Tiêu chuẩn hóa dược liệu đương qui nhật bản di thực từ rễ củ cây angelica acutiloba (sieb et zucc ) kitagawa trồng tại việt nam 25

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TIÊU CHUẨN HOÁ DƯỢC LIỆU ĐƯƠNG QUY NHẬT BẢN DI THỰC TỪ CÂY ANGELICA ACUTILOBA (SIEB ET ZUCC ) KITAGAWA TRỒNG TẠI VIỆT NAM Ngành Kiểm nghiệm thuốc và độc chất Mã số 62 72 04 10 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ YDƯỢC HỌC TP Hồ Chí Minh, năm 2022 Công trình được hoàn thành tại Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Người hướng dẫn khoa học Phản biện 1 Phản biện 2 Phản biện 3 Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường họp t.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

-TIÊU CHUẨN HOÁ DƯỢC LIỆU

ĐƯƠNG QUY NHẬT BẢN DI THỰC TỪ CÂY

ANGELICA ACUTILOBA (SIEB ET ZUCC ) KITAGAWA

TRỒNG TẠI VIỆT NAM

Ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất

Mã số: 62 72 04 10

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y/DƯỢC HỌC

TP Hồ Chí Minh, năm 2022

Công trình được hoàn thành tại:

Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh

Người hướng dẫn khoa học:

Phản biện 1: ……… Phản biện 2 ………

Phản biện 3: ………

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường họp tại Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh

vào hồi giờ ngày tháng năm

Có thể tìm hiểu Luận án tại thư viện:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Thư viện Khoa học Tổng hợp TP HCM

- Thư viện Đại học Y Dược TP HCM

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1 , Thạch Giang , Lê Thị Thu Cúc, Nguyễn

Ngọc Vinh , Nguyễn Văn Thanh, (2018), “Phân lập và tinhchế Z ligustilid từ Đương Quy Nhật Bản làm chất đối

chiếu”, Tạp chí Dược học, Số 498, năm 57, Số 10/2017, tr

55-58

2 , Hồ Xuân Hương , Lê Khánh Trúc Diễm,

Nguyễn Ngọc Vinh, Nguyễn Văn Thanh, (2018), “Ứngdụng kỹ thuật DNA barcoding trong định danh một số

giống đương quy đang lưu hành tại Việt Nam”, Tạp chí Dược học, Số 501, năm 58, Số 01/2018, tr 63-67

3 , Lê Thị Thu Cúc, Nguyễn Văn Thanh,

(2020), "Phân lập 3 furanocoumarin từ rễ Angelica

acutiloba Kitagawa trồng tại Lâm Đồng”,Tạp chí Y Dược học, Số 8, tháng 11/2020, tr 37-41

4 Thi Minh Tam Pham, Thi Thu Cuc Le, Van Thanh Nguyen,Viet Hung Tran, (2021), “Simultaneous quantitativeanalysis of five components in Angelica sinensis andAngelica acutiloba acclimatized growing in vietnam byhigh-performance liquid chromatography with photodiode

array detector”,World Journal of Traditional Chinese Medicine, Volume 7 | Issue 1 | January-March 2021, DOI:

10 4103/wjtcm wjtcm_28_20

5 Pham T M T , Le T T C , Tran V H , Nguyen V T (2021),

“Isolation and identification of two flavonoid compoundsfrom acclimatized Angelica acutiloba Kitagawa growing

in Vietnam”, World Journal of Traditional Chinese

Medicine, 2021(x), xx-xx (Accepted by July 1st, 2021)

- 1 -‐ ‐

GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

1 Tính cấp thiết của luận án

Đương quy là dược liệu quý và phổ biến trong Đông y, đa phần

dược liệu Đương quy (Angelica sinensis) đều nhập từ Trung quốc Đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba) được trồng rất nhiều

tại các tỉnh khu vực miền Trung, Tây Nguyên như Lâm Đồng,Đắk Nông, Đắk Lắk, Quảng Nam, và các tỉnh vùng núiphía Bắc như Lào Cai, Sơn La, Nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật hiện đại vào công táckiểm nghiệm, đánh giá chất lượngdược liệu là một yêu cầu

cấp bách và cần thiết để theo kịp với thế giới, phục vụ cho

nhu cầu của xã hội, cũng là một trong những động thái để tìmđầu ra cho Đương quy Nhật Bản

(Angelica acutiloba) đang được

nhân dân trồng ở quy mô công nghiệp

2 Mục tiêu nghiên cứu

Vì tính chất cấp thiết trên, đề tài:

"Tiêu chuẩn hóa dược liệu

xây dựng tiêu chuẩn và thiết lập cơ sở khoa học nhằm đề xuất

dự thảo nâng cấp chuyên luận

"Đương quy di thực" với các mục

tiêu cụ thể như sau:

1 Định danh cây thuốc Angelica acutiloba (Sieb et

Zucc )

Kitagawa bằng phương pháp phân tích thực vật vàgiải trình

tự gen

thực Radix Angelicae acutilobae

4 Xây dựng các quy trình định tính và định lượng đồng thời một

số chất trong dược liệu Radix Angelicae acutilobae

5 Tiêu chuẩn hoá dược liệu từ cây Đương quy Nhật Bản trồngtại Việt Nam, từ đó thiết lập dược liệu đối chiếu rễ Đương quy

Nhật Bản Radix Angelicae acutilobae Đề xuất dự thảo

nângcấp chuyên luận "Đương quy

Nhật Bản di thực (rễ) Radix Angelicae acutilobae"

3 Những đóng góp mới của nghiên cứu về mặt lý luận và thực

tiễn

1 Đánh giá mức độ phân biệt

của 4 trình tự ITS, rbcL, matK,

đoạn chèn trnH-psbA trên

tham chiếu theo mô hình Dược điển Anh

2 Phân lập 11 chất từ Angelica acutiloba; trong đó

rutin và

isoquercitrin là báo cáo đầu tiên trên thế giới phânlập từ

A acutiloba

3 Thiết lập 4 chuẩn đối

chiếu từ A acutiloba Trong

đó

Z- ligustilid là chuẩn đầu tiên ở Việt Nam

- 3 -‐ ‐

4 Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời 5 chấtacid chlorogenic, scopoletin, acid ferulic, xanthotoxin vàZ-ligustilid bằng phương phápHPLC đầu dò PDA

5 Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng các

monosaccharid cấu thành polysaccharid bằng phương pháp

thuỷ phân và tạo dẫn xuất với PMP, sau đó phân tích bằngHPLC với đầu dò PDA Tách các phân đoạn polysacchariddựa trên mức độ không tan trong EtOH ở các nồng độ khác

nhau và xác định tỷ lệ monosaccharid của các phân đoạn phân

lập được

6 Đã thiết lập một "Bảng điểm đánh giá marker" áp dụng chocác dược liệu dựa theo các tiêuchí của WHO Dựa vào nhữngnghiên cứu khảo sát về thành phần hóa học của dược liệu, đã

xây dựng toàn văn tiêu chuẩn

và dự thảo đề xuất nâng cấp

chuyên luận dược điển Đương quy Nhật Bản Đề xuất đổi tên

Việt Nam của chuyên luận

Radix Angelicae

acutilobae từ

"Đương quy di thực" thành "Đương quy Nhật

Bản di thực"

5 Bố cục của luận án

Luận án gồm 148 trang: Mở đầu 2 trang, tổng quan 33 trang, đối

tượng và phương pháp nghiêncứu 23 trang, kết quả nghiên cứu

61 trang, bàn luận 24 trang, điểm mới của luận án 1 trang,kết

luận 3 trang và kiến nghị 1 trang Luận án có 64 bảng, 49hình,

9 sơ đồ, 177 tài liệu tham khảo gồm 8 tài liệu tiếng Việt

và 169

tài liệu tiếng Anh, 35 phụ lục thể hiện các kết quả thực nghiệm

3 Tác dụng dược lý của Đương quy Nhật Bản

4 Tổng quan về các chỉ tiêu vàphương pháp kiểm nghiệm

5 Tổng quan về tiêu chuẩn hóa dược liệu, chuẩn đối chiếu và

chất đánh dấu

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2 1 Đối tượng

Đương quy Nhật Bản trồng tại

Việt Nam, Angelica acutiloba

(Sieb et Zucc ) Kitagawa, và những hợp chất tự nhiên trongthành phần hoá học có thể chọn làm chuẩn đối chiếu Nguyênliệu dùng cho nghiên cứu là thân,

lá và rễ củ Đương quy tươihoặc khô hoặc đã qua chế biến thành dược liệu

2 2 Phương pháp nghiên cứu

2 2 1 Định danh cây thuốc bằng

phân tích thực vật và giải trình

acid ferulic, scopoletin, xanthotoxin và Z-ligustilid

2 2 5 Phân tích carbohydrat

- 5 -‐ ‐

2 2 6 Tiêu chuẩn hoá và đề xuất

dự thảo nâng cấp chuyên luậndược liệu Đương quy Nhật

Bản di thực (rễ) Radix Angelicae

Từ cây phân loài và khoảng cách

loài, chọn ITS > trnH-psbA > matK làm marker sinh học để định danh dược liệu Angelica acutiloba

Xác định trình tự tham chiếu và trình tự key base của các đoạntrình tự/gen như sau:

Trình tự ITS có 618 base với 98

key base:

TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGA TCATTGTCGAATCCTGCAATAG

CAGAATGACCCGCTAACACGtcaacat

- 6 -‐ ‐

TCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCG

CCCGAAGCCACTAGGCTgagggca cgcctgcctgggtgtcacgcatcgtcttgcccacAA

ACCACTCACACCTGAGAAGTTG TGCCGGTTTGGGGCGGAAACTGGC CTCCCGTACCTTGTCGTGCGGT TGGCGGAAAAACGAGTCTCCGGCG ACGGACGTCGCGACATCGGTG GTTGTAAAAGACCCTCTTGTCTTGT CGTGCGAATCCTCGTCATCTTA GCGAGCTCCAGGACCCTTAGGCAG CACACACTCTGTGCGCTTCGAC TGTGACCCCAGGTCAGGCGGGACT ACCCGCTGAGTTTAAGCATATC AATAAG

Trình tự đoạn chèn trnH-psbA có

268 base với 41 key base:

CTTGGCTACATCCGCCCCGCCAatttt cttttatttatttattaaatatttattaAAGaaa aaaaaGGATTCCTTTTTGATCATTCAA

AAATATTTGTTTATCTAAAAC AGTCTGAAATATAAAAAGAAGAAA TACCGCCCTCTTGATAGAACA AGAGGGCGGTATTTCTTCTTTTTAT TTCAAAAAACTCGTATATACTA AAACCCGGTCTTACCCATTTGTAGA TGGAGCTTCAACAGCAGCTAG GTCTAGAGGAAAGTTATGAGCATTA CGTTCGTGCATAAC

TTAGacaaTGATCCAATTAGAGG

AA

CAATTGGAACAAGAGTATCGA ACTTATTAATAGGATTATCAATT AT

AAATGCATTTTCTAGCATTTGA CTGCGTACCATTGAAGGGTTTA GT

CGCGCACTTGATAGATAGCCCA GAAGAGCTAGGGAATGATTATA T

AATTGGTTTATACAGATCCGTC CCGGCTGAGACCATAGGTAAA AAT

GACATTTCCATAAATtgacaaaata atatgtccattttttcatcaaaaggggcgtcCC

TTT

- 7 -‐ ‐

TGAAGCGAGAATGGATTTTCCTTGA TAACTAATATAATGCATGAAA GGGTCCTTAAACAACCATAGATTGT CCTGAAAGGCCTTAGCAAAA GCTTCTACAAGTCCAAGATGTTTTA GTTTTCCATATAAAAAGATTC GTTCAAGAAGGGTTCCAGAAGACG TTGAGCATAAATGAGAAGATT TGTTACGAAGAAAGACGAAGATGG ATTCGTATTCACATAGATGAG AATTATATAGGACGAAGAAAAACCT TTGATTTCTTTTTGAAAAACA AGAACTGGCTTTATTTGGAGTATTC CAAATACGATACTCGTGGAGA AAGAATCTTAATAAATGTAAAGAAG AAGCGTCTTTTACCCAGTAGC GAAGAGTTTGA

Các bước định danh:

Bước 1: Chiết tách DNA toàn phần

Bước 2: Chọn lựa đoạn gen

(ITS, trnH-psbA, matK) để

khuếch đạiBước 3: Giải trình tựBước 4: So sánh với trình tự tham chiếu

Đánh giá kết quả

1 Trình tự mẫu thử phải bao phủ toàn bộ vùng key base củatrình tự tham chiếu

2 Trình tự vùng key base của

mẫu thử phải trùng khít 100%với vùng key base của trình tự tham chiếu

3 Trình tự ngoài vùng key base của mẫu thử phải trùng khít >

95% với vùng tương ứng của trình tự tham chiếu

3 2 - Chiết xuất, phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc

3 2 2 Xác định cấu trúc

Dựa vào các đặc tính lý, hoá và kết quả phân tích phổ UV, IR,

MS, NMR (13C-NMR, 1H-NMR, DEPT, HSQC, COSY, HMBC)

11 chất chiết xuất ở trên được xácđịnh là: (1) LIG là Z-ligustilid,(2) E29 là psoralen, (3) E30 là xanthotoxin, (4) E35A làIsopimpinellin, (5) E35B là bergapten, (6) P20A là senkyunolid

I, (7) P20B là senkyunolid H, (8) V20 là acid ferulic, (9) S18 làacid chlorogenic, (10) S1 là rutin

và (11) S2 là isoquercitrin Kếtquả phân tích cũng phù hợp với

các nghiên cứu đã công bố

n

Bergapte

n

Isopimpinelli

n

O OH HO

HO

O OO H

H O HO

O

O OH

OH

Acid ferulicOH OH

Acid chlorogenic

HO O

OH O

OHO O

OH O H

OHO O

O

H OH

H HO HO O

O H

!

OH O

O H

O O

OH OH

OH !

RutinIsoquercitrin

3 3 -Thiết lập chuẩn

đối chiếu hóa học từ dược liệu

Bốn chất được chọn lựa trong

số 11 chất tách chiết được từ dược

liệu Đương quy Nhật Bản là: (1): Z-ligustilid, (2):

xanthotoxin,

(3): acid chlorogenic, (4): acid ferulic

- 10 -‐ ‐

3 3 1 Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng

Bảng 3-2: Điều kiện sắc ký lỏng hiệu năng cao

Dữ liệu thẩm định cho thấy phương pháp đạt yêu cầu về tính đặc

hiệu, tính tuyến tính, độ chính xác

và độ đúng theo qui định ICH

3 3 2 Xây dựng tiêu chuẩn chất chuẩn đối chiếu

Bảng 3-3: Tóm tắt tiêu chuẩn chất lượng 4 chất đối chiếu

Mô tả/cảm quan Bột vô định

hình màu trắng xám

Bột vô định hình màu trắng xám

Tinh thể hình kim, màu trắng

Dung dịch màu vàng nhạt Định tính

Phổ IR trùng với phổ IR của chất chuẩn Thời gian lưu trùng với đỉnh chuẩn 204-210 ° C 168-174 ° C 146-148 ° C NA

≤≤ 5 % ≤≤ 5 % ≤≤ 5 % NA Định lượng ≥ 95 % ≥ 95 % ≥ 95 % ≥ 95 %

3 4 Định lượng đồng thời acid chlorogenic, scopoletin, acid ferulic, xanthotoxin và Z- ligustilid trong dược liệu

3 4 1 Chọn lựa các chất theo tài liệu tham khảo

Z-ligustilid và acid ferulic vì đóngvai trò trị liệu trong dược liệu,acid chlorogenic, xanthotoxin và z-ligustilid vì có hàm lượng caotrong dược liệu, acid chlorogenic

và scopoletin vì có tác dụng hỗtrợ trị liệu và scopoletin và xanthotoxin vì có tính đặc trưng và

xanthotoxin vì được cho là có độc tính (khi kết hợp với UV)

3 4 2 Chọn lựa phương pháp chiết xuất

Chiết siêu âm trong 1 h, 10 ml

MeOH cho 1 g dược liệu

3 4 3 Thẩm định quy trình

Điều kiện sắc ký

Pha động: Hệ 2 dung môi

ACN: AcOH 1%, gradient

- 12 -‐ ‐

Dữ liệu thẩm định cho thấy phương pháp đạt tất cả các yêu cầu

về tính đặc hiệu, tính tuyến tính,

độ chính xác và độ đúng theoqui định của ICH

3 4 4 Ứng dụng quy trình khảo sát mẫu dược liệu

Hình 3-1: So sánh tương quan hàm lượng các chất trong các dược liệu Đương quy khác nhau

Nhận xét: Các điểm khác biệt về thành phần hoá học của rễ

A acutiloba và A sinensis:

1 Xanthotoxin và scopoletin có

trong A acutiloba nhưng không có trong A sinensis,

2 Hàm lượng acid ferulic và

Z-ligustilid trong A sinensis cao hơn trong A acutiloba

3 5 Phân tích carbohydrat

3 5 1 Chọn lựa, tối ưu hóa điều kiện chiết xuất

Điều kiện chiết xuất: tỉ lệ nước: dược liệu = 10, tại 80

về tính đặc hiệu, tính tuyến tính,

độ chính xác và độ đúng theoqui định của ICH

Bảng 3-5: Kết quả định lượng hàm lượng polysaccharid quy ra glucose

3 5 3 Tối ưu hóa phản ứng thủy phân

Điều kiện tối ưu là 120 °C trong 1 giờ và nồng độ TFA 2 M

3 5 4 Định tính và định lượng đồng thời 8 monosaccharid cấu thành polysaccharid

Pha động: Hệ 2 dung môi ACN: Amonium acetat 20 nM, gradient Pha tĩnh: cột Gemini NX C18 (250 x 4,6 mm); 5 ∝m

- 14 -‐ ‐

3 5 5 Ứng dụng khảo sát định tính và định lượng monosaccharid cấu thành

Hình 3-2: Thành phần và tỷ lệ monosaccharid trong các mẫu polysaccharid toàn phần

Hình 3-3: Thành phần monosaccharid trong mẫu chưa thuỷ phân,

mẫu PĐ20 sau thuỷ phân và mẫu chuẩn

- 15 -‐ ‐

Hình 3-4: Thành phần monosaccharid trong mẫu chưa thuỷ phân,

mẫu PĐ30 sau thuỷ phân và mẫu chuẩn

3 6 Tiêu chuẩn hoá dược liệu và

đề xuất dự thảo nâng cấp chuyên luận Đương quy Nhật Bản di thực cho Dược điển Việt Nam

3 6 1 Tiêu chuẩn hóa

Chọn lựa các tiêu chí kiểm nghiệmtheo quy định của WHO vàdược điển

Xây dựng bảng điểm chọn marker

Bảng 3-6: Xây dựng Bảng điểm đánh giá chọn lựa marker cho

1

1 2 2 2Hoạt tính 1 2 2 2 1 Tác dụng trị liệucủa chất được sử dụng 2

cổ truyền vàhiện đại)

không liên quan đến việc sửdụng trong y học cổ truyền/

y học hiện đại của dược liệuđó

1 2 2 2 2 Tác dụng trị liệucủa chất được sử dụng liênquan đến việc sử dụng trong

y học cổ truyền/ y học hiệnđại của dược liệu đó

3

1 2 2 3Hoạt tínhsinh học cóliên quantrực tiếpđến tácdụng trị liệu(trong y học

cổ truyền vàhiện đại)

1 2 2 3 1 Tác dụng trị liệucủa chất được sử dụngkhông liên quan đến việc sửdụng trong y học cổ truyền/

y học hiện đại của dược liệuđó

4

1 2 2 3 2 Tác dụng trị liệucủa chất được sử dụng liênquan đến việc sử dụng trong

y học cổ truyền/ y học hiệnđại của dược liệu đó

- 17 -‐ ‐

* ½ số điểm của nhóm chínhChọn marker dựa trên tài liệu tham khảo

Bảng 3-7: Kết quả chọn marker dựa trên tài liệu tham khảo

Nhận xét: Dựa trên Bảng 6, đưa ra

5 marker có khả năng là acidchlorogenic, acid ferulic, scopoletin, xanthotoxin, và Z-ligustilid

Chọn marker dựa trên thực nghiệm: xác định tính đặc trưng trên

TLC và HPLC

CGA SCO FA XAN LIG

Đã được chọn làm marker cho dược liệu

mang tên Đương Quy

Có tác dụng trị liệu liên quan đến tác

Tác dụng sinh học hỗ trợ tác dụng trị liệu x x

Có thể chiết xuất, định tính định lượng

- 18 -‐ ‐

Bảng 3-8: Tổng kết kết quả khảo sát tính đặc trưng trên TLC và HPLC

Z-ligustilidXanthotoxinAcid ferulicScopoletinAcid chlorogenic

Angelica sinensis Angelica acutiloba

Levisticum officinale Ligusticum walchilli

Angelica gigas Angelica dahurica Angelica pubescens

Dựa vào tham khảo tài liệu và thực nghiệm, chọn acid chlorogenic, scopoletin, acidferulic,

xanthotoxin và Z-ligustlid để chấm điểm

- 19 -‐ ‐

Tổng kết kết quả chọn matker

Bảng 3-9: Kết quả chấm điểm marker

Kết luận: Dựa trên điểm số, chọn xanthotoxin và Z-ligustilid làmmarker

Xác định mức chất lượng markerĐánh giá hàm lượng xanthotoxin

và z-ligustild trên 6 vùngnguyên liệu Đak Nông, Đà Lạt, Đơn Dương, Quảng Nam và LàoCai Từ đó xác định mức chất lượng của xanthotoxin:”khôngđược ít hơn 0,015%” và z-ligustilid :”Không được ít hơn 0,05%”

3 6 2 Tóm tắt dự thảo đề xuất nâng cấp chuyên luận Đương quy Nhật Bản di thực

Bảng 3-10: tóm tắt dự thảo chuyên luận Đương quy Nhật Bản di thực

pháp

Ghi chú

1 Mô tả

Rễ chính ngắn và mập, dài10-20 cm, đường kính 2 cmtrở lên, có nhiều rễ nhánh dài15-20 cm, đường kính 0,2

cm trở lên Mặt ngoài màunâu tối, có nhiều nếp nhăndọc, nhiều sẹo lồi nằm ngang

là vết tích của rễ con Mặt cắtngang màu trắng ngà có vântròn và nhiều điểm tinh dầu

Chuyên luậnĐương quy

di thực,DĐVN 5

Hoạt tính sinh hoc 2 2 10 11 10

Hóa học-phân tích 4 2 2 7 5