TCNCYH 22 2 - 2003 Sử dụng multiplex PCR để phát hiện vi khuẩn Helicobacter pylori Nguyễn Thị Thanh Lợi và Nguyễn Thị Hồng Hạnh Viện Công nghệ Sinh học - Trung tâm Khoa học tự nhiên v
Trang 1TCNCYH 22 (2) - 2003
Sử dụng multiplex PCR để phát hiện vi khuẩn
Helicobacter pylori
Nguyễn Thị Thanh Lợi và Nguyễn Thị Hồng Hạnh
Viện Công nghệ Sinh học - Trung tâm Khoa học tự nhiên và Công nghệ quốc gia
ở Việt Nam, vi khuẩn Helicobacter pylori có thể mang các kiểu gien khác nhau do gien có thể bị
đột biến hoặc khiếm khuyết Vì thế, việc phát hiện chúng bằng nhân bản một gien (PCR đơn) có thể cho các kết quả âm tính giả
Multiplex PCR nhằm khuyếch đại ba gien mã hoá cho các protein độc tính CagA, Urease B và HP1125 của vi khuẩn Helicobacter pylori đã được nghiên cứu và có thể sử dụng trong thực tế lâm sàng ở Việt Nam
I Đặt vấn đề
Cho đến nay, các nhà nghiên cứu đều thống
nhất cho rằng, gần một nửa dân số trên thế giới
bị nhiễm vi khuẩn Helicobacter pylori [7,2]
Loại vi khuẩn Gram-âm này đã gây ra rất nhiều
rối loạn nghiêm trọng về tiêu hoá, bao gồm
viêm loét dạ dày và hành tá tràng với biểu hiện
nặng nhất là ung thư dạ dày [4]
Cũng như nhiều năm trước đây, ngày nay,
việc phát hiện và chẩn đoán các bệnh do nhiễm
khuẩn Helicobacter pylori vẫn còn là mối quan
tâm của các nhà khoa học, vì vi khuẩn hết sức
đa dạng về mặt sinh học [3,5] Một vài nghiên
cứu cho thấy, nếu các cặp primers thiết kế cho
phản ứng PCR để phát hiện vi khuẩn H pylori
ở các nước phương Tây không hiệu lực khi phát
hiện các chủng châu á [8]
ở Việt Nam, vi khuẩn Helicobacter pylori,
theo nghiên cứu được phân lập từ các bệnh
nhân có thể khiếm khuyết gien cagA hoặc gien
Urease B [6] Do thế, nếu chỉ tiến hành PCR
đơn để nhằm phát hiện một gien thì các kết quả
âm tính giả có thể xảy ra Để khắc phục nhược
điểm này chúng tôi đề nghị sử dụng Multiplex
PCR để khuyếch đại đồng thời nhiều gien trong
một ống nghiệm Phương pháp này có ưu điểm
là nhanh, rẻ tiền và cho nhiều thông tin về vi
khuẩn hơn là PCR đơn, ba gien mã hóa cho ba
protein bệnh lý: UreaseB, CagA và HP1125 -
một protein màng ngoài của vi khuẩn - được lựa chọn cho thử nghiệm
Mục tiêu nghiên cứu là đánh giá khả năng
sử dụng Multipex PCR trong chẩn đoán vi
khuẩn Helicobacter pylori trong các mẫu bệnh
phẩm của bệnh nhân
II Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
1 Đối tượng
Sinh thiết của người bệnh bị loét dạ dày chưa qua điều trị kháng sinh được lấy bằng máy nội soi ống mềm 2T-10 (Olympus-Nhật bản) và được giữ trong môi trường vận chuyển (theo Seelinger H.P.J và Schroter G.,1990) và
được bảo quản ở -800C
2 Phương pháp
2.1 Phân lập vi khuẩn Helicobacter pylori
từ sinh thiết bệnh nhân
Sinh thiết của bệnh nhân được nghiền kỹ, sau đó dịch nghiền được cấy lên môi trường
thạch đặc trưng cho vi khuẩn H.pylori có chứa
7% máu ngựa và một số chất khác như kháng sinh [2] Đĩa có vi khuẩn được đặt trong bình vi hiếu khí của hãng BBL (Becton Dickinson Microbiology System, Cockeysville) ở 370C Sau 48-72 ngày, thu thập vi khuẩn (chủng VNH-85) cho các nghiên cứu tiếp theo
Công trình nghiên cứu này được thực hiện tại Viện Công nghệ Sinh học- Trung tâm Khoa học tự nhiên và
Trang 2TCNCYH 22 (2) - 2003
2.2 Tách chiết ADN từ vi khuẩn và sinh
thiết bệnh nhân
*) Từ vi khuẩn: Vi khuẩn H pylori được thu
thập từ đĩa nuôi cấy và rửa 2 lần bằng 1xPBS
Tách ADN của vi khuẩn bằng chế phẩm sinh
học QIAmp Tissue Kit
*) Từ sinh thiết bệnh nhân: Bệnh phẩm được
nghiền trong dung dịch 1 x PBS, sau đó được ủ
với Proteinase
K 20mg/ml ở 370C trong 2 giờ Sau khi
được phenol hoá để loại protein, ADN được tủa
bằng cồn tuyệt đối có bổ sung Natri axetate
đến nồng độ cuối cùng 0,3M Độ sạch của
ADN được kiểm tra bằng phương pháp điện di
trên gel agaroza 0,8%., dung dịch đệm 1xTAE
2.3 PCR đơn và Multiplex PCR
*) PCR đơn
5-10ng ADN được dùng làm khuôn mẫu
cho phản ứng khuyếch đại gien cagA+, Urease
B và Hp1125 Phản ứng được thực hiện trên
máy PTC-100TM Programmable Thermal
controller
+) Gien cagA + :
Cặp mồi F1, F2 được dùng để khuyếch đại
đầu 5’ gien cagA+ kích thước 460 bp có trình tự
sau:
F1:5’-ACC-ATT-GAT-CAA-ACA-ACA-ACA-CC-3’
F2
:5’-AGG-GGG-TTG-TAT-GAT-ATT-TTC-CAT-3’
Chu trình nhiệt của phản ứng:
940C 1phút 580C 1 phút
720C 1 phút
Lặp lại 35-40 chu kỳ
+) Gien ureaseB
Cặp mồi F3, F4 được dùng để khuyếch đại
toàn bộ gien ureaseB kích thước 1700 bp có
trình tự là:
F3 :5’-CAG-CAT-ATG-AAA-AAG-ATT-AGC-AG-3’
F4 :5’-AAT-GCT-AAA-GAG-TTG-CGC-CAA-G-3’
Chu trình nhiệt của phản ứng: 940C 1 phút.,
580C 1 phút., 720C 1 phút Lặp lại 35 –40 chu kỳ
+) Gien Hp1125
Cặp mồi được sử dụng để khuyếch đại 540
bp của đầu 5’ của gien có trình tự là:
L:5’-ATG-AAG-AGA-TCT-TCT-GTA-TTT-AGT-T-3’
R:5’-TTA-CTT-CAC-TAA-TTT-GAT-CCA-CT-3’
Chu trình nhiệt của phản ứng: 940C 1 phút
550C 1 phút
720C 1 phút Lặp lại 35-40 chu kỳ
Sản phẩm PCR của từng gen trên được kiểm tra trên gel agaroza 0,8% Đệm điện di 1xTAE
*) Multiplex PCR
Phản ứng được thực hiện với sự có mặt cả 3 cặp mồi của 3 gien: cagA+, Urease B, Hp1125 Phản ứng PCR được tối ưu hoá trong thể tích 25àl: 5ng ADN tổng số được dùng làm khuôn cho phản ứng, 1àM của mỗi cặp mồi, 2,5àl của
10 x dịch đệm, 200àM của mỗi dNTP, 2,5 đơn
vị AmpliTaq DNA polymerase, thêm H2O (khử ion và đã khử trùng) đến 25àl
Chu trình nhiệt của phản ứng: 940C 1 phút
500C 1 phút 30 giây
720C 2 phút Lặp lại 35 –40 chu kỳ
Sản phẩm của phản ứng Multiplex PCR
được kiểm tra trên gel agaroza 0,8% Đệm điện
di 1xTAE
Trang 3TCNCYH 22 (2) - 2003
III Kết quả
1 Sử dụng phương pháp PCR đơn để
phát hiện các gien ureaseB, cagA và HP1125
của chủng vi khuẩn Helicobacter pylori
VNH - 85 (chủng Việt Nam)
Các kết quả phân tích các sản phẩm PCR
đơn của ba gien cagA., Hp1125 và UreaseB
được trình bày ở hình 1 Trong nghiên cứu này,
các gien được khuyếch đại có phân tử lượng
khoảng 460 bp (cagA)., 540bp (Hp1125) và
1700 kb (UreaseB) là những kích thước chờ
đợi
ảnh điện di đồ 1 cũng cho thấy, không có
một băng ADN nào được khuyếch đại thêm,
ngoài những băng của cagA, Hp1125 và
UreaseB, chứng tỏ các cặp mồi thiết kế đặc
trưng cho phân tích
2 Sử dụng Multiplex PCR để phát hiện
cùng một lúc ba gien cagA, UreaseB và
Hp1125 trong vi khuẩn
H pylori chủng VNH - 85 (chủng Việt
Nam)
Sau hàng loạt các thử nghiệm để tối ưu hoá
phản ứng Multiplex PCR, chúng tôi đã khuyếch
đại được cả ba gien trong một ống nghiệm
Hình 2 là kết quả điện di đồ của các sản phẩm PCR
Như đã thấy, ba gien cagA., Hp1125 và Urease B đã được khuyếch đại và cho các sản phẩm có phân tử lượng như đã chờ đợi: 1700 bp cho gien UreaseB., 540 bp cho gien HP1125 và
460 bp cho gien cagA
M 1
IV Bàn luận
Vi khuẩn Helicobacter pylori, chủng Việt
Nam đa dạng về mặt sinh học Chúng có thể khiếm khuyết một trong hai gien cagA và urease B [1] Nguyên nhân do các quá trình siêu đột biến xảy ra trong hệ gien của vi khuẩn Trong một nghiên cứu trên hơn một trăm bệnh nhân, Hạnh và cs
cũng nhận thấy, tỷ lệ các chủng
Helicobacter pylori mang gien urease B khiếm
khuyết là khoảng 20% Tương tự như vậy, số
các chủng Helicobacter pylori không tổng hợp
protein cagA chiếm một tỷ lệ đáng kể [Hạnh Kết quả chưa công bố]
Với những lý do như trên, để phát hiện vi
khuẩn Helicobacter pylori bằng phương pháp
PCR, không thể khuyếch đại một gien riêng rẽ, vì các kết quả âm tính giả có thể xảy ra Chúng tôi đã tối ưu hoá các điều kiện của phản ứng
Hình 2- Phát hiện ba gen Urease B (1)., Hp1125 (2) và cagA (3) bằng phương pháp Multiplex PCR
Kb
2 1.5 0.5
1
2 3
M 1 2 3
Kb
1.5
1
0.5
Hình 1- Phát hiện các gien cagA (1), HP1125 (2)
và UreaseB (3) bằng phương pháp PCR đơn
Trang 4TCNCYH 22 (2) - 2003
PCR đơn hoặc Multiplex PCR cho ba gien
ureaseB., cagA và Hp1125 Chúng tôi đề nghị
sử dụng phương pháp Multiplex PCR để phát
hiện vi khuẩn Helicobacter pylori trong sinh
thiết dạ dày, trong phân và vi khuẩn phân lập từ
người bệnh Việt Nam Phương pháp có giá trị
trong các trường hợp, các sàng lọc vi khuẩn
Helicobacter pylori bằng test Urease cho kết
quả âm tính
V Kết luận
1 Chúng tôi đã khuyếch đại nhiều gien
trong một ống nghiệm bằng phương pháp
Multiplex PCR để phát hiện vi khuẩn
Helicobacter pylori
2 Multiplex PCR là phương pháp phát hiện
Helicobacter pylori cho kết quả nhanh và đầy
đủ thông tin về sự có mặt của vi khuẩn trong
các sinh thiết bệnh nhân Phương pháp có thể
được áp dụng trong thực tế lâm sàng của Việt
Nam
Tài liệu tham khảo
1 Nguyễn Thị Hồng Hạnh và Nguyễn Thị
Thanh Lợi : Sự tồn tại của các chủng
Helicobacter pylori khiếm khuyết gien urease B
ở các bệnh nhân viêm loét và ung thư dạ dày
Việt Nam Đại hội lần thứ hai hội nghị khoa
học hoá sinh y dược năm 2001-Các báo cáo
khoa học.Tr 106-113
2 Trần Công Tước, Trần Quỳnh Hoa,
Nguyễn Thị Hồng Hạnh, Bùi Phương Thuận và
Lê Văn Phủng Sự có mặt cuả vi khuẩn
Helicobacter pylori mang cagA+status trong
các sinh thiết dạ dày cuả người Việt Nam Sinh học 23 (2): 51-54
3 Atherton, J C., Cao, P., Peek, R M J., Tummuru, M K., Blaser, M
J., Cover, T L : Mosaicism in vacuolating cytotoxin alleles of
Helicobacter pylori Association of specific vacA types with cytotoxin production and peptic ulceration J Biol Chem
1995, 270: 17771 - 17777
4 Correa, P : Helicobacter pylori and gastric carcinogenesis
Amm J Surg Patho 1995, 19 Suppl 1: S37 - S43
5 Cristina, N et al: Helicobacter pylori genotype may determine gastric histopathology Amer J Pathology 2001, 158 : 647 - 654
6 Hazell, S L The role of Helicobacter pylori Urease: a contentious issue Eur J Gastroenterol Hepato 4 1992, (Suppl 1) : 55 -
59
7 Hopkins, R J and Morris, Jr J G.: Helicobacter pylori: the missing link in perspective Am J Med 1984, 97: 265 - 277
8 Van de Ende, A., Pan, Z, J., Bart, R W., van de Hurst., Feller, M., Xio, S.D., Tytgat, G and Dankert, J (1998) cagA- postive Helicobacter pylori population in China and the Netherland are distinct Infect 2001, Immun
66 : 1822 - 1826
Summary Multiplex PCR and detection of three genes
of Helicobacter pylori Bacterium Helicobacter pylori is the causative agent of many gastric disorders That is why, its
correct detection is necessary However, monitoring the bacteria by amplifying only one gene has used to give false-negative results due to the
biodiversity of the bacteria The conditions for Multiplex PCR amplifying three virulent genes of
the bacteria such as cagA., ureaseB and Hp1125 were optimized It is recommended to detect
Helicobacter pylori in clinical setting in Viet nam
