật thông

thanh học Kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng ở các loài động vật khác nhau trong khoảng 2-60% Bằng chẩn đoán huyết thanh học, tỷ lệ nhiễm ở gia súc đã được tìm thấy là từ 50-89% [15] Tuy nhiên, tỷ lệ này chịu ảnh hưởng của tuổi động vật, các nghiên cứu về dịch tễ học của tuyến trùng và nhiễm trùng sán lá ở bò vàng

và bò sữa báo cáo tỷ lệ thấp, tương ứng là 22% và 28% [34] Nghiên cứu tại lò mổ trâu bò tại các tỉnh trong cả nước, các tác giả công bố tỷ lệ nhiễm sán ở gan từ 22 % đến 67% [34] Cũng nghiên cứu tại lò mổ, Anderson và CS (1999) thông báo rằng

hơn 66,7% gia súc bị nhiễm bệnh do Fasciola spp Và số lượng sán trong gan đã

được tìm thấy tỷ lệ thuận với độ tuổi của động vật [25] Có trường hợp hơn 200 con sán được tìm thấy trong gan nhiễm bệnh của gia súc 3 năm tuổi trở lên Thời gian

nhiễm bệnh do Fasciola ở bê non thường gặp là 3 đến 4 tháng tuổi [34] Tại Việt

Nam chưa có tài liệu nghiên cứu nào báo cáo về thiệt hại kinh tế do bệnh SLGL

Tại Quảng Nam, Nguyễn Khắc Lực và CS (2010) tiến hành nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm SLGL trên 245 trâu/bò bằng phương pháp tìm trứng trong phân Kết quả cho thấy, tỷ lệ nhiễm chung là 40,8% và tỷ lệ nhiễm SLGL ở trâu (43,2%) cao hơn ở bò (38,3%) Một nghiên cứu tương tự của Võ Thị Hải Lê (2010) tại Nghệ

An cho thấy, tỷ lệ nhiễm SLGL ở trâu là 61,6% và ở bò là 26,86% Theo các tác giả, tỷ lệ nhiễm SLGL ở trâu cao hơn ở bò là do đặc tính ưa ăn cỏ ngập nước của trâu, trong khi đó ở bò ít hơn Tỷ lệ nhiễm SLGL ở trâu/bò trong nghiên cứu của Nguyễn Khắc Lực (2010) [13] và Võ Thị Hải Lê (2010) [12] cao hơn của Lê Thị Tuyết và cộng sự (2009) [23] nghiên cứu tại Nam Định (35,3%) và cao hơn của Phạm Văn Lực và cộng sự (2006) [14] nghiên cứu tại Đắc Lắc (34,22%)

Bảng 1.1 Tỷ lệ nhiễm SLGL ở trâu/bò tại huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam [13]

Loài gia súc Tuổi (năm) Tổng số Số nhiễm Tỷ lệ %

Về tỷ lệ trâu bò nhiễm theo tuổi, theo hầu hết các nghiên cứu, ở cả trâu và

bò, tuổi càng cao thì tỷ lệ nhiễm càng cao (bảng 1) Theo Nguyễn Khắc Lực (2010), nhóm trâu/bò độ tuổi > 8 năm có tỷ lệ nhiễm cao nhất (50% ở trâu và 45,5% ở bò) [13] Giải thích về vấn đề này, các tác giả cho rằng tuổi trâu/bò càng cao thì sự tiếp xúc ngoại cảnh càng dài và cơ hội ăn phải nang ấu trùng SLGL (metacercaria) càng cao [12, 13] Hơn nữa, SLGL trưởng thành sống trong gan của trâu/bò tương đối dài (3 – 5 năm, thậm chí 10 năm)

Bệnh sán lá gan lớn ở người

Hai trường hợp đầu tiên của bệnh sán lá gan của con người tại Việt Nam khi chẩn đoán qua khám nghiệm tử thi, đã được báo cáo vào năm 1978 [6] Tính đến năm 2006, bệnh sán lá gan đã được chẩn đoán ở 4.585 bệnh nhân ở 47 tỉnh Năm

2012, Nguyễn Văn Đề và CS cho rằng có ít nhất 52 tỉnh có lưu hành bệnh do SLGL

và số người mắc bệnh lên tới trên 20.000 người [8] Tỷ lệ nhiễm SLGL cao tại các tỉnh miền Trung và Tây Nguyên như Quảng Nam, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên, Gia Lai [19] Trong khi đó tại các tỉnh miền Bắc, theo số liệu của Viện Sốt rét – KST – CT TƯ trong gần 3 năm (2009, 2010, tháng 4/2011) số ca bệnh được chẩn đoán SLGL đến khám và điều trị tại Viện chiếm 4,6%-8% tổng số bệnh nhân giun sán đều trị tại Viện Bệnh nhân các tỉnh miền Bắc mắc SLGL không nhiều như các tỉnh miền Trung và Tây Nguyên

Trước đây, một số tác giả cho rằng ở Việt Nam có lưu hành cả 2 loài SLGL

là F hepatica và F gigantica Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây sử dụng sinh học

phân tử để xác định loài SLGL ở cả người và động vật ở Việt Nam cho thấy chỉ có

một loài F gigantica [2, 16] Một số cho rằng nhiều mẫu sán ở Việt Nam có sự lai khác loài giữa F hepatica và F gigantica [17]

1.2 Đặc điểm sinh học của sán lá gan lớn

1.2.1 Phân loại sinh học

Theo Dunn (1978) và Soulsby (1982), sự phân loại của SLGL trong sinh giới như sau:

Ngành : Giun sán

Lớp : Giun dẹt

Dưới lớp : Lưỡng tính

Họ : Sán lá

Giống (chi) : Fasciola

Loài : Fasciola hepatica (Linnaeus, 1758)

Fasciola gigantica (Cobbold, 1885)

1.2.2 Hình thể sán trưởng thành

Theo Boray (1982) con sán lá trưởng thành F hepatica có dạng hình lá dẹt

(Hình 1.1 A), hình dạng đặc trưng cho các loài sán lá Kích thước từ 18 - 32 mm chiều dài và 7 - 14 mm chiều rộng Cơ thể của nó kéo dài về phía trước sau, đoạn cuối phía trước có dạng chóp nón, lan tỏa rộng về phía vai và hẹp dần về phía cuối sau, trên đó có giác miệng, phần giữa có thể có giác bụng Kích thước của giác bụng

và giác miệng xấp xỉ như nhau Ruột của con trưởng thành chia nhiều nhánh và nằm

ở nửa sau cơ thể Các buồng trứng tương đối nhỏ gọn nằm ngay phía trên tinh hoàn

và trứng được đổ vào tử cung Tử cung đổ vào lỗ sinh dục nằm ngay sau giác bụng Khi còn sống, sán có màu nâu xám, cơ thể phẳng thuôn dài, có viền màu tối bên

ngoài do manh tràng chứa đầy máu Hình thể của F gigantica có một số điểm khác biệt với F hepatica là kích thước thường dài hơn, trung bình 24 - 76 mm chiều dài

và 5 - 13 mm chiều rộng (Hình 1.1 B) [27] Ngoài ra, tỷ lệ phần đầu hình nón thì

nhỏ hơn của F hepatica và phần cơ thể của nó hình dạng giống chiếc lá hơn [29]

Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp rất khó phân biệt 2 loại này về mặt hình thái Tác giả Valero (1999, 2009) thấy rằng kích thước của chiều dài, chiều rộng cũng như khoảng cách của các giác miệng có sự thay đổi, phụ thuộc vào vật chủ ký sinh cuối cùng mà sán ký sinh [65, 67]

Sở dĩ trứng có kích thước khác nhau do SLGL tồn tại 2 thể: Nhị bội (diploid) và

tam bội (triloid) Trứng của Fasciola spp có thể phân biệt với các loài sán lá gan khác, đặc biệt là với các trứng lớn của sán Paramphistome Trứng SLGL có vỏ

màu vàng nâu với một nắp không rõ ràng và các tế bào phôi nằm bên trong Trong

khi đó ở Paramphistome, vỏ trứng có màu trong suốt, nắp rõ ràng và các tế bào

phôi sáng màu bên trong trứng Ngoài ra, trứng có một mấu nhỏ nằm phía sau của trứng [29, 21]

Hình 1.3 Hình thể trứng sán lá gan lớn

(Nguồn: http://www.med-chem.com/para-site.phpurl=org/fascgiga)

1.3 Chu kỳ phát triển của sán lá gan lớn

Theo các tác giả vòng đời của F hepatica và F gigantica kéo dài khoảng 14

– 23 tuần và yêu cầu qua 2 vật chủ Chu kỳ SLGL bao gồm 4 giai đoạn [27]

Giai đoạn đầu tiên (chu kỳ phát triển trong vật chủ):

Vật chủ bị nhiễm sán do ăn phải ấu trùng (metacercariae) SLGL giai đoạn lây nhiễm từ cỏ (đối với động vật), rau thủy sinh (người) và/hoặc uống phải nước

có nhiễm mầm bệnh Các ấu trùng thoát vỏ trong đường ruột và sau đó di chuyển tới gan và đường mật Trong tá tràng, ký sinh trùng bị vỡ nang ấu trùng và chui qua niêm mạc ruột vào khoang phúc mạc Các sán non vừa thoát ra không hấp thụ dinh dưỡng trong giai đoạn này, nhưng một khi nó tìm thấy nhu mô gan thì quá trình này bắt đầu Giai đoạn con sán chưa trưởng thành trong mô gan là giai đoạn gây bệnh, gây ra thiếu máu và dấu hiệu lâm sàng đôi khi quan sát thấy ở động vật

bị nhiễm bệnh Con sán di chuyển đến mô gan trong thời gian từ 5 – 6 tuần và cuối cùng tìm đường đến các ống mật Sau 3 – 4 tháng, phát triển thành con sán trưởng thành và đẻ trứng, được bài tiết vào trong mật và ruột Ở động vật một con sán trưởng thành có thể đẻ đến 25.000 đến 500.000 trứng/ngày, số lượng này sẽ được đào thải vào các đồng cỏ và môi trường Con sán trưởng thành có thể sống 9 – 14 năm trong vật chủ

Giai đoạn thứ 2 (chu kỳ phát triển trong môi trường nước ngọt): Trứng SLGL được bài tiết theo phân vật chủ (người hoặc động vật) ra ngoài môi trường Trong môi trường nước ngọt, trứng phát triển thành giai đoạn trùng lông (miracidium) Giai đoạn thứ 3 (chu kỳ phát triển ở vật chủ trung gian): Trong môi trường

nước ngọt, miracidia xâm nhập vào ốc vật chủ trung gian, ốc Lymnaea, phát triển

thành cercaria, và được thải loại qua phân ốc vào trong nước

Giai đoạn thứ 4 (chu kỳ trên thực vật thủy sinh): Ngay sau khi rời khỏi ốc, cercariae bơi ra hồ nước trong đồng cỏ, và nhanh chóng phát triển thành giai đoạn

ấu trùng nang (metacercariae) bám vào bề mặt thực vật thủy sinh, trong vòng 24 giờ Một số metacercariae không gắn với vật chủ nhưng vẫn có thể bơi trong nước

Từ đây, metacercariae bị động vật nhai lại ăn phải, hoặc trong một số trường hợp,

do con người ăn thực phẩm chưa nấu chín như cải xoong hoặc uống phải nước có ô nhiễm mầm bệnh (Hình 1.4)

Hình 1.4 Chu kỳ phát triển của sán lá gan lớn

ở Corsica [50]

1.4.2 Vật chủ trung gian

Theo tác giả Boray các yếu tố sinh học bao gồm ốc trung gian truyền bệnh và một môi trường thích hợp để SLGL phát triển là rất cần thiết [27] Theo Mas-Coma

và CS (2005) có nhiều loài ốc Lymnaeid với phân bố địa lý rộng lớn trên thế giới

[52, 49] Ở Australia vật chủ trung gian truyền bệnh SLGL quan trọng nhất là ốc

nước ngọt L tomentosa Tại Corsica, L truncatula là vật chủ trung gian truyền bệnh như ở châu Âu [57] Lymnaea là trung gian truyền bệnh không chỉ ở châu Âu mà có

cả ở Nam Mỹ [32] và người nhiễm quanh năm [50] Bắc Mỹ và vùng Thái Bình

Dương ốc trung gian truyền F hepatica và F gigantica chủ yếu là L collumella và

L viridis Vùng Trung Mỹ và Carribbean, Venezuela ốc truyền F hepatica là Fossaria cubensis Vùng Nam Mỹ ốc truyền F hepatica là L viatrix và L diaphana Vùng Địa Trung Hải chỉ có duy nhất L cailliaudi được tìm thấy dọc bờ

sông Nile Loài SLGL F gigantica thường gặp ở Triều Tiên, Iran, Ấn Độ, Nhật Bản Vật chủ trung gian truyền bệnh là loài ốc L truncatula và L viridis Ngoài ra,

F gigantica còn gặp ở Thái Lan, Malaysia, Singapore và Indonesia, loài ốc trung

gian truyền bệnh là L rubiginosa Cả 2 loài F gigantica và F hepatica đều gặp ở

Trung Quốc, Việt Nam, Lào, Cam pu chia và Phi líp pin Loài ốc trung gian truyền

bệnh F hepatica là L swinhoei, còn ốc L viridis truyền được cả 2 loài SLGL [69]

1.4.3 Vật chủ tình cờ

Người là vật chủ tình cờ của SLGL Khi ăn phải ấu trùng SLGL vào đường tiêu hóa, sau 1 giờ, ấu trùng thoát kén và xuyên qua thành ruột Sau 2 giờ xuất hiện trong ổ bụng, chúng tiếp tục vào gan và đến gan vào ngày thứ 6 và nằm trong nhu mô gan gây những ổ hoại tử lớn Nếu thích hợp, chúng có thể tồn tại ở người

từ 9 – 14 năm

Do người chưa là vật chủ thích hợp nên sán non có thể di chuyển xuống đại tràng, ra thành ngực, đến tuyến vú hoặc chui qua da, tạo những đường hầm dưới da trong quá trình di chuyển hướng ra ngoài Trên thế giới cũng đã từng ghi nhận những trường hợp sán chui cả xuống buồng trứng, tinh hoàn, màng phổi…

1.5 Các yếu tố nguy cơ của bệnh sán lá gan lớn

1.5.1 Thói quen ăn uống

Rau thủy sinh: Theo Mas-Coma (2009), động vật nhiễm SLGL do ăn phải

cỏ hoặc uống nước có nhiễm ấu trùng SLGL Người nhiễm khi họ ăn phải rau thủy sinh nhiễm metacercariae SLGL (cải xoong, rau muống nước, rau ngổ, ngó

sen…) trong một số trường hợp, rau cạn (như rau diếp, xà lách, húng,…) tưới bằng nước ô nhiễm

Nguồn nước ăn và sinh hoạt: Nguồn nước được xem như một yếu tố quan trọng tham gia vào đường lây truyền bệnh Tại các vùng dịch tễ bệnh SLGL, ấu trùng được tìm thấy trong các nguồn nước tự nhiên [56] Thói quen uống nước chưa đun sôi, hay bằng cách sử dụng dụng cụ rửa trong nước bị ô nhiễm hoặc có thể ăn gan chưa chín có nhiễm sán chưa trưởng thành [52]

1.5.2 Môi trường

Tại Bolivia Altiplano ở độ cao 4000 mét và với nguồn nước bẩn cũng tìm

thấy ốc L truncatula và xét nghiệm thấy có tới 13% ốc nhiễm ấu trùng SLGL [31] Trong thực nghiệm tỷ lệ phát triển của trứng F gigantica nuôi trong nước cất và

nước ao hồ là từ 80 – 96%, ở điều kiện nhiệt độ từ 27 – 35o

C, thời gian phát triển từ trứng đến metacercaria là 42 – 58 ngày, trong ốc vật chủ trung gian từ 31 – 40 ngày

[19] Tỷ lệ nhiễm ấu trùng F gigantica ở ốc L viridis và L swinhoei vào cuối mùa

khô khoảng giữa tháng 5 và tháng 7 là 0% Tuy nhiên, con số này vào cuối mùa mưa lại là 1,2 – 2,1% Tỷ lệ nhiễm này ở ốc là không khác biệt giữa miền núi, ven biển và đồng bằng [30] Tỷ lệ mắc bệnh ở động vật cao nhất tại các vùng chăn nuôi gia súc tập trung và chăn thả trên các cánh đồng cỏ

1.5.3 Tuổi và giới

Người nhiễm SLGL có thể tìm thấy ở hầu hết các độ tuổi Theo tác giả Nguyễn Văn Đề (2006) nhóm tuổi mắc bệnh nhiều nhất là từ 20 – 49 tuổi (69,5%) Tác giả Đặng Thị Cẩm Thạch (2008, 2010) cho rằng tỷ lệ mắc của nhóm tuổi này còn lên đến 80% Tuy nhiên một số trường hợp bệnh phát hiện ở trẻ còn rất nhỏ, có

1 ca bệnh mới 10 tháng tuổi (Phú Thọ) và 1 ca khác 12 tháng tuổi (Bắc Ninh) Năm

2005 trong số 285 bệnh nhân SLGL được theo dõi ở Hà Nội thì có tới 32 trẻ nhiễm bệnh Tại các tỉnh miền Trung Tây Nguyên, trong 2 năm (2006 – 2007) có 212 trẻ mắc bệnh SLGL được điều trị tại Quy Nhơn

Theo các tác giả, nữ giới mắc bệnh SLGL nhiều hơn nam đến hơn 2 lần [24, 4] Bệnh có tính chất gia đình [70]

1.6 Đặc điểm của bệnh do sán lá gan lớn

1.6.1 Đặc điểm lâm sàng

Bệnh cảnh của bệnh SLGL ở người được Chen và Mott mô tả tóm tắt từ những năm 1990 Con người được xác định không phải là vật chủ tự nhiên mà chỉ là vật chủ tình cờ của bệnh Các triệu chứng lâm sàng thường xuất hiện sau 2 tuần nhiễm nang ấu trùng và phụ thuộc vào số lượng sán ký sinh [29]

Bệnh SLGL được chia ra làm các thời kỳ: thời kỳ ủ bệnh (từ khi nang ấu trùng xâm nhập vào cơ thể đến khi xuất hiện triệu chứng lâm sàng đầu tiên); thời kỳ toàn phát (SLG di chuyển vào đường mật); thời kỳ bệnh tiềm tàng (sán trưởng thành và bắt đầu đẻ trứng); và thời kỳ tắc nghẽn hay mãn tính [29]

Thời kỳ ủ bệnh: triệu chứng của thời kỳ ủ bệnh rất thay đổi phụ thuộc vào số lượng ấu trùng xâm nhập và sự đáp ứng của cơ thể vật chủ Ở người, triệu chứng thời kỳ này thường không rõ ràng, thời gian có thể là vài ngày, 6 tuần, 2-3 tháng hoặc có khi dài hơn

Thời kỳ toàn phát: giai đoạn này kéo dài 2-4 tháng Các triệu chứng hình thành từ quá trình phá hủy tổ chức gan và phúc mạc từ sự di chuyển của ấu trùng, độc tố và hoạt động của các chất gây dị ứng Tại các vùng khu trú nhiễm SLG, các triệu chứng thường trùng lặp với các bệnh mãn tính hoặc cấp tính trên nền mãn tính

Vì vậy, giai đoạn cấp tính có thể kéo dài và gối vào giai đoạn tiềm tàng

1.6.2 Đặc điểm cận lâm sàng

Xét nghiệm máu [29]: Trong giai đoạn cấp tính, số lượng bạch cầu thường

tăng trên 10.000 đến 43.000/mm3 máu Số lượng bạch cầu ái toan luôn tăng trên 5%, có khi lên đến 83% Đây là một dấu hiệu gợi ý quan trọng khi kết hợp với tổn thương gan trên siêu âm Dấu hiệu thiếu máu thường gặp nhưng thường không nghiêm trọng Tốc độ máu lắng có thể tăng cao trong giai đoạn cấp tính, đạt giá trị

165 mm trong 1 giờ Trong giai đoạn tiềm tàng và mãn tính, máu lắng bình thường hoặc chỉ cao vừa phải

Xét nghiệm chức năng gan [29]: Các kết quả bất thường có thể được tìm ra

khi kiểm tra chức năng gan là:

Giai đoạn cấp tính: GOT, GPT, globulin và bilirubin tăng nhẹ trong hầu hết các trường hợp

Giai đoạn mãn tính: Vàng da được chứng minh bằng sự tăng cao bilirubin trong huyết thanh Tỷ lệ bilirubin huyết thanh từ 2,0 đến 8,6 mmol/l đã được báo cáo Nước tiểu màu vàng sẫm thường đi kèm với tăng GOT và globulin huyết thanh (chủ yếu là γ-globulin) thường tăng, trong khi albumin thì giảm

Chẩn đoán hình ảnh [29]: siêu âm cho thấy hình ảnh tổn thương gan là

những ổ âm hỗn hợp hình tổ ong hoặc có thể thấy hình ảnh tụ dịch dưới bao gan (Hình 1.5)

Hình 1.5 Tổn thương gan do sán lá gan lớn trên siêu âm

(Nguồn: www.benhgiunsan.com)

Chẩn đoán miễn dịch [29]: Kỹ thuật miễn dịch có ưu điểm là có thể chẩn

đoán nhiễm SLGL trong tất cả các giai đoạn của bệnh, đặc biệt trong giai đoạn cấp tính Kỹ thuật miễn dịch thường được sử dụng nhất là ELISA

Xét nghiệm phân [29]: Các xét nghiệm phân từ xét nghiệm trực tiếp đến tập

trung trứng bằng các cách khác nhau đã được sử dụng trong chẩn đoán bệnh sán lá gan ở người Kỹ thuật làm lắng để tìm trứng được chứng minh là ưu điểm hơn các phương pháp khác Cần xét nghiệm phân trong 3 ngày liên tiếp Chúng ta cũng có

thể lấy dịch mật để phát hiện sự có mặt của trứng

1.7 Tính đa dạng di truyền của Fasciola spp

1.7.1 Các yếu tố tác động đến đa dạng di truyền của Fasciola spp

Sinh học phân tử có ảnh hưởng sâu sắc trong hầu hết các lĩnh vực nghiên cứu sinh học Đến nay, trên thế giới các kỹ thuật của sinh học phân tử đã được

áp dụng trong các nghiên cứu về Fasciola spp với mức độ khác nhau Một số

nghiên cứu đã sử dụng các kỹ thuật của sinh học phân tử để sản xuất ra protein

của Fasciola spp nhằm mục đích tạo vacxin phòng chống bệnh do Fasciola spp

gây ra ở động vật và ở người Một số nghiên cứu khác lại sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để xác định được trình tự chuỗi ADN nhằm tìm hiểu tính đa

dạng di truyền của Fasciola spp [29]

Tính đa dạng di truyền trong một loài là nguyên liệu cơ bản để đánh giá tác động của môi trường đến quá trình tiến hóa của loài sinh vật đó Vì thế, nghiên cứu tính đa dạng di truyền rất cần thiết cho quá trình nghiên cứu tiến hóa của sinh vật

Fasciola spp là một ký sinh trùng được tìm thấy ở cả động vật có vú và động vật

thân mềm Trong thời gian ký sinh, ở các động vật có vú khác nhau có thể có sự

khác biệt lớn về môi trường sống Vị trí ký sinh của Fasciola spp trong quá trình ký

sinh cũng có thể thay đổi và ở các vị trí khác nhau trong cơ thể vật chủ và có những

đặc điểm môi trường cũng rất khác nhau (bình thường ở động vật nhai lại Fasciola

spp ký sinh ở đường tiêu hóa, khoang phúc mạc và nhu mô gan) Bên cạnh đó, ấu

trùng lông (miracidium) trong quá trình di chuyển tự do có thể ở trong các điều kiện môi trường hoàn toàn khác nhau trước khi tìm và lây nhiễm sang ốc Khi vào trong

ốc tạo các nang ấu trùng (sporocysts), lúc này chúng lại phải chịu những tác động mới của môi trường bên trong ốc Những yếu tố này tác động đến tính đa dạng di

truyền theo mỗi khu vực địa lý và tạo cho Fasciola spp có những đặc điểm riêng, bao gồm cả sức đề kháng của Fasciola [29]

Theo Dalton (1999), cơ chế tạo nên sự đa dạng ở Fasciola spp có thể xuất

hiện tương tự như những loài sinh vật khác, nhưng lại có một số điểm khác thường

có thể ảnh hưởng đến sự phát sinh tính đa dạng SLGL là sinh vật lưỡng tính, khả năng duy trì quần thể nơi chúng sống là rất lớn Ở đây, ký sinh trùng phân chia mạnh nhưng trong hoàn cảnh đó thì xu hướng di truyền quần thể đồng nhất đi kèm

Điều này sẽ làm phong phú thêm sản phẩm của ấu trùng rediae sau giai đoạn phân

chia vô tính trong ốc (hiện tượng đa phôi) Một ấu trùng lông có thể tăng sinh thành

600 ấu trùng đuôi Sự phân chia ấu trùng rediae, tính trạng lưỡng tính, tính đa phôi

và nhu cầu trong vòng đời của ký sinh trùng đan xen giữa 2 vật chủ để có thể giảm tính đa dạng di truyền Tuy nhiên, các yếu tố đó không làm ảnh hưởng đến những tác động chọn lọc tạo ra các quần thể đa dạng di truyền Những tác động chọn lọc

có thể được chia làm 2 nhóm:

- Nơi cư trú ở thú nuôi: Ở Fasciola, nếu hạn chế được các loài vật chủ trong

giai đoạn phát triển vòng đời của nó thì có thể được coi là những thuận lợi cho quá trình lây truyền mầm bệnh

- Hệ thống miễn dịch của vật chủ: Cả vật chủ trung gian và vật chủ chính có các hệ thống miễn dịch nhằm hạn chế quá trình lấy nhiễm Trong các quần thể có quan hệ xa lạ, ở đó sẽ có những biến đổi có hiệu quả cho những đáp ứng này

1.7.2 Vai trò của việc xác định loài và phân tích đa hình sán lá gan lớn

Năm 1995, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) thông báo phát hiện bệnh SLGL ở

65 quốc gia và vùng lãnh thổ với gần 180 triệu dân nằm trong vùng nguy cơ và có khoảng 2,4 triệu người dân nhiễm bệnh [70] WHO coi đây là bệnh cần được quan tâm trong chương trình sức khỏe cộng đồng và đã được nhiều quốc gia xếp vào vị trí quan trọng trong chiến lược và chính sách y tế

Bệnh SLGL (Fascioliasis) có thể gây ra những hậu quả nghiêm trọng cho cơ

thể người bệnh cả về thể chất lẫn tinh thần nếu không được chẩn đoán và điều trị sớm, đúng cách Bên cạnh đó, trong trường hợp sán di chuyển lạc chỗ có thể gây ra những dấu hiệu lâm sàng rất khó chẩn đoán và dễ nhầm với các bệnh lý khác Những lí do trên là nguyên nhân gây tổn thất rất lớn về sức khỏe cũng như kinh tế cho gia đình và xã hội

Phương pháp sinh học phân tử mà cụ thể là phương pháp PCR từ khi ra đời

đã tỏ ra ưu việt trong chẩn đoán và phân loại bệnh tật liên quan đến vi ký sinh Nhờ phương pháp này người ta có thể chẩn đoán chính xác tác nhân gây bệnh từ rất sớm, ngay cả khi bệnh tiềm tàng chưa biểu hiện triệu chứng Điều này giúp cho các nhà điều trị lựa chọn các biện pháp thích hợp, hiệu quả, ít tốn kém, góp phần ngăn chặn những hậu quả mà bệnh gây ra

Bên cạnh hỗ trợ chẩn đoán sớm căn nguyên gây bệnh, phương pháp PCR còn

có thể xác định được cấu trúc gen của sinh vật, qua đó giúp các nhà khoa học xác định được sản phẩm do gen đó tạo ra Trên cơ sở đó định hướng sản xuất kháng nguyên đặc hiệu sử dụng cho phương pháp chẩn đoán miễn dịch học [17]

SLGL Việt Nam được xác định là F gigantica có mặt ở cả 3 miền: Bắc,

Trung và Nam Các dữ liệu về hệ gen ty thể cũng như hệ gen nhân của SLGL Việt Nam còn rất hạn chế Chính vì vậy, việc xác định loài và phân tích một phần gen

của Fasciola spp gây bệnh từ các vùng địa lý sẽ góp phần nghiên cứu ký sinh

trùng ở Việt Nam dưới góc độ phân tử Qua đó có cơ sở tìm hiểu cơ chế bệnh sinh, sản xuất các kít chẩn đoán huyết thanh, nghiên cứu các loại thuốc, tình trạng kháng thuốc, vacxin giúp cho quá trình phát hiện, phòng chống bệnh này một cách

chỉ số hình thái có thể xác định và phân biệt các loài SLGL Các chỉ số cơ thể thường được sử dụng là chỉ số khối cơ thể (BR), kích thước chiều dài và chiều rộng thân, tỷ lệ giữa chiều dài và chiều rộng thân sán (BL/BW), giác miệng, giác bụng, buồng trứng, tinh hoàn và khoảng cách từ giác bụng đến cuối thân (VS-P) Theo một nghiên cứu của Periago và CS (2006), kết quả ở bảng sau [59]:

VS-P có sự khác biệt căn bản giữa F hepatica và F gigantica Một số khác lại cho

thấy các chỉ số này có một phần gối lên nhau Chính điều này gây rất nhiều khó khăn trong việc xác định loài sán bằng hình thái học

1.8.2 Phương pháp sinh học phân tử

1.8.2.1 Đặc điểm, vai trò hệ gen ty thể và hệ gen nhân trong giám định loài

Hiện nay hệ gen ty thể được sử dụng phổ biến để nghiên cứu về di truyền ở giun sán trong nghiên cứu phả hệ phân tử, xác định hệ thống phân loại và dịch tễ học [16] Các quần thể giun sán có khả năng đáp ứng với các tác động môi trường

và có quá trình chọn lọc tự nhiên, vì vậy không bắt buộc phải đồng nhất về mặt di truyền Việc sử dụng các phương pháp truyền thống để tìm ra những thay đổi qua

đó xác định bằng chứng tiến hóa của một loài nào đó nói chung khó thành công Sử dụng hệ gen ty thể có ưu điểm và được sử dụng nhiều hơn hệ gen nhân trong việc cung cấp những thông tin về bằng chứng tiến hóa của sinh vật [16]

Đặc điểm hệ gen nhân ribosomal DNA (rDNA)

Vùng gen ribosome (rDNA) là nhóm gen mã hóa rRNA của ribosome, có nhiều bản sao và không mã hóa cho bất kỳ protein nào Đây là vùng gen bảo tồn nên được xem là cơ sở chính xác để tìm ra sự tương đồng và khác biệt của các sinh vật cùng loài hay khác loài, đóng vai trò quan trong trong các nghiên cứu quá trình tiến hóa, phát sinh loài và phát hiện hiện tượng lai giữa các loài

Vùng gen rDNA chứa 5' external transcribed sequence (5' ETS), 18S rRNA,

ITS1, 5.8S rRNA, ITS2, 28S rRNA và 3' ETS Gen ITS-1 và ITS-2 (internal

transcribed spacer 1 and 2) với hai đầu biên là IGS (intergenic spacer là vùng kém

bảo tồn nhất của rDNA) (Hình 1.6) Vùng 5,8S – rDNA là vùng có kích thước rất nhỏ và ít có sự biến đổi [62] Vùng ITS - rDNA là vùng có rất nhiều biến đổi, mặc

dù chúng thường được sử dụng trong nghiên cứu tiến hóa của sinh vật tuy nhiên phần lớn các so sánh trên vùng này thường để xác định các biệt hóa trong cùng loài

để lập phả hệ di truyền [36] Các primer thiết kế trên những oligonucleotide có tính bảo tồn cao được sử dụng cho tất các sinh vật cùng loài nhằm khuếch đại các vùng tương đương dùng trong so sánh, tạo phả hệ di truyền Ngoài ra nhiều primer và probe cũng được thiết kế dựa trên các vùng không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh sinh vật [67]

Hình 1.6 Mô hình cấu trúc ribosome ADN của gen nhân [17]

Đặc điểm hệ gen ADN ty thể

ADN ty thể quy định tính di truyền theo dòng mẹ, có kích thước khoảng 16 -

30 kb, bao gồm 36 - 37 gen mã hóa cho sản phẩm protein và một số vùng không mã hóa cần thiết cho sự sao chép và phiên mã [43]

Ngoài các gen mã hóa protein, hệ gen ty thể ký sinh trùng và động vật còn có

2 gen RNA ribosome (rRNA) là 12S rRNA (hay rrnS) và 16S rRNA (hay rrnL), 22

gen RNA vận chuyển (tRNA) và một vùng không gen không mã hóa protein, có độ dài ngắn phụ thuộc vào từng loài động vật [26, 39, 43]

Với vị trí nằm trong tế bào chất, số lượng bản sao nhiều của ADN ty thể quy định những đặc điểm di truyền của ty thể [29], đó là: Di truyền theo dòng mẹ; tỷ lệ

ngưỡng: để biểu hiện một bệnh cần đòi hỏi ADN bị đột biến phải vượt qua một ngưỡng nào đó; các đột biến ADN ty thể ở tế bào sôma có liên quan đến tuổi tác

Những ưu điểm của hệ gen ty thể

Kích thước hệ gen ty thể nhỏ hơn so với hệ gen nhân tế bào, chứa đầy đủ các gen tối cần thiết cho hoạt động sống của tế bào nên DNA ty thể được coi là đối tượng để khảo sát sự biến đổi trong hệ gen về chẩn đoán, giám định, phân loại, dịch

tễ học và di truyền quần thể [43, 26]

Gen ty thể trong cùng loài hoặc có quan hệ dưới loài sinh học có tính bảo thủ rất cao nên bất kỳ sự thay đổi nhỏ nào cũng là giá trị được phản ánh trong giám định, phân loại và nghiên cứu di truyền học [33]

Hệ gen ty thể cung cấp nguồn dữ liệu quý giá về chỉ thị phân tử trong nghiên cứu về mối quan hệ giữa các loài và nội bộ loài trong giám định phả hệ

và dịch tễ học [71]

Ngoài ra, sự hiểu biết đầy đủ về hệ gen ty thể của ký sinh trùng còn có giá trị lớn trong chẩn đoán và phòng chống bệnh nhằm tìm kiếm các loại hóa chất, hóa dược đặc hiệu trong phòng và điều trị bệnh hoặc kiến tạo các loại vaccin thế hệ mới

[43, 39] Đã có nhiều hệ gen ty thể của các loại ký sinh trùng như giun đũa (Ascaris

suum), giun chỉ (Onchocerca), sán lá gan lớn (Fasciola hepatica, F gigantica), sán

lá gan nhỏ (Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini)… được giải mã và phân

tích cung cấp nguồn dữ liệu cần thiết cho nghiên cứu giám định, phân loại, phả hệ, quần thể ký sinh trùng [17]

Tính đến năm 1999, chưa có hệ gen ty thể hoàn chỉnh nào của sán dẹt được thông báo và đăng ký Chỉ sau đó chừng 2 năm, một loạt hệ gen ty thể hoàn chỉnh

và gần hoàn chỉnh đã được công bố, trong đó có 6 hệ gen ty thể của sán dẹt (5 của sán dây và 1 của sán lá) [17] Đến nay, đã có rất nhiều hệ gen ty thể hoàn chỉnh hoặc khá hoàn chỉnh của sán lá, sán dây gây bệnh ở người và động vật được công

bố như Paragonimus westermani, Schistosoma mansoni, S japonicum, S spindale,

Taenia crassiceps,T solium, T asiatica và T saginata [17]

Hệ gen ty thể của sán dẹt có cấu trúc và cách sắp xếp tương đối khác so với các động vật đa bào, đặc biệt về chiều dài, thành phần gen, hoặc cấu trúc của ARN vận chuyển và ARN ribosome Sán dẹt cũng giống giun tròn và một số ít động vật

đa bào khác là không có gen atp8 Trong tất cả các hệ gen ty thể của động vật đa bào được nghiên cứu cho đến nay thì hệ gen ty thể của sán dây (T crassiceps, T

asiatica, T solium) là nhỏ nhất (khoảng 13,5-13,7) [17]

Ở động vật nói chung và ở sán dẹt nói riêng, trật tự gen ty thể thường có tính

ổn định trong một thời gian dài của quá trình tiến hóa Sự khác nhau về trật tự gen giữa các thành viên trong cùng một họ rất hiếm, sự khác biệt đáng kể chỉ xảy ra ở mức phân loài lai như lớp hoặc ngành

Hệ gen ty thể của động vật có xương sống giàu AT (AT rich) thường chiếm

ưu thế Đặc điểm này cũng được ghi nhận ở các gen mã hóa protein ở một số sán

dẹt ký sinh Tuy nhiên, có sự không đồng nhất giữa các loài Ví dụ, ở sán dây T

crassiceps và tất cả các loài sán máng khác tỷ lệ AT trên 70% (ngoại trừ S mansoni 68,7%) Ở sán lá gan lớn F hepatica là 63,5% và ở sán lá phổi P westermani chỉ có 51,5% [17]

Các ARN vận chuyển ở sán dẹt nhìn chung giống với các động vật không

xương sống khác (ngoại trừ giun tròn Nematoda)

Đối với lớp sán lá (Trematoda) hệ gen ty thể được xác nhận là chỉ thị phân tử

thiết yếu trong công tác giám định, thẩm định loài [16] Trên thực tế, các gen

NAD1, COX1, COB thường được sử dụng để giám định và định loại các loài có họ

hàng gần gũi; các gen NAD3,16S, 12S, vùng không mã hóa thường được sử dụng

trong phân loại và so sánh biến đổi gen của các loài có họ hàng xa

Bên cạnh đó, các gen thuộc hệ gen nhân như các gen ribosome (18S, 28S, 58S) và vùng giao gen (ITS-1, ITS-2) thường được dùng trong phân tích phân loại Đáng lưu ý là ITS-1 và ITS-2 có mức độ biến đổi ngoại loài rất cao, khó có thể sử dụng để so sánh phân tích các loài khác giống, nhưng chúng lại là đối tượng lý tưởng trong nghiên cứu phả hệ nguồn gốc các chủng trong cùng loài hoặc cùng giống, nhất là hiện tượng nội bộ loài hay khác loài [16]

Sự khác nhau giữa số lượng của các cặp nucleotide của gen ITS-2 là một đặc

điểm để phân biệt giữa 2 loài F hepatica và F gigantica: Sự thiếu hụt 1 nucleotide

ở vị trí số 327 của vùng ITS-2 (Thymin, T) làm cho tổng số nucleotide của ITS-2

còn 361, cho phép xác định vùng ITS-2 đó sẽ thuộc về nhóm F gigantica và số

chéo ngược” của SLGL ký sinh trên người tại Việt Nam đã được khẳng định thông

qua thực hiện phân tích gen nhân ITS-2 và gen ty thể COX1 từ mẫu SLGL trưởng thành thu trên bệnh nhân người Nghệ An [11]

Các gen ty thể là cấu trúc di truyền theo dòng mẹ, do vậy, khi giám định các loài có khả năng lai hay trong vùng tạp lai ngoại loài, nhất thiết cần xem xét thêm chỉ thị hệ gen nhân (ví dụ ITS-2), vì gen nhân còn di truyền theo dòng bố Từ đó, việc phân tích dòng lai sẽ xác định được di truyền theo bố hay mẹ [16]

1.8.2.2 Các kỹ thuật sử dụng trong xác định và phân biệt 2 loài F hepatica

và F gigantica

Sự ra đời của sinh học phân tử giúp các nhà khoa học có thêm nhiều công cụ

để xác định một loài sinh vật hay phân biệt các loài sinh vật với nhau

Tại Việt Nam, nghiên cứu SLGL dưới góc độ phân tử đã được một số tác giả thực hiện từ năm 2002 Bước đầu, các nghiên cứu này đã giúp xác định loài SLGL gây bệnh ở nhiều điểm khác nhau trong cả nước Các công trình nghiên cứu sau này

bằng sinh học phân tử đã khẳng định loài F gigantica gây bệnh chủ yếu cho gia súc

ở Việt Nam [2, 22] Một số nghiên cứu khác sử dụng hệ gen nhân và hệ gen ty thể

đã cho kết luận SLGL gây bệnh trên người và trên động vật ở Việt Nam là F

gigantica có dạng lai với F hepatica [22] Các nghiên cứu trong nước chủ yếu sử

dụng các gen NAD1 [10], COX1 [1, 22] thuộc hệ gen ty thể và vùng ITS-2 thuộc hệ gen nhân trong giám định thành phần loài [22] Đối với Fasciola spp., nhiều công

cụ khác nhau đã được thiết kế để xác định và phân biệt giữa F hepatica và F

gigantica như: PCR cơ bản kết hợp với giải trình tự, multiplex PCR, SSCP-PCR,

LAMP, RFLP-PCR… Trong đó, PCR kết hợp với giải trình tự và RFLP-PCR là các công cụ thường được lựa chọn hơn cả [20]

1.9 Thuốc điều trị sán lá gan lớn tại Việt Nam

Điều trị bệnh SLGL chủ yếu là điều trị nội khoa và cần điều trị sớm có thể khỏi hoàn toàn Một số thuốc sử dụng để điều trị gồm:

Tricalabendazole: Là thuốc đặc hiệu trong điều trị SLGL ở người hiện nay Liều duy nhất 10 – 12mg/kg trọng lượng cơ thể kể cả giai đoạn cấp và mãn tính ở người So với các thuốc diệt sán khác thì thuốc này có tác động trên cả thể trưởng

thành và chưa trưởng thành Thuốc cũng dùng để điều trị thể cấp tính và mãn tính

bệnh sán lá ở cừu, bò và gia súc như SLGL (F hepatica, F gigantica) và sán lá phổi (Paragonimus westermani, Paragonimus khác)

Emetine hay dehydroemetine: Thuốc có tác dụng tốt nhưng thuốc này có nhiều tác dụng phụ nhất là cho người già, lại điều trị kéo dài Liều lượng: 1mg/kg cơ thể, dùng trong 10 ngày Do độc tính của thuốc nên hiện không sử dụng cho người

Bithionol: Thuốc có tác dụng diệt sán thấp, chỉ đạt 50%, liều lượng: 30 – 50mg/kg cơ thể, dùng cách nhật, trong 10 – 15 ngày, hoặc 30mg/kg cơ thể trong 5 ngày liền Hiện thuốc này cũng không sử dụng cho người

Artesunat: Tại Việt Nam thuốc đã được ứng dụng điều trị với liều Artersunate viên 4mg/kg cơ thể trong 10 – 14 ngày liên tục, theo đường uống, cho thấy có hiệu quả cao gần tương đương với thuốc Triclabendazole [48], nhưng chưa được áp dụng rộng rãi trên lâm sàng, cần phải nghiên cứu thêm

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Các mẫu trứng và sán lá gan lớn trưởng thành thu thập từ người và động vật tại các điểm nghiên cứu

2.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm khoa Ký sinh trùng và khoa Sinh học phân tử, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương

Mẫu thu trên người và động vật tại Hà Nội, Bắc Giang, Thanh Hóa, Nghệ

An, Nam Định

Thời gian nghiên cứu: Năm 2013 - 2014

2.2 Dụng cụ, trang thiết bị chung

Kính hiển vi Nikon E100 (Trung Quốc)

Kính hiển vi soi nổi Olympus S6 (Nhật)

Máy ly tâm Eppendorf Z233M2 (tốc độ 15000 vòng/phút)

Máy PCR Eppendorf Mastercycler

Máy chụp ảnh gel điện di BioDoc - It (hãng UVP, Mỹ)

Máy ổn nhiệt (Tempette Junior Techne)

Máy Vortex (Gyromax 737R Ameres Instrument)

Cân điện tử (Shinko DJ 2 kg/0,01 g, Nhật)

Hóa chất dùng nhuộm tiêu bản

Hóa chất dùng để tách chiết ADN của hãng QIAgen, Mỹ

Bộ kít tách mô: DNeasy Tissue Kit hãng QIAgen, Mỹ Ethanol 70% - 90% lạnh

Hóa chất dùng cho phản ứng PCR: dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP);

Taq-Polymerase (50 U/µl, Eurogentec, Searing, Belgium), Primer (hãng Takaza,

Nhật Bản); 10x PCR buffer

Sử dụng cặp mồi BD1 và BD2 (theo Mahami Oskouei và CS, 2011) để khuếch đại đoạn gen chứa ITS-2

Mồi BD1: 5’ GTC GTA ACA AGG TTT CCG TA 3’

Mồi BD2: 5’ TAT GCT TAA ATT CAG CGG GT 3’

Dung dịch nhuộm ADN: Ethidium bromide 10mg/ml

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

hình thái SLGL nghiên cứu

với SLGL trên thế giới

Đối chiếu, so sánh kết quả phân tích hình thái và trình tự

gen

Kết luận

Kỹ thuật làm tiêu bản cố định mẫu SLGL trưởng thành

Thu thập SLGL trưởng thành và trứng từ bệnh nhân và lò mổ ở các điểm nghiên cứu Các cá thể sán lá và trứng thu được sẽ được rửa chung trong nước muối sinh lí (NaCl 0,9%) 3-4 giờ để đẻ bớt trứng

Đặt sán lên lam kính sạch cố định bằng cồn 70°, phủ lá kính, cuốn chỉ và định hình trong cồn 70° trong 2 tuần trước khi nhuộm

Sán lá gan sau khi được cố định trong cồn 70° và thuốc nhuộm 15 – 30 phút cho đế nkhi có màu mận chín thì bỏ sán vào cồn axit

Để mẫu SLGL trong cồn axit từ vài giây đến 5 phút cho đến khi sán có màu hồng Quan sát bằng kính lúp để xác định xem các bộ phận bên trong sán đã rõ thì thôi Nếu chưa rõ thì phải để lại vào thuốc nhuộm

Làm trong: từ cồn axit chuyển sán lần lượt sang cồn 80° rồi 90° - 96° từ 10 –

15 phút đối với mỗi loại cồn Sau đó để giữ sán trong dung dịch xylen

Gắn gôm, đặt lá kính lên sán (tùy theo độ dày của sán) để gắn chặt sán giữa lam và lá kính

Sau đó được định loại bằng dấu hiệu hình thái đến giống hoặc loài theo khóa định loại và mô tả có sẵn của Urquhart (1996) và bảo quản trong cồn ethanol 70% cho tới khi tách chiết ADN tổng số [63]

Dựa vào khóa phân loại, căn cứ vào hình thái và kích thước chiều dài, chiều rộng thân, giác miệng, giác bụng, buồng trứng, tinh hoàn của con SLGL được xác

định thuộc loài F gigantica (Cobbold, 1885), F hepatica, giống Fasciola

(Linnaeus, 1785), họ Fasciolidae (Railliet, 1895), bộ Fasciolida (Skrjabin et Schulz, 1937)

Dựa vào khóa định loại hình thể trứng SLGL theo Skrjabin và CS (1977) và Nguyễn Thị Lê và CS (1996)

Các chỉ số hình thể SLGL trong nghiên cứu này bao gồm: Chiều dài (BL), chiều rộng (BW), kích thước giác bụng (VS), kích thước giác miệng (OS), chiều rộng cổ sán (CW), chiều dài đầu sán (CL), khoảng rộng tinh hoàn (TW), khoảng độ dài tinh hoàn (TL), khoảng cách giác bụng đến cuối thân (VS – P), khoảng cách từ giao điểm của tuyến hoàng thể đến cuối thân (Vit – P)

Hình 2.2 Các chỉ số của sán lá gan lớn trưởng thành [51]