Khảo sát hoạt tính biến tính tinh bột gạo của enzyme phân nhánh tái tổ hợp trong bacillus subtilis p3

49 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3 1 Phân tích tính chất hoá lý và cấu trúc phân tử của tinh bột gạo 3 1 1 Phân tích tính chất hóa lý của tinh bột gạo 3 1 1 1 Độ hoà tan, độ nhớt, tốc độ thoái hóa của gel bột gạo Độ hòa tan của bột gạo tự nhiên Trong quá trình khảo sát, tinh bột gạo tan trong nước ở nhiệt độ 25oC 6,5 ± 1,4 (mgml) Độ hòa tan của bột gạo tự nhiên trong nước không đáng kể, phù hợp với kết quả phân tích trọng lượng phân tử của bột gạo (trọng lượng phân tử của amylope.

49

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Phân tích tính chất hoá lý và cấu trúc phân tử của tinh bột gạo

3.1.1 Phân tích tính chất hóa lý của tinh bột gạo

3.1.1.1 Độ hoà tan, độ nhớt, tốc độ thoái hóa của gel bột gạo

* Độ hòa tan của bột gạo tự nhiên

Trong quá trình khảo sát, tinh bột gạo tan trong nước ở nhiệt độ 25oC: 6,5 ± 1,4 (mg/ml) Độ hòa tan của bột gạo tự nhiên trong nước không đáng kể, phù hợp với kết quả phân tích trọng lượng phân tử của bột gạo (trọng lượng phân tử của amylopectin bột gạo tự nhiên khoảng 108 và trọng lượng phân tử của amylose khoảng 105) Theo nghiên cứu của Mukerjea et al thì bột gạo Thái Lan có độ tan

khoảng 7,8 (mg/ml) [75] Sự khác biệt độ hòa tan giữa các loại gạo khác nhau có thể do đặc điểm giống, thổ nhưỡng điều kiện canh tác, làm ảnh hưởng đến tỷ lệ amylose/amylopectin, trọng lượng phân tử của amylopectin và amylose

* Độ nhớt của dung dịch hồ tinh bột

Độ nhớt của dung dịch hồ tinh bột ở nhiệt độ 25oC: 1,7 ± 0,5 (cP), nhỏ hơn độ nhớt

dung dịch hồ bột của khoai mì Theo nghiên cứu của Reddy et al (2014) thì các

giống khoai mì Basmati, HTM và Swarna có độ nhớt lần lượt là 2,0 cP; 3,5cP và 2,5

cP ở cùng nồng độ dung dịch 1%, nhiệt độ đo 25oC [76] Sự khác biệt này là do tỷ

lệ amylose/amylopectin trong tinh bột Khoai mì có amylopectin cao hơn nên độ nhớt cao hơn so với độ nhớt của dung dịch hồ bột gạo Tính chất này ảnh hưởng đến tính chất vật lý của sản phẩm chế biến từ tinh bột

* Tốc độ thoái hóa của gel

Sự thoái hóa tinh bột là một trong những tính chất làm thay đổi tính chất của sản phẩm Thoái hóa tinh bột được định nghĩa là hiện tượng tinh bột đã hồ hóa bị mất nước và tái kết tinh Bản chất của hiện tượng này chính là sự biến đổi về cấu trúc và mất ẩm của hạt tinh bột trong thời gian bảo quản Khi chế biến nhiệt, tinh bột sẽ hút

50

nước, trương nở và tạo gel Nhưng trong thời gian bảo quản nó có xu hướng nhả nước để tái kết tinh Quá trình dịch chuyển và biến đối trạng thái liên kết tự do của nước trong các cấu tử tinh bột là hai yếu tố quan trọng nhất kiểm soát sự biến đổi về cấu trúc [77]

Kết quả cho thấy tỷ lệ thoái hóa của gel tinh bột là 10% khi bảo quản ở nhiệt độ 4oC

(Hình 3.1)

y = 1.3214x - 0.2714

-1 0 1 2 3 4 5 6 7

Thời gian bảo quản (ngày)

Hình 3.1 Tốc độ thoái hóa của gel bột gạo khi bảo quản ở nhiệt độ 4oC

Tốc độ thoái hóa của gel ảnh hưởng đến sự ổn định của sản phẩm từ bột, khả năng tách nước, đặc biệt trong các ứng dụng sản xuất sản phẩm sốt hay dạng gel Quá trình thoái hóa của gel 10% của bột gạo tự nhiên khi bảo quản ở nhiệt độ 4oC tăng tuyến tính trong 5 ngày bảo quản Năng lượng thoái hóa tăng từ 0 lên 6,3 J/g bột trong 5 ngày khảo sát Tốc độ thoái hóa trung bình của gel bột gạo đạt 10% ở nhiệt độ 4oC là 1,32 J/g.ngày So với gel từ tinh bột khoai mì thì tốc độ thoái hóa trung bình của gel bột gạo cao hơn khoảng 20%

51

3.1.1.2 Hằng số động học của phản ứng thuỷ phân bột gạo tự nhiên

Bảng 3.1 Động học phản ứng với các enzyme tiêu hóa khác nhau

Enzyme tiêu hóa

Thông số động học

Km(mg/ml) kcat(1/s) kcat/Km PPA (Porcine Pancreatic

Glucoamylase (Aspergillus niger) 0,82±0,05 59,2±3,5 72,2±2,9 Giá trị Km của enzyme PPA đối với bột gạo tự nhiên là 0,12 nhỏ hơn 6,8 lần so với giá trị Km của enzyme glucoamylase đối với bột gạo, thể hiện enzyme tiêu hóa PPA

có ái lực rất lớn đối với bột gạo tự nhiên Theo nghiên cứu của Han Young-Joo thì giá trị Kcat/Km của enzyme PPA đối với bột khoai tây và lúa miến lần lượt là 5.036 ml/mg.s và 4.863 ml/mg.s thấp hơngiá trị Kcat/Km của gạo là 4030 ml/mg.s, thể hiện tốc độ tiêu hóa của enzyme PPA đối với bột gạo cao hơn so với khoai tây và lúa miến [78]

3.1.2 Cấu trúc phân tử của bột gạo

Kết quả phân tích hàm lượng amylose trong tinh bột gạo là 26,7 ± 0,5%

Hình 3.2 Phân bố chiều dài mạch nhánh của amylopectin trong phân tử tinh bột gạo Tính chất hoá lý và sinh học của các loại bột phụ thuộc vào cấu trúc phân tử, hàm lượng amylose và sự phân bố mạch của amylopectin của bột Bột gạo được cấu tạo

52

bởi 2 loại polysaccharide là amylose và amylopectin, tương tự như các loại bột từ ngủ cốc khác Trong các loại bột, tỉ lệ amylose trung bình là 25% và amylopectin là 75% Tuy nhiên bột gạo khảo sát có hàm lượng amylose cao hơn trung bình, đạt 26,7 ± 0,5 % Tỷ lệ phân bố mạch của amylopectin trong phân tử bột gạo (%) được thể hiện trong Bảng 3.2 Trong đó, amylopectin có DP 6-12 chiếm 25% Trong khi

đó, amypolpectin có mạch DP 13 - 24 chiếm đến 44% Amylopectin có mạch DP 25-36 chiếm 19% và amylopectin có DP > 36 chiếm 10% Tinh bột gạo tự nhiên có

DP trung bình là 20,3

Bảng 3.2 Mạch amylopectin trong phân tử tinh bột gạo (%)

25,1±0,7 43,7±0,2 19,3±0,3 9,9±0,2 20,3±0,2

Ghi chú: A DP 6-12; B1 13-24; B2 24-36; B3 >36

3.2 Biến nạp plasmid mang gen mã hóa enzyme phân nhánh vào vi khuẩn B

subtilis; nuôi cấy vi khuẩn B subtilis và thu nhận, tinh sạch enzyme phân

nhánh

3.2.1 Biến nạp plasmid mang gen mã hóa enzyme phân nhánh vào vi khuẩn B subtilis

Để thu nhận enzyme phân nhánh (BBE) với số lượng lớn sử dụng cho thí nghiệm

tiếp theo, plasmid mang gen mã hóa cho enzyme mục tiêu được biến nạp vào B subtilis 1012 và sàng lọc trên môi trường chứa kháng sinh Kết quả biến nạp được

thể hiện ở Hình 3.3

53

Hình 3.3 Kết quả biến nạp BBE vào Bacillus subtilis 1012

A Đối chứng âm; B B subtilis 1012 biến nạp với pBBE Các tế bào B subtilis 1012 có mang plasmid tái tổ hợp mang gene kháng kháng sinh

có khả năng mọc được trên môi trường chứa kháng sinh Kanamycin Kết quả cho

thấy ở đĩa đối chứng âm (B subtilis biến nạp với nước cất) (Hình 3.3.A) không có

sự xuất hiện của khuẩn lạc, ngược lại, ở đĩa có trải vi khuẩn được biến nạp với plasmid có sự xuất hiện của các khuẩn lạc mọc trên môi trường có chứa kháng sinh Kanamycin (Hình 3.3.B) Điều này chứng tỏ rằng đã biến nạp thành công plasmid

mang BBE vào tế bào B subtilis 1012 và những khuẩn lạc này có khả năng mang

plasmid tái tổ hợp

3.2.2 Thu nhận và tinh sạch enzyme phân nhánh

Sau quá trình biến nạp và nuôi cấy vi khuẩn trong điều kiện thích hợp để tạo enzyme phân nhánh Tiến hành phá vỡ tế bào và thu nhận protein tổng Dịch này được nạp vào cột sắc ký Ni - NTA để tiến hành tinh chế

54

Hình 3.4 Kết quả điện di SDS-PAGE BBE trong quá trình tinh chế

M: thang protein; B: dịch sau qua cột; W: washing buffer; E1-E5: các phân đoạn dung ly với

Elution buffer

Dịch protein tổng sau khi lọc được nạp trực tiếp đi qua cột sắc ký ái lực Ni-NTA

Do enzyme phân nhánh được biểu hiện bằng hệ thống vector biểu hiện pBBE nên protein tạo ra sẽ được dung hợp với đuôi histidine (His-tag) giúp protein tái tổ hợp bám vào cột sắc ký nhờ liên kết ái lực với resin Ni2+ trong cột, trong khi các protein khác sẽ bị loại bỏ bằng dung dịch washing chứa 30 mM imidazole Sau khi đã rửa sạch các protein tạo liên kết không đặc hiệu với cột sắc ký, protein đích được đẩy phân đoạn bằng dung dịch elution chứa 300 mM imidazole Kết quả thu được trên bảng điện di SDS-PAGE cho thấy BBE tái tổ hợp đã được thu lại ở dạng tinh sạch,

có kích thước khoảng 80 kDa (Hình 3.4)

Phân tích kết quả sau tinh chế cho thấy, protein mục tiêu sau tinh chế có tỷ lệ cao, chiếm 72,86 % protein trong dung dịch (kết quả phân tích tỷ lệ của protein mục tiêu

được biểu hiện so với protein tổng của tế bào B subtilis bằng phần mềm

UN-SCAN-IT gel 7.1)

Kết quả SDS-PAGE và phân tích tỷ lệ phần trăm protein sau tinh chế cho thấy trong dịch vẫn còn lẫn một lượng nhỏ enzyme không phải enzyme mục tiêu Điều này có thể do trong quá trình rửa giải không triệt để các protein khác bám trên cột, nồng độ

55

imidazole trong dung dịch wash không đủ lớn để đẩy những protein này ra khỏi cột trong bước rửa cột Phân đoạn chứa enzyme mục tiêu được thẩm tích nhằm loại muối và những protein tạp dưới 12 kDa

3.3 Khảo sát hoạt tính biến tính tinh bột gạo của enzyme phân nhánh

3.3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH

Enzyme chỉ có thể hoạt động tốt nhất ở trạng thái nhất định khi vận tốc xúc tác của phản ứng enzyme mạnh nhất Trong quá trình thuỷ phân tinh bột, tốc độ phản ứng phụ thuộc vào sự hình thành liên kết enzyme - tinh bột Liên kết này do sự hấp thụ lẫn nhau giữa các nhóm háo nước có trên bề mặt của các hạt tinh bột và enzyme như [- COOH], [- OH], [- COO], [NH2], [- SH] Các nhóm này khi tác dụng với nhau sẽ làm giảm năng lượng bề mặt, làm biến dạng các phần riêng biệt của phân tử amylose và amylopectin, dẫn đến làm đứt các liên kết glucoside để tạo sản phẩm và giải phóng enzyme Trạng thái này phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong đó có pH môi trường [79] Kết quả chỉ số DE khảo sát ở các giá trị pH khác nhau được thể hiện qua Bảng 3.3

Bảng 3.3 Chỉ số DE của tinh bột biến tính ở các giá trị pH khác nhau

56

Dựa vào kết quả Bảng 3.3 cho thấy có sự khác biệt về chỉ số DE ở các giá trị pH khác nhau Ở thí nghiệm đối chứng (không sử dụng enzyme), chỉ số DE cao nhất là 0,212 Điều này chứng tỏ rằng amylose trong dung dịch tinh bột không bị thay đổi cấu trúc thành các cấu trúc nhánh nên dễ dàng bị thủy phân bằng α-amylase và tạo

ra hàm lượng đường khử cao, dẫn đến chỉ số DE cao

Mặt khác, càng tăng giá trị pH từ 5,0 đến 7,0 chỉ số DE của tinh bột biến tính có xu hướng giảm Trong đó, ở các giá trị pH 6,0; 6,5 và 7,0 chỉ số DE đạt thấp nhất và có

khác biệt thống kê với các giá trị còn lại với mức ý nghĩa 1% Theo Shih et al

(2007), pH trong môi trường phản ứng có khả năng tác động lên trạng thái tích điện của nhóm carboxyl hoặc nhóm amin qua đó làm thay đổi các mối liên kết ion (vốn

có chức năng tạo cấu hình 3D cho phân tử protein), chính vì vậy sẽ làm thay đổi cấu hình không gian của phân tử enzyme Tại pH tối ưu, cấu hình không gian của enzyme hoặc trạng thái tích điện của cơ chất là phù hợp cho phản ứng xảy ra nhất Ngoài pH tối ưu thì khả năng xúc tác của enzyme yếu hơn hoặc bị bất hoạt [80].Theo nghiên cứu, thông số hoạt động tối ưu của enzyme phân nhánh là ở pH trung tính (6,0 - 7,0) Trong điều kiện thí nghiệm đã khảo sát, không có sự khác biệt về ý nghĩa thống kê giữa các giá trị pH 6,0; 6,5 và 7,0 do vậy để tiết kiệm hóa chất trong việc điều chỉnh giá trị pH, mẫu ứng với pH 7 được lựa chọn để làm thông số thích hợp cho các thí nghiệm tiếp theo

3.3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme Trong các phản ứng sinh học, khi nhiệt độ tăng, khả năng xúc tác của enzyme sẽ tăng Tuy nhiên, do bản chất enzyme là protein không bền nhiệt nên tốc độ phản ứng có một giới hạn nhất định, quá giới hạn đó tốc độ phản ứng sẽ giảm [57] Tùy thuộc vào nguồn gốc enzyme, loại cơ chất, pH môi trường… mà nhiệt độ tối thích cho hoạt động của enzyme có thể thay đổi Kết quả khảo sát sự thay đổi giá trị DE ở các mức nhiệt độ khác nhau được thể hiện ở Bảng 3.4

57

Bảng 3.4 Chỉ số DE của tinh bột biến tính ở các nhiệt độ khác nhau

Tuy nhiên, khi tăng nhiệt độ lên 70℃ - 80℃, chỉ số DE có xu hướng tăng (hoạt tính enzyme phân nhánh giảm) Điều này cũng hoàn toàn phù hợp với lý thuyết, nếu nhiệt độ quá cao, enzyme bị biến tính Khi cấu hình vị trí xúc tác không còn phù hợp với cơ chất, enzyme mất hoạt tính xúc tác Khi nhiệt độ hạ thấp hơn nhiệt độ tối

ưu, cơ chất và phân tử enzyme chuyển động chậm Tần số va chạm giữa chúng thấp, kết quả là ít phức hợp enzyme-cơ chất được hình thành và tốc độ phản ứng sẽ giảm

58

Dựa vào kết quả trên cho thấy nhiệt độ 65℃ là nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme phân nhánh nên được lựa chọn là mức nhiệt độ cho các thí nghiệm tiếp theo

3.3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ bột gạo

Nồng độ cơ chất là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng enzyme Trong cùng một nồng độ enzyme, khi nồng độ tinh bột tăng, tốc độ biến tính tăng, chỉ số DE giảm

Kết quả chỉ số DE của dung dịch biến tính ở các nồng độ cơ chất 1%, 5%, 7%, 10% (v/v) tại pH 7 và nhiệt độ 65℃ được thể hiện thông qua Bảng 3.5

Bảng 3.5 Chỉ số DE của tinh bột biến tính ở các nồng độ cơ chất khác nhau

59

giải thích là do nồng độ tinh bột cao nên độ nhớt của dung dịch trở nên rất cao làm enzyme phân nhánh khó tiếp xúc với cơ chất tinh bột Ở điều kiện phản ứng khảo sát, 5% tinh bột là nồng độ cho hoạt tính enzyme cao nhất Do đó nồng độ này được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo

3.3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Tương tự như các yếu tố pH, nhiệt độ và nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme cũng có ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme Trong trường hợp cơ chất cố định và nồng độ enzyme tăng dần, ban đầu tốc độ phản ứng sẽ tăng nhanh do môi trường thừa cơ chất Sau một thời gian, cơ chất bị phân giải dần và giảm nồng độ nên tốc độ phản ứng không tăng lên nữa mà có khuynh hướng giảm dần hoặc ngừng hẳn khi gặp điều kiện bất lợi [60] Kết quả trình bày ở Bảng 3.6 cho thấy có sự khác biệt của chỉ số DE theo nồng độ enzyme trong phản ứng

Bảng 3.6 Chỉ số DE của tinh bột biến tính ở các nồng độ enzyme khác nhau

Qua Bảng 3.6 cho thấy khi tăng nồng độ enzyme từ 15U - 30U thì chỉ số DE giảm

từ 0,176 xuống 0,114 Trong đó, ở nồng độ enzyme 25U và 30U, DE đạt giá trị thấp

60

nhất và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các giá trị còn lại Theo Nguyễn Trọng

Cẩn và cộng sự (1998), trong điều kiện nồng độ cơ chất thích hợp thì vận tốc phản

ứng tuyến tính với nồng độ enzyme [60] Enzyme phân nhánh có tác dụng kép trên chất nền tinh bột, phá vỡ chuỗi (phá vỡ liên kết α-D-1,4 glycosidic, giảm liên kết α-D1,6 glycosidic) và hình thành chuỗi bên mới (biến đổi liên kết α-D-1,4 glycosidic thành liên kết α-D-1,6, liên kết α-D1,3 hoặc liên kết α-D-1,4 khác) [44] Do đó, nồng độ enzyme tăng, dẫn đến tốc độ hình thành mạch nhánh trong phân tử tinh bột biến tính tăng lên

Tuy nhiên khi nồng độ enzyme tăng đến một giới hạn thì tốc độ phản ứng không tăng lên nữa Giai đoạn đầu khi nồng độ cơ chất thừa, vận tốc phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ enzyme, hàm lượng chất khô hòa tan tăng Càng về sau sản phẩm tạo thành tăng lên, vừa đóng vai trò chất ức chế không cạnh tranh, vừa làm cho lượng

cơ chất trong môi trường giảm nên khi tiếp tục tăng nồng độ enzyme thì vận tốc phản ứng tăng không đáng kể Kết quả này cho thấy rằng việc tăng thêm nồng độ enzyme không có tác dụng làm tăng sự biến tính của tinh bột, điều này có nghĩa là tốc độ phản ứng không tăng do hiện tượng bão hòa enzyme

Dựa trên kết quả thí nghiệm kết hợp với điều kiện kinh tế, nồng độ enzyme 25 U được lựa chọn cho thí nghiệm tiếp theo

3.3.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân

Thời gian biến tính cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến tốc độ tiêu hóa của tinh bột biến tính Sau khi xác định được các giá trị thích hợp là pH 7,0, nhiệt độ 65℃, nồng độ tinh bột 5% và nồng độ enzyme 25 U cho hoạt động thích hợp của enzyme phân nhánh, tiến hành khảo sát các mức thời gian thủy phân là 0,5 giờ, 3 giờ, 6 giờ, 9 giờ, 18 giờ, 24 giờ Thí nghiệm được lặp lại 3 lần với 3 ống nghiệm khác nhau Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở Bảng 3.7

61

Bảng 3.7 Chỉ số DE của tinh bột biến tính ở các thời gian thủy phân khác nhau

là do enzyme xúc tác phản ứng thủy phân càng dài càng tạo lượng tinh bột biến tính càng nhiều, làm giảm hàm lượng đường khử bị phân hủy bởi α- amylase từ đó chỉ

số DE thấp

Theo Crabb and Mitchinson (1997), tốc độ phản ứng sẽ tăng theo thời gian phản ứng do enzyme có thời gian để tiếp xúc với cơ chất [82] Thời gian thủy phân càng kéo dài thì phản ứng càng xảy ra triệt để và đạt thông số kỹ thuật [60] Tuy nhiên với một lượng cơ chất nhất định, phản ứng thủy phân của enzyme đến một giai đoạn nào đó thì khả năng xúc tác sẽ giảm Enzyme tạo ái lực với các sản phẩm tạo thành của phản ứng và cơ chất, các sản phẩm sinh ra đóng vai trò như chất kìm hãm không cạnh tranh và kìm hãm hoạt động của enzyme [57]

62

Do đó, dựa trên hiệu suất quá trình kết hợp tiết kiệm năng lượng, thời gian biến tính

là 6 giờ được chọn là khoảng thời gian thích hợp nhất

3.3.6 Kết quả cấu trúc tinh bột sau biến tính

Kết quả phân tích hàm lượng amylose cho thấy, hàm lượng amylose của tinh bột biến tính (2,5 ± 0,3) thấp hơn tinh bột gạo tự nhiên 8 lần (20,4 ± 0,3) Đối với dạng tinh bột hồ hóa, cấu trúc của hạt tinh bột hầu như bị phá vỡ Cấu trúc phân tử của tinh bột rất quan trọng trong dinh dưỡng và các chức năng khác trong thực phẩm, khi hàm lượng amylose thấp, nhiệt độ hồ hóa giảm Các đặc tính của tinh bột hiện nay phụ thuộc chủ yếu vào tỷ lệ amylopectin/amylopectin, cấu trúc của amylopectin đặc biệt phân bố theo chiều dài chuỗi phân nhánh [84] Phân tích cấu trúc tinh bột sau biến tính bằng phương pháp HPLC cho thấy tỷ lệ amylopectin mạch nhánh ở tinh bột biến tính cao hơn ở tinh bột chưa biến tính (các phân tử có DP thấp xuất hiện nhiều hơn) Kết quả xuất ra từ phần mềm cho thấy mạch nhánh của tinh bột biến tính tăng thêm 12,3% so với tinh bột gạo tự nhiên (Hình 3.5)

Hình 3.5 Sự phân bố chiều dài mạch nhánh của amylopectin trong phân tử tinh bột

gạo tự nhiên và tinh bột gạo biến tính