Mẫu của 38 người được chia thành 2 nhúm: nhúm cú mẫu bỡnh thường: thấy rừ 3 nhúm tế bào lympho, mono, bạch cầu hạt trờn cửa sổ FSC, SSC.. Với nhúm tế bào bỡnh thường cú sự tương quan tốt
Trang 1Chiến l−ợc sử dụng kháng thể để định tỷ lệ
phần trăm TCD4, TCD8 một cách chính xác và rẻ tiền
Trần Khiên Hùng
Phòng Miễn dịch tế bào, Viện Pasteur tp Hồ Chí Minh
Nghiờn cứu nhằm xõy dựng cho Labo miễn dịch một chiến lược dựng khỏng thể để định
tỷ lệ % TCD4, % TCD8 một cỏch chớnh xỏc và rẻ tiền Mẫu của 38 người được chia thành 2
nhúm: nhúm cú mẫu bỡnh thường: thấy rừ 3 nhúm tế bào lympho, mono, bạch cầu hạt trờn
cửa sổ FSC, SSC Và nhúm cú mẫu bất thường: khụng thấy rừ 3 nhúm tế bào như trờn
Hai bộ khỏng thể được sử dụng:
Với phương phỏp 4 màu: CD3 (FITC)/CD8 (PE)/CD45 (PerCP)/CD4 (APC) và với
phương phỏp 3 màu: CD4 (FITC)/CD3 (PE)/CD8 (PerCP)
Giỏ trị % TCD4, %TCD8 của từng mẫu được ghi nhận ở cả 2 phương phỏp
Dựng phần mềm Excell để xỏc định hệ số tương quan ở cả 2 phương phỏp của cỏc mẫu
nghiờn cứu
Kết quả:
+ Trong nhúm tế bào bỡnh thường hệ số tương quan giữa PP 4 màu và PP 3 màu đối
với:
* TCD4: r = 0.96
* TCD8: r = 0.87
+ Trong nhúm cú tế bào bất thường hệ số tương quan giữa PP 4 màu và PP 3 màu đối
với
* TCD4: r = 0.66
* TCD8: r = 0.57
Với nhúm tế bào bỡnh thường cú sự tương quan tốt giữa hai phương phỏp 3 và 4 màu
và chỳng ta cú thể xử dụng phương phỏp 3 màu để định tỷ lệ % TCD4, % TCD8 với độ chớnh
xỏc khụng kộm gỡ đối với phương phỏp 4 màu Điều này dẫn chúng tụi đến một chiến lược:
Trước tiờn dựng phương phỏp 3 màu Nếu cú gỡ bất thường xảy ra lỳc xử lý mẫu (cũn nhiều
hồng cầu sau khi ly giải), lỳc chạy mẫu (thấy nhiều mảnh vụn) thỡ mới chuyển sang phương
phỏp 4 màu
I ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong lõm sàng việc đỏnh giỏ tỷ lệ %
của lympho TCD4, TCD8 cú một giỏ trị thực
tiễn vỡ đối với HIV/AIDS thỡ nú giỳp xỏc định
bệnh nhõn nhiễm HIV đang ở giai đoạn
nào? Cú chỉ định dựng thuốc ức chế men
sao chộp ngược chưa? Hiệu quả của việc
điều trị bằng thuốc hay những liệu phỏp
khỏc như thế nào? [1]
+ Đối với bệnh nhõn ghộp cơ quan thỡ việc theo dừi định kỳ cỏc tỷ lệ này giỳp ta
dự bỏo đến tỡnh trạng thải ghộp [2]…
Trong thực tế để làm được việc này, chỳng ta cú nhiều chọn lựa khỏc nhau về cỏch thức xử lý mẫu, loại khỏng thể sử dụng, cỏch thức phõn tớch …, tuy nhiờn trong phạm vi nghiờn cứu này chỳng tụi tập
Trang 2trung vào việc lựa chọn kháng thể để làm
xét nghiệm
Với 2 loại kháng thể sau tương ứng với
phương pháp 4 màu, 3 màu
+ CD3 (FITC)/CD8 (PE)/CD45
(PerCP)/CD4 (APC) {4 màu}
+ CD4 (FITC)/CD3 (PE)/CD8 (PerCP) {3
màu}
Thì độ chính xác của thử nghiệm và giá
cả cũng khác nhau
Loại đầu tiên giá cho mỗi mẫu thử là
19.12 USD (theo khuyến cáo xử dụng của
hãng- báo giá ngày 21- 05- 2002) và nó
chính xác hơn loại kế tiếp nếu được kết
hợp với phương pháp phân tích đúng…(1)
Loại thứ hai thì giá tiền cho mỗi mẫu thử
chỉ có 6.44 USD nhưng kém tin cậy hơn
Mục đích nghiên cứu là nhằm đưa ra được
chiến lược xử dụng kháng thể như thế
nào để đảm bảo tính chính xác và rẻ tiền
trong việc xác định tỷ lệ % CD4, CD8
II VËt liÖu vµ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1 Vật liệu và đối tượng nghiên cứu:
- Ống chống đông bằng EDTA- TRI K cung cấp bởi LMD Paris
- Ống nghiệm 5ml, cỡ 12 x 75mm do hãng BD cung cấp
- Kháng thể của BD:
+ PP 4 màu: CD3 (FITC)/CD8 (PE)/CD45 (PerCP)/CD4 (APC)
+ PP 3 màu: CD4 (FITC)/CD3 (PE)/CD8 (PerCP)
- Dung dịch ly giải hồng cầu
- Máy FASCalibur của BD
- Phần mềm Cellquest, Excel
- Mẫu nghiên cứu gồm 38 người lấy từ những người thấy rõ 3 nhóm quần thể lympho, mono, bạch cầu hạt ở cửa sổ FSC, SSC theo quy định của chúng tôi, trong nghiên cứu này gọi là nhóm bình thường và ngược lại là nhóm bất thường
LYMPHO
MONO
BC HAT
Hình 1: Nhóm bình thường và nhóm bất thường
A Nhóm bình thường thấy rõ 3 nhóm
dân số lympho, mono, bạch cầu hạt ở cửa
sổ FSC, SSC
B Nhóm quần thể bất thường không thể
xác định chính xác vị trí các nhóm
C Cũng là mẫu của nhóm quần thể bất
thường nhưng được ủ với loại kháng thể 4
màu và dùng cách xử lý khác Nên sau đó
cũng phân biệt các nhóm quần thể tế bào như ở hình 1- A
2 Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu:
+Xử lý mẫu:
*1 ml máu tươi chống đông bằng EDTA được xử lý trong vòng 4 giờ
Trang 3*Với PP 4 màu: ủ 5 µl kháng thể CD3
(FITC)/CD8 (PE)/CD45 (PerCP)/CD4 (APC)
với 100 µl máu toàn phần
*Với PP 3 màu: ủ 9 µl kháng thể (3 µl
cho mỗi loại) CD4 (FITC)/CD3 (PE)/CD8
(PerCP) với 100 µl máu toàn phần
*Hồng cầu bị ly giải bằng 1 ml dung dịch
ly
*Trung hòa bằng 1ml dung dịch PBS
*Ly tâm 2000 rpm/1’ trong vòng 4 phút
Bỏ dịch nổi, thêm vào 500 µl dung dịch
PBS, lắc đều và các tế bào được phân tích
sau đó bằng máy FASC
+Mẫu được chạy bằng máy FASCalibur,
sản phẩm của hãng BD (Hoa Kỳ)
*Máy có 2 đèn laser
- Xanh: cung cấp ánh sáng ở bước sóng
488 nm
- Đỏ: cung cấp ánh sánh ở bước sóng
620 nm
*Có 6 cảm thụ quan nhận cảm ánh sáng phát xạ và những cảm thụ quan này cho ta biết được:
- FSC: hình thái của tế bào
- SSC: cấu trúc của tế bào
- Fl1:bắt màu huỳnh quang FITC
- Fl2:bắt màu huỳnh quang PE
- Fl3:bắt màu huỳnh quang PerCP
- Fl4:bắt màu huỳnh quang APC
+ Mẫu được phân tích bằng sơ đồ chạy trong chương trình Cellquest
% TCD4, TCD8 được xác định như sau:
+ Đối với phương pháp 4 màu CD3 (FITC)/CD8 (PE)/CD45 (PerCP)/CD4 (APC)
R1
R2
UR UL
LR
LR
LYMPHO
Hình 2: Xác định tỷ lệ % TCD4, TCD8 bằng phương pháp 4 màu
Trang 4A Dùng cửa sổ (x=SSC, y=Fl3:CD45)
giới hạn bạch cầu trong khu vực R1 Loại
trừ tất cả những yếu tố gây nhiễu như hồng
cầu, xác tế bào… ra khỏi khu vực phân
tích
B Cửa sổ (x=FSC, y=SSC) bắt nguồn
từ vùng R1 Thấy rõ 3 nhóm dân số và giới
hạn vùng lympho trong khu vực R2
C Cửa sổ (x=fl1:CD3, y=fl2:CD8) bắt
nguồn từ hội vùng R1 và R2 để biết được
quần thể T CD8 ( CD3+, CD8+) và phối hợp với phần mềm thống kê Biết được tỷ
lệ % T CD8 trong vùng UR của cửa sổ
D Cửa sổ (x=fl1:CD3, y=fl4:CD4) bắt nguồn từ hội vùng R1 và R2 để biết được quần thể T CD4 ( CD3+, CD4+) và phối hợp với phần mềm thống kê Biết được tỷ
lệ % T CD4 trong vùng UR của cửa sổ + Đối với phương pháp 3 màu CD4 (FITC)/CD3 (PE)/CD8 (PerCP):
Sample ID: 210802/42856 Acquisition Date: 21-Aug-02 Gated Events: 10102 Total Events: 55255 Quad Events % Gated % Total
UL 1356 13.42 2.45
UR 3450 34.15 6.24
LL 2707 26.80 4.90
LR 2589 25.63 4.69
R1
UR
UR
Hình 3: Xác định tỷ lệ % TCD4, TCD8 bằng phương pháp 3 màu
A Dùng cửa sổ (x=FSC, y=SSC) để
phân biệt 3 nhóm quần thể và giới hạn
lympho trong vùng R1
B Cửa sổ (x=fl1:CD4, y=fl2:CD3) bắt
nguồn từ vùng R1 để biết được quần thể T
CD4 (CD3+, CD4+) và phối hợp với phần
mềm thống kê Biết được tỷ lệ % TCD4
trong vùng UR của cửa sổ
C Cửa sổ (x=fl2:CD3, fl3:CD8) bắt nguồn từ vùng R1 để biết được quần thể TCD8 (CD3+, CD8+) và phối hợp với phần mềm thống kê Biết được tỷ lệ % TCD8
trong vùng UR của cửa sổ
D Giới thiệu kết quả truy xuất của phần mềm thống kê % gated của vùng UR là phần chúng ta quan tâm Mỗi một cửa sổ
sẽ có một kết quả truy xuất thích hợp
Trang 53 Phương phỏp thống kờ:
+ Giỏ trị % TCD4, TCD8 của từng mẫu
được ghi nhận ở cả 2 phương phỏp 3, 4
màu
+ Đối tượng nghiờn cứu được chia
thành 2 nhúm:
*Nhúm bỡnh thường (hỡnh 1- A)
*Nhúm bất thường (hỡnh 1- B)
+Dựng phần mềm Excell để xỏc định hệ
số tương quan ở cả 2 phương phỏp cho 2
nhúm đối tượng
III KẾT QUẢ
+ Trong nhúm đối tượng bỡnh thường hệ
số tương quan giữa phương phỏp 4 màu
và phương phỏp 3 màu đối với:
* TCD4: r = 0.96
* TCD8: r = 0.87
+ Trong nhúm đối tượng bất thường hệ
số tương quan giữa phương phỏp 4 màu
và phương phỏp 3 màu đối với:
* TCD4: r = 0.66
* TCD8: r = 0.57
IV BÀN LUẬN
Trong nhúm dõn số bỡnh thường, cú sự
tương quan tốt giữa 2 phương phỏp Đặc
biệt tốt đối với quần thể T CD4, điều này dễ
hiểu vỡ thực chất quần thể TCD4 là quần
thể tỏch biệt rừ giữa nhúm dõn số õm tớnh
(khụng cú CD4 ở bề mặt tế bào) và nhúm
dõn số dương tớnh (cú CD4 ở bề mặt tế
bào) Trỏi lại với quần thể T CD8 lại là quần
thể liờn tục, khú thấy ranh giới giữa 2 nhúm
dõn số õm và dương Vỡ thế trong phõn tớch
đối với dõn số TCD8, chỳng ta khú loại trừ
hết những tớn hiệu nhiễu do đú sẽ cú sai số
giữa 2 phương phỏp [1]
Cũn trong nhúm bất thường thỡ sự
tương quan kộm hơn nhiều
Hàm ý rằng chỳng ta cú thể sử dụng
phương phỏp 3 màu để định tỷ lệ % TCD4,
T CD8 với độ chớnh xỏc khụng kộm gỡ đối
với phương phỏp 4 màu và điều này chỉ
giới hạn trong nhúm dõn số bỡnh thường
Một yếu tố rất quan trọng, theo thống kờ của chỳng tụi tại viện Pasteur TP.HCM từ 4- 2002 đến 2- 2003 Cú khoảng 1581 trường hợp làm % TCD4, %TCD8, trong đú chỉ cú 8 trường hợp bất thường (với tỷ lệ tương ứng < 0.51%, một tỷ lệ rất thấp) Bất thường cú nghĩa là hồng cầu khụng ly giải hoàn toàn, cũn nhiều mảnh vở tế bào…
trong mẫu cần phõn tớch Chỳng tụi đó thử bằng nhiều cỏch như tăng thể tớch dung dịch ly giải, ly giải lập đi lập lại nhiều lần…
đều khụng thể loại trừ được hết hồng cầu
ra khỏi mẫu
Trong những trường hợp bất thường như thế, xử dụng phương phỏp 4 màu và dựng CD 45 để loại trừ hồng cầu, mảnh vở
tế bào để định tỷ lệ % TCD4, TCD8 thỡ chớnh xỏc hơn phương phỏp 3 màu Vỡ với phương phỏp 3 màu chỳng ta khụng thể nào loại trừ được cỏc yếu tố gõy nhiễu kể trờn
Từ nghiờn cứu trờn, hiện nay chỳng tụi
cú chiến lược dựng khỏng thể như sau:
Trước tiờn dựng phương phỏp 3 màu
Nếu cú gỡ bất thường xảy ra lỳc xử lý mẫu (cũn nhiều hồng cầu sau khi ly giải), lỳc chạy mẫu (thấy nhiều mảnh vụn)… thỡ lập tức chỳng tụi chuyển sang phương phỏp 4 màu
V Kết luận Kết quả nghiên cứu cho chúng tôi có các kết luận về chiến lược sử dụng kháng thể trong việc xác định tỷ lệ % TCD4 và TCD8
Đầu tiên chỉ cần dùng phương pháp 3 mầu với bộ kháng thể CD4/CD3/CD8 Nếu có tế bào bất thường mới chuyển sang phương pháp 4 màu với bộ kháng thể CD3/CD8/CD45/CD4 Tỷ lệ đối tượng có tế bào bất thường của chúng tôi thấp (<0,51%)
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.Marilyn A Owens, Michael R Loken
Principles for clinical laboratory practice
Wiley- Liss 73- 108
Trang 62.Carl A Burtis, Edward R Ashwood; Tietz
Textbook of Clinical Chemistry, Part 3;
W B Saunders Company; p1338
Summary The strategy use antibodies for quantity the
low- cost
The samples were obtained from the 38 peoples that can be divided in two groups:
+ Normal samples group: can see clearly three populations (lymphocyte, monocyte, granulocyte) on the window SSC, FSC
+ Abnormal samples group: can’t difference those populations
There are two types of antibodies used for each method
+ 4 colors method: CD3 (FITC)/CD8 (PE)/CD45 (PerCP)/CD4 (APC)
+ 3 colors method: CD4 (FITC)/CD3 (PE)/CD8 (PerCP)
Obtained results: shown that the correlation coeficients of the % TCD4 and TCD8 between two methods were:
+ With normal samples:
* TCD4: r = 0.96
* TCD8: r = 0.87
+ And with abnormal samples:
* TCD4: r = 0.66
* TCD8: r = 0.57
It means that we can use 3 colors method to quantify a accurately the % of TCD4 and TCD8
