TCNCYH-2003 Bảo quản tinh trùng người bằng nitơ lỏng trong môi trường glycerol, GEYC và Sperm freeze Trịnh Sinh Tiên, Trịnh Bình Nguyễn Ngọc Hùng và Nguyễn Thị Bình Đại học Y Hà Nội
Trang 1TCNCYH-2003
Bảo quản tinh trùng người bằng nitơ lỏng trong môi
trường glycerol, GEYC và Sperm freeze
Trịnh Sinh Tiên, Trịnh Bình Nguyễn Ngọc Hùng và Nguyễn Thị Bình
Đại học Y Hà Nội
Sử dụng ba loại môi trường glycerol, GEYC và Sperm freeze để bảo quản tinh trùng người trong
đương với môi trường Sperm freeze và cao hơn có ý nghĩa thống kê so với bảo quản ở môi trường glycerol đơn thuần (p < 0,01); Bảo quản tinh trùng người bằng lạnh sâu dùng môi trường GEYC và Sperm freeze có hiệu quả với CSF ≥ 50%
(Từ viết tắt: GEYC: Glycerol – egg yolk – citrat; CSF: Cryosurvival factor; TT: Tinh trùng)
I Đặt vấn đề
Bảo quản đông lạnh tế bào và mô là một
nhánh của ngành sinh học nhiệt độ thấp, với
mục đích làm ngừng và bảo tồn được đời sống
tế bào trong suốt quá trình lưu giữ kéo dài trong
tình trạng đóng băng ở nhiệt độ thấp Nguyên
lý cơ bản của bảo quản lạnh sâu là kiểm soát
được chuyển động của các phân tử trong các
tế bào và mô Quá trình sống luôn đòi hỏi
những biến đổi sinh học, có liên quan đến sự
chuyển động của các phân tử trong môi trường
nước Khi nước ở trong và quanh tế bào chuyển
thành dạng nước đá đủ để ngăn cản sự chuyển
động của các phân tử, và sau đó nếu được làm
ấm lại, các hệ thống sinh học của tế bào không
bị tổn thương, người ta nói quá trình bảo quản
thành công [5] Chất lượng tế bào và mô được
bảo quản phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác
nhau như: quy trình bảo quản, nhiệt độ bảo
quản, môi trường bảo quản và quy trình làm tan
băng Theo thời gian, trên thế giới nhiều loại
môi trường đã được dùng để bảo quản lạnh sâu
tinh trùng người Tuy nhiên, những công bố về
hiệu quả của mỗi loại môi trường bảo quản tinh
trùng rất khác nhau
ở nước ta, bảo quản lạnh sâu tinh trùng
người để phục vụ nhu cầu chăm sóc sức khoẻ
sinh sản là vấn đề mới mẻ và cần thiết Câu
hỏi đặt ra là: trong số các môi trường, môi
trường nào phù hợp? Để góp phần trả lời câu hỏi này, chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu áp dụng quy trình bảo quản tinh trùng người bằng lạnh sâu trong môi trường glycerol, GEYC và Sperm freeze” với mục tiêu:
Đánh giá hiệu quả môi trường glycerol, GEYC và Sperm freeze trong bảo quản tinh
II đối tượng và phương pháp nghiên cứu
1 Đối tượng nghiên cứu
- 30 mẫu tinh dịch có tinh dịch đồ bình thường
được xét nghiệm và bảo quản tại phòng bảo quản Mô - Phôi, Trường Đại học Y Hà Nội trong thời gian từ tháng 5 đến tháng 8 năm 2002
- Tiêu chuẩn chọn đối tượng nghiên cứu: Nam giới trong độ tuổi sinh sản, không xuất tinh từ 3 đến 5 ngày trước ngày lấy tinh dịch, không sốt, không dùng thuốc, không uống rượu tại thời điểm lấy mẫu
2 Phương pháp nghiên cứu
áp dụng nghiên cứu can thiệp So sánh hiệu quả bảo quản của 3 loại môi trường ở các thời điểm 1, 2, 30 và 90 ngày sau bảo quản, theo các chỉ số tinh trùng sống di động tiến tới
sống di động tiến tới nhanh và chậm sau bảo
- Đề tài được thực hiện tại Lab bảo quản Mô - Phôi Đại học Y Hà Nội
Trang 2TCNCYH-2003
2.1 Chuẩn bị và chọn mẫu tinh dịch
Tinh dịch được lấy trong một phòng riêng,
nằm cạnh phòng xét nghiệm, bằng cách tự kích
thích và cho xuất tinh thẳng vào một cốc thuỷ
tinh có chia vạch, miệng rộng, đã ghi sẵn tên
bệnh nhân và ngày giờ lấy mẫu Cốc đựng tinh
30 phút, lấy ra để đánh giá các chỉ số tại phòng
Những mẫu tinh dịch trong giới hạn bình
thường được tiến hành bảo quản đông lạnh
2.2 Quy trình bảo quản tinh trùng bằng
nitơ lỏng (- 196 0 C)
2.2.1 Môi trường bảo quản
a Glycerol: glycerol 99%
b Sperm freeze: Do Perti Pro N.V - Bỉ sản
xuất, được bán trên thị trường
Thành phần: 15% glycerol và 0,4% albumin
huyết thanh người
c Glycerol – egg yolk – citrat (GEYC) [1]:
Được pha tại phòng bảo quản Mô, bộ môn
Mô học – Phôi thai học, theo công thức của
Ackerman Thành phần trong 200 ml môi
trường GEYC có:
8 Nước cất 2
lần, khử ion
kim loại
130 ml
2.2.2 Quy trình bảo quản và tan đông
Để làm rõ ưu điểm của môi trường bảo quản theo mục tiêu đã đề ra, một quy trình chung đã
được thực hiện ở tất cả các mẫu nghiên cứu
- Chia mỗi mẫu tinh dịch thành ba phần bằng nhau, cho vào 3 cốc thuỷ tinh đã ghi nhãn: tên bệnh nhân, môi trường pha Mỗi phần sử dụng một loại môi trường, nhỏ từng giọt môi trường lắc đều, theo tỉ lệ glycerol 2 giọt/1ml tinh dịch [5], môi trường GEYC 1ml/1ml tinh dịch [1], Sperm freeze 0.7ml/1ml tinh dịch Sau khi cho môi trường, để mẫu ở nhiệt độ phòng thí nghiệm 15 phút
- Nạp mỗi mẫu đã chuẩn bị để bảo quản trong 4 cọng rạ (straw) bằng máy hút cầm tay Cọng rạ 0,25 ml, dài 13 cm, một đầu được nút bởi bột dính Khi nạp để lại 1 đoạn trống ở đầu kia và hàn kín bằng máy ép nhiệt In các thông tin cá nhân và thời hạn bảo quản bằng máy in lên thành cọng rạ
- Hạ nhiệt độ bằng máy Nicool 10: Từ +25°C xuống -10°C trong 6 phút; từ -10°C xuống 120°C trong 20 phút; từ 120°C xuống -196°C trong 5 phút
- Chuyển các cọng rạ vào gầu chứa, nhúng thẳng vào bình trữ GT 35 chứa đầy nitơ lỏng
- Lấy mẫu sau bảo quản đông lạnh: Chọn mẫu cần lấy qua ký hiệu đã ghi trên cán gầu
Đưa gầu ra khỏi bình trữ, lấy cọng rạ đặt vào tủ
ấm 37°C trong 10 phút
2.4 Xử lý số liệu theo phần mềm Epi-Info
Version 6.0 của WHO Kiểm định sự khác biệt bằng test t và sự khác biệt có ý nghĩa thống kê
khi p < 0,05
3 Những chỉ tiêu nghiên cứu
Tỷ lệ % tinh trùng di động tiến tới nhanh sau bảo quản
Trang 3TCNCYH-2003
Tỷ lệ % tinh trùng di động tiến tới nhanh và chậm sau bảo quản
Tỷ lệ % tinh trùng sống sau bảo quản
III Kết quả
các bảng sau
Bảng 1 Chỉ số chất lượng tinh trùng (CSF 1,2,3 ) ở khoảng thời gian bảo quản 1 ngày: ⎯X ± SD
Môi trường
Chỉ số %
Glycerol (I)
GEYC (II)
Sperm freeze (III)
So sánh (p)
(Di động nhanh)
p I,II < 0,01
p I,III < 0,01
p II,III > 0,05
(DĐ nhanh & chậm)
p I,II < 0,01
p I,III < 0,01
p II,III > 0,05
(TT sống)
p I,II < 0,01
p I,III < 0,05
p II,III > 0,05
Qua kết quả trên cho thấy, ở cả 3 chỉ số, môi trường GEYC đảm bảo hiệu quả cao hơn so với khi dùng môi trường Glycerol với ý nghĩa thống kê p <0,01 So sánh với môi trường Sperm freeze
chưa có ý nghĩa thống kê (p > 0,05)
Bảng 2 Chỉ số chất lượng tinh trùng (CSF 1,2,3 ) ở khoảng thời gian bảo quản 2 ngày: ⎯X ± SD
Môi trường
Chỉ số %
Glycerol (I)
GEYC (II)
Sperm freeze (III)
So sánh (p)
(Di động nhanh)
p I,II < 0,01
p I,III < 0,01
p II,III > 0,05
(DĐ nhanh &chậm)
p I,II < 0,01
p I,III < 0,01
p II,III > 0,05
(TT sống)
p I,II < 0,01
p I,III < 0,05
p II,III > 0,05
Kết quả trên cho thấy, sau hai ngày bảo quản, chất lượng tinh trùng được đánh giá theo các chỉ tiêu vẫn được duy trì tương ứng như sau một ngày
Trang 4TCNCYH-2003
Bảng 3 Chỉ số chất lượng tinh trùng (CSF 1,2,3 ) ở khoảng thời gian bảo quản 30 ngày: ⎯X ± SD
Môi trường
Chỉ số %
Glycerol (I)
GEYC (II)
Sperm freeze (III)
So sánh (p)
(Di động nhanh)
p I,III < 0,01
p II,III > 0,05
(DĐ nhanh & chậm)
p I,III < 0,05
p II,III < 0,05
(TT sống)
p I,II < 0,01
p I,III < 0,05
p II,III < 0,05
Kết quả trên cho thấy sau 30 ngày bảo quản, chất lượng tinh trùng vẫn được duy trì với các chỉ
Bảng 4 Chỉ số chất lượng tinh trùng (CSF 1,2,3 ) ở khoảng thời gian bảo quản 90 ngày: X ± SD
Môi trường
Chỉ số %
Glycerol (I)
GEYC (II)
Sperm freeze (III)
So sánh (p)
(Di động nhanh)
p I,II < 0,01
p I,III < 0,01
p II,III > 0,05
(DĐ nhanh & chậm)
p I,II < 0,01
p I,III < 0.05
p II,III < 0,05
(TT sống)
p I,II < 0,01
p I,III < 0.05
p II,III > 0,05
Kết quả trên cho thấy sau 90 ngày bảo quản,
môi trường GEYC vẫn duy trì được các chỉ số
chất lượng tinh trùng cao hơn so với môi trường
Glycerol với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p
< 0,01) So với môi trường chuẩn Sperm freeze
những vẫn duy trì được hiệu quả cao hơn như
biệt có ý nghĩa thống kê p < 0,05
Từ những kết quả xác định chỉ số CSF,
chúng tôi có những nhận xét sau:
quản khi dùng 3 loại môi trường đều đạt mức
trên 50% (trừ giai đoạn sau 30 ngày với môi
trường glycerol)
các giai đoạn bảo quản, khi dùng hai môi trường hỗn hợp GEYC và Sperm freeze, đều
đạt trên mức 50%, nhưng không vượt quá 76%
đoạn bảo quản khi dùng môi trường đơn thuần glycerol đều ở mức dưới 50%
- ở tất cả các giai đoạn bảo quản, dùng môi trường hỗn hợp GEYC và Sperm freeze, các
nghĩa thống kê so với dùng môi trường glycerol
- Có sự khác biệt nhưng chưa có ý nghĩa
GEYC và Sperm freeze ở tất cả các giai đoạn
Trang 5TCNCYH-2003
khác nhau có ý nghĩa thống kê hoặc không có
ý nghĩa thống kê tuỳ giai đoạn bảo quản
iv bàn luận
1 Về phương pháp nghiên cứu
Để đánh giá được hiệu quả của từng môi
trường bảo quản dùng trong công trình nghiên
cứu này, chúng tôi đã tiến hành làm đông lạnh
cho từng mẫu tinh dịch ở các thời điểm như
nhau với cùng một quy trình thao tác kỹ thuật
Trong đó, những yếu tố ảnh hưởng đến chất
lượng tinh trùng sau bảo quản đã được chú ý
là: sốc lạnh, tốc độ làm lạnh (hạ nhiệt độ chậm
theo chương trình của máy Nicool 10), làm tan
đông sau bảo quản (đưa mẫu đông lạnh vào tủ
trùng người không hoặc rất ít nhạy cảm với yếu
tố này, tuy nhiên không loại trừ tính nhạy cảm
của một số mẫu tuỳ cá thể Trong cả 3 môi
trường đã dùng, đều có glycerol là chất chống
sốc lạnh cho tinh trùng [5], môi trường chứa
lòng đỏ trứng, theo một số tác giả cũng có khả
năng làm giảm tính nhạy cảm với sốc lạnh cho
tinh trùng của một số cá thể [3] [4]
Trong công trình này, 30 mẫu tinh dịch đã
được xác định có tinh dịch đồ nằm trong giới
hạn của một tinh dịch đồ bình thường (theo tiêu
chuẩn do WHO 1999 đề xuất [6]) Trong đó
những thông số quan trọng là: mật độ tinh trùng,
tỉ lệ tinh trùng di động tiến tới trước, tỉ lệ tinh
trùng có hình thái bình thường Chúng tôi cho
rằng với những mục tiêu nghiên cứu đã đặt ra,
việc chọn mẫu nghiên cứu như vậy là phù hợp
Về thời gian bảo quản (hay thời điểm lấy
mẫu sau bảo quản để đánh giá) ở công trình
này là 1, 2, 30 và 90 ngày Đây là những mốc
thời gian bảo quản ngắn Theo chúng tôi có thể
phù hợp với liệu trình điều trị cho các cặp vô
sinh mà các nhà lâm sàng áp dụng như lọc rửa
tinh trùng bơm vào buồng tử cung, thụ tinh
trong ống nghiệm Những nghiên cứu bảo
quản tinh trùng dài ngày sẽ được thực hiện tiếp
tục sau công trình nghiên cứu này
Theo tiêu chuẩn của Hiệp hội ngân hàng
Mô Hoa Kỳ [5], chỉ số tinh trùng di động sau
bảo quản CSF là từ 50% trở lên thì được coi là
mẫu tinh dịch được bảo quản thành công Chỉ
chúng tôi đặt ra trong công trình nghiên cứu
động tiến tới trước nhanh, sau bảo quản đông lạnh) là chỉ số có giá trị thực tế nhất, cần được
đặt ra khi xác định chất lượng của một mẫu sau bảo quản lạnh sâu, đặc biệt là những mẫu có tinh dịch đồ thấp hơn giới hạn bình thường
2 Về hiệu quả bảo quản lạnh sâu tinh trùng người của 3 môi trường dùng trong công trình này
Cho đến nay, glycerol đã được công nhận là chất bảo vệ lạnh có hiệu quả nhất trong bảo quản tinh trùng Glycerol làm hạ thấp điểm đóng băng, làm giảm tập trung các chất điện giải, duy trì độ pH và làm tăng tính bền vững của màng tinh trùng [5] [2] Trong hai môi trường hỗn hợp
đã sử dụng trong công trình, tỉ lệ glycerol đều chiếm khoảng 15% Môi trường Sperm freeze có thêm 0,4% albumin huyết thanh người, môi trường GEYC có thêm 20% lòng đỏ trứng, một tỉ
lệ nhỏ glucose, glycin và citrat natri Những thành phần được đưa thêm này có tác dụng hỗ trợ cho glycerol giúp duy trì áp lực thẩm thấu và pH, đồng thời cung cấp năng lượng cho tinh trùng tránh việc sử dụng phospholipid bên trong tế bào [4] Kết quả nghiên cứu từ công trình này qua
của 3 môi trường đã dùng
- Căn cứ tiêu chuẩn của Hiệp hội ngân hàng
trên 50%; riêng với môi trường glycerol đơn thuần
ở giai đoạn bảo quản 30 ngày, chỉ số này chỉ đạt
trường GEYC và Sperm freeze đều đạt mức trên 50% ở tất cả các giai đoạn bảo quản, trong khi
đó dùng môi trường glycerol đơn thuần hai chỉ số này chỉ đạt mức thấp dưới 40%, sự khác biệt này
có ý nghĩa thống kê Từ những nhận xét trên, chúng tôi cho rằng dùng hai môi trường GEYC và Sperm freeze để bảo quản lạnh sâu tinh trùng rõ ràng có hiệu quả hơn so với dùng môi trường glycerol đơn thuần
Trang 6TCNCYH-2003
2 Quy trình bảo quản tinh trùng người bằng lạnh sâu dùng môi trường GEYC và Sperm freeze có hiệu quả với chỉ số CSF ≥ 50%
hỗn hợp ở cả 4 giai đoạn, tuy có khác biệt nhưng
không có ý nhĩa thống kê Đồng thời, sự khác biệt
các giai đoạn bảo quản cũng không hoàn toàn có
ý nghĩa thống kê Từ những nhận xét trên, chúng
tôi cho rằng hiệu quả bảo quản lạnh sâu tinh
trùng người trong nghiên cứu này giữa hai môi
trường Sperm freeze và môi trường GEYC là
tương đương nhau
- Bài báo là một phần của luận văn cao học và nghiên cứu cơ sở Bạn đọc có thể tìm đọc toàn văn tại Thư viện trường ĐHYHN, Trung tâm thông tin Y học, Thư viện Quốc gia
tài liệu tham khảo
1 Trương Công Hổ, Hồ Mạnh Tường
(2001) Phương pháp trữ tinh trùng Phương
pháp xét nghiệm tinh dịch Bệnh viện Phụ sản
Từ Dũ, Thành phố Hồ Chí Minh
Tuy nhiên, khi sử dụng cần cân nhắc những
ưu điểm và nhược điểm của 2 loại môi trường này
về quy trình thao tác Môi trường Sperm freeze là
môi trường được pha sẵn, bán trên thị trường, giá
cao và có hạn dùng ngắn; tuy nhiên sau khi làm
tan đông mẫu để đánh giá chất lượng và sử dụng
tinh trùng chỉ cần loại bỏ môi trường bằng
phương pháp lọc rửa tinh trùng thông thường
(phương pháp swim up hoặc phương pháp thang
nồng độ) Môi trường GEYC là môi trường có thể
tự pha, giá thành hạ, nhưng muốn làm sạch môi
trường để có tinh trùng cần phải ly tâm tách phần
nhằm tách hoàn toàn môi trường, đặc biệt là các
hạt lòng đỏ trứng
2 Hồ Mạnh Tường, Nguyễn Thị Mai, Lại Văn Tám (2000) Trữ lạnh tinh trùng người
trong thụ tinh nhân tạo Thời sự Y dược học Bộ
V (1), tr: 8-10
3 Foote RH; McGonagle; Goldstein M; Feldschuh J (2002) The influence of cryoprotective media and processing procedures on motility and migration of frozen
– thawed human sperm Asian J Androl, 4(2),
pp: 137 – 41
4 Hollanders J.M., Carver – Ward J.A (1996) Male Infertility from A to Z Studies in profertility series The Parthenon publishing Group, Vol 4, p 32-33
III kết luận:
Nghiên cứu bảo quản tinh trùng người, mẫu
có tinh dịch đồ trong giới hạn bình thường bằng
GEYC và Sperm freeze, chúng tôi có những
kết luận sau:
5 J.K.Sherman (1990) Cryopreservation of
human semen CRC Handbook of the
Laboratory Diagnosis and Treatment of Infertility pp: 229-258
6 World health organisation (1999) WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm – Cervical mucus interation Fourth edition, Cambridge University press 34
1 Chất lượng tinh trùng sau bảo quản ở môi
trường GEYC tương đương với môi trường Sperm
freeze và cao hơn có ý nghĩa thống kê so với bảo
quản ở môi trường glycerol đơn thuần
Summary
deep – cryopreservation of human spermatoza in
glycerol, geyc and sperm freeze
media shows that after preservation, quality of spermatozais the same in GEYC and Sperm freeze but higher in glycerol medium with statisticallysignificant level p < 0,01 CSF of deep – cryopreservation of human spermatoza in GEYC and Sperm freeze media are > 50%
