CHIẾT XUẤT, XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG POLYPHENOL VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HOÁ CỦA CÁC MẪU BỘT CHIẾT LÁ DÂU Phạm Thiện Ngọc, Lê Ngọc Liễn Bộ môn Hoá sinh - Trường Đại học Y Hà Nội.. Hàm
Trang 1CHIẾT XUẤT, XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG POLYPHENOL VÀ
ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HOÁ CỦA
CÁC MẪU BỘT CHIẾT LÁ DÂU
Phạm Thiện Ngọc, Lê Ngọc Liễn
Bộ môn Hoá sinh - Trường Đại học Y Hà Nội
t
l
Đã có một số nghiên cứu trên thế giới đánh giá về tác dụng quý có thể áp dụng trong sinh y học của lá dâu Cây dâu được trồng phổ biến ở nước ta để lấy lá nuôi tằm, nhưng chưa có nghiên cứu khoa học nào
về chiết xuất, xác định lượng polyphenol, tác dụng chống oxy hoá của lá dâu Mục tiêu: (1) Chiết xuất và
xác định hàm lượng polyphenol lá dâu (2) Đánh giá khả năng chống oxy hoá của các mẫu bột chiết lá
dâu Đối tượng và phương pháp: Dùng 5 loại dung môi methanol 100%, methanol 75%, n - hexan
100%, ethylacetat 100% để chiết xuất tạo bột lá dâu Hàm lượng polyphenol trong các mẫu bột chiết được xác định bằng phương pháp đo quang đơn giản dùng ferrous sulphate Sử dụng acid linoleic đánh giá khả
năng chống oxy hoá in vitro của các mẫu chiết xuất Kết quả: (1) Methanol 75% cho hiệu xuất chiết xuất
bột lá dâu cao nhất (3,9%), trong đó lượng polyphenol chiếm 2,62% Xác định hàm lượng polyphenol trong mẫu chiết xuất bằng phương pháp Ferrous sulphat cho kết quả chính xác hơn phương pháp dùng thuốc thử folin (2) Ở ngày thứ 7 và 12, acid linoleic với sự có mặt của các mẫu bột chiết lá dâu chỉ bị
peroxy hoá từ 15% tới 42,2%, trong khi ở mẫu đối chứng bị peroxy hoá là 100% Kết luận: (1) Lá dâu có
chứa polyphenol và Ferrous sulpha là phương pháp đơn giản, tin cậy để xác định hàm lượng polyphenol trong mẫu chiết xuất (2) Bột chiết lá dâu từ 5 loại dung môi trên đều có khả năng chống oxy hoá và tốt nhất là bột chiết bằng methanol 75%
Từ khoá: Lá dâu, polyphenol, acid linoleic, peroxy hoá
I ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây dâu được trồng khá phổ biến ở nước ta để
lấy lá nuôi tằm, lấy tơ dệt vải Lá dâu và các bộ
phận khác của cây dâu còn được dùng để chữa
một số bệnh, làm mỹ phẩm bảo vệ và làm đẹp da
[5,6] Trái dâu ngâm rượu làm thức uống khai vị
kích thích ăn ngon Lá dâu là loại thảo dược dễ
tìm, giá thành rẻ, không độc, rất phù hợp với đời
sống kinh tế và nhu cầu chữa bệnh của người dân
nước ta [1]
Gần đây các công trình nghiên cứu của một số
tác giả Nhật Bản, Trung Quốc cũng chứng minh lá
dâu có nhiều tác dụng quí có thể áp dụng trong
sinh y học như: làm hạ Glucose máu, chống oxy
hóa [3], hạn chế rối loạn lipid máu [2] Hiện nay ở
nước ta chưa có nghiên cứu nào về lá dâu, chúng
tôi tiến hành đề tài này nhằm mục tiêu:
1 Chiết xuất và xác định hàm lượng
polypheno từ lá dâu sử dụng một số dung
môi khác nhau
2 Đánh giá khả năng chống oxy hoá của
các mẫu dịch chiết lá dâu.
II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1 Đối tượng
1.1 Chất liệu
Nguyên liệu nghiên cứu là lá dâu (Morus alba
L thuộc họ Moraceae) được thu hái vào cuối tháng 11 năm 2004 tại xã Tam Giang, huyện Yên Phong, tỉnh Bắc Ninh
1.2 Hóa chất
- Ethylgallate, ferrous sulfate, postasium sodium tartrate tetratrydrat, phosphate buffer sodium, acid linoleic, polyphenol chè xanh, folin ciocalteau phenol
- n - hexan, aceton, ethylacetat, methanol, ethanol
- Acid linoleic (Nhật bản)
- Sunphenon 100S của công ty Taiyokagaku (Nhật Bản) chứa 68,5% polyphenol
- Acid galic
Trang 2ị
l ị
1.3 Trang th ết bị
- Bộ cất quay chân không của hãng Buchi
(Thụy Sĩ)
- Quang kế photometer 4010 (Đức)
- Quang phổ kế Optizen 2120 UV (Hàn Quốc)
2 Phương pháp nghiên cứu
2.1 Chiết xuất tạo d ch chiết cô đặc
Lá dâu sau khi thu hái được xử lý sơ bộ và
được chiết xuất các thành phần có hoạt tính bằng
5 loại dung môi
Mẫu 1: 50g bột lá dâu + 200ml n - Hexan 100%
Mẫu 2: 50g bột lá dâu + 200ml Ethyl axetat 100%
Mẫu 3: 50g bột lá dâu + 200ml Aceton 100%
Mẫu 4: 50g bột lá dâu + 200ml Methanol 100%
Mẫu 5: 50g bột lá dâu + 200ml Methanol 75%
Chiết xuất 2 lần và dịch chiết của các mẫu
được cô đặc ở áp suất và nhiệt độ thấp
2.2 Định lượng polypheno d ch chiết
Polyphenol dịch chiết lá dâu được xác định
bằng 2 phương pháp Ferrous sulphate và phương
pháp dùng thuốc thử Follin Biểu đồ chuẩn được
xây dựng bằng acid galic [5] Nồng độ polyphenol
trong các mẫu chiết xuất được tính toán theo nồng
độ polyphenol chuẩn có trong sản phẩm sunphenon 100S
2.3 Đánh giá khả năng chống oxy hóa của các mẫu chiết lá dâu
Khả năng chống oxy hoá của các mẫu chiết lá dâu được xác định qua việc bảo vệ acid linoleic khỏi bị tác động oxy hoá [4] qua thực nghiệm sau
- Tạo các nhóm hỗn hợp ủ: quá trình peroxy hóa acid linoleic được thực hiện trong 7 ống nghiệm (kể cả ống chứng) Mỗi ống chứa 0,8 ml acid linoleic 2,5% ; 1,6 ml đệm phosphat pH 7,0 ; 0,8 ml nước cất và 1,8 ml mỗi mẫu dịch chiết 0,001% (ống chứng được thay bằng 1,8 ml ethanol 96o Các ống nghiệm được nút kín, tránh ánh sáng, ở 400C
- Thực hiện phản ứng xác định mức độ peroxy hoá của các mẫu ở các thời điểm: Trước khi tạo hỗn hợp phản ứng, ngày thứ 7, ngày thứ 12 sau khi tạo hỗn hợp phản ứng Mức độ peroxy hoá acid linoleic được xác định bằng phản ứng màu với hỗn hợp sau: dịch các ống nghiệm ở trên (0,05ml), Ethanol 750 (4,85ml), NH4SCN 30% (0,05ml), FeCl2 0,02M/HCl 3,5% (0,05ml) Lắc đều, đúng 3 phút sau đo mật độ quang học các mẫu thí nghiệm so với ống trắng (Ethanol 750) ở bước sóng 500nm
III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1 Kết quả chiết xuất tạo dịch chiết cô đặc
Từ 50g lá dâu khô chiết xuất bằng 5 loại dung môi khác nhau, kết quả như sau:
Chiết bằng n - Hexan 100% Lượng bột thu được: 0,09g
Chiết bằng Ethylacetate 100% 1,56g
Chiết bằng Methanol 100% 1,75g
Chiết bằng Methanol 75% 1,94g
Như vậy lượng bột chiết thô thu được khi chiết bằng Methanol 75% là lớn nhất
2 Hàm lượng polyphenol trong lá dâu
Qua mẫu polyphenol chuẩn, chúng tôi thấy phương pháp xác định hàm lượng polyphenol trong dịch chiết bằng thuốc thử ferrous sulphate có độ xác thực cao hơn hẳn phương pháp folin ( kết quả định lượng bằng phương pháp folin không trình bày ở đây) Vì vậy kết quả về hàm lượng polyphenol ở các mẫu dịch chiết ở bảng 1 là dựa theo phương pháp ferrous sulphate
Trang 3Bảng 1 Hàm lượng polyphenol ở các mẫu chiết cô đặc thu được sau chiết xuất
Lượng polyphenol Mẫu chiết xuất
Hàm lượng (mg) Tỷ lệ % trong bột chiết
Nhận xét: Trong 50g bột lá dâu khô lượng polyphenol chiết xuất được bằng dung môi methanol 75%
(mẫu 5) là cao nhất và chiết xuất bằng n - hexan là thấp nhất (mẫu 1)
3 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các mẫu chiết lá dâu bằng cách sử dụng acid linoleic
Hoạt tính chống oxy hoá của 5 loại bột chiết lá dâu dựa theo ống chứng có so sánh với mẫu chè xanh
có cùng hàm lượng polyphenol được trình bày ở bảng 2 và minh hoạ ở biểu đồ 1
Bảng 2 MĐQH và mức độ peroxy hoá acid linoleic (POL)
của các mẫu thí nghiệm ở các thời gian
Thời điểm
Trước khi ủ Ngày 7 sau ủ Ngày 12 sau ủ
Polyphenol
(0,01%)
Nhận xét:Tất cả các mẫu bột chiết lá dâu có tác dụng hạn chế quá trình peroxy hóa lipid in vitro và
tác dụng mạnh nhất là ở mẫu bột lá dâu 5 tương đương với mãu chè xanh Chúng tôi coi toàn bộ lượng
acid linoleic có trong ống nghiệm ở thời điểm 12 ngày sau ủ đã bị oxy hoá hết và có MĐQH là 1,276
Biểu đồ 1 Mức độ peroxy hoá acid linoleic của các mẫu thí nghiệm
với sự có mặt của các loại bột chiết lá dâu
Trang 4IV BÀN LUẬN
1 Kết quả xác định hàm lượng
polyphenol
Hàm lượng polyphenol trong các mẫu chiết
xuất được xác định bằng phương pháp Ferrous
sulphate chính xác hơn dùng thuốc thử Follin Cả 2
phương pháp đều dùng acid gallic là chất chuẩn để
dựng biểu đồ chuẩn
Kết quả định lượng polyphenol bằng phương
pháp Ferrous sulphate trên cơ sở phản ứng màu
của polyphenol với ion Fe2+ Mặc dù phương pháp
này có thể có sai số thừa vì các monophenol (nếu
có) trong mẫu chiết xuất có thể phản ứng với ion
Fe2+ và làm tăng MĐQH, ảnh hưởng đến kết quả
định lượng Tuy nhiên đây là phương pháp đơn
giản cũng cho phép xác định sơ bộ hàm lượng
polyphenol trong dịch chiết trên cơ sở mẫu chuẩn,
cho kết quả phân tích khá chính xác Theo tài liệu
tham khảo mà chúng tôi có, trong lá dâu hầu như
không chứa monophenol [1][4]
Do vậy lượng polyphenol định lượng được
trong dịch chiết bằng phương pháp sử dụng thuốc
thử Ferrous sulphate có độ xác thực cao hơn, kết
quả định lượng được như sau: Hàm lượng
polyphenol dịch chiết lá dâu (từ 50g bột lá dâu
khô) cao nhất ở mẫu chiết bằng Methanol 75%
(50,8mg), tiếp đến là mẫu chiết bằng Methanol
100% (17,5mg), sau đó là mẫu chiết bằng
Ethylacetate 100% (5,36mg), mẫu chiết bằng
Aceton 100% (3,17mg) và thấp nhất là mẫu chiết
bằng n - Hexan 100% (0,04mg)
Sự khác nhau về lượng dịch chiết thô thu được
cũng như hàm lượng polyphenol dịch chiết ở đây
phụ thuộc hoàn toàn vào dung môi dùng để chiết
xuất Vì các mẫu chiết xuất trên cùng một lượng
50g bột lá dâu khô (lá dâu cùng loại), qui trình và
điều kiện chiết xuất giống nhau Tỷ lệ polyphenol
trong dịch chiết ở các mẫu đánh giá chất lượng
dịch chiết thu được ở mỗi mẫu chiết bằng các
dung môi khác nhau Tỷ lệ này cao nhất ở mẫu
chiết bằng Methanol 75% (2,62%), tiếp theo là
mẫu chiết bằng Methanol 100% (1,01%), sau đó
là mẫu chiết bằng Aceton 100% (0,44%), mẫu
chiết bằng Ethylacetate 100% (0,34%), thấp nhất
ở mẫu chiết bằng n - Hexan 100% (0,04%)
2 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các mẫu chiết bằng cách sử dụng acid linoleic
Trong thí nghiệm này chung tôi đánh giá tác dụng chống oxy hoá của các polyphenol trong các mẫu chiết (ở nồng độ 0,01%) thông qua lượng acid linoleic bị peroxy hoá (POL) theo thời gian ủ ở 400C Lượng acid linoleic bị peroxy hóa ở thời điểm 7 ngày sau ủ nhỏ hơn lượng acid linoleic bị peroxy hóa ở thời điểm 12 ngày sau ủ Mức độ chênh lệch này ở các thí nghiệm là khác nhau: Mẫu chứng (100% - 100%), Mẫu bột lá dâu 1 (11,6% - 29,6%), Mẫu bột lá dâu 2 (17% - 42%), Mẫu bột
lá dâu 3 (13,7% - 33%), Mẫu bột lá dâu 4 (11,5%
- 18,3%), Mẫu bột lá dâu 5 (14,1% - 15%), Mẫu chè xanh (15,3% - 16,3%)
Kết quả thực nghiệm cho thấy ở các nhóm thí nghiệm ủ với polyphenol thì lượng acid linoleic bị peroxy hóa giảm so với nhóm chứng Lượng acid linoleic bị peroxy hóa tỷ lệ nghịch với tác dụng chống oxy hóa của các polyphenol Polyphenol các mẫu chiết đều có tác dụng hạn chế quá trình peroxy hóa acid linoleic nhưng ở mức độ khác nhau:
- Ngày 7 sau ủ: Polyphenol Mẫu 4 có tác dụng chống peroxy hóa tốt nhất, sau đó là polyphenol Mẫu 3, tiếp theo là polyphenol Mẫu 5, polyphenol Mẫu 1, polyphenol Mẫu chè xanh và thấp nhất là polyphenol Mẫu 2
- Ngày 12 sau ủ: Polyphenol Mẫu 5 có tác dụng chống oxy hóa tốt nhất, sau đó là polyphenol Mẫu chè xanh, tiếp theo là polyphenol Mẫu 4, polyphenol Mẫu 1, polyphenol Mẫu 3 và thấp nhất polyphenol Mẫu 3
Sự khác nhau về hoạt tính chống oxy hóa của các polyphenol ở các mẫu chiết có thể do thành phần và lượng polyphenol Hay nói cách khác, dùng các dung môi chiết xuất khác nhau có thể thu được các polyphenol có phẩm chất khác nhau
Ta thấy polyphenol Mẫu 1 (chiết bằng Methanol 75%) có khả năng chống peroxy hóa tốt và tác dụng này được kéo dài theo thời gian
V KẾT LUẬN
1 Lá dâu chiết bằng dung môi methanol 75% thu được lượng bột lớn nhất (3,9%); trong đó hàm lượng polyphenol cũng nhiều nhất (2,62%)
Trang 52 Các mẫu chiết xuất lá dâu đều có khả năng
chống oxy hóa, mẫu chiết bằng methanol 75% có
khả năng chống oxy hóa cao nhất, tiếp đến là mẫu
chiết bằng methanol 100%, mẫu chiết bằng dung
môi n - hexan 100%, mẫu chiết bằng dung môi
aceton 100% và thấp nhất là mẫu chiết bằng dung
môi ethylacetate 100%
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Đỗ Tất Lợi (2001), Cây thuốc và vị thuốc
Việt Nam, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật , tr
252 - 253, 498 - 499, 721 - 723, 734 - 735, 820 -
821
2 Alan R.L (1994), "Cholesterol and
triglyceride", Free Radical, Biology of Medicin
3 Gow - Chin Yen, She - Ching - Wu and
Pin - Der Duh, Extraction and identification of
antioxidant components from the leaves of
mulberry (Morus alba L.), J Agre Food Chen:
1996, 44, 1687 - 1690
4 Husain S.R, Cillard J, cillard P (1987),
"Hydroxyl radical scavenging activity of flavonoids", Phytochemistry, (26), pp 2489 - 2491
5 Kayo Dol, Takashi Kojima, and Yasuo Fujimoto (2000), Mulberry leaf extract inhibits
the oxidative modification of rabbit and human low density lipoprotein, Biol, Pharm, Bull 23 (9), 106 -
1071
6 Vijavan K, Srivastava PP, Awasthi AK
Analysis of phylogenetic relationship among five mulberry (Morus) species using molecular markers Genome 2004; 47: 439 - 48
Summary
EXTRACTION, DETERMINATION OF POLYPHENOL CONCENTRATION AND ANTIOXIDANT ACTIVITIES OF MULBERRY LEAF EXTRACT POWDERS
It has been being some studyes on biomedical effects of mulberry leaves in the world Mulberry trees are widly cultivated in VietNam to take leaves for fed of silkworm However, it has not been a study on
extraction, determination and antioxidation of mulberry leaves in VietNam Objectives: extraction and
determination of polyphenol from mulberry leaves Evaluation of antioxidant capacities of mulberry leaf
extract powders Methods: Mulberry leaf extract powder were extracted from mulberry leaves by five
solvens: methanol 100%, methanol 75%, n - hexan 100%, ethylacetat 100% Polyphenol concentration of the extracts are determined by ferrous sulphate and follin reagent assay Antioxidant capacities of the
powders are based on peroxidation of linoleic acid at 40oC Results: Among five solvens, the extract by
methanol 75% from 50g dryed leaves is best The powder is 1,94g with 2,62% of polyphenol Polyphenol concentraion of the extract powders are determined by two methods: ferrous sulphate and follin reagent The result with ferrous sulphate method is more accurate than follin reagent method The mulberry leave extract powders inhibited linoleic acid peroxidation at the 7th and 12th of reaction (only 15,5 % to 42,2%
linoleic acid peroxidated) in comparison with control (100% linoleic acid peroxidated) Conclusions:
Polyphenol from mulberry leaves was extracted by some solvens Among them extraction of polyphenol by methanol 75% is best Polyphenol concentration of extract powders can be dedermined by ferrous sulphat The extract powders from mulberry leaves exhibited antioxidant capacities in vitro The extract powder by methanol 75% showed highest antioxidant capacitiy
Keywords: mulberry leaf, polyphenol, linoleic acid peroxidation.
