SINH HỌC PHÂN TỬ SINH HỌC PHÂN TỬ BÀI 1 HÓA MÔ MIỄN DỊCH TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH U có nguồn gốc thần kinh nội tiết Synaptophysin Mô cơ trơn Actin Mô tuyến giáp Thyroglobulin Mô tuyến tiền liệt PSA Cặp đôi kháng thể CK7CK20 được dùng để chẩn đoán Xác định nguồn gốc các carcinoma di căn Phân biệt carcinoma tuyến và carcinoma gai Cặp đôi kháng thể kappalambda được dùng để chẩn đoán phân biệt tăng sản mô lympho lành tính với lymphoma Để đạt kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch tốt nhất, mẫu mô sau khi lấy.
Trang 1BÀI 1: HÓA MÔ MIỄN DỊCH TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH
- U có nguồn gốc thần kinh nội tiết: Synaptophysin
- Mô cơ trơn: Actin
- Mô tuyến giáp: Thyroglobulin
- Mô tuyến tiền liệt: PSA
- Cặp đôi kháng thể CK7/CK20 được dùng để chẩn đoán:
o Xác định nguồn gốc các carcinoma di căn
o Phân biệt carcinoma tuyến và carcinoma gai.
- Cặp đôi kháng thể kappa/lambda được dùng để chẩn đoán: phân biệt tăng sản mô lympho lành tính với lymphoma
- Để đạt kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch tốt nhất, mẫu mô sau khi lấy ra khỏi người bệnh
nhân phải bỏ vào dung dịch cố định ngay, không lâu hơn 30 phút.
- Kháng thể CK (cytokeratin) dùng để xác định mô có nguồn gốc từ: biểu mô
- Kháng thể LCA dùng để xác định mô có nguồn gốc từ: mô lympho
- Để điều trị Ritixumab trong Lympho không Hodgkin, dựa vào xét nghiệm dương tính nào sau đây: CD20 (sẽ đáp ứng tốt với kháng thể đơn dòng)
- CD 30 dương tính rải rác trong mô hạch có nghĩa gì: chẩn đoán bệnh Hodgkin (TB Reed-Sternberg)
- Để điều trị Trastuzumab trong bệnh ung thư vú, cần làm thêm xét nghiệm nào: nhuộm
hóa mô miễn dịch HER2
- Để chẩn đoán phân biệt u lành và u ác ở tuyến vú có thể nhuộm hóa mô miễn dịch với
kháng thể nào: p.63, dương trong u nhú trong ống dẫn sữa, âm trong carcinoma vú dạng nhú.
- Để chẩn đoán u lành và ác ở tiền liệt tuyến, nhuộm hóa mô miễn dịch với kháng thể: p63-đám tuyến ác tính cho phản ứng nhuộm âm tính.
- Để điều trị GLEEVEC trong u mô đệm đường tiêu hóa cần làm xét nghiệm nào: nhuộm
hóa mô miễn dịch CD117
Trang 2BÀI 2: RỐI LOẠN GEN DO BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ
- Cấu trúc nhiễm sắc thể:
o Được cấu tạo bởi ADN và PROTEIN, mang thông tin di truyền, cần cho sự phát triển của tế bào
o NST có phần tâm centromere và phần tận telomere
o NST tâm giữa hoặc lệch giữa có nhánh p ngắn và nhánh q dài
o Tâm giữa (metacentric): 2 vai bằng nhau.
Tâm đầu (acrocentric): 2 vai không bằng nhau
Tâm mút (telocentric): tâm động nằm gần cuối
- Cấu trúc và chức năng Centromere của nhiễm sắc thể
o Là vị trí gắn kết của 2 chromatide
o Có vai trò trong quá trình phân bào
- Cấu trúc và chức năng Telomere của nhiễm sắc thể
o Là nắp tận của NST
o Duy trì cấu trúc nguyên vẹn của NST
o Giúp định vị NST
o Đảm bảo việc sao mã hoàn tất
- Chu kỳ tế bào
o Gồm các giai đoạn G1 10-12h, S 6-8h, G2 3-4h và Mitosis 1h
o Nhiễm sắc thể quan sát rõ nhất ở kỳ giữa của M
o Chu kỳ tế bào khoảng 24h
- Khái niệm về interphase và metaphase
o interphase là các giai đoạn của chu kỳ tế bào, gồm S G1 G2, NST không quan sát được
o metaphase là 1 giai đoạn của sự phân chia tế bào, NST cuộn nhiều và dễ phân biệt nhất
o từ kỳ sau của nguyên phân đến trước khi nhân đôi ADN trong giai đoạn S thì NST
là sợi đơn
- Ưu điểm của NST đồ:
o phát hiện được bất thường NST
Trang 3- Khuyết điểm NST đồ:
o đòi hỏi tế bào phải phân chia và phải thu được TB ở kỳ giữa
o băng NST > 10 Mb
o kết quả trong vòng 2 tuần, sớm nhất 3 ngày
o phân tích khoảng 20-30 tế bào
o không phát hiện tái sắp xếp ẩn, khuyếch đại gen
- Ưu điểm của kỹ thuật FISH:
o phát hiện được khuếch đại gen
o đoạn dò đặc hiệu nên phát hiện được tái sắp xếp ẩn
o cho kết quả nhanh trong 24g
o phát hiện được bất thường NST trên cả tế bào không phân chia
o phân tích được nhiều tế bào 200-500 độ nhạy phát hiện bất thường 1%
o đoạn dò được gắn huỳnh quang lai hóa với đoạn NST muốn khảo sát nằm trong tế bào
- Khuyết điểm của FISH
o không phát hiện được bất thường đi kèm vì không quan sát được toàn bộ cấu trúc NST
- Việc phát hiện bất thường NST
o Giúp chẩn đoán
o Quyết định phác đồ
o Đánh giá đáp ứng điều trị
- Các loại bệnh phẩm có thể nuôi cấy NST (trừ mẫu paraffin block)
o Máu ngoại biên và tủy xương
o Dịch ối và gai nhau
o U đặc
o Nuôi cấy trong vong1-2h sau lấy mẫu, không làm đông
- Chất kích thích trong nuôi cấy NST
o Tế bào B non: không dùng chất kích thích
o Tế bào B trưởng thành: LPS, TPA, EBV
- Nuôi cấy tế bào dòng tủy: IL3, 6, GM-SCF(tb bth cũng có thể phát triển)
- Nuôi cấy tế bào lympho T trưởng thành: PHA-M, pokeweed mitogen
Trang 4- Các yếu tố cần thiết trong nuôi cấy NST
o Môi trường cấy RMPI 1640, MEM, HamF10
o Huyết thanh phôi bò
o Một số chất kích thích tùy loại tế bào được cấy
- Các yếu tố cần thiết trong môi trường nuôi cấy NST
o Mẫu bệnh phẩm
o Môi trường nuôi cấy
o Nhiệt độ, độ ẩm
- Các phương pháp nhuộm băng NST
o Băng G: nhuộm Giêmsa, tập trung vùng nhiều AT, ưu tiên vì lưu tiêu bản lâu
o Băng R: nhuộm vùng GC
o Băng Q: nhuộm Quinacrine
o Băng C: nhuộm centromere
o Băng T: nhuộm telomere
- Rối loạn gen trong hội chứng Down
o Hiện diện thêm NST làm tăng biểu hiện gen
o SOD1 gây lão hóa sớm, giảm miễn dịch
o DYRK làm chậm phát triển tâm thần
o COL6A1 khiếm khuyết tim
o CYA1 gây đục thủy tinh thể
o ETS2 có thể gây bất thường xương
- Bất thường NST trong hội chứng Edwards
o Có 3 dạng bất thường NST là trisomy 18, thể khảm và thể chuyển vị NST 18
o Hơn 98% gây tử vong, sinh ra thì sống <1 năm
o Tăng biểu hiện của gen Transthyretin (TTR) vận chuyển thyroxine và retinol, quan trọng cho sự phát triển bình thường của thai
- Bất thường NST trong hội chứng Turner
o Có thể mất hoàn toàn hoặc mất một phần NST X
o Tăng biểu hiện của MIS Mullerian inhibiting substance có thể gây thất bại trong quá trình biệt hóa buồng trứng
Trang 5- Bất thường NST trong hội chứng Patau
Esterase D (ESD, định vị tại 13q14.11) vai trò trong việc giải độc vì vậy nó có vai trò
trong sự phát triển của gan và thận.
- Rối loạn gen trong hội chứng Klinefelter : câu sai: Tăng biểu hiện của GTP PB6 tương quan thuận với khả năng ngôn ngữ tùy thuộc vào tăng thêm 1 hoặc >1 NST X.
Đúng:
o Tăng biểu hiện của GTP PB6 tương quan nghịch với khả năng ngôn ngữ tùy thuộc vào tăng thêm 1 hoặc >1 NST X
o Tăng biểu hiện các gen trên NST X làm giảm biểu hiện của các gen chịu trách nhiệm sản xuất testosteron huyết tương
o Thường gặp là nam mang bộ NST 47XXY, có thể có kiểu hình là nữ
o Tăng biểu hiện của XIST (X inactive-specific transcript ): bất hoạt ¬ nhiều gen trên NST
X trên KS tương tự như người nữ (XX)
- Rối loạn gen trong đa bội
o Giảm biểu hiện gen mã hóa Asparagine synthetase Tăng biểu hiện gen SLC19A1 (mã hóa chất vận chuyển MTX vào tb) ¬ trên NST 21 tăng tích tụ của MTX polyglutamates trong tế bào (thường có 3, 4 NST 21/đa bội)
o Tăng biểu hiện của gen proapoptotic CAS-P8AP2 tại NST 6q15 ¬ tế bào blast đa bội có
xu hướng trải qua quá trình chết theo chương trình tế bào một cách tự phát khá rõ.
- Marker chromosome là
o NST bất thường nhưng chưa định danh được
o Khi đã xác định thì định danh bất thường
- Ring chromosome
o NST bị gãy ở 2 đầu tận và tự nối lại với nhau
- Các bất thường cấu trúc NST có thể tạo ra tổ hợp gen, chọn câu sai: mất đoạn phần nhánh ở NST( do làm giảm các gen ở phần NST bị mất)
o Chuyển vị cân bằng
o Đảo đoạn NST
o Chèn đoạn NST (có thể tạo ra tổ hợp gen, có thể tăng thêm phần gen)
o Mất đoạn ở phần trong của NST
- Đồng NST
o Tăng thêm 1 lần phần gen, 2 phần nhánh p,q đối xứng nhau qua tâm
o Tương tự như trisomy
o Tùy điểm gãy có chứa centromere không, khi nhân đôi NST có thể có 2
centromere
Trang 6BÀI 3: BẤT THƯỜNG NST VÀ GEN TRONG HUYẾT HỌC
o Rối loạn tăng sinh tủy MPN
o Bạch cầu cấp dòng tủy AML
o Bạch cầu cấp dòng lympho ALL
o Lymphoma
o Đa u tủy
-Rối loạn tăng sinh tủy MPN Bạch cầu cấp dòng tủy
AML t(9,22)
BCR/ABL CML và ALL Philadelphia
Đb kháng Imatinib JAK2V617F
t(8,21)
AML1/ETO
cKIT
t(15,17)
AML-M3 PML (15) RARA(17) Inv(16)
- Kỹ thuật phát hiện gen ( BCR22/ABL9) không dùng được FISH
o RT-PCR
o RQ-PCR
- Tổ hợp gen BCR/ABL
o Điểm gãy major tạo ra 2 kiểu bản sao b2a2 và b3a2
o Gãy miner tạo kiểu bản sao e1a2 gây ALL
- Chuyển vị t(9,22)
o Gặp trong CML và ALL
o Tạo ra tổ hợp gen BCR/ABL trên NST 22
o Phát hiện bằng NST hoặc FISH tìm NST Philadelphia
Trang 7- Đột biến kháng Imatinib trong CML
o Thường gặp là đột biến thay đổi nucleotide (TAC-CAC)(GAG-AAG)
o Có 30 vị trí và 44 loại đột biến
o Phát hiện bằng giải trình tự hoặc ASO-PCR
o Dựa vào kiểu đột biến để quyết định tăng lều hay ngưng Imatinib
o Đột biến T315I là đột biến kháng mạnh với Imatinib
- Theo dõi CML
o Huyết đồ dùng đánh giá đáp ứng về mặt huyết học
o NST Phil đánh giá về mặt di truyền: đếm tỉ lệ tế bào mang NST
o Về mặt sinh học phân tử: Đo số copy BCR/ABL
- Kỹ thuật phát hiện nhiễm sắc thể Phil22
o Nhiễm sắc thể đồ
o FISH
- Kỹ thuật phát hiện đột biến JAK2V617F
o Giải trình tự gen
o PCR
(Mức độ NST làm NST đô và FISF, mức độ gen làm PCR rồi giải trình tự)
- Đột biến p.V617F của gen JAK2 trong hội chứng tăng sinh tủy thuộc loại đột biến nào
o Thêm chức năng (đột biến trên H2 mất điều hòa ngược H2 lên H1, làm tăng đáp ứng với epo)
- Đột biến thêm chức năng của gen JAK2 gây rối loạn tăng sinh tủy
o Tập trung vào vùng exon 12-15, nhiều nhất ở codon 617
o Gặp trong đa hồng cầu nguyên phát (codon 617 chiếm 97%, tăng tiểu cầu nguyên phát 60% xơ tủy nguyên phát 60%)
- Chuyển vị t(8,21) (sai là phát hiện bằng giải trình tự)
o Phát hiện bằng FISH, NST đồ
o Gặp trong AML
o Bệnh nhân có tiên lượng tốt nếu không có đột biến gen cKIT
o Tạo ra tổ hợp gen AML1/ETO
Trang 8- Phân nhóm nguy cơ AML
o Phân nhóm theo bất thường NST, gen
o Chia làm 3 nhóm tốt, trung bình và xấu
- Chuyển vị t(15,17)(q22,q12)
o Đặc hiệu cho AML-M3
o PML (15q22) RARA(17q12)
o Tạo ra tổ hợp gen nằm trên NST 15 (PML15/RARA17)
o Thuộc nhớm có tiên lượng tốt.
o PML là đích tác dụng của ATO, làm tế bào đi vào chu trình chết tự nhiên.
o RARA là đích tác dụng của ATRA , làm tế bào biệt hóa
- Các gen đột biến có giá trị tiên lượng trong AML
o cKIT: tb
o NMP1: nặng
o FLT3: nặng
- Bất thường NST có giá trị tiên lượng tốt trong AML
o t(8,21)
o Inv(16)
o t(15,17)
- Phân nhóm nguy cơ của AML theo bất thường NST và gen:
o Tốt t(8,21) inv(16) t(15,17)
o Trung bình: NST đồ bình thường
o Xấu: bất thường phức tạp
- Đột biến kháng Imatinib trong BML
o Thường gặp là đột biến thay đổi nucleotide
- Bất thường NST có giá trị tiên lượng tốt trong ALL
o t(12,21)
Trang 9o đa bội > 50 tế bào
- Bất thường NST trong ĐA U TỦY
o Gặp trong 85% trường hợp lúc mới chẩn đoán
o t (11,14) là chuyển vị thường gặp nhất trong chuyển vị liên quan 14q32
o Giúp phân nhóm quy cơ
o Bất thường về cấu trúc và số lượng NST
Trang 10BÀI 4: GIỚI THIỆU VÊ ĐỘT BIẾN GEN
- Đột biến gen gây bệnh có thể gặp trong các trường hợp sau:
Bệnh ung thư
Bệnh di truyền
Bệnh tim mạch, phì đại cơ tim bẩm sinh, hội chứng Brugada gây rối loạn nhịp
- Khái niệm về gen
o Exon phần gen còn lưu lại trong ARN có thể mã hóa hoặc không mã hóa aa
o Intron phần không mã hóa (IVS) bắt đầu bằng GT kết thúc AG
o Codon bộ ba nucleotide mã hóa cho 1 aa, khởi đầu bằng ATG
o Chiều của gen 5’-3’
- Đột biến gen: thay đổi trình tự nucleotide của gen
- Phân loại theo cấu trúc
o Deletion (in-frame?)
o Insertion
o Thay thế: im lặng (không đổi aa), sai nghĩa (đổi aa), vô nghĩa (stop codon)
o Phức tạp
- Phân loại theo chức năng: thêm, mất
- Chọn câu sai khi nói về đột biến gen: bệnh b-Thalass do đột biến mất đoạn
o Đột biến thêm chức năng thường tập trung vùng nóng của gen (hotspot)
o Bệnh alpha Thalassemie do đột biến đoạn, b Thalass đột biến điểm
o Các rối loạn nhịp tim có thể do đột biến gen gây nên
o Các đột biến gen gây hội chứng thực bào máu không giống nhau giữa các chủng tộc
- Chọn câu sai: đột biến vùng intron không gây bệnh
o Đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson (gen lặn, NST thường, đột biến trên 21 exon của gen, lắng đọng đồng trong các mô, triệu chứng tâm thần, thần kinh, gan)
o Đột biến thêm nucleotide có thể vẫn bảo tồn khung đọc
o Đột biến vô nghĩa sẽ thay thế 1 aa bằng 1 mã dừng (stop codon) TAA TAG TGA
- Đột biến mất chức năng gen ATP7B gây bệnh Wilson, chọn câu sai: đb chỉ tập trung vùng exon11
o Đột biến phân tán khắp chiều dài gen
o Làm giảm, mất chức năng của ATP7B trong việc thải đồng vào tiểu quản mật của gan
o Xác định đột biến góp phần chẩn đoán bệnh
- Để phát hiện các đột biến gen gây bệnh trong dân số nghiên cứu mới, kỹ thuật nên chọn
Trang 11o PCR rồi giải trình tự
- Chọn câu sai: tất cả các đột biến gen đều gây bệnh
o Các đột biến gen gây bệnh thường xảy ra trên exon
o Trong cùng một hội chứng có thể do nhiều đột biến gen gây nên
o Đột biến JAK2 là một trong các tiêu chuẩn chẩn đoán hội chứng tủy tăng sinh
o Đột biến BRCA1 giúp đánh giá nguy cơ K vú gia đình
o Đột biến gen globine giúp chẩn đoán bệnh Thalassemie
- Đột biến p.V617F của gen JAK2 trong hội chứng tăng sinh tủy
o Đột biến thêm chức năng
o Đột biến trên H2, mất điều hòa ngược H1 lên H2, tăng đáp ứng với EPO
- Đột biến thêm chức năng gen JAK2 gây rối loạn tăng sinh tủy, chọn câu sai: phổ đột biến phân tán đều trên các exon của JAK2
ĐÚNG:
o Tập trung vùng exon 12-15, nhiều nhất ở codon 617
o Gặp trong đa hồng cầu nguyên phát
o Phát hiện ASO-PCR, giải trình tự gen
- Bản chất đột biến p.E746_A750del của gen EGFR trong ung thư phổi là
o Mất 5 aminoacid từ E746 đến A750 (E: glutamate, A: Alanin)
- Đột biến gặp trong bệnh X-link agammaglobulinemia
o Đột biến mất chức năng phân bố khắp chiều dài gen
o Đột biến thêm chưc năng thường tập trung hơn
o Đột biến sai nghĩa trên 19 exon của gen BTK
o Không tạo được tế bào B trưởng thành làm thiếu hụt kháng thể trong máu
- Đột biến gen nào gây cản trở quá trình trưởng thành tế bào B trong bênh thiếu
gammaglobulin liên kết NST X
o Gen BTK
- Đột biến IVS12+1G>A của gen BTG
o Thay G bằng A tại vị trí đầu tiên của intron 12
- Trong PCR và giải trình tử chuỗi ADN để chẩn đoán đột biến gen, đặc tính quan trọng nhất của polymerase
o Có tính sửa sai để đảm bảo tính trung thực cao
Trang 12BÀI 5: SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG BỆNH LÝ UNG THƯ
- Phát biểu nào không đúng: đột biến gen gây ung thư nên ung thư là bệnh di truyền
o Chẩn đoán xác định ung thư thường là chẩn đoán của giải phẫu bệnh
o Chẩn đoán đột biến gen giúp chia nhóm bệnh ung thư sâu hơn
o Trong một loại ung thư có thể mang nhiều loại gen đột biến.
- Kiểu đột biến thường gặp trong ung thư:
o Đột biến mất chức năng đè nén khối u P53 kèm với tăng chức năng gen tiền sinh ung
KRAS
- Gen đè nén khối u P53 (giúp tế bào apoptosis) có thể bị đột biến trong loại ung thư nào
o Ung thư gan do aflatoxin B1
o Ung thư phổi do khói thuốc lá
o Ung thư cổ tử cung và ung thư buồng trứng.
P53-> ty thể (cytochrome C) -> apoptosis
- Đột biến gen KRAS có thể gặp trong ung thư nào
o Ung thư đại tràng
o Ung thư phổi
o Ung thư tụy
- Trong diễn biến của ung thư biểu mô, biểu hiện của protein FAK và SCR cao nhất trong giai đoạn
o Xâm lấn và di căn
- Phân chia theo cơ chế phân tử, ung thư vú có thể được xếp vào nhóm sau đây
o Nhóm có biểu hiện thụ thể Estrogen 60-70%
o Nhóm có khuếch đại gen HER2 20- 30%
o Nhóm có đột biến gen BRCA1 BRCA2 5- 10%
- Cần xác định kháng nguyên ER và PR trong ung thư vú để
o Điều trị bằng nội tiết tố
- Để phát hiện các kiểu đột biến rất đa dạng của gen BRCA1 trong ung thư vú gia đình, kỹ thuật phù hợp nhất
o Giải trình tự AND của các sản phẩm PCR
- Để điều trị Trastuzumab (Hercetin) trong bệnh ung thư vú, cần làm xét nghiệm
o Nhuôm hóa mô miễn dịch với HER2
o FISH
- Trong ung thư, phát hiện đột biến gen có ý nghĩa
o Tiên lượng bệnh trong BCC dòng tủy AML
o Đánh giá nguy cơ mắc bệnh trong K vú gia đình
o Lựa chọn điều trị nhắm trúng đích trong K phổi.