Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Đề tài Định lượng Coliforms và E. Coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.

Ngoài ra, vi khuẩn Coliforms và vi khuẩn E.coli là loại vi khuẩn có thể sinh sống trong nhiều môi trường khác nhau như đất, nước và cả hệ tiêu hóa của con người.. Ô nhiễm nguồn nước:• E

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM

Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm.

GVHD: Hoàng Xuân Thế

Quy trình định

lượng Coliforms

và E.coli bằng

phương pháp đến khuẩn lạc.

Dụng cụ môi trường, và thiết bị.

LỜI MỞ ĐẦU

Ô nhiễm môi trường nước ảnh hưởng rất xấu đến sức khỏe của con

người cũng như hệ sinh thái Do các chất thải của con người, khu xí nghiệp, khai thác khoáng sản, dầu mỏ, dầu khí,… khiến nguồn nước bị ô nhiễm

nghiêm trọng, ảnh hưởng trực tiếp đến nhiều vấn đề sức khỏe và cuộc sống của con người Kể cả chất thải khu chế biến thủy sản, khu giết mổ, chế biến thực phẩm và hoạt động lưu thông với khí thải hóa chất cặn sau sử dụng

cũng là tác nhân gây ô nhiễm nguồn nước.

Ngoài ra, vi khuẩn Coliforms và vi khuẩn E.coli là loại vi khuẩn có thể

sinh sống trong nhiều môi trường khác nhau như đất, nước và cả hệ tiêu hóa của con người Đây chính là thủ phạm gây nhiều bệnh nguy hiểm trên hệ

tiêu hóa như tiêu chảy, mất nước dẫn tới suy thận, thậm chí là tử vong Tuy nhiên để làm rõ hơn, nhóm chúng em xin trình bày đề tài: “Định lượng

Coliforms và E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc”.

01 Tình Hình Ô Nhiễm Vi Sinh Vật

Ô nhiễm nguồn nước:

• E.coli và Coliforms được sử dụng làm

chỉ thị vi sinh vật cho các nghiên cứu về

ô nhiễm nguồn nước ăn uống và nước

sinh hoạt

• Mật độ E coli và Coliforms là chỉ tiêu

quan trọng để đánh giá chất lượng

nước

• Do vậy, kiểm tra sự có mặt của vi khuẩn

này trong nước rất cần quan tâm thực

hiện

Tình Hình Ô Nhiễm Vi Sinh Vật

Nguồn nước bị ô nhiễm Coliforms và Escherichia Coli

Nguyên nhân:

 Xử lý chất thải sinh hoạt, chất thải công nghiệp

và phân động vật không đúng cách, không

đúng quy trình dẫn đến các vi khuẩn ngấm vào

lòng đất, thấm vào các mạch nước ngầm và

khiến nguồn nước bị nhiễm khuẩn.

 Các nhà máy xử lý nước sinh hoạt chưa xử lý

triệt để.

 Nguồn nước giếng chưa xử lý vì nguồn cung

cấp nước giếng chính là các mạch nước ngầm

đã bị ngấm vi khuẩn.

 Nước máy nhiễm khuẩn do chảy qua các

đường ống cũ, bị gỉ sét do thời gian sử dụng

quá dài.

 Nước mưa chưa qua xử lý.

Nguy cơ ô nhiễm vi khuẩn:

Là bệnh truyền nhiễm lây truyền qua đường

phân, tay, miệng Chúng ta bị lây nhiễm qua các

vật trung gian như bàn tay, vật dụng, thức ăn,

nước uống,…

Có thể nhiễm khuẩn qua tắm sông Nếu nước bị

nhiễm khuẩn hay nước chưa được khử trùng

bằng chlorine.

Thực phẩm và nước bị nhiễm khuẩn khó bị phát

hiện Vì mùi vị và màu sắc không có gì thay đổi.

Cách phòng ngừa: ăn chín, uống nước tiệt trùng

Vệ sinh môi trường, rửa tay ngay sau khi đi vệ

sinh Dùng nước đã qua xử lý để nấu nước uống

và nấu ăn.

Nguồn nước bị ô nhiễm Coliforms và Escherichia Coli

Tác hại của vi khuẩn đối với cơ thể bị nhiễm

Biểu hiện ở người:

 Gây rối loạn hệ tiêu hóa: thời gian để vi khuẩn Coliform ủ bệnh là từ 1 – 2 ngày, sau đó xuất hiện triệu chứng đau quặn bụng dữ dội.

 Mắc các bệnh về đường ruột như: bệnh lị, tiêu chảy, đi phân lỏng, … thậm chí là xuất huyết đường ruột.

 Đi ngoài ra máu hoặc không ra máu tùy vào diễn biến nặng nhẹ của bệnh.

 Người bệnh bị sốt cao, co giật,… do đã nhiễm khuẩn nặng.

 Gây nên tình trạng cơ thể mệt mỏi và đổ mồ hôi nhiều.

 Khi đi tiểu bị ra máu trong nhiều ngày, có thể bị đau rát, gây mất nước trầm trọng cho cơ thể.

 Hội chứng tan máu suy thận cấp do thiếu các tế bào tiểu cầu, dẫn đến tử vong.

 Rối loạn hệ thống thần kinh.

 Một số biểu hiện khác như: da xanh xao, tay chân không có sức.

 Tăng nguy cơ lây nhiễm khuẩn từ người sang người, rất dễ gây bệnh dịch tràn lan.

Cách xử lý nước khi bị nhiễm khuẩn.

Thực trạng ô nhiễm môi trường ở Ngoài nước.

Ô nhiễm nguồn nước trầm trọng ở Ấn Độ (hóa chất) gây nên nguồn

nước ô nhiễm ở Mỹ

Thực trạng ô nhiễm môi trường ở Việt Nam.

Ô nhiễm nguồn nước ở Hà Nội Ô nhiễm nguồn nước ở Sài

Gòn.

Đặc điểm sinh học Coliforms

Đặc điểm sinh học Coliforms.

Coliforms là gì?

Vi khuẩn Coliforms là một loại vi khuẩn gram âm kỵ khí, hình que

và không sinh bào tử Chúng được sống trong nhiều môi trường

khác nhau như đất, nước (nước uống, nước sinh hoạt và nước

nuôi trồng thủy sản), thức ăn và trong phân động vật

Coliforms là một loại vi khuẩn được tìm thấy trong tự nhiên, trong

chất thải của con người và động vật Vi khuẩn Coliforms không có

hại, tuy nhiên, vi khuẩn Coliforms trong nước có thể cho thấy sự

hiện diện của rất nhiều sinh vật gây hại Những sinh vật này có thể

là virut, động vật nguyên sinh hoặc các loại vi khuẩn

Đây là một trong những nguyên nhân gây kiết lỵ và viêm gan.

Coliforms thuộc họ Enterobacteriaceae,

có khả năng sinh acid, sinh hơi do lên

men lactose ở trong vòng 24 giờ, không

sinh bào tử, chứa β-galactosidase

Coliforms phát triển tốt trên nhiều loại

môi trường, nhiều loại thực phẩm Có

những nghiên cứu cho thấy chúng có thể

phát triển ở nhiệt độ thấp đến

Đặc điểm sinh học Coliforms.

Ngưỡng pH để Coliforms có thể phát triển.

• Vi khuẩn Coliforms có một lớp Peptidoglycan mỏng, Không

hình thành bào tử: Trong môi trường khắc nguyệt, một số vi

khuẩn sẽ hình thành bào tử để có thể tồn tại và phát triển Tuy

nhiên, Coliform không hình thành quá trình này.

• Chúng là sinh vật kỵ khí: Chúng có thể tồn tại với rất ít hoặc

không có oxy bằng cách sử dụng hô hấp kỵ khí.

• Trực khuẩn gram: Trực khuẩn còn được gọi là Rod Shaped

Chúng có hình dạng giống như một hình trụ kéo dài.

• Thuộc họ lên men Lactose: Quá trình lên men Lactose bằng

Coliforms sẽ sản xuất axit và khí.

Đặc điểm sinh học Coliforms.

vi khuẩn coliform

Vi khuẩn Tổng Coliforms (TC).

 Xuất hiện trong chất thải của người và động vật, vi khuẩn tổng

Coliforms còn được tìm thấy trong môi trường như nước, thực vật và đất.

Vi khuẩn Coliforms Fecal.

 Vi khuẩn Coliforms Fecal được tìm thấy trong ruột và phân của động

vật máu nóng (con người, lợn, bò, chó,…) Vi khuẩn Coliforms Fecal cũng có thể được tìm thấy trong các loài động vật có vỏ như sò, ốc,…

Các loại vi khuẩn Coliforms.

03 Đặc điểm sinh học của E.coli.

 Vi khuẩn Escherichia coli (thường được viết tắt là E.coli) hay còn được gọi

là vi khuẩn đại tràng Chúng là một trong những loài vi khuẩn chính ký sinh trong đường ruột của động vật máu nóng

 E.coli là trực khuẩn Gram âm Kích thước trung bình từ 2-3 micromet vi

khuẩn dài như sợi chỉ, E.coli có vỏ, nhưng hầu hết có lông và có khả năng di động

Đặc điểm sinh học của E.coli

 Tính chất nuôi cấy E.coli phát triển dễ dàng trên các

môi trường nuôi cấy, phát triển trên môi trường tổng

hợp rất nghèo chất dinh dưỡng Có thể phát triển ở

nhiệt độ từ 5–40°C Nhiệt độ thích hợp xung quanh

37°C

 Tính chất hóa sinh Hầu hết E.coli đều lên men lactose

và sinh hơi E.coli có khả năng sinh indole Không sinh

H2S Không sử dụng được nguồn carbon cua citrate

trong môi trường Simmons Vì vậy có khả năng khử

carboxyl của lysin, ornithin, arginin và acid glutamic

Đặc điểm sinh học của E.coli

Vi khuẩn E.coli

 Các loại E coli gây bệnh đường ruột (IPEC) gồm:

 EPEC (Enteropathogenic): E coli gây bệnh đường ruột.

 ETEC (Enterotoxigenie): E coli sinh độc tố ruột.

 EIEC (EnteroIinvasIve): E coli xâm nhập ruột.

 EABC (Enteroaggregative): E coli ngưng tập ruột.

 DABC (Diffusely adherent): E coli bám dính phân tán.

 EHEC (Enterohaemorrhagic): E coli gây xuất huyết ruột

 Hai loại E coli gây bệnh ngoài đường ruột quan trọng nhất là:

 MAEC (Meningitidis-assoclated): E coli gây viêm màng não.

 UPEC (Uropathogenic): E.coli gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu.

Đặc điểm sinh học của E.coli

Cơ Sở phân tích.

Cơ sở phân tích Coliform.

 TCVN 6848:2007 thay thế TCVN 6848:2001 và TCVN 6262-1:1997

 TCVN 6848:2007 (ISO 4832:2007) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng Coliform - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc

 TCVN 6848:2007 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F13 Phương pháp

phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng

đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố

Cơ Sở phân tích

Phạm vi áp dụng.

Tiêu chuẩn này có thể áp dụng cho: thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, và các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất và chế biến thực phẩm bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc trên môi trường đặc sau khi ủ ở 30 °C hoặc 37 °C

Nguyên tắc.

Số lượng Coliforms được xác định bằng cách cấy một lượng mẫu xác định vào

một môi trường rắn chọn lọc thích hợp (thạch Violet Red Bile) có chứa lactose

và một chất chỉ thị pH Đếm số khuẩn lạc lên men lactose tiêu biểu sau khi ủ môi trường ở 37 °C trong 24 giờ Đếm các khuẩn lạc điển hình và khẳng định

lại trong môi trường canh Brilliant Green Bile Salt Lactose (BGBL), coliforms

sẽ sinh khí trong môi trường này ở 37 °C trong 24 giờ

Cơ Sở phân tích

Cơ sở phân tích E.coli.

TCVN 7924-2:2008 hoàn toàn tương đương với ISO 16649-2 :

2001

TCVN 7924-2:2008 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia.

TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn,

Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học

và Công nghệ công bố.

TCVN 7924-2: 2008 (ISO 16649-2 : 2001) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza - Phần 2: Kỹ thuật đếm khuẩn

lạc ở 44 oC sử dụng 5-bromo-4-clo-3-indolyl- β-D-glucuronid.

Cơ Sở phân tích

Phạm vi áp dụng.

Phương pháp này sử dụng kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 44°C trên môi

trường đặc có chứa thành phần tạo sắc để phát hiện enzym

β-glucuronidaza.

Nguyên tắc.

Cấy một lượng mẫu xác định trên môi trường rắn chọn lọc thích hợp (thạch TBX) có chứa lactose và một chất chỉ thị pH Đếm số khuẩn lạc lên men lactose tiêu biểu sau khi ủ môi trường ở 44°C trong 24 giờ Đếm các khuẩn lạc E coli điển hình trên môi trường TBX Kết quả được biểu thị bằng số E coli trên 1g mẫu chưa pha loãng.

Cơ sở phân tích Coliforms và E coli trên

cùng một đĩa.

 TCVN 9975 : 2013 thực phẩm – định lượng Coliform và Escherichia Coli bằng phương pháp sử dụng đĩa đếm Petrifilmtm.

 TCVN 9975:2013 được xây dựng trên cơ sở AOAC 991.14 Coliforms and

Escherichia coli Counts in Foods Dry Rehydratable (Petrifilm TM E coli/ Coliform Count Plate TM and Petrifilm TM Coliform Count Plate TM ) Methods

 TCVN 9975:2013 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp

phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm

định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Phạm vi áp dụng.

 Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sử dụng đĩa đếm PetrifilmTM để định lượng

coliform và Escherichia coli trong thực phẩm.

Nguyên tắc.

 Phương pháp này sử dụng các đĩa cấy chứa môi trường dinh dưỡng khô và chất tạo đông tan được trong nước lạnh Cho các dung dịch huyền phù mẫu thử chưa pha loãng hoặc đã pha loãng vào các đĩa với lượng 1 ml mỗi đĩa Dàn đều dung dịch

huyền phù trên diện tích khoảng 20cm2 Chất tạo đông có trong thành phần của đĩa

sẽ làm môi trường dinh dưỡng trong đĩa đông lạnh Đĩa được ủ ấm ở 35°C ± 1°C trong thời gian thích hợp rồi đếm khuẩn lạc.

Cơ sở phân tích Coliforms và E coli trên

cùng một đĩa.

Quy trình định lượng Coliforms và E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.

Quy trình định lượng Coliforms và E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.

Định lượng E.coli

Kỹ thuật pha mẫu.

Đếm và chọn các khuẩn lạc để

khẳng định.

Khuẩn lạc E.coli trên môi

trường TBX

Tổng số E.coli trong 1g mẫu (X) được tính theo công thức:

(CFU/g hay CFU/ml)

THỬ NGHIỆM KHẲNG ĐỊNH E.COLI

 Từ các ống nghiệm cho kết quả (+) trên EC đã được

xác định ở bước làm thử nghiệm khẳng định Coliforms phân tiếp tục cấy chuyền sang các môi trường sau:

Canh Trypton, canh MR- VP và thạch Simmon Citrate.

 Ủ các môi trường trên ở 44  0,5oC trong 24h để thực

hiện các thử nghiệm Indol, Methyl Red, Voges- Proskauer và Citrate

Thử nghiệm khả năng sinh Indol

44,5 0,2 o C / 24h Thuốc thử Kovac’s

Chủnng VSV MT Canh Tryptone Klebsiella (-) E.Coli (+)

Thử nghiệm MR (Methyl Red)

Chủng VSV MR-VP broth E Coli (+) Klebsiella (-) ĐC

44,5 0,2 o C

Ủ 18-24h

Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer)

Đọc kết quả:

(-): Bề mặt môi trường không đổi màu

(+): Có màu đỏ trên bề mặt môi trường

Klebsiella pneumonia (+)

E Coli (-)

Thử nghiệm Citrate

Chủng VSV MT thạch nghiêng SCA ĐC (-) (+)

44,5 0,2 o C

Ủ 24h

Kết quả thu được như sau

Định lượng coliform

Định lượng coliform

Các bước tiến hành:

phù ban đầu.

khẳng định.

Kỹ thuật pha mẫu

Định lượng coliform

Khuẩn lạc Coliforms trên môi trường VRB

Tổng số coliforms trong 1g mẫu (X) được tính theo công thức:

(CFU/g hay CFU/ml)

Trong đó:

C1,2,3,4: Số khuẩn lạc Coliforms đếm được tương ứng trên 4 đĩa

của hai độ pha

loãng liên tiếp được giữ lại.

V: Thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit

n1: Số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được giữ lại

n1: Số đĩa ở độ pha loãng thứ hai được giữ lại

d: Độ pha loãng thứ nhất được giữ lại

R1,2,3,4: tỉ lệ khẳng định dương tính trên 4 đĩa của hai độ pha

loãng liên tiếp được giữ lại.

Ví dụ: Kiểm tra định lượng Coliforms có trong 1ml sũa tươi tiệt trùng theo phương pháp Pasteur.

Quy trình phân tích

Chuẩn bị mẫu trước khi phân tích:

Dùng pipet vô trùng hút chính xác 1ml mẫu và pha loãng thành các dãy thập phân kế tiếp nhau Cuối cùng thu được các dịch mẫu có các nồng độ thập phân như sau: 10 -1 , 10 -2 , 10 -3

Kỹ thuật pha loãng mẫu

Kỹ thuật cấy mẫu

Kết quả khuẩn lạc trên môi trường VRB:

Khuẩn lạc Coliforms đặc trưng trên môi trường VRB có màu đỏ đến đỏ đậm, có vùng tủa muối mật, đường kính ≥ 0,5 mm.

Khuẩn lạc trên đĩa cấy

Tính N = Tổng số khuẩn lạc đặc trưng trên tất cả các đĩa cấy

Kết quả: số khuẩn lạc đếm được

trên các đĩa ở mỗi nồng độ pha loãng trên môi trường VRB như sau:

Từ tổng số khuẩn lạc đếm trên 6 đĩa, chọn bất kì 5 khuẩn lạc nghi ngờ từ các đĩa (2 KL (khuẩn lạc) từ 2 đĩa của

10 -1 , 1 khuẩn lạc từ 1 đĩa của được10 -2 và 2 khuẩn lạc từ 2 đĩa của 10 -3 ), dùng que cấy vòng vô trùng cấy chuyền sang

5 ống nghiệm chứa môi trường BGBL có chứa ống Durham úp ngược Ủ ở 37 o C ± 1 o C trong 24 - 48h.

Kết quả khẳng định là (+) khi vi khuẩn tăng trưởng làm đục môi trường và sinh hơi trong ống Durham.

Thử nghiệm khẳng định Coliforms

Thử nghiệm khẳng định Coliforms Ghi nhận số ống (+) có sinh hơi với mỗi độ pha loãng.

Cách tính kết quả:

Dựa vào số khuẩn lạc đếm được và tỉ lệ khẳng định, tính mật độ của Coliforms theo công thức sau:

A (CFU/g hay CFU/ml) = × R

Trong đó: N: tổng số khuẩn lạc đếm được

ni: số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi độ pha loãng

v: dung tích mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩa

fi: độ pha loãng có khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm

R: tỉ lệ khẳng định

Kết quả thu được như sau:

Tính mật độ Coliforms theo công thức:

A (CFU/g hay CFU/ml) = × R

=

= 2,1.10-2 (CFU/ml)

( Theo Bảng 1.2 Tiêu chuẩn vi sinh cho phép trong thực phẩm, BYT 4/1998 , trang 23 của Trần Linh Thước)

Chỉ tiêu Coliforms và E.coli trong mẫu sữa tươi không nằm trong giới hạn cho

phép của BYT 4/1998 đặt ra Vì vậy phải tiến hành tiệt trùng lại hoặc loại mẫu ngay để đảm bảo VSATTP.