Thẩm định phương pháp xác định hạt vi nhựa trong mẫu nước, ứng dụng phân tích mẫu nước biển cần giờ phần 3 luận văn thạc sĩ

45 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3 1 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến ảnh huỳnh quang 3 1 1 Kết quả khảo sát dung môi mang Nile red NR đƣợc chuẩn ị với nồng độ 5 mgL trong 3 loại dung môi gồm acetone, methanol và n hexan, nồng độ làm việc là 0,05 mgL Dung dịch từng loại vi nhựa PA 6, PE, PET, PVC, PMMA và chitin (mỗi loại 3 mẫu tƣơng ứng với 3 loại dung môi) đƣợc lọc qua màng lọc CA, sau đó dùng nƣớc c t chuyển các hạt vi nhựa trên màng lọc CA vào cốc thủy tinh 250 mL, tổng thể tích du.

45

3.1 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến ảnh huỳnh quang

3.1.1 Kết quả khảo sát dung môi mang Nile red

NR được chuẩn ị với nồng độ 5 mg/L trong 3 loại dung môi gồm acetone, methanol và n-hexan, nồng độ làm việc là 0,05 mg/L

Dung dịch từng loại vi nhựa PA 6, PE, PET, PVC, PMMA và chitin (mỗi loại 3 mẫu tương ứng với 3 loại dung môi) được lọc qua màng lọc CA, sau đó dùng nước

c t chuyển các hạt vi nhựa trên màng lọc CA vào cốc thủy tinh 250 mL, tổng thể tích dung dịch thu được khoảng 100 mL, tiếp đó thêm vào 1 mL dung dịch NR 5 mg/L (tương ứng pha trong 3 loại dung môi gồm acetone, methanol và n-hexan), để yên dung dịch 30 phút trong tối Tiến hành lọc qua màng lọc sợi thủy tinh GF/C, tráng rửa cốc 3 lần, mỗi lần 50 mL nước c t, chuyển màng lọc qua đ a petri, đậy nắp, s y khô ở 60oC trong 8 giờ, tiến hành xác định ảnh huỳnh quang của vi nhựa Kết quả ảnh huỳnh quang thu được tương ứng với 3 ộ lọc huỳnh quang được trình bày trong phụ lục 1 Dựa vào kết quả thu được chúng tôi nhận th y ảnh huỳnh quang của NR pha trong acetone sáng và rõ nét hơn so với NR pha trong methanol

và n-hexan Cả 3 loại dung môi đều cho ảnh huỳnh quang màu xanh ( ộ lọc 2) và cường độ huỳnh quang màu đỏ r t mạnh ( ộ lọc 3), trong đó cường độ huỳnh quang của NR pha trong methanol có phần yếu hơn so với NR pha trong acetone và n-hexan

46

Bảng 3.1 Ảnh huỳnh quang nhựa PE nhuộm ởi NR trong 3 loại dung môi

3.1.2 Kết quả khảo sát nồng độ Nile red

Dung dịch vi nhựa PA 6 (5 mẫu ứng với 5 nồng độ NR khảo sát) được xử lý như mục 3.1.1 nhưng thay ằng 1 mL dung dịch NR có nồng độ lần lượt là 5 – 10 – 50 –

250 – 500 mg/L (pha trong acetone) tương ứng với dung dịch NR làm việc là 0,05 – 0,1 – 0,5 – 2,5 – 5,0 mg/L Tiến hành phân tích trên kính hiển vi huỳnh quang, hình ảnh huỳnh quang thu được trong cùng điều kiện tương ứng với 3 ộ lọc huỳnh quang được trình ày trong ảng 3.2

47

Hình 3.1 Nhựa PA 6 đƣợc nhuộm với nồng độ NR t ng dần

Hình 3.2 Màng lọc GF chứa PA 6 nhuộm với nồng độ NR t ng dần

Nhựa PA 6 đƣợc nhuộm ởi NR với nồng độ t ng dần từ 0,05 đến 5 mg/L (hình 3.1), màng lọc GF/C chứa các hạt PA 6 sau khi lọc và s y khô cho màu sắc t ng dần theo nồng độ NR (hình 3.2), điều đó cho th y thuốc nhuộm đang dần ị ão hòa

Kết quả trong ảng 3.2 cho th y cường độ huỳnh quang có xu hướng giảm khi nồng

độ Nile red t ng từ 0,05 đến 5 mg/L Ở nồng độ Nile red 0,05 mg/L ảnh huỳnh quang sáng và rõ nét, có thể phân iệt từng hạt nhỏ PA 6 ở cả 3 ộ lọc (hình 3.1, hình 3.2 và hình 3.3) Ở đây chúng tôi th y có hiện tượng dập tắt huỳnh quang khi

t ng nồng độ thuốc nhuộm Hiện tượng này được cho là do quá trình oligome hóa (tự xếp chồng) của thuốc nhuộm Ở nồng độ cao, các phân tử thuốc nhuộm Nile red

có xu hướng tương tác với nhau t ng lên Do sự tương tác này, các phân tử thuốc

Hình 3.3 Ảnh huỳnh quang nhựa PA 6 ở nồng độ NR 0,05 mg/L, ộ lọc 1

Hình 3.4 Ảnh huỳnh quang nhựa PA 6 ở nồng độ NR 0,05 mg/L, ộ lọc 2

50

Hình 3.5 Ảnh huỳnh quang nhựa PA 6 ở nồng độ NR 0,05 mg/L, ộ lọc 3

3.1.3 Kết quả khảo sát độ nhạy của các bộ lọc huỳnh quang

Dung dịch vi nhựa PA 6, PE, PET, PVC, PMMA (đƣợc xử lý nhƣ mục 3.1.1) với nồng độ làm việc NR 0,05 mg/L (pha trong acetone) Ảnh huỳnh quang của các vi nhựa đƣợc xác định với 3 ộ lọc ở các mốc thời gian phơi sáng lần lƣợt 1 ms, 10

ms, 50 ms, 100 ms, 200 ms và 500 ms Kết quả đƣợc trình ày trong các ảng 3.3 (nhựa PA 6), ảng 3.4 (nhựa PE), ảng 3.5 (nhựa PET), ảng 3.6 (nhựa PVC), ảng 3.7 (nhựa PMMA)

Dựa vào kết quả thu được, chúng tôi nhận th y:

Tín hiệu huỳnh quang có xu hướng t ng khi thời gian phơi sáng t ng, thời gian phơi sáng càng cao thì ảnh huỳnh quang càng sáng và có thể khó xác định được hình thái của hạt nhựa Thời gian phơi sáng càng dài, đầu dò sẽ nhận được càng nhiều photon, dẫn đến cường độ điểm ảnh t ng lên và hình ảnh sáng hơn

Bộ lọc 3 cho phép phát hiện ảnh huỳnh quang màu đỏ của 5 loại nhựa ở t t cả các mốc thời gian phơi sáng trong khi ộ lọc 1 và ộ lọc 2 cho ảnh huỳnh quang không

rõ nét, mờ (hoặc không phát hiện) ở các mốc thời gian phơi sáng th p (1 ms, 10 ms,

50 ms), ngoại trừ PE

Đánh giá hình ảnh huỳnh quang của 5 loại nhựa PA 6, PE, PET, PVC, PMMA tại mốc thời gian phơi sáng 10 ms tương ứng với 3 ộ lọc (trình bày trong ảng 3.8) chúng tôi nhận th y ộ lọc 3 cho phép phát hiện rõ nét ảnh huỳnh quang của cả 5 loại nhựa so với ộ lọc 1 và ộ lọc 2 (ngoại trừ PE) Điều này được giải thích là do

ộ lọc 3 với ước sóng phát xạ màu đỏ ở 670 nm, ước sóng dài hơn so với ộ lọc 1

và ộ lọc 2 (470 nm và 560 nm) nên một lượng photon ít hơn cũng đủ cho ảnh huỳnh quang rõ nét ( ước sóng tỷ lệ nghịch với n ng lượng), điều đó cho th y độ nhạy của ộ lọc 3 là tốt hơn so với ộ lọc 1 và ộ lọc 2

do đó, nên sử dụng huỳnh quang màu xanh lá cây để loại ỏ nền và ao gồm các

ch t gây ô nhiễm tự nhiên [87][89]

Từ những nhận định trên chúng tôi rút ra kết luận, ộ lọc 3 với huỳnh quang màu đỏ cho độ nhạy tốt nh t, có thể phát hiện rõ các hạt vi nhựa như PA 6, PE, PET, PVC

và PMMA ở thời gian phơi sáng th p, vi nhựa PE có xu hướng phát huỳnh quang màu xanh mạnh hơn so với các vi nhựa còn lại như PA 6, PET, PVC, PMMA

55

3.2 Mô tả quy trình phân tích

Với kết quả khảo sát nồng độ làm việc tối ưu của thuốc nhuộm Nile red và độ nhạy của các ộ lọc, chúng tôi đề xu t quy trình phân tích xác định hạt vi nhựa trong mẫu nước như sau:

Bước 1: Lọc tách MPs

Mẫu được lọc qua rây inox 5 mm nhằm loại ỏ cặn có kích thước lớn hơn 5 mm, dung dịch qua lọc được lọc tiếp qua màng lọc cellulose acetate (CA), sau đó dùng nhíp chuyển màng lọc này vào cốc thủy tinh 250 mL, rửa l y cặn trên màng lọc CA với khoảng 50 mL nước c t (màng lọc CA được sử dụng vì ề mặt màng nhẵn óng, cho phép rửa cặn trên màng lọc dễ dàng, giảm thiểu th t thoát do vi hạt ám chặt trên ề mặt màng Ngoài ra màng CA đã được chứng minh có hiệu su t cao trong việc lọc vi nhựa [99])

Bước 2: Phân hủy vật chất hữu cơ

Đặt cốc vào ếp cách cát (đã điều chỉnh nhiệt độ khoảng 75o

C), để dung dịch bay hơi xuống còn khoảng 10 mL, để nguội Tiến hành phân hủy vật ch t hữu cơ ằng cách sử dụng thuốc thử Fenton (20 mL H2O2 30% và 20 ml FeSO4 0,05 M) ở 75oC trong 30 phút Lặp lại quá trình trên một lần nữa (nếu cần), để nguội, dùng nước c t tráng rửa thành cốc và mặt kính đồng hồ sao cho tổng thể tích dung dịch khoảng

100 mL [94]

Bước 3: Nhuộm MPs

Thêm vào 1 mL Nile red 5 mg/L (pha trong acetone) ằng pipet thủy tinh, để yên dung dịch 30 phút trong tối Tiến hành lọc qua màng lọc sợi thủy tinh GF/C, tráng rửa cốc 3 lần, mỗi lần 50 mL nước c t, chuyển màng lọc qua đ a petri, đậy nắp, s y khô ở 60oC trong 8 giờ, tiến hành soi vi nhựa dưới kính hiển vi huỳnh quang [89][100][101]

56

Bước 4: Định lượng MPs

Chuẩn ị hệ thống kính hiển vi huỳnh quang Olympus BX53 với các thông số cài đặt như sau:

- Độ phóng đại: lựa chọn độ phóng đại phù hợp (4X, 10X, 20X, 40X), thường thì

ắt đầu với độ phóng đại 10 lần

- Thời gian phơi sáng (exposure time): 10 ms, có thể t ng lên sao cho ảnh huỳnh quang sáng rõ

- Độ phân giải (resolution):

Bắt đầu xác định tín hiệu huỳnh quang với ộ lọc 3, vì ộ lọc này cho độ nhạy cao,

có thể dễ dàng phát hiện tín hiệu huỳnh quang màu đỏ ở thời gian phơi sáng ngắn (khoảng 10 ms), sau đó có thể chuyển sang ộ lọc 2 để xác định tín hiệu huỳnh quang màu xanh (nếu cần)

Đặt màng lọc lên lam kính, để xác định ảnh huỳnh quang ta chọn ―Live‖, sau đó di chuyển lam kính đến khi phát hiện tín hiệu huỳnh quang, di chuyển vi trí kính sao cho ảnh huỳnh quang rõ nét, điều chỉnh thời gian phơi sáng (exposure time) sao cho ảnh huỳnh quang sáng rõ

Xác định kích thước hạt: vào menu ―Measura‖, chọn ―Ar itrary line‖ sau đó đo kích thước hạt đã xác định

Chọn ―Snapshot‖ để chụp ảnh huỳnh quang, lưu và đặt tên

57

Bước 5: Định danh MPs

Chuẩn ị hệ thống ATR - FTIR, đặt màng lọc vào vị trí trên kính hiển vi, xác định

vị trí MPs, sử dụng đầu dò ATR gắn trên kính hiển vi đo phổ IR của MPs, kết quả phổ IR được so sánh với thư viện phổ của thiết ị, từ đó cho kết quả định danh MPs

Sơ đồ quy trình phân tích

Lọc tách l y MPs

Phân hủy hữu cơ

Nhuộm MPs Mẫu nước

Định danh MPs Định lượng MPs

Hình 3.6 Sơ đồ quy trình phân tích MPs trong nước

58

3.3 Kết quả thẩm định phương pháp phân tích

3.3.1 Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của phương pháp

N m loại nhựa (polyme tổng hợp) bao gồm PA 6, PE, PET, PVC, PMMA và một polyme tự nhiên là chitin sau quá trình phân hủy ằng thuốc thử Fenton được nhuộm ởi Nile red, phân tích trên kính hiển vi huỳnh quang thu được hình ảnh huỳnh quang tương ứng với 3 ộ lọc huỳnh quang, kết quả được trình ày trong ảng 3.9

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát độ đặc hiệu

59

Dựa vào kết quả trên ta th y nhựa và chitin đều cho ảnh huỳnh quang màu xanh lá cây ( ộ lọc 2) và màu đỏ ( ộ lọc 3), ảnh sáng và rõ nét Bộ lọc 1 cho ảnh huỳnh quang của PET và chitin sáng và rõ nét hơn so với PA 6, PE, PVC, PMMA, với PET màu tím và chitin màu xanh dương Dễ dàng nhận th y sự khác iệt của chitin (màu xanh dương) khi xem xét kết quả phân tích mẫu hỗn hợp ( ảng 3.10)

Bảng 3.10 Ảnh huỳnh quang mẫu hỗn hợp gồm nhựa và chitin

Mẫu sau quá trình định lượng trên kính hiển vi huỳnh quang được sử dụng để xác định c u trúc vi nhựa ằng phương pháp quang phổ FTIR trên thiết ị Nicolet IS50 với các số sóng nằm trong khoảng từ 4000 cm-1

đến 500 cm-1 Kết quả phổ FTIR thu được với các số dao động riêng của từng loại polyme ( ảng 3.11) hoàn toàn phù hợp với c u trúc của nhựa chuẩn và tương thích với các công trình đã công ố trước đây [102][103] Điều này chứng tỏ rằng phương pháp FTIR có thể được sử dụng để xác định thành phần của nhựa trong nghiên cứu này và có thể được sử dụng cho các loại vi nhựa khác tùy theo đặc tính của chúng

60

Phổ ATR – FTIR của nhựa và chitin:

Hình 3.7 Phổ ATR – FTIR của PA 6 sau khi nhuộm NR

Hình 3.8 Phổ ATR – FTIR của PE sau khi nhuộm NR

61 Hình 3.9 Phổ ATR – FTIR của PET sau khi nhuộm NR

Hình 3.10 Phổ ATR – FTIR của PVC sau khi nhuộm NR

62 Hình 3.11 Phổ ATR – FTIR của PMMA sau khi nhuộm NR

Hình 3.12 Phổ ATR – FTIR của Chitin sau khi nhuộm với NR

1461 CH2, dao động uốn cong

1371 CH2, dao động uốn cong

1199 CH2, dao động uốn cong

PET 1712 C = O, dao động kéo dãn

721 Aromatic CH, dao động uốn cong

PVC 1427 CH2, dao động uốn cong

64

1327 CH2, dao động uốn cong

1247 CH2, dao động uốn cong

1439 CH2, dao động uốn cong

1387 CH3, dao động uốn cong

1622 Amide C = O, dao động kéo dãn

1066 C – O – C, dao động kéo dãn

65

Từ những kết quả thu được, chúng tôi th y rằng tuy có sự khác iệt về ảnh huỳnh quang của chitin với polyme tổng hợp nhưng sẽ chính xác hơn để phân iệt ản ch t của chúng nếu kết hợp với phổ FTIR Các kết quả này khẳng định tính đặc hiệu và thực tế của việc phân tích vi nhựa trong nước iển ằng kính hiển vi huỳnh quang với thuốc nhuộm Nile red kết hợp phổ hồng ngoại nói riêng và các phương pháp phân tích c u trúc phân tử nói chung

3.3.2 Kết quả khảo sát độ thu hồi và độ lặp lại của phương pháp

Để đánh giá độ thu hồi và độ lặp lại của phương pháp, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm dựa trên các mẫu trắng thêm chuẩn được pha chế từ nước iển qua lọc và các hạt vi nhựa chuẩn với số lượng hạt được thêm vào lần lượt là 3 hạt, 5 hạt và 10 hạt Tại mỗi điểm khảo sát, số thí nghiệm lặp lại là 6 lần (n = 6) Tiến hành xử lý mẫu theo quy trình, phân tích trên kính hiển vi huỳnh quang, hình ảnh huỳnh quang thu được của các hạt PE và PVC được trình ày trong ảng 3.12 và ảng 3.13, kết quả khảo sát độ thu hồi và độ lặp lại của nhựa PE và nhựa PVC được trình ày lần lượt trong các ảng 3.14, ảng 3.15

66

Bảng 3.12 Ảnh huỳnh quang của các hạt PE tìm lại

Stt Mẫu trắng thêm chuẩn

70

Kết quả khảo sát với nhựa PE cho th y độ thu hồi (%R) dao động từ 93,3 – 100 %,

độ lặp lại nhỏ hơn 11,1 %, và kích thước hạt trung ình đạt 541 micron (được trình

ày trong phụ lục) Độ thu hồi của nhựa PVC dao động từ 88,3 – 90,0 %, độ lặp lại

%RSD nhỏ hơn 19,4 %, và kích thước hạt trung ình đạt 165 micron (được trình

ày trong phụ lục) Điều này cho th y với hạt có kích thước lớn thì độ thu hồi và độ lặp lại tốt hơn so với những hạt có kích thước nhỏ hơn do trong quá trình xử lý mẫu những hạt lớn hơn thì khả n ng dính vào thành ình th p hơn những hạt có kích thước nhỏ hơn, các hạt có kích thước nhỏ hơn có khả n ng ị xót khi soi kính hiển

vi cũng cao hơn, ên cạnh đó lực hút t nh điện giữa các hạt MPs với dụng cụ kim loại như nhíp gắp, hoặc ị gió cuốn đi trong quá trình s y cũng làm m t vi nhựa Những kết quả này cho th y phương pháp có độ thu hồi và độ lặp lại tốt mặc dù vẫn chưa có các tiêu chí đánh giá cụ thể Trong các phương pháp phân tích định lượng, tùy theo nồng độ ch t phân tích mà có các tiêu chí đánh giá khác nhau, nồng độ càng cao thì yêu cầu về độ thu hồi và độ lặp lại càng cao Theo AOAC 2016, ở mức nồng độ nhỏ nh t 1pp thì tiêu chí ch p nhận với độ thu hồi (%R) cho phép dao động trong khoảng từ 40 – 120 %, và độ lặp lại (%RSD) cho phép nhỏ hơn 30 %

71

3.4 Kết quả phân tích mẫu thực

Mẫu nước iển khu vực Cần Giờ được thu thập với một số thông tin cụ thể như sau:

Bảng 3.16 Vị trí l y mẫu khu vực iển Cần Giờ

Ảnh định vị

Google map

V độ N 10°22'07.8" N 10°22'09.8" N 10°24'43 8" Kinh độ E 106°53'25.5" E 106°56'33.2" E 106°58'49.1"

Mẫu sau khi thu thập được tiến hành phân tích theo quy trình, định lượng MPs ằng

kỹ thuật hiển vi huỳnh quang, định danh MPs ằng quang phổ FTIR Hình ảnh huỳnh quang và quang phổ FTIR của một số MPs được trình ày trong hình 3.13 và hình 3.14, số liệu phân tích MPs tại mỗi vị trí được trình ày trong phần phụ lục, nồng độ trung ình tổng quát khu vực iển Cần Giờ được trình ày trong ảng 3.17

74

Bảng 3.17 Sồ liệu tổng quát mẫu nước iển Cần Giờ

Loại nhựa Vị trí 1 Vị trí 2 Vị trí 3 Trung bình

Sai số chuẩn (SE) được tính theo công thức: SE SD

n



Trong đó: SD là độ lệch chuẩn, n là số mẫu

Ta có iểu đồ iểu diễn nồng độ MPs/L mẫu nước iển Cần Giờ

Hình 3.15 Biểu đồ iểu diễn nồng độ MPs trong mẫu nước iển Cần Giờ

75

Từ kết quả phân tích cho th y, hai loại vi nhựa là PE và PET có nồng độ cao nh t, với hàm lượng PE dao động từ 3,6 – 5,1 MPs/L và hàm lượng PET dao động từ 2,4 – 4,7 MPs/L Bốn loại nhựa có hàm lượng ở mức trung bình là PA, PVC, PP và PS với hàm lượng dao động từ 0,4 - 1,7 MPs/L Tổng nồng độ trung ình của vi nhựa dao động từ 11,9 - 14,1 MPs/L, hình thái vi nhựa chủ yếu là dạng mảnh và dạng sợi nên dễ dàng ị sóng đánh dạt vào gần ờ và phân ố ở tầng trên của cột nước

Các kết quả này phù hợp với các thành phần nhựa được sử dụng phổ iến trong các sản phẩm thực tế và phù hợp với hiện trạng, cơ c u và thành phần các sản phẩm nhựa của nước ta hiện nay Bên cạnh đó sự chiếm ưu thế của PE và PET cũng được xác nhận trong các áo cáo về MPs trong các sản phẩm muối iển thương mại [59]

Để kiểm tra sự khác iệt giữa nồng độ vi nhựa tại 3 vị trí, chúng tôi sử dụng phần mềm Excel với thuật toán thống kê ANOVA (single factor) Kết quả kiểm định thống kê ANOVA với độ tin cậy 95 % (α = 0,05) cho th y giá trị F(=0,29) < F crit (=3,02), điều đó chứng tỏ nồng độ vi nhựa tại a vị trí khác nhau là không có sự khác iệt, có tính thống nh t về mặt thống kê

Bảng 3.18 Kết quả kiểm định Anova

77

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1 Kết luận

Trong nghiên cứu này chúng tôi đã thực hiện thẩm định phương pháp xác định hạt

vi nhựa trong mẫu nước và ứng dụng phân tích hạt vi nhựa trong mẫu nước iển Cần Giờ Kết quả thu được như sau:

- Nồng độ làm việc tối ưu của thuốc nhuộm Nile red là 0,05 mg/L được pha trong acetone

- Huỳnh quang màu đỏ cho độ nhạy tốt nh t, có thể phát hiện rõ các hạt vi nhựa như PA 6, PE, PET, PVC và PMMA ở thời gian phơi sáng th p, khoảng 10 ms

Vi nhựa PE có xu hướng phát huỳnh quang màu xanh mạnh hơn so với các vi nhựa còn lại như PA 6, PET, PVC, PMMA

- Phương pháp có độ đặc hiệu, độ thu hồi và độ lặp lại cao Vi nhựa sau khi nhuộm với Nile red cho hình ảnh rõ nét và dễ phân iệt so với polyme tự nhiên như chitin

- Độ thu hồi ở các nồng độ 3, 5, 10 MPs/L dao động từ 88,3 – 100,0%

2 Kiến nghị

Do thời gian thực hiện đề tài có hạn, với kết quả thu được ở trên chúng tôi có một

số kiến nghị cho các nghiên cứu tiếp theo như sau: