Bài viết Phân tích đa dạng di truyền dựa trên gene ORF5 của virus gây bệnh heo tai xanh (PRRS virus) tại một số tỉnh ở Việt Nam nghiên cứu về sự biến đổi của virus PRRS giúp có thêm cơ sở khoa học trong đánh giá hiệu quả vaccine phòng chống bệnh PRRS trên đàn heo tại Việt Nam.
Trang 11 Bộ môn Bệnh truyền nhiễm - Thú y Cộng đồng, Khoa Chăn nuôi Thú y, Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM;
2 Phòng Xét nghiệm - Chẩn đoán thú y Hàn Việt, Khoa Chăn nuôi Thú y, Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM;
3 Công ty TNHH MSD Animal Health Việt Nam;
* Tác giả liên hệ: Nguyễn Ngọc Hải; Email: nguyenngochai@hcmuaf.edu.vn; ĐT: 0908840765
PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN DỰA TRÊN GENE ORF5 CỦA VIRUS GÂY BỆNH HEO TAI
XANH (PRRS VIRUS) TẠI MỘT SỐ TỈNH Ở VIỆT NAM
Nguyễn Ngọc Hải 1,2* , Trần Hoàng Anh Thư 2 , Nguyễn Trung Quân 2 , Nguyễn Thị Phương Bình 2 và Lê Thị Thu Hà 3
Tóm tắt
Nghiên cứu về sự biến đổi của virus PRRS giúp có thêm cơ sở khoa học trong đánh giá hiệu quả vaccine phòng chống bệnh PRRS trên đàn heo tại Việt Nam Mười sáu mẫu thu thập từ thực địa năm 2021, tại một số tỉnh ở Việt Nam (Đồng Nai, Đắk Nông, Hải Phòng, Lai Châu, Vĩnh Phúc), bằng kĩ thuật RT-PCR được xác định dương tính với virus PRRS Gene ORF5, có chiều dài là 764 bp, thu nhận từ 16 mẫu được giải trình tự và so sánh với trình tự tương ứng của các chủng virus PRRS tham khảo trên ngân hàng gene Kết quả phân tích di truyền của 16 chủng virus PRRS thực địa năm 2021 ghi nhận sự đa dạng di truyền của các chủng PRRSV thực địa, với 11 chủng thực địa thuộc dòng PRRSV Trung Quốc độc lực cao (HP), có độ tương đồng nucleotide từ 91,0% - 100%; 5 chủng thực địa thuộc dòng PRRSV Bắc Mỹ cổ điển (C-PRRSV), trong đó có 4 chủng NADC30-like Mặt khác, các chủng virus PRRS thực địa năm 2021 trong nghiên cứu này có sự khác biệt khá lớn về di truyền so với các chủng vaccine PRRS, mức độ tương đồng di truyền gene ORF5 khá thấp, thay đổi ở mức 83,9 - 84,4% với các chủng vaccine Bắc Mỹ cổ điển, 83,4 - 84,2% với các chủng vaccine độc lực cao Trung Quốc, và 58,8 - 59,8% với các chủng vaccine PRRSV châu Âu.
Từ khóa: Chủng PRRSV thực địa và vaccine, ORF5, phân tích di truyền.
GENETIC ANALYSIS OF ORF5 GENE OF PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS IN SOME PROVINCES IN VIET NAM
Abstract
Research on genetic changes of PRRS virus helps to have more scientific basis in assessing effective prevention
of PRRS in pigs in Vietnam with vaccination Sixteen samples collected from the field in 2021, in some provinces
in Vietnam (Dongnai, Daknong, Haiphong, Laichau, and Vinhphuc), using RT-PCR technique were confirmed positive for PRRS virus ORF5 gene, 764 nucleotide length, was obtained from 16 samples and compared with corresponding sequences of PRRS virus strains referenced on gene banks The results of genetic analysis of the gene sequences of 16 field PRRSV strains in 2021 recorded the genetic diversity of the strains, with 11 strains belonging to the highly pathogenic Chinese PRRSV (HP) group, with similarity of nucleotides from 91.0% - 100%; 5 field strains belong to the classic North American PRRSV (C-PRRSV) group, in which 4 strains belong
to NADC-like subgroup Moreover, the 2021 field PRRS virus strains in this study are quite different genetically compared to the PRRS vaccine strains, the genetic similarity level of ORF5 is quite low, ranging from 83.9 to 84.4% with classic North American vaccine strain, form 83.4 to 84.2% with highly pathogenic Chinese vaccine strain, and from 58.8 to 59.8% with European PRRSV vaccine strain
Keywords: Field and vaccine PRRSV strain, ORF5, phylogenetic.
1 GIỚI THIỆU
Bệnh heo tai xanh hay còn gọi là hội
chứng rối loạn sinh sản và hô hấp là bệnh truyền nhiễm cấp tính trên heo xuất hiện lần đầu tiên tại Việt Nam vào năm 1997 gây ra
Trang 2nhiều thiệt hại cho người chăn nuôi Bệnh
do virus PRRS thuộc loài Nidovirales, họ
Arteriviridae, giống Arterivirus, có cấu trúc
vỏ bọc dạng chuỗi đơn RNA Kích thước bộ
gene của virus PRRS khoảng 15,4 kb với ít
nhất 10 khung đọc mở (ORFs) nằm xung
quanh ở những vùng không dịch mã 5’ và 3’,
có cấu trúc đuôi poly (A) tại đầu 3’ (Goua Z
H và cs., 2019) Dựa theo sự khác biệt về
địa lý và biến thể di truyền, virus PRRS được
chia làm PRRSV-type 1 (kiểu gene châu Âu
- EU) and PRRSV-type 2 (kiểu gene Bắc Mỹ
- NA) (Kuhn và cs, 2015) Ngoài ra, dựa theo
đặc điểm gen và khả năng gây bệnh,
PRRSV-type 2 (kiểu gene Bắc Mỹ) (NA-PRRSV) có
thể được chia thành các phân nhóm chính:
PRRSV Bắc Mỹ cổ điển (C-PRRSV), phân
nhóm PRRS độc lực cao (HP-PRRSV)
và phân nhóm PRRSV giống NADC30
(NL-PRRSV) Cho đến nay, ba phân nhóm
NA-PRRSV trên đang lưu hành ở Trung
Quốc (Li Y và cs., 2017) ORF5 mã hóa cho
protein cấu trúc GP5 (khoảng 26 kDa) là
thành phần cấu thành protein vỏ (envelope
glycoprotein) cần thiết cho sự lắp ráp của
virus PRRS, thường được sử dụng trong phân
tích đa dạng di truyền và sự tiến hóa của virus
PRRS Mặc dù hầu hết các trại heo đều kiểm
soát khá hiệu quả bệnh PRRS qua việc tiêm
phòng vaccine thương mại, bệnh PRRS vẫn
xảy ra tại một số trại liên quan đến sự xuất
hiện các biến chủng của virus PRRS (Han G
và cs., 2019) Nghiên cứu phân tích di truyền
và sự biến đổi của virus PRRS thực địa, dựa
trên gene ORF5, thu được từ một số trại tại
một số tỉnh của Việt Nam năm 2021, đã được
tiêm vaccine PRRS nhưng vẫn có biểu hiện
lâm sàng liên quan đến PRRS, giúp xác định
sự đa dạng di truyền và góp phần làm rõ hơn
nguyên nhân bệnh PRRS xảy ra tại trại
2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Xác định mẫu dương tính với virus PRRS
bằng kĩ thuật RT-PCR
Tổng cộng 16 mẫu heo nghi ngờ lâm
sàng bệnh PRRS (mô hạch, thận, lách và
huyết thanh) được thu thập tại các trại heo
từ các tỉnh Đồng Nai, Đắk Nông, Hải Phòng, Vĩnh Phúc, Lai Châu Sau đó, mẫu được đồng nhất với tỷ lệ 1 g mẫu trong 1 mL nước cất, hỗn hợp sau đó được ly tâm ở 4000 vòng trong 10 phút, thu dịch ở trên để ly trích ARN của virus
ARN của virus PRRS được thu nhận bằng kit ly trích GeneJET Viral DNA/ RNA Purification Kit (Thermo, Mỹ), sau đó, cDNA của virus được tổng hợp bằng phản ứng phiên
mã ngược thông qua RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo, Mỹ) Kĩ thuật RT- PCR được thực hiện theo quy trình của Phòng xét nghiệm chẩn đoán thú y Hàn Việt, với 1 cặp primer nhân bản đoạn gene mục tiêu trên ORF6 có kích thước 508 bp, để phát hiện
sự hiện diện của virus PRRS trong mẫu thực địa Sản phẩm sau đó được điện di trên gel agarose 1,5% và quan sát dưới đèn UV
Thu nhận gene ORF5
Mẫu ARN sau khi được xác nhận dương tính với PRRSV thông qua phản ứng RT-PCR tiếp tục được sử dụng để thu nhận đoạn gene ORF5 của virus PRRS kích thước
764 bp, theo quy trình của Phòng xét nghiệm chẩn đoán thú y Hàn Việt Kết quả phản ứng RT-PCR được điện di trên gel agarose 1,5%
và quan sát dưới đèn UV
Giải trình tự và phân tích di truyền
Sản phẩm PCR sau khi được xác nhận
có chứa đoạn gene ORF5 sẽ được gửi đi giải trình tự hai chiều với cặp mồi đặc hiệu dùng trong phản ứng phát hiện gene ORF5 tại Công
ty Nam Khoa Biotek Kết quả được xử lý và lắp ráp bằng phần mềm Sequencher 5.4.6 Trình tự nucleotide và aminoacid của các mẫu được phân tích và so sánh với các trình
tự tham khảo đã công bố trên ngân hàng gene bằng phần mềm Bioedit 7.2.6 Tiến hành xây dựng cây di truyền dựa trên gene ORF5 của
16 chủng thực địa với 43 chủng tham khảo trên ngân hàng gene (Bảng 1) bằng phần mềm MEGA 7.0.26, theo phương pháp Neighbor Joining với chỉ số bootstrap 1000 lần lặp lại (Tamura và cs., 2013)
Trang 3Bảng 1 Danh sách các chủng PRRSV tham khảo dùng trong phân tích di truyền
STT Tên chủng phân lập Năm Nơi phân lập ngân hàng gen Mã truy cập Kiểu gene
Trang 43 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Trong nghiên cứu này, 16 mẫu bệnh
phẩm (hạch, lách, thận và huyết thanh) của
heo bệnh thu thập từ các tỉnh Đồng Nai, Đắk
Nông, Lai Châu, Vĩnh Phúc đã cho kết quả
dương tính với virus PRRS Sản phẩm
RT-PCR sau khi điện di trên gel agarose 1,5% cho thấy sự hiện diện của đoạn ADN có kích thước 508 bp (Hình 1) Sau đó, đoạn gene ORF5 có kích thước 764 bp, từ các mẫu ARN dương tính với virus PRRS, cũng đã được nhân bản bằng kỹ thuật RT-PCR (Hình 2)
Trong 16 chủng virus PRRS được nghiên
cứu sau khi giải trình tự thì có 11 chủng thuộc
phân nhóm PRRS độc lực cao (HP-PRRSV),
5 chủng còn lại thuộc phân nhóm PRRS Bắc
Mỹ cổ điển (C-PRRSV) (Bảng 2) Nghiên
cứu của Feng và cs (2007) ghi nhận chủng
virus PRRS phân lập ở tỉnh Quảng Nam có
kiểu gene thuộc phân nhóm chủng PRRS độc
lực cao (HP-PRRSV) Theo nghiên cứu của Nguyen và cs (2013), các chủng virus PRRS thu nhận được từ các tỉnh Việt Nam gồm Hậu Giang, Cần Thơ, Đồng Tháp, Bình Dương, Đồng Nai, thành phố Hồ Chí Minh và Điện Biên cũng cho kết quả tương tự Các nghiên cứu trên đều dựa vào sự biến đổi di truyền đối với gene ORF5 của virus PRRS
Bảng 2 Kiểu gene các chủng PRRSV thực địa trong phân tích di truyền
Hình 1 Kết quả điện di RT-PCR phát hiện
virus PRRS (508 bp)
(L): Thang DNA 100 bp;
(1): DakNong1; (2): DakNong2;
(3): DakNong3; (4): DakNong4
Hình 2 Kết quả điện di RT-PCR đoạn gene
ORF5 (764 bp)
(L): Thang DNA 100 bp;
(1): DakNong1; (2): DakNong2; (3): DakNong3; (4): DakNong4
Trang 512 DakNong2 2021 Đăk Nông HP-PRRSV
Dựa vào cây di truyền (Hình 3) cho thấy
16 chủng PRRSV thực địa trong nghiên cứu
đều thuộc về genotype 2, nhưng cơ bản phân
chia thành 2 nhóm Nhóm 1 gồm 4 chủng
PRRS thu nhận ở Đồng Nai (1/2848, 2/2848,
3/2848, 4/2848) và 1 chủng thu nhận được
ở Lai Châu, có tỷ lệ tương đồng nucleotide
với nhau rất cao, từ 99,3 - 100,0%, thuộc về
dòng US-PRRSV, trong đó 4 chủng 1/2848,
2/2848, 3/2848, 4/2848 tách riêng thành 1
nhóm phụ, gần với các chủng NADC30 - like
(NL-PRRSV) với tỷ lệ tương đồng nucleotide
với chủng tham khảo NADC30 từ 83,5 -
86,2% Bốn chủng thực địa NADC30-like
trong nghiên cứu này có tỷ lệ tương đồng
nucleotide với các chủng vaccine dòng Bắc
Mỹ cổ điển từ 83,9 - 84,4%, bao gồm các
chủng vaccine tham khảo PrimePac, Ingelvac
MLV và BSL-PS 100; tương đồng nucleotide
với các dòng vaccine độc lực cao Trung Quốc
từ 83,4 - 84,2% và với các dòng vaccine
PRRSV châu Âu chỉ ở mức từ 58,8 - 59,8%
Theo nghiên cứu năm 2019 của Wei và cs,
phân tích phát sinh loài dựa trên gene ORF5,
trên đàn heo nuôi tại Trung quốc đã xuất hiện
các chủng PRRSV thuộc dòng linaege 1, đại
diện bởi NADC30, gây tỷ lệ mắc bệnh, tử
vong cao ở heo nái và heo con
Chủng thực địa U4 thu nhận được tại
Lai Châu, Việt Nam thuộc dòng PRRSV Bắc
Mỹ cổ điển (C-PRRSV) có tỷ lệ tương đồng
nucleotide với các chủng thực địa 1/2848,
2/2848, 3/2848, 4/2848 trong cùng nhóm từ
83,5 - 83,9%, và với các chủng tham khảo trong
nhóm PRRSV Bắc Mỹ cổ điển (C-PRRSV)
từ 84,5 - 92,3% Tỷ lệ tương đồng nucleotide
của chủng U4 với các chủng vaccine PRRS
Bắc Mỹ cổ điển tham khảo gồm PrimePac,
Ingelvac MLV và BSL-PS 100 cao hơn nhiều
so với 4 chủng PRRSV thực địa thuộc nhóm
NADC-like, dao động từ 91,3 - 92,5% so với
83,9 - 84,4% So với các chủng vaccine Trung Quốc độc lực cao thì sự tương đồng về trình
tự nucleotide của chủng U4 là 93,6% với chủng vaccine JXA1-R và 93,3% với chủng vaccine JXA1 P80, JXA1 P120
Nhóm 2 gồm 6 chủng ở Đắk Nông (Daknong1, Daknong2, Daknong3, Daknong4, Daknong5 và 1402/2934), 4 chủng thu nhận được ở Hải Phòng (75/2816, 76/2816, 77/2816, 78/2816) và 1 chủng thu nhận được
ở Vĩnh Phúc (U1), thuộc về dòng HP-PRRSV
Tỷ lệ tương đồng về trình tự nucleotide của
11 chủng thực địa này với nhau từ 96,3 - 100,0% So với 3 chủng vaccine chủng Trung Quốc độc lực cao tham khảo, độ tương đồng nucleotide của ORF5 ở 11 chủng PRRSV thực địa này là ở mức 97,8 - 98,6% đối với chủng vaccine JXA1-R, 97,3 - 99,3% đối với chủng vaccine JXA1 P80 và 97,3 - 99,6% đối với chủng vaccine JXA1 P120 Trong khi đó,
tỷ lệ tương đồng về trình tự nucleotide của 11 chủng thực địa với các chủng PRRSV vaccine tham khảo dòng châu Âu chỉ từ 61,3 - 62,1%; còn so với các chủng vaccine tham khảo dòng Bắc Mỹ cổ điển là từ 87,8 - 90,3%
4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Qua phân tích di truyền, xây dựng cây sinh dòng dựa trên nucleotide gene ORF5 của
16 chủng PRRSV thu nhận được trong nghiên cứu cho thấy PRRSV tại Việt Nam có sự đa dạng di truyền khá rõ, với 2 nhóm PRRSV, nhóm PRRSV độc lực cao (HP-PRRSV) và nhóm PRRSV Bắc Mỹ cổ điển (C-PRRSV) Đặc biệt là sự xuất hiện của các biến chủng PRRSV thuộc lineage 1, nhóm NADC-like gây bệnh PRRS nghiêm trọng hơn so với chủng C-PRRSV Ngoài ra, các chủng PRRSV ngay trong cùng nhóm HP-PRRSV cũng tách ra thành 2 phân nhóm riêng: các chủng PRRSV thu nhận ở Đắk Nông và các chủng PRRSV thu nhận được ở Hải Phòng
Trang 6Các chủng PRRSV thực địa năm 2021, dựa
trên gene ORF5, có sự khác biệt di truyền
khá lớn với các chủng virus PRRS vaccine
thương mại Sự đa dạng di truyền này có thể
liên quan đến hiệu quả tiêm phòng vaccine
PRRS trên đàn heo tại Việt Nam, là cơ sở lựa
chọn và sử dụng loại vaccine phù hơp để tiêm phòng bệnh PRRS, hạn chế cao nhất rủi ro và thiệt hại cho người chăn nuôi Tuy nhiên, cần
có thêm các nghiên cứu chuyên sâu để theo dõi sự biến đổi của virus PRRS và sự phù hợp của vaccine PRRSV ở Việt Nam
Hình 3 Cây di truyền dựa trên trình tự nucleotide của gen ORF5 của các chủng virus PRRS
Cây di truyền được xây dựng theo
phương pháp Neighbor-Joining bằng phần
mềm MEGA 6.06 Các con số ở mỗi nhánh
đại diện cho phần trăm giá trị bootstrap với
1000 lần lặp lại (Giá trị < 70 không được trình bày).l Các chủng virus PRRS khảo sát; Các chủng virus PRRS vaccine
Trang 7TÀI LIỆU THAM KHẢO
Wei C H., Ailing Dai, Jialin Fan, Yan Li,
Anni Chen, Xia Zhou, Manlin Luo,
XiaoyanYang and Jiankui Liu (2019)
Efficacy of Type 2 PRRSV vaccine
against challenge with the Chinese
lineage 1 (NADC30-like) PRRSVs in
pigs Scientific Reports 9:10781
J H Kuhn, M Lauck, A.L Bailey, A.M
Shchetinin, T.V Vishnevskaya, Y Bao, et
al (2016) Reorganization and expansion
of the nidoviral family Arteriviridae
Arch Virol., 161: 755-768
Nguyen Thi Dieu Thuy, Nguyen Thi Thu,
Nguyen Giang Son, Le Thi Thu Ha, Vo
Khanh Hung, Nguyen Thao Nguyen
and Do Vo Anh Khoa (2013) Genetic
analysis of ORF5 porcine reproductive
and respiratory syndrome virus isolated in
Vietnam Microbiol Immunol 57: 518-526
Li Y., Guobiao J, Xiaodong Xu, Juan Wang,
Yingying Li , Feifei Tan and Xiangdong Li
(2017) Development and Application of
an RT-PCR to Differentiate the Prevalent
NA-PRRSV Strains in China The Open
Virology Journal 11.(Suppl-1, M4): 66-72
Feng Y., Tiezhu Zhao, Tung Nguyen, Ken Inui, Ying Ma, Thi Hoa Nguyen, Van Cam Nguyen, Di Liu, Quang Anh Bui, Long Thanh To, Chuanbin Wang, Kegong Tian, and George F Gao (2008) Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus Variants, Vietnam and China, 2007 Emerging Infectious Diseases 14(11): 1774-1776
Guoa Z., Xin-xin Chena, Xiang Lid, Songlin Qiaoa, Ruiguang Denga, Gaiping Zhang,
et al (2019) Prevalence and genetic characteristics of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in central China during 2016-2017: NADC30- like PRRSVs are predominant Microbial Pathogenesis
Han G., HuilingXu, KexiongWang and Fang
He, 2019 Emergence of Two different recombinant PRRSV strains with low neutralizing antibody susceptibility in China Scientific Reports 9: 2490
