2.3.3 Làm tiêu bản nhuộm vi bào tử trùng Microsporidia Nghiền phần cơ bị nhiễm bào nang Microsporidia trong nước muối sinh lý.. 3 KẾT QUẢ 3.1 Tỉ lệ nhiễm và cường độ nhiễm bào nang Kết
Trang 1KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU BƯỚC ĐẦU VỀ
BỆNH GẠO Ở CÁ TRA (Pangasianodon
hypophthalmus)
Nguyễn Thị Thu Hằng 1 và Đặng Thị Hoàng Oanh 1
ABSTRACT
A total of 324 samples of stripped catfish (Pangasianodon hypophthalmus) were collected from 10 grow out pond at several location in the Mekong Delta from July to December 2009 These samples were subjected to gross observation, fresh smear and histopathological analysis Result from fresh smear observation showed that 133 fish samples displayed opalescent or milky oval shaped cysts which sizes were around 0,5-4 mm These fish did not show any typical infected sign Their sizes ranged from 10 g to 910 g The number of cysts in individual fish varied greatly from 0-49 cysts/fish, but commonly about 1-5 cysts/fish Result from histopathological analysis showed necrotic channges developed in muscle fibres and the necrotic areas were replaced by parasite stages and spores
Keywords: Striped catfish, Microsporidia, Myxobolus, Parasitic disease
Title: Preliminary results of the study on Microsporidia and Myxobolus parasitic disease on the stripped catfish (Pangasianodon hypophthalmus)
TÓM TẮT
Tổng cộng có 324 mẫu cá tra được thu từ 10 ao nuôi ở một số địa phương thuộc vùng Đồng bằng sông Cửu Long trong thời gian từ tháng 7 đến tháng 12 năm 2009 Mẫu cá được quan sát dấu hiệu bệnh lý, soi tiêu bản tươi và phân tích mô bệnh học Kết quả soi tươi cơ cá có 133/324 mẫu có chứa bào nang màu trắng đục, kích cỡ dao động từ 0,5-4 mm Cá có chứa bào nang ở cơ không có dấu hiệu bệnh lý bên ngoài đặc trưng Kích thước cá nhỏ nhất có chứa bào nang là 10g và lớn nhất là 910 g Các mẫu cá chứa bào nang với cường độ nhiễm khác nhau, phổ biến từ 0-5 bào nang/cá, đặc biệt có những cá thể có đến 49 bào nang Kết quả phân tích mô học cho thấy vùng cơ cá tra bị nhiễm bào tử trùng bị mất cấu trúc và hoại tử Vùng bị hoại tử chứa đầy các bào tử trùng
Từ khóa: Cá tra, bệnh gạo, Microsporidia, Myxobolus
Trang 21 GIỚI THIỆU
Cá tra là một trong những đối tượng nuôi phổ biến ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL), tập trung nuôi nhiều nhất ở các tỉnh Đồng Tháp, An Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long Xuất phát từ những nhu cầu về kinh tế, thị trường trong
và ngoài nước, nghề nuôi cá tra đòi hỏi phải đáp ứng một sản lượng cá thịt lớn nên mật độ và diện tích nuôi ngày càng tăng đáng kể Hiện nay nghề nuôi cá tra chủ yếu được nuôi thâm canh trong ao đất Do chi phí đầu tư thấp, mức độ thâm canh cao nên dễ sinh nhiều vấn đề dịch bệnh vì khó quản lý tốt môi trường nước ao nuôi Bệnh thường xuất hiện ra trên cá tra do nhiều tác nhân gây ra như ký sinh trùng, vi khuẩn, nấm hoặc do môi trường, dinh dưỡng Một
số tác nhân gây bệnh là ký sinh trùng có thể gây thiệt hại về kinh tế cho người nuôi cá tra như trùng quả dưa, trùng mặt trời, sán lá đơn chủ, bào tử trùng Gần đây, trên cá tra xuất hiện một loại bệnh mới do ký sinh trùng gây ra Do hình thái bào nang của ký sinh trùng có hình tròn hoặc bầu dục, màu trắng sữa giống hạt gạo nên người nuôi cá gọi là bệnh “gạo” Bệnh “gạo” không làm cho
cá chết hàng loạt nhưng làm cá gầy yếu và làm giảm giá trị thương phẩm, đặc biệt là sản phẩm thịt cá không tiêu thụ được Hơn nữa, nếu tỉ lệ nhiễm và cường độ nhiễm “gạo” cao cũng có thể gây chết cá và làm thiệt hại lớn Hiện nay còn rất ít thông tin và hầu như chưa có một nghiên cứu đầy đủ nào về bệnh gạo trên cá tra ở Việt Nam Trong báo cáo này chúng tôi trình bày một số kết quả nghiên cứu bước đầu về bệnh gạo ở cá tra cung cấp thông tin cho các nghiên cứu phòng trị bệnh gạo một cách khoa học và hiệu quả
2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Phương pháp thu mẫu
Mẫu cá được thu ngẫu nhiên tại các ao nuôi ở Vĩnh Long, Hậu Giang và Cần Thơ từ tháng 7-12/2009 Số lượng mẫu thu từ 10-15 con/ao (giai đoạn cá giống đến cá thịt) Cá được vận chuyển sống về phòng thí nghiệm bằng thùng nhựa hoặc thùng xốp có chứa một ít nước và sục khí Đối với cá vừa mới chết thì trữ lạnh bằng nước đá, vận chuyển về phòng thí nghiệm và phân tích trong ngày
2.2 Phương pháp phân tích mẫu
2.2.1 Lấy mẫu cơ cá
Dùng kim mũi giáo hủy não cá, cân trọng lượng và đo chiều dài cá Đặt cá nằm trên thớt, dùng dao cắt một đường ngang sau phần đầu cá, tiếp tục cắt dọc theo thân cá, từ đầu xuống đuôi theo vết cắt đầu tiên Cẩn thận cắt sát phần cơ gần xương sống theo chiều từ mặt lưng xuống mặt bụng và cắt rời phần cơ này ra khỏi cơ thể cá Thực hiện tương tự với phần cơ còn lại Dùng dao cắt bỏ phần
da và rửa sạch mẫu
Trang 32.2.2 Phương pháp soi tươi và nhuộm tiêu bản
Phân tích mẫu cá tra bệnh gạo bằng phương pháp soi tươi và nhuộm tiêu bản
theo phương pháp của Tonguthai et al., (1999)
2.3 Kiểm tra ký sinh trùng
2.3.1 Soi tươi
Dùng đĩa petri φ16 ép mẫu cơ cá, tiến hành quan sát mẫu cơ dưới ánh sáng đèn neon hoặc ánh sáng mặt trời để tìm các bào nang màu trắng sữa lẫn trong cơ cá Đối với mẫu cá lớn, cần cắt lát mỏng phần cơ ra để dễ quan sát Trường hợp mẫu cá có những bào nang nhỏ, khó thấy thì quan sát dưới kính hiển vi soi nổi Đếm số lượng bào nang ký sinh trong cơ
Thu bào nang, loại bỏ các phần cơ xung quanh để lên lam sạch Dùng kim mũi giáo chọc thủng bào nang Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi ở vật kính 10X, 40X để xác định giống loài
2.3.2 Làm tiêu bản nhuộm thích bào tử trùng Myxosporea
Thu bào nang của bào tử trùng để lên lame sạch Dùng kim mũi giáo chọc thủng bào nang Để tiêu bản khô ở nhiệt độ phòng rồi nhuộm với thuốc nhuộm nitrat bạc AgNO3 (có thể gắn tiêu bản không nhuộm) Gắn tiêu bản bằng glycerol-jelly Quan sát mẫu dưới kính hiển vi ở ở vật kính 10X, 40X
2.3.3 Làm tiêu bản nhuộm vi bào tử trùng Microsporidia
Nghiền phần cơ bị nhiễm bào nang Microsporidia trong nước muối sinh lý
Lấy 1 giọt huyền phù đã nghiền cho lên lam và đậy lame lại Để khô ở nhiệt độ phòng Nhuộm dung dịch Giemsa (Tonguthai, 1999) Cho glycerol-jelly vào cạnh của lame Kiểm tra tiêu bản dưới kính hiển vi ở vật kính 10X, 40X và 100X
2.4 Phương pháp mô bệnh học
Dùng dao tiểu phẫu cắt rời phần cơ có chứa bào nang, cố định mẫu trong lọ nhựa có chứa Formol 10% theo tỉ lệ formol: cơ là 10:1 trong 24 giờ Sau đó tiến hành rửa mẫu dưới vòi nước trong thời gian 5 phút, chuyển mẫu sang dung dịch ethanol 70% cho đến khi phân tích mô học Mẫu được cắt với độ dày từ
5-7 µm và xử lý qua các giai đoạn: loại nước, làm trong mẫu và tẩm paraffin Sau
đó mẫu được đúc khối, cắt và dán lên lame rồi nhuộm Haematoxylin & Eosin Tiêu bản được quan sát dưới kính hiển vi lần lượt ở độ phóng đại 10X, 40X và 100X và chụp hình tiêu bản đặc trưng
2.5 Xử lý số liệu
Mức độ nhiễm bệnh gạo được tính bằng tỉ lệ nhiễm [(tổng số cá nhiễm bệnh/tổng số cá kiểm tra) x 100] và cường độ nhiễm (số bào nang/cơ cá)
Trang 43 KẾT QUẢ
3.1 Tỉ lệ nhiễm và cường độ nhiễm bào nang
Kết quả soi tươi 324 mẫu cá tra đã phát hiện 133 mẫu cá nhiễm bào nang (bệnh gạo) của ký sinh trùng ở nhiều mức độ khác nhau
Qua 4 đợt thu mẫu trong các ao nuôi ở Hậu Giang đã thu được 77 mẫu cá, trong đó có 31 cá bị bệnh gạo (chiếm 40%) và 46 cá không bệnh Kích cỡ trung bình cá bị bệnh gạo là 85,5 g Cường độ nhiễm trung bình 3 bào nang/cá Cá biệt ở đợt thu mẫu tháng 8 đã thu được 1 cá bệnh với cường độ nhiễm đến 49 bào nang và các bào nang có kích thước khác nhau
Tổng số cá thu ở Vĩnh Long qua 5 đợt thu mẫu là 128 cá, trong đó có 61 cá bệnh (chiếm 47,6%) và 67 cá khỏe Kích cỡ trung bình cá nhiễm bệnh gạo là
395 g Cường độ nhiễm trung bình 4 bào nang/cá Một số cá nhiễm bệnh gạo với cường độ nhiễm dày đặc cao nhất là 27 bào nang/cá, các bào nang lớn hình tròn hay hình bầu dục có chiều dài 2-3 mm Những cá này còn có biểu hiện vàng da bên ngoài với các mức độ nặng nhẹ khác nhau Khi mổ cá để phân tích nhận thấy phần cơ thịt phân hủy rất nhanh và có mùi hôi
Ở Cần Thơ, qua 5 đợt thu mẫu ở Thới Lai với tổng số mẫu cá thu được là 78 mẫu, trong đó có 31 cá bệnh và 47 cá khỏe Trọng lượng trung bình cá bị bệnh
là 450 g Tỷ lệ nhiễm trung bình là 57,5% và cao nhất ở tháng cuối vụ nuôi là 85,7% Cường độ nhiễm trung bình 3 bào nang/cá Riêng 2 đợt thu mẫu từ ao ương cá giống ở Ô Môn có 41 mẫu cá, trong đó có 10 cá bệnh (chiếm 24,3%) với kích cỡ cá từ 10-70 g Kết quả phân tích mẫu đã phát hiện những cá bị bệnh gạo ở kích cỡ khá nhỏ (10,5 g) Tuy nhiên mức độ nhiễm trung bình thấp, với
tỷ lệ nhiễm 15% và cường độ nhiễm 1 bào nang/cơ cá Một số mẫu cá 60 g có cường độ nhiễm cao nhất là 9 bào nang/cơ cá
3.2 Dấu hiệu bên ngoài của cá tra bệnh gạo
So với cá không nhiễm bệnh gạo, cá nhiễm bệnh gạo ở giai đoạn sớm thường không có dấu hiệu bệnh rõ ràng bên ngoài cơ thể Một số cá có da bị sần và có những chấm hay vệt đen tập trung nhiều ở chỗ có vùng da mỏng như vùng bụng Khi mổ cá, hầu hết các bào nang tồn tại trong cơ có dạng những túi tròn hay những vệt dài kích thước dao động từ 0,5-4 mm, bên trong chứa một chất lỏng hơi sệt màu trắng sữa (Hình 1) Đặc biệt là ở những cá nhiễm nặng, các bào nang thường có xu hướng tập trung nhiều ở phần cơ chính giữa gần cơ quan đường bên của cá Khi các bào nang bệnh gạo ký sinh gây bệnh trên cơ thể cá thường gây ra hiện tượng hoại tử vùng cơ xung quanh bào nang Các vùng hoại tử này có xu hướng phát triển theo kích cỡ của bào nang và tạo thành
khoảng trống bên trong cơ cá Theo Lom et al (1999), khi nghiên cứu về sự phá hủy tế bào ký chủ của nhóm Microsporidia cho thấy, một số loài có các
giai đoạn phát triển được bao quanh bởi một vùng cơ bị phân hủy hoàn toàn
Trang 5enzym có cơ chế phân hủy và hóa lỏng cơ của tế bào ký chủ giống như những loài thuộc nhóm Myxosporean gây ra ở cá biển
Hình 1: Cơ cá tra nhiễm bào tử trùng, bào nang có dạng màu trắng sữa, giống
như hạt gạo
3.3 Đặc điểm bào tử bên trong bào nang
Khi lấy bào nang trong cơ ép trên lam và quan sát dưới kính hiển vi ở các độ phóng đại khác nhau thấy có rất nhiều bào tử nhỏ bên trong Một số bào nang
có chứa cả hai loại bào tử với hai kích cỡ khác nhau Những bào tử có kích cỡ lớn gấp 10 lần bào tử nhỏ chiếm số lượng rất ít (4-5 bào tử/TT) Khi quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi (Hình 2B) ở vật kính 40X có thể nhìn thấy rõ bào tử nhỏ có dạng hình quả lê (Hình B-a) tương tự cấu trúc của nhóm Microsporidia
và bào tử lớn có 2 cực nang (Hình B-b) thuộc giống Myxobolus (Lom và
Dykova, 1992)
Hình 2: (A) (Æ) Bào tử Myxobolus trong bào nang (tiêu bản tươi), 10X; (B) Bào
tử quan sát ở vật kính 40X: (Æa) Bào tử Microsporidia; (Æb) Bào tử
Myxobolus
A
B
a
b
Trang 6Khi nhuộm tiêu bản mẫu bào nang bệnh gạo bằng thuốc nhuộm Giemsa và
quan sát dưới kính hiển vi nhận thấy các bào tử bắt màu xanh của thuốc nhuộm
ở phần cực nang (Hình 3C) Khi nhuộm với thuốc nhuộm nitrat bạc các bào tử
bắt màu nâu nhạt (Hình 3D)
Hình 3: (C) Thích bào tử trùng Myxobolus bắt màu xanh ở phần cực nang khi
nhuộm Giemsa (D) và bắt màu nâu nhạt khi nhuộm AgNO3 (40X) (a: vi
bào tử trùng Microsporedia; b: thích bào tử trùng Myxobolus)
3.4 Đặc điểm mô bệnh học của cơ cá tra bị bệnh gạo
Ở cá tra khỏe, cơ vân phân bố dọc hai bên thân cá, cơ nằm dưới lớp hạ bì của
da Khi quan sát mặt cắt dọc của lớp da cơ từ ngoài vào trong ta thấy đầu tiên
là lớp biểu bì của da kế đến là lớp hạ bì và trong cùng là lớp cơ Ở mặt cắt dọc
quan sát thấy các sợi cơ chạy dọc và bên trong có một nhân (Hình 4A) Ở mặt
cắt ngang quan sát thấy các bó cơ có hình đa giác hoặc hình tròn nhưng không
thấy nhân Giữa các bó cơ này là mô liên kết (Hình 4B)
Hình 4: (A) Bó cơ khỏe (H&E, 40X) (lát cắt dọc); a Các sợi cơ; b Nhân tế bào
(B) Bó cơ khỏe (H&E, 40X), (lát cắt ngang) a Các bó cơ, b Mô liên kết
C D
A B
a
b
Trang 7Kết quả phân tích mô bệnh học ghi nhận được hình dạng bào nang và bên trong
là vùng cơ đã bị hoại tử (Hình 5), ngoài bào nang có một lớp màng mỏng mô liên kết để bao bọc những bào tử (Hình 6)
Hình 5: Vùng cơ bị mất cấu trúc (H&E) A vùng cơ bị hoại tử (mẫu M-P4-S2)
(40X) B vùng cơ bị hoại tử (mẫu M-P2-S2) (40X)
Hình 6: Mô liên kết (Æ) bên ngoài bào nang (mẫu M-P6-S2) (H&E, 400X)
Khi thích bào tử trùng Myxobolus và vi bào tử trùng Microsporidia xâm nhập
vào cơ của cá tra tạo ra những bào nang trong cơ cá gây hủy hoại tế bào vùng
ký sinh và khi số lượng bào tử phát triển quá mức sẽ làm vỡ bào nang, tạo điều kiện cho bào tử lan sang những vùng khác, lúc đó sẽ có nhiều vùng cơ mà chúng ký sinh bị mất cấu trúc Những vùng cơ khỏe thì từ những bó cơ lớn sẽ chuyển thành những bó cơ nhỏ hơn (Hình 5) và dần dần những bó cơ đó sẽ được thay thế bằng những bào tử (Hình 6) Một số tiêu bản của mẫu cá bệnh
khi quan sát thì vùng cơ xung quanh thấy có dấu hiệu bị Microsporidia sp tấn
công Kết quả trên phù hợp với nghiên cứu của Lom và Dykova (2000) về sự
Trang 8lan Những thay đổi chính về mô học gây ra bởi Microsporidia sp được tìm
thấy ở cơ bên, cơ lưng, cơ bụng Hầu hết các khối cơ bên bị che kín bởi các bào
tử Những thay đổi nghiêm trọng về cấu trúc trong mô cơ đi kèm với sự nhân
lên của Microsporidia sp và sự lây lan của sự truyền nhiễm đều chiếm ưu thế
trong các mẫu được quan sát Thêm vào đó sự thay đổi về cấu trúc của những sợi cơ đặc trưng như sự mất đi của những sợi cơ, hoại tử cơ được quan sát ở tất
cả các giai đoạn phát triển cũng như ở ngoại vi thay vào đó tập hợp các bào tử khổng lồ, tổng thể này lớn lên tăng kích thước hoặc ít tỏa tròn hơn
4 KẾT LUẬN
Cá giống có khối lượng khoảng 10 g đã nhiễm bào nang (bệnh gạo) của ký sinh trùng, mức độ nhiễm khác nhau theo kích cỡ cá Một số mẫu nhiễm bào nang chứa 2 loại bào tử có kích thước khác nhau, một loại bào tử có kích thước lớn
có 2 cực nang thuộc giống Myxobolus chiếm số lượng ít và 1 loại có kích thước nhỏ có 1 cực nang thuộc nhóm Microsporidia chiếm số lượng rất nhiều Khi bị bệnh gạo, vùng cơ cá tra bị nhiễm bệnh bị mất cấu trúc và hoại tử Vùng
bị hoại tử được thay thế bằng các bào tử của ký sinh trùng
LỜI CẢM TẠ
Tác giả xin chân thành cảm ơn đến sinh viên Hồ Hữu Trọng và Lê Thu Hồng lớp Bệnh học Thủy sản 32 đã tham gia phân tích mẫu nghiên cứu
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Lom, J and I Dykova, 2000 Histopathology of kabatana arthuri (Microspora)
infection in sutchi catsfish, Pangasius sutchi Folia parasitologica 47:
161-166
Lom, J and I Dykova 1992 Protozoan parasite of fish Developments in Aquaculture and Fisheries Science, Vol 26 Elsevier, Amsterdam 1992, 315
pp
Lom, J I Dykova and K Tonguthai 1999 Kabataia gen.n., a new genus proposed for icrosporidium spp infecting trunk muscles of fishes Diseases of Aquatic Organisms Vol 38: 39-46
Tonguthai, K., S Chinabut, T Somsiri, P ChanratChakoo and S Kanchanakhan
1999 Diagnostic Procedures for Finish Diseases Aquatic Animal (Health Research institute (AAHRI) Department of fisheries kasetsart University campus Bangkok, Thailand
