28 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2 1 Vật liệu nghiên cứu 2 1 1 Vật liệu Plasmid BBE (Đại học Quốc gia Chungnam, Hàn Quốc) Bacillus subtilis 1012 (leuA8 metB5 trpC2 hsdRM1) được sử dụng làm chủng biểu hiện cung cấp bởi Trung tâm Khoa học và Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên ĐHQG TpHCM Thang protein Hình 2 1 Thang chuẩn Promega 10 225 kDa 2 1 2 Dụng cụ thiết bị 2 1 2 1 Dụng cụ HisTrapTMFF (GE Healthcare) Hình 2 2 Cột sắc ký ái lực Ni NTA (GE Healthcare).
Trang 128
CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu nghiên cứu
2.1.1 Vật liệu
- Plasmid BBE (Đại học Quốc gia Chungnam, Hàn Quốc)
- Bacillus subtilis 1012 (leuA8 metB5 trpC2 hsdRM1) được sử dụng làm chủng biểu
hiện cung cấp bởi Trung tâm Khoa học và Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên- ĐHQG TpHCM
- Thang protein
Hình 2.1 Thang chuẩn Promega 10-225 kDa
2.1.2 Dụng cụ thiết bị
2.1.2.1 Dụng cụ
- HisTrapTMFF (GE Healthcare)
Hình 2.2 Cột sắc ký ái lực Ni-NTA (GE Healthcare)
Trang 229
- Màng lọc 0.45µm (Whatman)
- Màng lọc 0,47 µm (MS)
- Màng thẩm tích 12 MWCO (Spectrum Laboratries)
- Erlen, beaker, ống nghiệm
- Máy ly tâm lạnh (Hettich, Đức)
- Máy ly tâm lạnh (SER 148/3 F30300240, Ý)
- Máy vortex (Velp, Ý)
- Máy đo quang phổ (Cary 50)
- Máy khuấy từ (IKA, Đức)
- Máy phá mẫu bằng sóng siêu âm (Q500-Qsonica, Mỹ)
- Cân phân tích (Kern ABJ 220-4NM, Đức)
- Cân phân tích (SJ 220CE-Vibra, Nhật Bản)
- Máy đo pH (Adwai Instruments, Hungary)
- Nồi hấp tiệt trùng (ALP, Nhật Bản)
- Máy lắc ổn nhiệt
- Tủ lạnh -20 ºC, 4ºC
Trang 330
- Tủ cấy vô trùng
2.1.3 Hóa chất
2.1.3.1 Hóa chất biến nạp
* Tạo tế bào B subtilis 1012 khả nạp
- Dung dịch CaCl2 100 mM vô trùng (giữ ở 4 ºC)
- Dung dịch glycerol 100% vô trùng (giữ ở 4 ºC)
- Dung dịch EGTA 0,1M, pha bằng nước cất vô trùng và giữ ở 4 ºC
* Cảm ứng biểu hiện protein trên B subtilis 1012
- Dung dịch IGPT, pha bằng nước cất khử trùng và giữ ở 4 ºC
2.1.3.2 Hóa chất điện di
- Dung dịch đệm điện di: Tris 40 g, Glycine 45,5 g trong 5 lít nước
- Acrylamide mix (29:1)
- SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)
- TEMED (N,N,N’,N’- tetramethyl ethylen ediamine)
- APS (Amonium persulfate)
- Tris- HCl (pH 8,8) và Tris- HCl (pH 6,8)
- Thang protein chuẩn BioLab
- Comassie blue R-250 Stain
- SDS- loading buffer 5X: 200mM Tris- HCl pH 6,8, 8% SDS, 40% glycerol, 0,4% bromophenol blue, 200mM DTT (Dithiolthreitol)
- Dung dịch điện di 10X: 140 g Glycine, 30g Tris- HCl, 10 g SDS, thêm dH2O vừa
đủ 1 lít Pha loãng 10 lần trước khi dùng
Trang 431
- Dung dịch nhuộm: 0,625 g comassive brilliant blue, 112,5 mL ethanol 99%, 25
mL glacial acetic acid, thêm H2O vừa đủ 1 lít
- Dung dịch giải nhuộm: 75 mL acid acetic, 100 mL ethanol, thêm H2O đến 1 lít Thành phần được thể hiện trong Bảng 2.1
2.1.3.3 Hóa chất tinh chế protein
Bảng 2.2 Thành phần buffer dùng trong tinh chế protein
Hóa chất
Nồng độ Binding buffer Washing buffer Elution buffer
Trang 5- 1% Tinh bột: 1 g tinh bột trong 100 mL 0,016 M đệm sodium acetate pH 4,8 Đun nóng và khuấy đến khi tan, sau đó làm nguội
- Dung dịch maltose chuẩn (5 µM/mL): 180 mg maltose (MW 360,3) trong 100 mL
nước cất
2.1.3.4 Hóa chất khác
- Kanamycin 50 mg/mL, pha bằng nước cất vô trùng và bảo quản ở -20 ºC
- Dung dịch IPTG, pha bằng nước cất vô trùng và bảo quản ở -20 ºC
2.1.4 Môi trường
- Môi trường LB (Luria - Bertami): 10 g trypton, 5 g yeast extract (cao nấm men), 5
g NaCl, dH2O vừa đủ 1 lít
- Môi trường LB - Agar: thành phần như LB lỏng, bổ sung 2% agar
- Môi trường LB - Kana: là môi trường LB có bổ sung Ampicillin nồng độ cuối 50 µg/mL
- Môi trường LB - Agar - Kana: là môi trường LB - Agar có bổ sung Ampicillin nồng độ cuối 50 µg/mL
Trang 6vô trùng sau khi hấp
- Môi trường HS (High salt medium): 10 mL 10X S - Base, 2,5 mL glucose 40%, 5
mL L - tryptophan 0,1%, 1 mL casein 2%, 5 mL yeast extract 10%, 10 mL arginine 8% và histidine 0,4%, thêm dH2O đủ 100 mL
- Môi trường LS (Low salt medium): 10 mL 10X S – Base, 2,5 mL glucose 20%, 0,5 mL L - tryptophan 0,1%, 0,5 mL casein 2%, 5 mL yeast extract 10%, 0,25 mL MgCl2 1 M, 0,05 mL CaCl2 1 M, thêm dH2O đủ 100 mL
Tất cả thành phần pha HS và LS được hấp khử trùng ở 121 ºC, 20 phút trước khi pha môi trường, các amino acid được pha bằng nước cất khử trùng
2.2 Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 1: Phân tích tính chất hoá lý và cấu trúc phân tử của tinh bột gạo
- Nội dung 2: Biến nạp plasmid mang gen mã hóa cho enzyme phân nhánh vào vi khuẩn Bacillus subtilis; biểu hiện, thu nhận và tinh sạch enzyme phân nhánh:
+ Biến nạp plasmid mang gen mã hóa cho enzyme phân nhánh vào vi khuẩn
Bacillus subtilis
+ Nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis tái tổ hợp
+ Thu nhận và tinh sạch enzyme phân nhánh bằng sắc ký ái lực với Ni-NTA resin
- Nội dung 3: Khảo sát hoạt tính của enzyme phân nhánh đối với tinh bột gạo dưới các điều kiện khác nhau:
+ Khảo sát ảnh hưởng của pH;
Trang 734
+ Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ;
+ Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ bột gạo;
+ Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme;
+ Khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân
Trong mỗi thí nghiệm khảo sát, hiệu quả biến tính được đánh giá thông qua chỉ tiêu
DE Trong sản phẩm của thí nghiệm cuối cùng, cấu trúc tinh bột biến tính được đánh giá và so sánh với cấu trúc tinh bột ban đầu
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Nội dung 1: Phân tích tính chất hoá lý và cấu trúc phân tử của tinh bột gạo
- Các mẫu gạo lấy từ: Công ty Lương thực Tiền Giang
- Giống gạo được sử dụng trong thí nghiệm là IR50404 (tên thương mại là gạo 504) Đây là giống gạo được sử dụng tại cơ sở bánh bún, hủ tiếu thuộc làng nghề bánh bún, hủ tiếu xã Mỹ Phong, Tp Mỹ Tho, tỉnh Tiền Giang (loại gạo đã làm sạch cám) Gạo được thu về, tiến hành nghiền thành bột như tại các cơ sở sản xuất
- Các chỉ tiêu phân tích:
+ Phân tích tính chất hóa lý, bao gồm:
i) Xác định độ hòa tan của bột gạo trong nước;
ii) Đánh giá độ nhớt của dung dịch bột gạo bằng nhớt kế;
iii) Khả năng tạo gel;
iv) Tốc độ thoái hoá khi bảo quản gel (hồ) tinh bột: theo phương pháp của Singh et
al (2004);
+ Phân tích cấu trúc phân tử của tinh bột gạo:
Trang 8Để phân tích cấu trúc của mạch tinh bột (chiều dài mạch và tỉ lệ nhánh) của bột và
bột sau khi biến tính, sử dụng HPLC với quy trình sau:
+ 1 mL mẫu được xử lý với enzyme isoamylase (25 mM; 0,36 U/mg) trong dung
dịch đệm acetate (pH 4,3) ở 60oC, 48 giờ
+ Dừng phản ứng bằng cách đun sôi dung dịch trong 10 phút
+ Sau đó mang đi ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/phút trong 10 phút Mẫu sau ly tâm sẽ được lọc bởi màng lọc 0,45m (Millex, Millipore, Bedford, MA, USA) + Cấu trúc của chuỗi được phân tích bằng HPAEC (high-performance anion-exchange
chromatography), hệ thống (Dionex-300, Dionex, Sunnyvale, CA, USA) đồng bộ với đầu dò điện tử (ED40, Dionex) Cột trao đổi ion CarboPacTM PA1(250 x 4 mm,
Dionex) và cột bảo vệ được sử dụng để tách riêng các mẫu đã được gắn thêm nhánh + Sau khi cột được cân bằng bởi NaOH 150 mM, mẫu được rửa giải nhiều lần với
hệ dung dịch sodium acetate 600 mM trong NaOH 150 mM, tốc độ 1 mL/phút Tốc độ thay đổi nồng độ sodium acetate như sau: 10 - 30% trong 0 - 10 phút, 30 - 40% trong 10 - 16 phút, 40 - 50% trong 16 - 27 phút, 50 - 60% trong 27 - 44 phút và 60 -
64% trong 44 - 60 phút
2.3.2 Nội dung 2: Biến nạp plasmid mang gen mã hóa cho enzyme phân nhánh vào
vi khuẩn Bacillus subtilis; biểu hiện, thu nhận và tinh sạch enzyme phân nhánh
Đề tài kế thừa: có sẵn plasmid sinh enzyme phân nhánh cho cơ chất là tinh bột và vi
sinh vật nuôi cấy: sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis (Các nội dung chọn dòng, biến nạp plasmid vào vi khuẩn, nuôi cấy và thu nhận enzyme đã được tác giả Lê Quang
Trang 936
Trí [40] nghiên cứu, không bố trí thí nghiệm, chỉ thực hiện đúng quy trình để nhận được vi khuẩn mang plasmid cần và enzyme thô đủ số lượng cho các nội dung sau) 2.3.2.1 Biến nạp plasmid mang gen mã hóa cho enzyme phân nhánh vào vi khuẩn Bacillus subtilis
- Chuẩn bị tế bào khả nạp B subtilis:
+ Cấy 1 khuẩn lạc B subtilis vào 5 mL môi trường HS, lắc 37oC, qua đêm
+ Cấy truyền sang 55 mL môi trường HS sao cho giá trị OD600 cuối đạt được 0,1, lắc 250 vòng/phút ở 37oC
+ Tiến hành dựng đường cong tăng trưởng
+ Khi sự tăng trưởng bắt đầu vào pha cân bằng, thu 10 mL dịch nuôi cấy (mỗi lần thu cách nhau 15 phút) cho vào 1 mL glycerol (100%), huyền phù và giữ trong đá
15 phút Sau đó chia vào mỗi eppendorf 1 mL dịch, bảo quản ở -800C
+ Các phân đoạn tế bào khả nạp được cho biến nạp vào plasmid để chọn ra phân đoạn cho hiệu suất biến nạp cao nhất
- Biến nạp plasmid vào tế bào B subtilis:
+ Lắc nhẹ 1 mL tế bào khả nạp trong 10 mL LS, tốc độ lắc 60 vòng/phút ở 300C trong 2 giờ
+ Bổ sung 100 µl EGTA, ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng
+ Chia 1 mL dịch nuôi cấy vào eppendorf chứa 10 µg plasmid, lắc 250 vòng/phút trong 2 giờ ở 370C
+ Ly tâm 9.000 vòng/phút, bỏ 1 phần dịch nổi, huyền phù sinh khối với phần dịch còn lại, trải dịch huyền phù trên đĩa LB-Agar-Kana
+ Ủ 370C, qua đêm
Trang 1037
2.3.2.2 Thu nhận và tinh sạch enzyme phân nhánh
- Sau quá trình biến nạp và nuôi cấy vi khuẩn trong điều kiện thích hợp để tạo enzyme phân nhánh Tiến hành phá vỡ tế bào và thu nhận enzyme thô
- Tinh sạch enzyme thô Theo kết quả nghiên cứu, enzyme phân nhánh có trọng lượng phân tử là 74 KDa
- Quy trình nuôi cấy và biểu hiện enzyme với tổng thể tích lên men 1 L:
+ Chủng B subtilis được hoạt hóa trong 15 mL môi trường LB chứa Kanamycin
nồng độ 50 µg/mL, nuôi cấy lắc 250 rpm, 370C qua đêm
+ Tiếp tục hoạt hóa thứ cấp từ dịch hoạt hóa sơ cấp trong 50 mL môi trường LB - Kana, nuôi cấy lắc 250 rpm, 370C trong 16 - 18 giờ
+ Đo OD600 và chuyển dịch nuôi cấy sang 1 L môi trường LB - Kana, sao cho OD đạt 0,1 Nuôi cấy lắc 250 rpm, 370C cho đến khi dịch nuôi cấy đạt giá trị OD600
khoảng 0,8 - 1,0; tiến hành cảm ứng với nồng độ 0,5 mM IPTG và thời gian cảm ứng là 3 giờ trong điều kiện lắc 37 ºC
+ Tiến hành thu tổng sinh khối vào thời điểm đã khảo sát
+ Bảo quản sinh khối ở -800C
- Quy trình tinh chế:
+ Sinh khối B subtilis thu được sau khi nuôi cấy và cảm ứng biểu hiện trước đó
được huyền phù trong dung dịch Binding buffer, bổ sung 20 µg/mL Dnase I và 1
mM PMSF Huyền phù sinh khối
+ Phá tế bào bằng sống siêu âm Chu trình phá tế bào gồm biên độ sóng 70 trong 10 giây, nghỉ 25 giây, 6 chu kỳ, thực hiện trong đá lạnh
+ Tiến hành ly tâm 13.000 rpm, 30 phút, 40C, thực hiện 2 lần, thu nhận phần dịch nổi chứa enzyme dạng tan
Trang 1138
+ Phần dịch nổi được lọc qua màng lọc 0,22 µm
+ Phần dịch nổi sau khi lọc được cho chảy qua cột Histrap HP (GE healthcare) đã được cân bằng với dung dịch Binding buffer; các enzyme có His-tag sẽ bám lên cột + Rửa sạch các enzyme bám không đặc hiệu bằng 100 mL dung dịch rửa chứa 5 nM Imidazole
+ Enzyme mục tiêu được dung ly ra khỏi cột bằng dung dịch dung ly chứa Imidazole với nồng độ tăng dần từ 10, 40, 100 và 250 nM, thu với nhiều phân đoạn
+ Kiểm tra các phân đoạn enzyme bằng phương pháp SDS-PAGE
+ Sau khi có kết quả điện di, thu nhận enzyme ở phân đoạn có protein mục tiêu tinh sạch tiến hành thẩm tách trong dung dịch bảo quản (50mM Tris pH 7,5, 1mM PMSF),
đo nồng độ enzyme và bảo quản ở -200C
2.3.3 Nội dung 3: Khảo sát hoạt tính của enzyme phân nhánh đối với tinh bột gạo dưới nhiều điều kiện khác nhau
2.3.3.1 Nguyên lý
Enzyme phân nhánh xúc tác thủy phân liên kết α-1-4-glycosidic của amylose tạo dextrin và amylose mạch ngắn, song song đó xúc tác tạo liên kết α-1-6-glycosidic với dextrin hoặc amylose còn lại Kết quả tạo glucan phân nhánh Đồng thời enzyme phân nhánh này xúc tác thủy phân amylopectin tại liên kết α-1-4-glycosidic ở giữa mạch, tạo ra các bó amylopectin Như vậy sau giai đoạn này sẽ thu được bột gạo biến tính với hàm lượng amylose thấp và các bó amylopectin có trọng lượng thấp
2.3.3.2 Bố trí thí nghiệm
Bố trí các thí nghiệm thích hợp quá trình biến tính bột gạo bằng enzyme phân nhánh: Thông thường, 2 thông số nhiệt độ và pH thuộc về bản chất enzyme, do đó, cần khảo sát 2 thông số này trước và chỉ cần khảo sát từng biến Sau khi tìm được thông
số nhiệt độ và pH thích hợp, tiếp tục khảo sát tiếp 2 thông số nồng độ bột gạo và nồng độ enzyme; cuối cùng, khảo sát thời gian phản ứng
Trang 12Lượng mẫu sử dụng 100 mL dung dịch hồ tinh bột 5% (w/w)
- Số lần lặp lại: 3 lần
→ Hàm mục tiêu: Chỉ số DE của tinh bột gạo
- Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Trang 1340
- Cách thực hiện:
+ Hòa tan bột gạo trong các dung dịch đệm pH 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0 và hồ hóa 100
mL huyền phù bột nồng độ 5% (w/w) (có khuấy trộn) trong 15 phút ở 60℃
+ Làm nguội hồ tinh bột trên xuống 600C cho dịch enzyme α-amylase 25 U/g vào
và ủ ở 600C trong 6 giờ trong bể điều nhiệt có rung lắc
+ Sau 6 giờ cho 300 mL ethanol 960 vào dịch hồ tinh bột đã ủ với enzyme để kết tủa tinh bột Tách kết tủa bằng cách ly tâm 6000 vòng trong 20 phút Tinh bột này được rửa lại 2 lần bằng nước cất và được tách ra bằng cách ly tâm Tinh bột đã biến tính bằng enzyme được sấy đối lưu ở 500C trong 24 giờ Mẫu bột gạo đối chứng được tiến hành hồ hóa, kết tủa, rửa tủa và sấy khô mẫu như các mẫu khảo sát (độ ẩm của các mẫu sau khi sấy khô vào khoảng 12 ± 0,5%) Sau đó tiến hành nghiền mịn Bột gạo sau biến tính được sử dụng cho các bước tiếp theo nhằm xác định DE
b Thí nghiệm khảo sát nhiệt độ thích hợp cho phản ứng của enzyme phân nhánh
Bảng 2.4 Thông số thí nghiệm b
Nhiệt độ ủ enzyme 50oC; 55oC; 60oC; 65oC; 70oC; 75oC; 80oC
Thông số cố định
Lượng mẫu sử dụng 100 mL dung dịch hồ tinh bột có nồng độ 5% (w/w)
pH của phản ứng enzyme Kết quả thí nghiệm a
Trang 1441
+ Cho dịch hồ tinh bột trên vào bể ổn nhiệt, cho dịch enzyme phân nhánh 25 U/mẫu và
ủ ở các nhiệt độ 50, 55, 60, 65, 70, 75, 800C trong 6 giờ trong bể điều nhiệt có rung lắc + Sau 6 giờ cho 300 mL ethanol 960 vào dịch hồ tinh bột đã ủ với enzyme để kết tủa tinh bột Tách kết tủa bằng cách ly tâm 6000 vòng trong 20 phút
+ Bột này được rửa lại 2 lần bằng nước cất và được tách ra bằng cách ly tâm Bột đã biến tính bằng enzyme được sấy đối lưu ở 500C trong 24 giờ Mẫu bột đối chứng được tiến hành hồ hóa, kết tủa, rửa tủa và sấy khô mẫu như các mẫu khảo sát (độ ẩm của các mẫu sau khi sấy khô vào khoảng 12 ± 0,5%) Sau đó tiến hành nghiền mịn Bột gạo sau biến tính được sử dụng cho các bước tiếp theo nhằm xác định DE
Đánh giá mẫu
Trang 1542
c Thí nghiệm khảo sát nồng độ bột gạo thích hợp cho phản ứng của enzyme
Bảng 2.5 Thông số thí nghiệm c
Nồng độ dung dịch hồ tinh bột 1%; 3%; 5%; 7%, 10% (w/w)
Thông số cố định
Lượng mẫu sử dụng 100 mL dung dịch hồ tinh bột
pH của phản ứng enzyme Kết quả thí nghiệm a
Chọn nồng độ
bột
Đánh giá mẫu
10
%
Trang 1643
- Cách thực hiện:
+ Hồ hóa 100 mL huyền phù bột với các nồng độ khác nhau 1%, 3%, 5%, 7%, 10% (w/w), (có khuấy trộn) trong 15 phút
+ Các bước tiếp theo thực hiện tương tự thí nghiệm a
d Thí nghiệm khảo sát nồng độ enzyme phân nhánh thích hợp cho phản ứng
pH của phản ứng enzyme Kết quả thí nghiệm a
- Số lần lặp lại 3 lần
→ Hàm mục tiêu: Chỉ số DE của tinh bột gạo
Trang 17+ Làm nguội hồ tinh bột trên xuống nhiệt độ thích hợp cho dịch enzyme phân nhánh
ở các mức như trên sơ đồ bố trí thí nghiệm, ủ ở nhiệt độ và pH thích hợp trong 6 giờ trong bể điều nhiệt có rung lắc
+ Các bước tiếp theo thực hiện tương tự thí nghiệm a
