Tiêu chuẩn hóa dược liệu Đương qui Nhật Bản di thực từ rễ củ cây Angelica acutiloba (Sieb. et Zucc.) Kitagawa trồng tại Việt Nam

TÓM TẮT NHỮNG KẾT LUẬN MỚI CỦA LUẬN ÁN 1. Đánh giá mức độ phân biệt của 4 trình tự DNA: ITS, rbcL, matK, đoạn chèn trnH-psbA trên Angelica acutiloba. Đề xuất trình tự tham chiếu của ITS, matK, đoạn chèn trnH-psbA làm cơ sở dữ liệu so sánh. Đề xuất các bước để định danh dược liệu A. acutiloba bằng phương pháp giải trình tự gen dựa trên trình tự tham chiếu theo mô hình Dược điển Anh. 2. Phân lập 11 chất từ A. acutiloba, trong đó rutin và isoquercitrin là báo cáo đầu tiên trên thế giới phân lập từ A. acutiloba. 3. Thiết lập 4 chuẩn đối chiếu từ A. acutiloba. 4. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng 5 chất acid chlorogenic, scopoletin, acid ferulic, xanthotoxin và Z-ligustilid bằng phương pháp HPLC đầu dò PDA. 5. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng các monosaccharid cấu thành polysaccharid bằng phương pháp thủy phân và tạo dẫn xuất với PMP, sau đó phân tích bằng HPLC với đầu dò PDA. Tách các phân đoạn polysaccharid dựa trên mức độ không tan trong EtOH ở các nồng độ khác nhau và xác định tỷ lệ monosaccharid của các phân đoạn phân lập được. Thiết lập một "Bảng điểm đánh giá marker" áp dụng cho các dược liệu dựa theo các tiêu chí của WHO. Xây dựng toàn văn dự thảo đề xuất nâng cấp chuyên luận dược điển Đương quy Nhật Bản. Đề xuất đổi tên Việt Nam của chuyên luận Radix Angelicae acutilobae từ "Đương quy di thực" thành "Đương quy Nhật Bản di thực".

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

-PHẠM THỊ MINH TÂM

TIÊU CHUẨN HOÁ DƯỢC LIỆU

ĐƯƠNG QUY NHẬT BẢN DI THỰC TỪ CÂY

ANGELICA ACUTILOBA (SIEB ET ZUCC.) KITAGAWA

TRỒNG TẠI VIỆT NAM

Ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất

Mã số: 62.72.04.10

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y/DƯỢC HỌC

TP Hồ Chí Minh, năm 2022

Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh

Người hướng dẫn khoa học: GS TS Nguyễn Văn Thanh

vào hồi giờ ngày tháng năm

Có thể tìm hiểu Luận án tại thư viện:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Thư viện Khoa học Tổng hợp TP HCM

- Thư viện Đại học Y Dược TP HCM

Ngọc Vinh , Nguyễn Văn Thanh, (2018), “Phân lập và tinh

chế Z ligustilid từ Đương Quy Nhật Bản làm chất đối

chiếu”, Tạp chí Dược học, Số 498, năm 57, Số 10/2017, tr

55-58

2 Phạm Thị Minh Tâm, Hồ Xuân Hương , Lê Khánh Trúc Diễm,

Nguyễn Ngọc Vinh, Nguyễn Văn Thanh, (2018), “Ứng

dụng kỹ thuật DNA barcoding trong định danh một số

giống đương quy đang lưu hành tại Việt Nam”, Tạp chí

Dược học, Số 501, năm 58, Số 01/2018, tr 63-67

3 Phạm Thị Minh Tâm, Lê Thị Thu Cúc, Nguyễn Văn Thanh,

(2020), "Phân lập 3 furanocoumarin từ rễ Angelica

acutiloba Kitagawa trồng tại Lâm Đồng”,Tạp chí Y Dược

học, Số 8, tháng 11/2020, tr 37-41

4 Thi Minh Tam Pham, Thi Thu Cuc Le, Van Thanh Nguyen,

Viet Hung Tran, (2021), “Simultaneous quantitative

analysis of five components in Angelica sinensis and

Angelica acutiloba acclimatized growing in vietnam by

high-performance liquid chromatography with photodiode

array detector”,World Journal of Traditional Chinese

Medicine, Volume 7 | Issue 1 | January-March 2021, DOI:

10.4103/wjtcm.wjtcm_28_20

5 Pham T.M.T., Le T.T.C., Tran V.H., Nguyen V.T (2021),

“Isolation and identification of two flavonoid compounds

from acclimatized Angelica acutiloba Kitagawa growing

in Vietnam”, World Journal of Traditional Chinese

Medicine, 2021(x), xx-xx (Accepted by July 1st, 2021)

GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

1 Tính cấp thiết của luận án

Đương quy là dược liệu quý và phổ biến trong Đông y, đa phần

dược liệu Đương quy (Angelica sinensis) đều nhập từ Trung quốc Đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba) được trồng rất nhiều

tại các tỉnh khu vực miền Trung, Tây Nguyên như Lâm Đồng, Đắk Nông, Đắk Lắk, Quảng Nam, và các tỉnh vùng núi phía Bắc như Lào Cai, Sơn La,

Nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật hiện đại vào công tác kiểm nghiệm, đánh giá chất lượng dược liệu là một yêu cầu cấp bách và cần thiết để theo kịp với thế giới, phục vụ cho nhu cầu của xã hội, cũng là một trong những động thái để tìm

đầu ra cho Đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba) đang được

nhân dân trồng ở quy mô công nghiệp

2 Mục tiêu nghiên cứu

Vì tính chất cấp thiết trên, đề tài: "Tiêu chuẩn hóa dược liệu

Đương quy Nhật Bản di thực từ cây Angelica acutiloba (Sieb et

Zucc.) Kitagawa trồng tại Việt Nam" được thực hiện với mục tiêu xây dựng tiêu chuẩn và thiết lập cơ sở khoa học nhằm đề xuất

dự thảo nâng cấp chuyên luận "Đương quy di thực" với các mục tiêu cụ thể như sau:

1   Định danh cây thuốc Angelica acutiloba (Sieb et Zucc.)

Kitagawa bằng phương pháp phân tích thực vật và giải trình

tự gen

2   Chiết xuất, tinh chế và xác định cấu trúc một số thành phần

hóa học chính trong Angelica acutiloba (Sieb et Zucc.)

Kitagawa

3   Thiết lập một số chất đối chiếu hóa học đặc trưng cho dược

liệu Đương quy Nhật Bản di thực Radix Angelicae acutilobae

4   Xây dựng các quy trình định tính và định lượng đồng thời một

số chất trong dược liệu Radix Angelicae acutilobae

5   Tiêu chuẩn hoá dược liệu từ cây Đương quy Nhật Bản trồng tại Việt Nam, từ đó thiết lập dược liệu đối chiếu rễ Đương quy

Nhật Bản Radix Angelicae acutilobae Đề xuất dự thảo nâng cấp chuyên luận "Đương quy Nhật Bản di thực (rễ) Radix

so sánh Đề xuất các bước để định danh dược liệu A acutiloba

bằng phương pháp giải trình tự gen dựa trên trình tự tham chiếu theo mô hình Dược điển Anh

2   Phân lập 11 chất từ Angelica acutiloba; trong đó rutin và

isoquercitrin là báo cáo đầu tiên trên thế giới phân lập từ

A acutiloba

3   Thiết lập 4 chuẩn đối chiếu từ A acutiloba Trong đó

Z- ligustilid là chuẩn đầu tiên ở Việt Nam

4   Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời 5 chất acid chlorogenic, scopoletin, acid ferulic, xanthotoxin và Z-ligustilid bằng phương pháp HPLC đầu dò PDA

5   Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng các monosaccharid cấu thành polysaccharid bằng phương pháp thuỷ phân và tạo dẫn xuất với PMP, sau đó phân tích bằng HPLC với đầu dò PDA Tách các phân đoạn polysaccharid dựa trên mức độ không tan trong EtOH ở các nồng độ khác nhau và xác định tỷ lệ monosaccharid của các phân đoạn phân lập được

6   Đã thiết lập một "Bảng điểm đánh giá marker" áp dụng cho các dược liệu dựa theo các tiêu chí của WHO Dựa vào những nghiên cứu khảo sát về thành phần hóa học của dược liệu, đã xây dựng toàn văn tiêu chuẩn và dự thảo đề xuất nâng cấp chuyên luận dược điển Đương quy Nhật Bản Đề xuất đổi tên

Việt Nam của chuyên luận Radix Angelicae acutilobae từ

"Đương quy di thực" thành "Đương quy Nhật Bản di thực"

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Trình bày về những vấn đề sau

1   Tổng quan về dược liệu mang tên Đương quy

2   Thành phần hóa học của Đương quy Nhật Bản

3   Tác dụng dược lý của Đương quy Nhật Bản

4   Tổng quan về các chỉ tiêu và phương pháp kiểm nghiệm

5   Tổng quan về tiêu chuẩn hóa dược liệu, chuẩn đối chiếu và chất đánh dấu

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng

Đương quy Nhật Bản trồng tại Việt Nam, Angelica acutiloba

(Sieb et Zucc.) Kitagawa, và những hợp chất tự nhiên trong thành phần hoá học có thể chọn làm chuẩn đối chiếu Nguyên liệu dùng cho nghiên cứu là thân, lá và rễ củ Đương quy tươi hoặc khô hoặc đã qua chế biến thành dược liệu

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Định danh cây thuốc bằng phân tích thực vật và giải trình

tự gen

2.2.2 Chiết xuất, phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc

2.2.3 Thiết lập chuẩn đối chiếu từ dược liệu

2.2.4 Xây dựng quy trình định lượng đồng thời acid chlorogenic, acid ferulic, scopoletin, xanthotoxin và Z-ligustilid

2.2.5 Phân tích carbohydrat

2.2.6 Tiêu chuẩn hoá và đề xuất dự thảo nâng cấp chuyên luận

dược liệu Đương quy Nhật Bản di thực (rễ) Radix Angelicae

Từ cây phân loài và khoảng cách loài, chọn ITS > trnH-psbA >

matK làm marker sinh học để định danh dược liệu Angelica acutiloba

Xác định trình tự tham chiếu và trình tự key base của các đoạn trình tự/gen như sau:

Trình tự ITS có 618 base với 98 key base:

TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTGTCGAATCCTGCAATAG

CAGAATGACCCGCTAACACGtcaacattttgggcgAGCGTCGGGGGGCCTC GGTCTCCTGTCTGCGAATCCCTGGTAGGTggccactcccgggtggCCACTG

GCCTGCAAAATCATTCGGGCGCGGAATGCGCCAAGGACCTTAAAA

CTGAATTGTACGTCCGTATCCCGTTagcgggcaccggcgtcattccaaaacACAA

CGACTCTCGACAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACG TAGCGAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCA

TCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCACTAGGCTgagggca

cgcctgcctgggtgtcacgcatcgtcttgcccacAAACCACTCACACCTGAGAAGTTG

TGCCGGTTTGGGGCGGAAACTGGCCTCCCGTACCTTGTCGTGCGGT TGGCGGAAAAACGAGTCTCCGGCGACGGACGTCGCGACATCGGTG GTTGTAAAAGACCCTCTTGTCTTGTCGTGCGAATCCTCGTCATCTTA GCGAGCTCCAGGACCCTTAGGCAGCACACACTCTGTGCGCTTCGAC TGTGACCCCAGGTCAGGCGGGACTACCCGCTGAGTTTAAGCATATC AATAAG

Trình tự đoạn chèn trnH-psbA có 268 base với 41 key base:

CTTGGCTACATCCGCCCCGCCAattttcttttatttatttattaaatatttattaAAGaaa

aaaaaGGATTCCTTTTTGATCATTCAAAAATATTTGTTTATCTAAAAC

AGTCTGAAATATAAAAAGAAGAAATACCGCCCTCTTGATAGAACA AGAGGGCGGTATTTCTTCTTTTTATTTCAAAAAACTCGTATATACTA AAACCCGGTCTTACCCATTTGTAGATGGAGCTTCAACAGCAGCTAG GTCTAGAGGAAAGTTATGAGCATTACGTTCGTGCATAAC

Trình tự gen matK có 816 base vói 75 key base

AGTCGAAGTATATACTTTATTCGATACAAACTCtttttttGTGAGGATCC ACTATAATAATGAGAAATATTTCTGcagatacgcccaaatcggacaacAATAT

CAGAATCTGATAAATCAGTCCAAACCGCCTTACTAATAGGGTGCCC

CAATACGTTACAAAATCTCGCCTTAGacaaTGATCCAATTAGAGGAA

CAATTGGAACAAGAGTATCGAACTTATTAATAGGATTATCAATTAT AAATGCATTTTCTAGCATTTGACTGCGTACCATTGAAGGGTTTAGT CGCGCACTTGATAGATAGCCCAGAAGAGCTAGGGAATGATTATAT AATTGGTTTATACAGATCCGTCCCGGCTGAGACCATAGGTAAAAAT

GACATTTCCATAAATtgacaaaataatatgtccattttttcatcaaaaggggcgtcCCTTT

TGAAGCGAGAATGGATTTTCCTTGATAACTAATATAATGCATGAAA GGGTCCTTAAACAACCATAGATTGTCCTGAAAGGCCTTAGCAAAA GCTTCTACAAGTCCAAGATGTTTTAGTTTTCCATATAAAAAGATTC GTTCAAGAAGGGTTCCAGAAGACGTTGAGCATAAATGAGAAGATT TGTTACGAAGAAAGACGAAGATGGATTCGTATTCACATAGATGAG AATTATATAGGACGAAGAAAAACCTTTGATTTCTTTTTGAAAAACA AGAACTGGCTTTATTTGGAGTATTCCAAATACGATACTCGTGGAGA AAGAATCTTAATAAATGTAAAGAAGAAGCGTCTTTTACCCAGTAGC GAAGAGTTTGA

Các bước định danh:

Bước 1: Chiết tách DNA toàn phần

Bước 2: Chọn lựa đoạn gen (ITS, trnH-psbA, matK) để

3.2.1 Chiết xuất, phân lập và tinh chế

Sơ đồ 3-1: Kết quả phân lập và tinh chế 11 chất từ cây Đương quy Nhật Bản trồng tại Việt Nam

I, (7) P20B là senkyunolid H, (8) V20 là acid ferulic, (9) S18 là acid chlorogenic, (10) S1 là rutin và (11) S2 là isoquercitrin Kết quả phân tích cũng phù hợp với các nghiên cứu đã công bố

Z-ligustilid   Senkyunolid I   Senkyunolid H  

O

H

O H

O OH

HO

!

O H

O OH HO

Psoralen Xanthotoxin   Bergapten   Isopimpinellin  

Acid ferulic Acid chlorogenic

Rutin Isoquercitrin

3.3 -Thiết lập chuẩn đối chiếu hóa học từ dược liệu

Bốn chất được chọn lựa trong số 11 chất tách chiết được từ dược liệu Đương quy Nhật Bản là: (1): Z-ligustilid, (2): xanthotoxin, (3): acid chlorogenic, (4): acid ferulic

C O OH HO

O

COO HO

HO

OH OH

HO

O OH

H3C

!

O

O OH HO

OH OH

O O

OH

3.3.1 Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng

Bảng 3-2: Điều kiện sắc ký lỏng hiệu năng cao  

Cột Gemini NX C18 (150 x 4,6mm); 5 µm Tốc độ dòng 1 ml/phút

Dữ liệu thẩm định cho thấy phương pháp đạt yêu cầu về tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ chính xác và độ đúng theo qui định ICH

3.3.2 Xây dựng tiêu chuẩn chất chuẩn đối chiếu

Bảng 3-3: Tóm tắt tiêu chuẩn chất lượng 4 chất đối chiếu

hình màu trắng xám

Bột vô định hình màu trắng xám

Tinh thể hình kim, màu trắng

Dung dịch màu vàng nhạt Định tính

3.3.3 Thiết lập chất chuẩn đối chiếu

Bảng 3-4: Giá trị ấn định và độ không đảm bảo đo

Hoạt

CGA 98,19 0,684 0,200

FA 97,92 1,211 0,356 XAN 96,30 0,356 0,106 LIG 96,45 0,678 0,200

3.4 Định lượng đồng thời acid chlorogenic, scopoletin, acid ferulic, xanthotoxin và Z-ligustilid trong dược liệu

3.4.1 Chọn lựa các chất theo tài liệu tham khảo

Z-ligustilid và acid ferulic vì đóng vai trò trị liệu trong dược liệu, acid chlorogenic, xanthotoxin và z-ligustilid vì có hàm lượng cao trong dược liệu, acid chlorogenic và scopoletin vì có tác dụng hỗ trợ trị liệu và scopoletin và xanthotoxin vì có tính đặc trưng và xanthotoxin vì được cho là có độc tính (khi kết hợp với UV)

3.4.2 Chọn lựa phương pháp chiết xuất

Chiết siêu âm trong 1 h, 10 ml MeOH cho 1 g dược liệu

Dữ liệu thẩm định cho thấy phương pháp đạt tất cả các yêu cầu

về tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ chính xác và độ đúng theo qui định của ICH

3.4.4 Ứng dụng quy trình khảo sát mẫu dược liệu

Hình 3-1: So sánh tương quan hàm lượng các chất trong các dược liệu Đương quy khác nhau

Nhận xét: Các điểm khác biệt về thành phần hoá học của rễ

3.5.1 Chọn lựa, tối ưu hóa điều kiện chiết xuất

Điều kiện chiết xuất: tỉ lệ nước: dược liệu = 10, tại 80 ºC trong

thời gian 4 giờ

3.5.2 Định lượng polysaccharid toàn quy sang glucose bằng phương phápđo quang với thuốc thử phenol sulfuric

Thực hiện phản ứng tạo dẫn xuất furan và tạo màu với phenol

Đo quang ở 490 nm

Dữ liệu thẩm định cho thấy phương pháp đạt tất cả các yêu cầu

về tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ chính xác và độ đúng theo qui định của ICH

Bảng 3-5: Kết quả định lượng hàm lượng polysaccharid quy ra glucose

3.5.3 Tối ưu hóa phản ứng thủy phân

Điều kiện tối ưu là 120 °C trong 1 giờ và nồng độ TFA 2 M

3.5.4 Định tính và định lượng đồng thời 8 monosaccharid cấu thành polysaccharid

Pha động: Hệ 2 dung môi ACN: Amonium acetat 20 nM, gradient Pha tĩnh: cột Gemini NX C18 (250 x 4,6 mm); 5 µm

Cài đặt hệ thống: nhiệt độ cột 25 ºC, tốc độ dòng 1 ml/phút, detector 245 nm, thể tích tiêm 10 µl

Dữ liệu thẩm định cho thấy phương pháp đạt tất cả các yêu cầu

về tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ chính xác và độ đúng theo qui định của ICH

Hình 3-4: Thành phần monosaccharid trong mẫu chưa thuỷ phân, mẫu PĐ30 sau thuỷ phân và mẫu chuẩn

3.6 Tiêu chuẩn hoá dược liệu và đề xuất dự thảo nâng cấp chuyên luận Đương quy Nhật Bản di thực cho Dược điển Việt Nam

3.6.1 Tiêu chuẩn hóa

Chọn lựa các tiêu chí kiểm nghiệm theo quy định của WHO và dược điển

Xây dựng bảng điểm chọn marker

Bảng 3-6: Xây dựng Bảng điểm đánh giá chọn lựa marker cho

1 1.2.2.2

Hoạt tính 1.2.2.2.1 Tác dụng trị liệu của chất được sử dụng 2

sinh

học (nhóm trị liệu) sinh học có liên quan

gián tiếp (chất hỗ trợ) tác dụng trị liệu (trong y học

cổ truyền và hiện đại)

không liên quan đến việc sử dụng trong y học cổ truyền/

y học hiện đại của dược liệu

đó 1.2.2.2.2 Tác dụng trị liệu của chất được sử dụng liên quan đến việc sử dụng trong

y học cổ truyền/ y học hiện đại của dược liệu đó

3

1.2.2.3 Hoạt tính sinh học có liên quan trực tiếp đến tác dụng trị liệu (trong y học

cổ truyền và hiện đại)

1.2.2.3.1 Tác dụng trị liệu của chất được sử dụng không liên quan đến việc sử dụng trong y học cổ truyền/

y học hiện đại của dược liệu

đó

4

1.2.2.3.2 Tác dụng trị liệu của chất được sử dụng liên quan đến việc sử dụng trong

y học cổ truyền/ y học hiện đại của dược liệu đó

Tính Có tính chỉ điểm địa lý hoặc đặc trưng cho dưới loài 5

Chọn marker dựa trên tài liệu tham khảo

Bảng 3-7: Kết quả chọn marker dựa trên tài liệu tham khảo

CGA SCO FA XAN LIG

Đã được chọn làm marker cho dược liệu

mang tên Đương Quy x x

Có tác dụng trị liệu liên quan đến tác

dụng trị liệu của dược liệu x x Tác dụng sinh học hỗ trợ tác dụng trị liệu x x

Đã có thực hiện đánh giá chuẩn x x x x x

Có thể chiết xuất, định tính định lượng

được

x x x x x Hàm lượng cao trong dược liệu x x x

Có tính đặc trưng x

Nhận xét: Dựa trên Bảng 6, đưa ra 5 marker có khả năng là acid chlorogenic, acid ferulic, scopoletin, xanthotoxin, và Z-ligustilid Chọn marker dựa trên thực nghiệm: xác định tính đặc trưng trên TLC và HPLC

Tổng kết kết quả chọn matker

Bảng 3-9: Kết quả chấm điểm marker

Đặc điểm CGA SCO FA XAN LIG Hoạt tính sinh hoc 2 2 10 11 10 Hóa học-phân tích 4 2 2 7 5

3.6.2 Tóm tắt dự thảo đề xuất nâng cấp chuyên luận Đương quy Nhật Bản di thực

Bảng 3-10: tóm tắt dự thảo chuyên luận Đương quy Nhật Bản di thực

1 Mô tả

Rễ chính ngắn và mập, dài 10-20 cm, đường kính 2 cm trở lên, có nhiều rễ nhánh dài 15-20 cm, đường kính 0,2

cm trở lên Mặt ngoài màu nâu tối, có nhiều nếp nhăn dọc, nhiều sẹo lồi nằm ngang

là vết tích của rễ con Mặt cắt ngang màu trắng ngà có vân tròn và nhiều điểm tinh dầu

Chuyên luận Đương quy

di thực, DĐVN 5