NGHIÊN cứu tạo, NHÂN PHÔI vô TÍNH và rễ bất ĐỊNH cây NGŨ GIA bì CHÂN CHIM (schefflera octophylla lour harms)

TÓM TẮTĐề tài: “Nghiên cứu tạo, nhân phôi vô tính và rễ bất định cây Ngũ gia bì chân chim Schefflera octophylla Lour Harms” được thực hiện tại Viện Sinh học nhiệt đới –Viện Hàn lâm Khoa

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-NGHIÊN CỨU TẠO, NHÂN PHÔI VÔ TÍNH

VÀ RỄ BẤT ĐỊNH CÂY NGŨ GIA BÌ CHÂN CHIM

(Schefflera octophylla Lour Harms)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2022

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-NGHIÊN CỨU TẠO, NHÂN PHÔI VÔ TÍNH

VÀ RỄ BẤT ĐỊNH CÂY NGŨ GIA BÌ CHÂN CHIM

(Schefflera octophylla Lour Harms)

Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

Mã số: 9 42 01 12

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2022

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận án: “Nghiên cứu tạo, nhân phôi vô tính và rễ bất

định cây Ngũ gia bì chân chim (Schefflera octophylla Lour Harms)” là công trình

nghiên cứu của tôi, dưới sự hướng dẫn khoa học của TS

Nội dung nghiên cứu và các kết quả trong đề tài này hoàn toàn trung

thực Toàn bộ số liệu và kết quả nghiên cứu chưa từng được sử dụng để công bố trongcác công trình nghiên cứu để nhận học vị, các thông tin trích dẫn trong luận án nàyđều được trích dẫn nguồn gốc rõ ràng Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về sự camđoan này

Tp Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 05 năm 2022

Tác giả

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến PGS TS

, là những người Thầy đã tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ, truyền

đạt những kiến thức quý báu để tôi hoàn thành luận án này

Tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc đến Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ ViệtNam, Phòng Đào tạo, Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Sinh học nhiệt đới đãtạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và thực hiện nghiên cứu đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Sở Giáo dục và Đào tạo Phú Yên,Trường THPT chuyên Lương Văn Chánh Phú Yên, đã tạo điều kiện cho tôi học tập,nghiên cứu

Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các anh chị em của phòng Công nghệ gen– Viện Sinh học nhiệt đới, đã rất tận tình tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất cũngnhư thời gian quý báu để tôi thực hiện nghiên cứu đề tài

Sự quan tâm và động viên của các Thầy Cô, anh chị em của Viện Sinh họcnhiệt đới là động lực lớn cho tôi thực hiện đề tài nghiên cứu Chân thành cảm ơn!

Tp Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 05 năm 2022

Tác giả

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC CÁC BẢNG ix

DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ xi

TÓM TẮT xv

SUMMARY xvii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

2 1 Mục tiêu tổng quát 2

2 2 Mục tiêu cụ thể 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

3 1 Ý nghĩa khoa học 3

3 2 Ý nghĩa thực tiễn 3

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3

4 1 Đối tượng nghiên cứu 3

4 2 Phạm vi nghiên cứu 3

5 Tính mới của đề tài 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1 1 Giới thiệu về Ngũ gia bì chân chim (Schefflera octophylla Lour Harms) 5

1 1 1 Nguồn gốc và phân bố 5

1 1 2 Đặc điểm sinh học – sinh thái 6

1 1 3 Thành phần hóa học và công dụng 7

1 1 3 1 Thành phần hóa học 7

1 1 3 2 Công dụng 10

1 2 Tình hình nghiên cứu về phôi vô tính, rễ bất định ở một số loài thuộc các chi quan trọng ở họ Ngũ gia bì (Araliaceae) 11

1 2 1 Chi Panax 11

1 2 1 1 Phôi vô tính 11

1 2 1 2 Rễ bất định 14

1 2 2 Chi Acanthopanax 15

1 2 2 1 Phôi vô tính 15

1 2 2 2 Rễ bất định 16

1 2 3 Chi Polyscias 17

1 2 4 Chi Schefflera 18

1 2 4 1 Schefflera octophylla (Lour ) Harms 18

1 2 4 2 Schefflera arboricola (Hayata) Merr 18

1 2 4 3 Schefflera leucantha Viguier 19`

1 2 4 4 Didymopanax morototoni (Aublet) Decaisne et Planchon 19

1 3 Sự phát sinh phôi vô tính 20

1 3 1 Cơ sở khoa học của sự phát sinh phôi vô tính 20

1 3 2 Một số nghiên cứu về sự phát sinh phôi vô tính 22

1 4 Sự hình thành rễ bất định 29

1 4 1 Cơ sở khoa học của sự hình thành rễ bất định 29

1 4 2 Một số nghiên cứu về sự hình thành rễ bất định 31

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 35

2 1 Nguồn mẫu – Vật liệu nuôi cấy 35

2 1 1 Nguồn mẫu 35

2 1 2 Tạo vật liệu nuôi cấy ban đầu 35

2 2 Nội dung nghiên cứu 36

2 2 1 Nội dung 1 Tạo phôi vô tính 36

2 2 2 Nội dung 2 Nhân phôi vô tính 36

2 2 3 Nội dung 3 Tạo rễ bất định 36

2 2 4 Nội dung 4 Nhân rễ bất định 36

2 3 Nội dung 1 Tạo phôi vô tính 39

2 3 1 Tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá 39

2 3 1 1 Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường khoáng đến sự tạo phôi trực tiếp từ mô lá 39

2 3 1 2 Ảnh hưởng của sự kết hợp auxin và BA đến sự tạo phôi trực tiếp từ mô lá 39

2 3 1 3 Ảnh hưởng của nồng độ đường và điều kiện chiếu sáng đến sự tạo phôi trực tiếp từ mô lá 40

2 3 1 4 Ảnh hưởng của nước dừa đến sự tạo phôi trực tiếp từ mô lá 40

2 3 1 5 Tạo cây con in vitro hoàn chỉnh từ phôi vô tính 40

2 3 1 6 Trồng cây con ở chậu đất 41

2 3 2 Tạo phôi vô tính gián tiếp qua mô sẹo từ nuôi cấy mô lá 41

2 3 2 1 Tạo phôi vô tính gián tiếp qua mô sẹo mảnh lá (10 x 10 mm) 41

2 3 2 2 Tạo phôi vô tính gián tiếp qua mô sẹo mảnh lá (3 x 10 mm) 43

2 4 Nội dung 2 Nhân phôi vô tính 44

2 4 1 Nhân phôi trên môi trường đặc 44

2 4 2 Nhân phôi trong môi trường lỏng 44

2 4 2 1 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự tạo phôi thứ cấp qua nuôi lỏng lắc 44

2 4 2 2 Ảnh hưởng của khối lượng phôi nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khối phôi 45

2 4 2 3 Ảnh hưởng của kích thước phôi nuôi cấy đến sự tạo phôi thứ cấp 45

2 4 2 4 Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối phôi 45

2 4 2 5 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sự tăng trưởng sinh khối phôi 45

2 4 2 6 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến sự tạo phôi thứ cấp 46

2 4 2 7 Tạo cây con từ phôi nuôi lỏng lắc 46

2 4 3 Quan sát cấu trúc giải phẫu phôi sơ cấp và thứ cấp 46

2 4 4 Các chỉ tiêu theo dõi và phương pháp xác định 46

2 5 Nội dung 3 Tạo rễ bất định 46

2 5 1 Tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá 46

2 5 1 1 Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường khoáng đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá 46

2 5 1 2 Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá 47

2 5 1 3 Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá 47

2 5 1 4 Khảo sát hình thái giải phẫu rễ tái sinh trực tiếp từ mô lá 48

2 5 2 Tạo rễ bất định từ chồi 48

2 5 2 1 Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc từ đốt thân cây vườn ươm 48

2 5 2 2 Tạo rễ bất định từ chồi đốt thân cây in vitro 49

2 5 2 3 Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc phôi vô tính 49

2 6 Nội dung 4 Nhân rễ bất định trong môi trường lỏng 50

2 6 1 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự phân nhánh của rễ 50

2 6 2 Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối rễ 50

2 6 3 Ảnh hưởng của khối lượng rễ nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khối rễ 50

2 6 4 Khảo sát diễn biến tăng trưởng sinh khối rễ theo thời gian 50

2 7 Điều kiện nuôi cấy in vitro 51

2 8 Phương pháp thống kê và xử lý số liệu 51

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52

3 1 Tạo phôi vô tính 52

3 1 1 Tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá 52

3 1 1 1 Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường khoáng đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá 52

3 1 1 2 Ảnh hưởng của sự kết hợp NAA và BA đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá 57

3 1 1 3 Ảnh hưởng của nồng độ đường và điều kiện chiếu sáng đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá 60

3 1 1 4 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá 62

3 1 1 5 Tạo cây con hoàn chỉnh từ phôi vô tính 64

3 1 1 6 Trồng cây con ở chậu đất 66

3 1 2 Tạo phôi vô tính gián tiếp 66

3 1 2 1 Tạo phôi vô tính gián tiếp qua mô sẹo mảnh lá (10 x 10 mm) 66

3 1 2 2 Tạo phôi vô tính gián tiếp qua mô sẹo mảnh lá (3 x 10 mm) 76

3 2 Nhân phôi vô tính 80

3 2 1 Nhân phôi trên môi trường đặc 80

3 2 2 Nhân phôi trong môi trường lỏng 82

3 2 2 1 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự tạo phôi thứ cấp 82

3 2 2 2 Ảnh hưởng của khối lượng phôi nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khối phôi 83

3 2 2 3 Ảnh hưởng của kích thước phôi đến sự tạo phôi thứ cấp 86

3 2 2 4 Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối phôi 88

3 2 2 5 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sự tăng trưởng sinh khối phôi 90

3 2 2 6 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến sự hình thành phôi thứ cấp 91

3 2 2 7 Tạo cây con từ phôi nuôi lỏng lắc 92

3 2 3 Quan sát cấu trúc giải phẫu phôi sơ cấp và phôi thứ cấp 93

3 3 Tạo rễ bất định 96

3 3 1 Tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá 96

3 3 1 1 Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường khoáng đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá 96

3 1 1 2 Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá 104

3 1 1 3 Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá 106

3 1 1 4 Minh họa sự tái sinh rễ trực tiếp và khảo sát hình thái giải phẫu rễ tái sinh trực tiếp 109

3 3 2 Tạo rễ bất định từ chồi 111

3 3 2 1 Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc từ đốt thân cây vườn ươm 111

3 3 2 2 Tạo rễ bất định từ chồi đốt thân cây in vitro 113

3 3 2 3 Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc phôi vô tính 115

3 4 Nhân rễ bất định trong môi trường lỏng 117

3 4 1 Ảnh hưởng của NAA, IBA đến sự phân nhánh rễ 117

3 4 2 Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối rễ 121

3 4 3 Ảnh hưởng của khối lượng rễ nuôi cấy đến tăng trưởng sinh khối của rễ 123

3 4 4 Khảo sát diễn biến tăng trưởng sinh khối rễ theo thời gian 124

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 127

KẾT LUẬN 127

KIẾN NGHỊ 128

TÀI LIỆU THAM KHẢO 130

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Benzyl adenineCytokininĐối chứngĐiều hòa sinh trưởngGibberellic acidHigh-Performance Liquid ChromatographyIndole-3-acetic acid

Indole-3-butyric acidInduced Embryogenic Determined CellKhả năng sinh phôi

Khối lượng phôiKhối lượng tươi phôiLát mỏng tế bàoMurashige và Skoog

Mô sẹo sinh phôiα-Naphthaleneacetic acidNgũ gia bì chân chimNgày sau cấy

Pre-Embryogenic Determined CellRespiratory Syncytial Virus

Rễ nhánh

Rễ sơ cấpSettled Cell VolumeScanning Electron MicroscopeSchenk và Hildebrandt

transverse_Thin Cell layer

Vein-Derived CellWoody Plant Medium

từ mảnh lá (10 x 10 mm), ở môi trường SH, 60 NSC 63Ảnh hưởng của 2,4-D đến sự hình thành mô sẹo có khả năngsinh phôi, ở môi trường SH, 30NSC 68Ảnh hưởng của NAA và BA đến sự tạo phôi từ mô sẹo mảnh lá(10 x 10 mm), ở môi trường SH, 30 NSC 70Ảnh hưởng của NAA và BA đến tạo phôi từ mô sẹo mảnh lá (3

x 10 mm), ở môi trường SH, 30 NSC 77Ảnh hưởng của NAA và BA đến sự tạo phôi thứ cấp trên môitrường đặc SH, 30 NSC 80Ảnh hưởng của NAA và BA đến sự tạo phôi thứ cấp trong môitrường lỏng SH, 30 NSC 82

Bảng 3 10 Ảnh hưởng của khối lượng phôi nuôi cấy đến tăng trưởng sinh

khối phôi, trong môi trường lỏng SH, 45 NSC 84

Bảng 3 11 Ảnh hưởng của kích thước phôi đến sự hình thành phôi thứ cấp,

trong môi trường lỏng SH, 30 NSC 87

Bảng 3 12 Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối

phôi, trong môi trường lỏng SH, 30 NSC 89

Bảng 3 13 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sự tăng trưởng sinh khối

phôi trong môi trường lỏng SH, 30 NSC 90

Bảng 3 14 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến sự tạo phôi thứ cấp, trong

môi trường lỏng SH, 21 NSC 91

Bảng 3 15 Ảnh hưởng của NAA và môi trường khoáng đến sự tạo rễ bất

định trực tiếp từ mảnh lá (10 x 10 mm), ở môi trường ½MS, 30

NSC 98

Bảng 3 16 Ảnh hưởng của NAA và môi trường khoáng đến tạo rễ bất định

trực tiếp từ mảnh lá (3 x 10 mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC

Bảng 3 20 Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tạo rễ bất định trực

tiếp từ mảnh lá (3 x 10 mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC 108

Bảng 3 21 Ảnh hưởng của NAA, IBA đến sự tạo rễ bất định từ chồi có

nguồn gốc từ đốt thân cây vườn ươm, ở môi trường ½MS, 60

NSC 111

Bảng 3 22 Ảnh hưởng của NAA và IBA đến sự tạo rễ bất định từ chồi đốt

thân cây in vitro, ở môi trường ½MS, 60 NSC 113

Bảng 3 23 Ảnh hưởng của NAA và IBA đến sự tạo rễ bất định từ chồi có

nguồn gốc phôi vô tính, ở môi trường ½MS, 30 NSC 115

Bảng 3 24 Ảnh hưởng của NAA, IBA đến sự phân nhánh rễ, ở môi trường

½MS, 21 NSC 118

Bảng 3 25 Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối rễ,

ở môi trường ½MS, 30 NSC 121

Bảng 3 26 Ảnh hưởng của khối lượng rễ nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh

khối rễ, ở môi trường ½MS, 45 NSC 123

Cây Ngũ gia bì chân chim (Schefflera octophylla)

Lá kép Ngũ gia bì chân chim và vật liệu nuôi cấy Vật liệu đốt thân dùng nuôi cấy tạo chồi Các dạng phát triển của phôi vô tính hình thành trực tiếp từ mô

lá Mảnh lá tạo phôi ở môi trường ½MS, MS, B5, SH có NAA,

60 NSC Các giai đoạn phát triển của phôi vô tính và hình thái giải phẫuphôi tương ứng Mảnh lá tạo phôi trực tiếp ở môi trường SH có NAA kết hợpvới BA, 60 NSC Phôi vô tính phát sinh trực tiếp từ mảnh lá ở môi trường SH,

có đường và điều kiện sáng, tối, 60 NSC Phôi vô tính phát sinh trực tiếp từ mảnh lá ở môi trường SH,

có bổ sung nước dừa, 60 NSC Phôi bình thường và một số dạng bất thường của phôi vô tính Tạo cây con từ phôi vô tính trên môi trường MS, ½MS không

có chất ĐHST Trồng cây từ phôi vô tính ra chậu đất ở vườn ươm Ảnh hưởng của cách cấy mảnh lá đến hiệu quả tạo mô sẹo Tạo mô sẹo từ mảnh lá (10 x 10 mm)nuôi cấy trên môi trường

SH Ảnh hưởng của 2,4-D đến sự hình thành mô sẹo có khả năngsinh phôi ở môi trường SH, 30 NSC Tái sinh phôi từ mô sẹo có khả năng sinh phôi trên môi trườngđặc SH, 30 NSC và hình thái giải phẫu phôi tái sinh từ mô sẹo

353548

67

69

71

Hình 3 14 Các dạng phát triển của phôi tái sinh từ mô sẹo mảnh lá, cây

con hoàn chỉnh từ phôi 73

Hình 3 15 Tạo phôi từ mô sẹo có KNSP bằng phương pháp nuôi lỏng lắc,

hình thái cụm tế bào phân chia, cụm mô tạo phôi 74

Hình 3 16 So sánh kết quả tái sinh phôi ở môi trường SH đặc và lỏng, 30

Hình 3 21 Ảnh hưởng của NAA và BA đến sự tạo phôi thứ cấp nuôi lỏng

trong môi trường SH, 30 NSC 83

Hình 3 22 Ảnh hưởng của khối lượng phôi (w/v) nuôi cấy đến tăng

trưởng sinh khối phôi, trong môi trường lỏng SH, 45 NSC 84

Hình 3 23 Nhân phôi qua nuôi cấy lỏng lắc trong môi trường SH, 30 – 60

Hình 3 26 Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng sinh khối phôi,

trong môi trường lỏng SH, 30 NSC 89

Hình 3 27 Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tăng trưởng sinh

khối phôi, trong môi trường lỏng SH, 30 NSC 91

Hình 3 28 Ảnh hưởng của nước dừa đến sự hình thành phôi thứ cấp, trong

môi trường lỏng SH, 21 NSC 92

Hình 3 29 Tạo cây con từ phôi vô tính nuôi lỏng lắc trong môi trường

MS, ½MS 93

có NAA, 30 NSC Tạo rễ trực tiếp từ mảnh lá (10 x 10 mm) ở môi trường B5, cóNAA, 30 NSC Tạo rễ trực tiếp từ mảnh lá (10 x 10 mm) ở môi trường SH, cóNAA, 30 NSC Tạo rễ trực tiếp từ mảnh lá (3 x 10 mm) ở môi trường MS, cóNAA, 30 NSC Tạo rễ trực tiếp từ mảnh lá (3 x 10 mm) ở môi trường ½MS,

có NAA, 30 NSC Tạo rễ trực tiếp từ mảnh lá (3 x 10 mm) ở môi trường B5, cóNAA, 30 NSC Tạo rễ trực tiếp từ mảnh lá (3 x 10 mm) ở môi trường SH, cóNAA, 30 NSC Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tạo rễ trực tiếp từ mảnh

lá (10 x 10 mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tạo rễ từ mảnh lá (3 x

10 mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tạo rễ bất định từmảnh lá (10 x 10 mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tạo rễ bất định từmảnh lá (3 x 10 mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC Minh họa cận cảnh sự tái sinh trực tiếp rễ bất định từ mảnh lánuôi cấy trên môi trường ½MS, 12 – 20 NSC Hình thái giải phẫu sơ khởi rễ bất định hình thành trực tiếp từmảnh lá

Hình 3 46 Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc từ đốt thân, ở môi trường

ở môi trường ½MS

Rễ tăng trưởng sinh khối liên tục qua quá trình phân nhánh của

rễ đơn Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối

rễ, ở môi trường ½MS, 30 NSC Ảnh hưởng của khối lượng rễ nuôi cấy đến tăng trưởng sinhkhối rễ, ở môi trường ½MS, 45 NSC Diễn biến tăng trưởng sinh khối rễ bất định theo thời gian, 7 –

TÓM TẮT

Đề tài: “Nghiên cứu tạo, nhân phôi vô tính và rễ bất định cây Ngũ gia bì

chân chim (Schefflera octophylla Lour Harms)” được thực hiện tại Viện Sinh học

nhiệt đới –Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam từ tháng 9 năm 2015 đếntháng 9 năm 2019

Mục tiêu tổng quát của đề tài là tạo được phôi vô tính tái sinh trực tiếp, giántiếp và nhân được phôi vô tính trên môi trường đặc và trong môi trường lỏng lắc Tạođược rễ bất định tái sinh trực tiếp và nhân được rễ bất định trong môi trường lỏng lắc

Mục tiêu cụ thể của đề tài là: (1) Xác định được một số yếu tố ảnh hưởng (môitrường khoáng, chất điều hòa sinh trưởng, đường,…) đến tái sinh trực tiếp hoặc/và

gián tiếp phôi vô tính và rễ bất định từ mô lá nuôi cấy in vitro; (2) Xác định được một

số yếu tố ảnh hưởng (môi trường khoáng, chất điều hòa sinh trưởng, số/khối lượngphôi/rễ, đường,…) đến nhân phôi vô tính và rễ bất định có nguồn gốc từ mô lá nuôi

cấy in vitro; (3) Tạo được cây con in vitro hoàn chỉnh từ phôi vô tính; (4) Tạo được

rễ bất định từ chồi có nguồn gốc đốt thân/phôi vô tính; (5) Xác định được hình tháigiải phẫu của phôi vô tính ở một số giai đoạn phát triển khác nhau, nguồn gốc tế bàophát sinh phôi vô tính và rễ bất định thông qua kỹ thuật nhuộm hai màu

Đề tài gồm có các nội dung cơ bản như: (i) Tạo phôi vô tính trực tiếp và giántiếp từ mô lá; (ii) Nhân phôi vô tính trên môi trường đặc và trong môi trường lỏnglắc; (iii) Tạo cây con hoàn chỉnh từ phôi vô tính; (iv) Tạo rễ bất định trực tiếp từ mô

lá, từ chồi có nguồn gốc đốt thân/phôi vô tính; (v) Nhân rễ bất định trong môi trườnglỏng lắc; (vi) Khảo sát hình thái giải phẫu phôi vô tính và rễ bất định

Qua nghiên cứu, kết quả cho thấy môi trường thích hợp cho sự hình thành phôi

vô tính trực tiếp từ nuôi cấy in vitro mô lá cây Ngũ gia bì chân chim là SH có bổ sung

5 mg/L NAA, 0,25 mg/L BA; 50 g/L sucrose, 10% (v/v) nước dừa kết hợp với nuôi

mô ở điều kiện chiếu sáng 4 000 lux Môi trường thích hợp cho tạo mô sẹo từ mô lá

là môi trường SH có 2 mg/L 2,4-D Phôi vô tính tái sinh (gián tiếp) từ mô sẹo trên

môi trường SH có 2 mg/L NAA, 0,25 mg/L BA, 30 g/L sucrose Đã nhân in vitro

thành công phôi vô tính trên môi trường đặc và trong môi trường lỏng thông qua sựhình thành phôi thứ cấp theo cơ chế bất định Nhân phôi trong môi trường lỏng hiệuquả hơn so với môi trường đặc Môi trường lỏng thích hợp dùng nhân nhanh phôi vô

tính là môi trường SH có bổ sung 2 mg/L NAA, 0,25 mg/L BA, 50 g/L sucrose, 10%(v/v) nước dừa; khối lượng phôi nuôi cấy ban đầu thích hợp là 2% (w/v), kích thướcphôi thích hợp dùng nuôi cấy ~ 10 mm, điều kiện chiếu sáng ~ 4 000 lux Phôi vô

tính phát triển thành cây con có khả năng sinh trưởng bình thường trong điều kiện in

vitro và ex vitro

Môi trường thích hợp cho tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá là môi trường đặc

½MS có 3 mg/L NAA, 30 g/L sucrose; cường độ ánh sáng ~ 4 000 lux Đã nhân thànhcông sinh khối rễ bất định thông qua sự hình thành rễ thứ cấp bằng phương pháp nuôilỏng lắc dùng môi trường ½MS có bổ sung 2 mg/L NAA, 30 g/L sucrose Khối lượng

rễ nuôi cấy ban đầu thích hợp là 2% (w/v), sinh khối rễ phát triển rất nhanh ở giaiđoạn 21–35 ngày, đạt mức cao nhất ở giai đoạn 42 ngày sau cấy

Cũng đã tạo được rễ bất định cho chồi có nguồn gốc đốt thân (cây vườn ươm,

cây in vitro) và phôi vô tính (đã cắt bỏ rễ trụ), ghi nhận được hình thái giải phẫu phôi

vô tính và rễ bất định bằng phương pháp nhuộm hai màu

The study “In vitro induction and multiplication of somatic embryos and

adventitious roots of Schefflera octophylla Lour Harms” was carried out at the

Institute of Tropical Biology (ITB) – Vietnam Academy of Science and Technology(VAST) from September of 2015 to September of 2019

The general objective of this study was to generate directly/indirectly somaticembryos and multiply somatic embryos on solid and shaking liquid media, to generatedirectly adventitious roots and mutiply adventitious roots in shaking liquid medium

The specific objectives of the study were to identify: (1) The optimal cultureconditions for inducing direct and indirect formation of somatic embryos and

adventitious roots from leaf explants cultured in vitro; (2) The optimal culture

conditions for multiplication of somatic embryos and adventitious roots originatedfrom leaf explants on solid and/or shaking liquid media; (3) The condition for

generation of in vitro plantlets from somatic embryos; (4) The condition for induction

of adventitious roots from shoots originated from nodal explants/somatic embryos (5)The morphological and histological properties of somatic embryos at many differentstages of development, cellular origin of somatic embryo and adventitious root

formation through double staining with carmine alum and iodine green

The study comprised of four contents: (i) To generate directly/indirectly

somatic embryos from leaf explants; (ii) To multiply somatic embryos on the solidand liquid media; (iii) To generate the plantlets originated from somatic embryos; (iv)

To generate directly adventitious roots from leaf explants, from shoots originatedfrom nodal explants/somatic embryos; (v) To multiply adventitious roots in liquidmedium; (vi) To examine the morphology and histology of somatic embryo andadventitious root

The results showed that the suitable medium for the direct induction of somatic

embryos from the leaf explants cultured in vitro was SH + 5 mg/L NAA + 0 25 mg/L

BA + 10% (v/v) coconut water, 50 g/L sucrose, in light condition ~ 4,000 lux Thesuitable media for callus induction from the leaf explants, for regeneration of somaticembryos from callus, were SH + 2 mg/L 2,4-D; SH + 2 mg/L NAA + 0 25 mg/L BA,

30 g/L sucrose, respectively Successfully in vitro multiplied somatic embryos on

solid and shaking liquid media through secondary embryogenesis by an adventitiousmechanism Somatic embryo multiplication in liquid medium was more efficient than

on solid media The suitable liquid medium for multiplication of somatic embryoswas SH + 2 mg/L + 0 25 mg/L BA + 10% (v/v) coconut water, 50 g/L sucrose; thesuitable somatic embryo inoculum density/size for culture was 2% (w/v), the suitablesize of somatic embryos for multiplication in liquid medium was ~ 10 mm, lightcondition was 4,000 lux The somatic embryos developed into plantlets with normal

growth under in vitro/ex vitro conditions

The suitable medium for direct adventitious roots from leaf explants was ½MS+ 3 mg/L NAA, 30 g/L sucrose, light condition was ~ 4,000 lux Through secondary

rhizogenesis by an adventitious mechanism, successfully in vitro multiplied

adventitious roots in liquid medium ½MS + 2 mg/L NAA, 30 g/L sucrose; suitableroot inoculum density for culture was 2% (w/v), root biomass developed quickly atthe period of 21-35 days, reaching the highest level at 42 days after culturing

The adventitious roots from shoots originated from nodal explants

(greenhouse and in vitro plants) and somatic embryos (with the tap roots removed),

the morphology and anatomy of somatic embryos and adventitious roots via doublestaining method were also achieved

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Ngũ gia bì chân chim (Schefflera octophylla Lour Harms), là loài cây thuộc

họ Ngũ gia bì/Nhân sâm (Araliaceae) – họ các loài thực vật có nguồn hoạt chất sinhhọc quan trọng, trong đó có Ngũ gia bì chân chim (NGBCC) [1] Trong Đông y và yhọc hiện đại, có khá nhiều công trình công bố kết quả nghiên cứu về các hợp chất thứcấp ở NGBCC với nhiều tác dụng như tăng cường sức khỏe [2], kháng virus [3][4][5]kháng một số dòng tế bào ung thư [6], làm giảm đau [7] kháng viêm [8], đông máu[9], Ở Việt Nam, các vật liệu như lá, vỏ của thân/rễ và rễ nhỏ Ngũ gia bì chân chimđều được dùng để làm thu ốc [10]

Đến nay, một số công trình có liên quan đến NGBCC đã được ghi nhận nhưnhân giống bằng phương pháp giâm cành, và bằng phương pháp nuôi cấy mô [3] Đặng Thị Thanh Tâm (2012) đã nghiên cứu tạo rễ tơ thông qua biến nạp gen dùng vi

khuẩn Agrobacterium rhizogenes và thử nghiệm sản xuất sinh khối loại rễ này bằng

hệ thống bioreactor [11]

Trong những năm gần đây, nghiên cứu ở lĩnh vực sinh học nói chung, sinh lýhọc thực vật nói riêng đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể, trong đó phương phápnuôi cấy mô tế bào luôn được các nhà nghiên cứu quan tâm sử dụng như một công

cụ nhằm tìm hiểu sâu các khía cạnh sinh lý của tính toàn thế của tế bào như vai tròsinh lý của chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST) ngoại sinh, nội sinh và tương tác củachúng, vai trò của các hệ thống di chuyển và phân bố auxin trong mối quan hệ với hệthống gene điều hòa, tuổi sinh lý của mẫu nuôi cấy, đối với sự hình thành, phát triểnhai con đường phát sinh hình thái phôi vô tính/rễ bất định thông qua hai kiểu tái sinhtrực tiếp/gián tiếp của hai dạng hình thái phát sinh nói trên [12][13][14][15]

Theo nhiều tài liệu, hệ thống phôi vô tính không chỉ là mục tiêu đối với nghiêncứu về phát sinh hình thái mà còn là vật liệu được sử dụng trong nhiều nghiên cứunhằm các mục đích khác nhau như nhân giống [16], thu hợp chất thứ cấp [17], bảo

quản nguồn gen in vitro [18], tạo hạt nhân tạo [19], biến nạp gen [20], nuôi cấy quang

tự dưỡng [21], chuyển giao công nghệ và thương mại hóa sản phẩm phôi vô tính [22] Tương tự phôi vô tính, rễ bất định cũng là mục tiêu trong các nghiên cứu về phát sinhhình thái; ngoài ra, nuôi cấy rễ bất định cũng là một trong các hướng nghiên cứu rất

quan trọng nhằm thu nhận các hợp chất thứ cấp Hệ thống nuôi cấy này khắc phụcđược các nhược điểm của hệ thống nuôi cấy tế bào trong một số trường hợp, do các

ưu điểm sau: một là, rễ là một tập hợp có hệ thống các tế bào biệt hóa và như vậy đã

mang một nhiệm vụ nhất định đối với hoạt động sống của cây, do vậy cũng liên kết

với năng lực sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp; hai là, đối với một số cây dược liệu,

rễ là nơi sinh tổng hợp/tích tụ các hợp chất thứ cấp; ba là, có thể nhân nhanh sinh

khối rễ trong môi trường lỏng mà không bị hạn chế vì hiện tượng hóa kính/hóa trong

(vitrification) như trường hợp nuôi thể chồi; bốn là, tương tự như ở một số hệ thống

nuôi cấy khác, có thể nuôi nhân quy mô lớn rễ trong điều kiện khống chế, không phụthuộc vào điều kiện môi trường bên ngoài

Đến nay đã ghi nhận được một số công bố về kết quả nghiên cứu nhân sinhkhối rễ, phôi vô tính phục vụ chiết xuất, thu nhận hợp chất thứ cấp với nhiều quy mô

khác nhau, ví dụ như ở trường hợp Panax ginseng, Panax vietnamensis, Panax

quinquefolius [ 23][24][17] Tuy nhiên, cho đến nay chưa ghi nhận được công bố nào

trên thế giới và trong nước nghiên cứu về nuôi cấy phôi vô tính và rễ bất định câyNGBCC

Dựa vào các cơ sở khoa học và thực tiễn nêu trên và góp phần phát triển nghiên

cứu trên đối tượng NGBCC, luận án được thực hiện với tên đề tài: “Nghiên cứu tạo,

nhân phôi vô tính và rễ bất định cây Ngũ gia bì chân chim (Schefflera octophylla

Lour Harms)” phục vụ định hướng dài hạn sử dụng nguồn phôi vô tính, rễ bất định

cho các nghiên cứu về nhân giống, thu nhận hợp chất thứ cấp và cho một số nghiêncứu quan trọng khác trong tương lai

2 Mục tiêu của đề tài

2 1 Mục tiêu tổng quát

Tạo được phôi vô tính tái sinh trực tiếp, gián tiếp và nhân được phôi vô tínhtrên môi trường đặc và trong môi trường lỏng lắc Tạo được rễ bất định tái sinh trựctiếp và nhân được rễ bất định trong môi trường lỏng lắc

2 2 Mục tiêu cụ thể

Xác định được điều kiện môi trường thích hợp cho sự cảm ứng hình thành phôi

vô tính trực tiếp và gián tiếp từ mô lá (môi trường khoáng, loại và nồng độ auxin vàcytokinin, nồng độ đường, tỷ lệ nước dừa, điều kiện chiếu sáng,…)

Xác định được điều kiện thích hợp (chất ĐHST, khối lượng/kích thước phôi,nồng độ đường, tỷ lệ nước dừa) cho sự nhân sinh khối và tăng sinh phôi

Xác định được điều kiện thích hợp cho sự cảm ứng hình thành và tăng sinh rễbất định từ mô lá (môi trường khoáng, loại và nồng độ auxin, nồng độ đường, điềukiện chiếu sáng,…)

Tạo được rễ bất định cho chồi có nguồn gốc đốt thân/phôi vô tính

Xác định được hình thái giải phẫu của phôi vô tính ở một số giai đoạn pháttriển khác nhau, nguồn gốc tế bào phát sinh phôi vô tính và rễ bất định thông qua kỹthuật nhuộm hai màu

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3 1 Ý nghĩa khoa học

Cung cấp những dẫn liệu khoa học mới có giá trị nghiên cứu về hai con đườngphát sinh hình thái phôi vô tính và rễ bất định, hai kiểu tái sinh trực tiếp/gián tiếp phôi

vô tính và rễ bất định; về nhân phôi vô tính và rễ bất định thông qua cơ chế tạo phôi

và rễ bất định thứ cấp ở NGBCC - một trong các đối tượng thực vật/cây dược liệuquan trọng thuộc họ Ngũ gia bì Đồng thời, luận án cũng là tài liệu tham khảo hữuích phục vụ cho nghiên cứu và giảng dạy về lĩnh vực sinh lý thực vật, nuôi cấy mô,

tế bào thực vật

3 2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả từ nghiên cứu này là tiền đề quan trọng cho nghiên cứu nhân sinh khốiphôi vô tính, rễ bất định trên quy lớn và sản phẩm sinh khối tạo được có thể được sửdụng trong nghiên cứu nhân giống (phôi vô tính), thu hợp chất thứ cấp (rễ bất định)phục vụ lĩnh vực y dược và mỹ phẩm

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

4 1 Đối tượng nghiên cứu

Phôi vô tính từ nuôi cấy mảnh lá; rễ bất định từ nuôi cấy mảnh lá/chồi có nguồngốc đốt thân/phôi vô tính

hoàn chỉnh từ phôi vô tính và ứng dụng phương pháp khảo sát hình thái/hình thái giảiphẫu mô tế bào nhằm xác định nguồn gốc phát sinh phôi vô tính và rễ bất định

Do giới hạn về thời gian nên chưa đề cập đến nghiên cứu nhân rễ bất định từchồi có nguồn gốc đốt thân/phôi vô tính bằng phương pháp nuôi lỏng lắc, nhân phôi

vô tính/rễ bất định bằng hệ thống bioreactor cũng như không thu thập số liệu các chỉ

tiêu sinh trưởng của cây từ phôi vô tính ở giai đoạn ex vitro

5 Tính mới của đề tài

Nghiên cứu này đã xác định được môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấythích hợp cho sự phát sinh phôi vô tính trực tiếp từ mảnh lá NGBCC, đồng thời cũng

xây dựng quy trình tạo phôi gián tiếp thông qua mô sẹo mảnh lá Nhân in vitro phôi

vô tính trên môi trường đặc và trong môi trường lỏng thông qua sự hình thành phôithứ cấp theo cơ chế bất định Phôi vô tính phát triển thành cây con có khả năng sinh

trưởng bình thường trong điều kiện in vitro và ex vitro Kết quả này có ý nghĩa rất

lớn trong nhân giống loài dược liệu này

Xác định được môi trường thích hợp cho tạo rễ bất định trực tiếp từ mảnh lá

nuôi cấy in vitro Nhân sinh khối rễ bất định thông qua sự hình thành rễ thứ cấp bằng

phương pháp nuôi lỏng lắc Kết quả này có thể ứng dụng cho hướng nghiên cứu sảnxuất thu các hợp chất thứ cấp

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 1 Giới thiệu về Ngũ gia bì chân chim (Schefflera octophylla Lour Harms)

: Araliaceae

: Schefflera Loài : Schefflera octophylla

`

Hình 1 1 Hình thái một số bộ phận của cây NGBCC (Schefflera octophylla)

A Lá; B Hoa; C Quả

(Nguồn: A: Wikipedia – Việt Nam; B,C: Wang và cộng sự, 2021[25])

Họ Ngũ gia bì/họ Nhân sâm (Araliaceae) là họ rất đa dạng về thành phần loài,

có khoảng 70 chi, 900 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới, rất ít đạidiện ở vùng ôn đới, phần lớn các chi và loài phân bố ở Đông nam Á, châu Úc, châu

Mỹ nhiệt đới Ở Việt Nam thực vật thuộc họ Ngũ gia bì cũng khá đa dạng về thànhphần loài, đặc điểm sinh thái – sinh học, hiện thống kê được 141 loài thuộc 19 chi,phân bố rộng thường mọc rải rác ở vùng rừng núi nhưng mọc tập trung nhiều ở nhữngvùng núi cao có khí hậu ôn hòa, có nhiều loài sống ở những nơi quang đãng, ẩm ướt,ven rừng, ven suối…Thực vật họ Ngũ gia bì còn rất đa dạng và phong phú về các hợpchất thứ cấp, có khả năng tổng hợp và tích lũy các hợp chất triterpenoid saponin,steroidal saponin, ginsenosides, polysaccharid, các flavonoid, tinh dầu, các hợp chất

hữu cơ khác…[1] Đây chính là nguồn hợp chất sinh học có hoạt tính rất tốt, vì thếrất nhiều loài trong họ này đã được sử dụng làm nguồn dược liệu quý có giá trị caotrong ứng dụng bảo vệ sức khỏe cho con người

Chi Schefflera là chi lớn nhất trong họ Ngũ gia bì, thành phần loài rất đa dạng

với khoảng 450 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới châu Á nhưNhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam, Lào, Campuchia, Thái Lan, Malaysia, Ấn Độ, SriLanka, Philippines, Indonesia, New Zealand, Singapore, Australia và một số đảo ởThái Bình Dương [10] Ở Việt Nam cũng đã thống kê được 56 loài (chiếm 39,7%tổng số loài của họ Ngũ gia bì), 4 thứ [1] Nhiều loài trong chi này đã được sử dụnglàm thuốc chữa trị bệnh phong thấp, đau nhức xương khớp ngoài ra còn có tác dụng

điều trị bệnh tiêu hóa, ho, cầm máu…như NGBCC (Schefflera octophylla Lour Harms), Chân chim Bắc bộ (Schefflera tonkinensis R Vig), Chân chim lá nhỏ

(Schefflera pes-avis R Vig), Ngũ gia bì lá láng (Schefflera nitidifolia Harms), Chân chim Sapa (Schefflera vietnamensis Grush, N Skvorts/Schefflera chapana Hamrs), ở loài Chân chim núi – Chân chim Petelot (Schefflera petelotii Merr ) còn được sử dụng

chữa gãy xương [10]

NGBCC có danh pháp khoa học là Schefflera octophylla (Lour ) Harms [26], tên khoa học khác Schefflera heptaphylla (L ) Frodin, Aralia octophylla Lour, còn có

tên gọi khác là Sâm nam, cây Đáng, Lá lằng, Kotan (Lào) Đây là loài thực vật thườngxanh, có hoa, có nguồn gốc từ Đông Á là Nhật Bản và miền nam Trung Quốc Ở NhậtBản NGBCC mọc hoang từ miền nam Kyushu đến Okinawa, nó là loài thực vật đạidiện cho vùng Yanbaru của Okinawa Nhật Bản Ở Trung Quốc NGBCC phân bố chủyếu ở Quảng Đông, Quảng Tây, Vân Nam, Phúc Kiến [8] Ở Việt Nam, NGBCC mọcrải rác ở vùng núi cao phía bắc, phía nam của dãy Trường Sơn, có nơi mọc tập trung

có diện tích lớn khoảng 5 - 10 hecta, gặp ở các tỉnh như Lạng Sơn, Cao Bằng, LàoCai, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Hòa Bình, Hà Tây, Tuyên Quang,Ninh Bình, Quảng Ngãi, Đắc Lắc, Bình Phước, Lâm Đồng [27][10]

1 1 2 Đặc điểm sinh học – sinh thái

NGBCC thuộc loài cây nhỏ hoặc cây to, cao khoảng 2 - 8 m Lá chét hình chânvịt, mọc so le có 6 - 8 lá chét, cuống lá dài 8 - 30 cm, lá chét nguyên, hình trứng, đầunhọn hay hơi tù, dài 7 - 17 cm, rộng 3 - 6 cm, cuống lá chét ngắn 1,5 - 2,5 cm, cuống

lá chét giữa dài hơn có thể tới 5 cm, mặt trên lá xanh sẫm bóng, mặt dưới lá nhạt hơn

Cụm hoa mọc thành chùm tán, hoa nhỏ màu trắng thơm, mẫu 5, bao phấn có 2 ngăn,bầu dưới, trên cuống phụ của cụm hoa đôi khi có hoa riêng lẻ Quả mọng hình cầu,đường kính ~ 5 mm, khi chín có màu tím sẫm đen, cây thường ra hoa vào tháng 2 -

1 1 3 Thành phần hóa học và công dụng

1 1 3 1 Thành phần hóa học

Đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của NGBCC thông qua chiếtxuất, phân tách và phân lập các chất từ các bộ phận lá, thân, rễ Kết quả thu đượcnhiều hợp chất tự nhiên có hoạt tính tốt được sử dụng trong y học Chen và cộng sự(2015) cho rằng thành phần hóa học chính là triterpenoid, đã có hơn 40 loại

triterpenoid được chiết xuất từ các bộ phận của loài thực vật này [7], bao gồm

oleanane [29][30], ursane [31], lupane [2][29][30]

Lá

Phân lập hoạt chất từ lá NGBCC thu được 2 triterpenoid glycoside mới là

3-epi-betulinic acid 3-O-β-D-glucopyranoside (1);

3α-hydroxylup-20(29)-ene-23,28-dioic acid 28-O-[α-L-rhamnopyranosyl (1→4)-O-β-D-glucopyranosyl glucopyranoside (2); khác với lup-20(29)-ene-23,28-dioic acid [2]

(1→6)]-β-D-Nghiên cứu của Sung và cộng sự (1991) phân lập hoạt chất từ lá khô, thu nhậnmột glucoside triterpenoid sulfate mới, từ dữ liệu quang phổ và biến đổi hóa học đã

xác định là 3-epi-betulinic axid 3-O-sulfate 28-O-[α-L- rhamnopyranosyl

(1→4)-O-β-D-glucopyranosyl (1→6)]-β-D-glucopyranoside [28] Tiếp tục phân lập từ lá, Sung

và cộng sự thu nhận được một saponin triterpenoid 3,28-bidesmosidic mới, mộttrisaccharid mới và oleanonic acid Dựa trên dữ liệu quang phổ và sự biến đổi hóa

học, các thành phần mới được xác định là 3-epi-betulinic acid

3-O-β-D-glucopyranoside 28-O-[α-L-rhamnopyranosyl (1→4)-O-β-D-glucopyranosyl

(1→6)-β-D-glucopyranoside [29] Phân lập lá, dùng dữ liệu quang phổ và biến đổi

hóa học, Sung và cộng sự thu nhận được 28-O-[α-L-rhamnopyranosyl

(1→4)-O-β-D-glucopyranosyl (1→6)]-β-D-glucopyranoside của

3α-hydroxylup-20(29)-ene-23,28-dioic acid (1); 3α,11α-dihydroxylup-20(29)-ene-3α-hydroxylup-20(29)-ene-23,28-dioic acid (2);

3-epi-betulinic acid (3), trong đó hợp chất (2) và (3) được tìm thấy lần đầu tiên trong giới

thực vật [29]

Li và cộng sự (2005) đã phân lập từ cuống lá NGBCC thu được ba dẫn xuất

caffeoylquinic acid là 3,4-di-O-caffeoylquinic axid (1); 3,5-di-O-caffeoylquinic axid

(2); 3-O-caffeoylquinic axid (3) Nh ữ ng h ợ p ch ấ t này có hoạ t tính kháng virus - chố ng

lạ i virus th ể hợp bào gây b ệ nh hô h ấ p Respiratory Syncytial Virus (RSV), trong đó

3,4-di-O-caffeoylquinic axid, 3,5-di-O-caffeoylquinic acid có ho ạ t tính ch ống RSV

r ấ t mạ nh mẽ Các h ợp ch ấ t này phát huy tác d ụng ch ống RSV, thông qua vi ệ c ứ c ch ế

sự dung h ợp t ế bào- virus trong giai đoạn đầ u và ứ c ch ế sự dung h ợp t ế bào-virus ởgiai đoạn cuối [4] Li và cộng sự (2007) chiết xuất từ lá, tiến hành phân đoạn và phân

lập đã thu được hai triterpenoid tinh khi ế t có ho ạ t tính cao, kháng virus h ợp bào hô

hấ p (RSV) r ấ t m ạnh, là 3α -hydroxylup-20(29)-ene-23,28-dioic acid (1);

3-epi-betulinic acid 3-O-sulfate (2), và m ột saponin không ho ạt độ ng là 3α

(1→4)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranoside [5] Tiếp tục phân tích thành phần hóa

học tinh dầu được chiết xuất từ lá, Li và c ộng s ự (2009) đã thu được 27 hợp chất dễ

bay hơi, trong đó có 17 hợp chất thuộc về monoterpene hoặc sesquiterpene Tinh dầu

này có hoạt tính kháng sinh với ba dòng tế bào ung thư: tế bào MCF-7, A375 và Hep

G2 [6]

Từ nguyên liệu lá tươi của NGBCC, Liu và cộng sự (2019) đã phân lập và xác

định được 03 lupanine triterpenes có tác dụng đông máu hiệu quả, đó là

3α-hydroxy-lup-20(29)-ene-23,28-dioic acid (1); betulinic acid 3-0-sulfate (2); 3α

28-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranoside (3) Trong đó chất betulinic acid

3-0-sulfate thúc đẩy sự đông máu rất đáng kể, tác dụng cầm máu hiệu quả cao [9]

Một triterpenoid mới và glycoside được phân lập từ vỏ thân của NGBCC là

asiatic acid; và các asiaticoside được xác định là 3α-hydroxy-urs-12-ene-23,28-dioicacid; 3α-hydroxy-urs-12-ene-23,28-dioic acid 28-O-[α-L-rhamnopyranosyl (1→4)-

O-β-D-glucopyranosyl (1→6)]-β-D-glucopyranoside Lần đầu tiên asiaticoside được

phân lập từ một loài thực vật không phải của Centella Asiatica [31]

Wu Chun và cộng sự (2013) đã phân lập từ vỏ thân, trên cơ sở phân tích quangphổ và phương pháp hóa học đã thu được chín saponin triterpenoid mới gồm bốn

saponin triterpenoid loại ursane là heptursosides AD (1-4), saponin triterpenoid loại

oleanane là heptoleosides AD (5-8), một saponin triterpenoid loại damarane,

heptdamoside A, cùng với hai saponin đã biết là asiaticoside D và scheffoleoside B

Lần đầu tiên sự hiện diện của saponin triterpenoid tetracyclic từ Schefflera, các

saponin có vai trò chống viêm [32] Tiếp tục nghiên cứu các hợp chất chiết xuất từ

vỏ thân, Wu Chun và cộng sự (2014) phân l ập được năm saponin triterpenoid loạ i

ursane m ới (1-5), các h ợp ch ất được phân l ậ p t ừ cây này đều được đánh giá về cáchoạt độ ng ứ c ch ế sả n xu ấ t oxide nitric do lipopolysaccharide gây ra trong t ế bàoRAW264 7, và các h ợ p ch ấ t 2 và 5 cho th ấ y ho ạt động ch ống viêm y ế u ở nồng độkhông gây độc tế bào c ủa chúng [33]

Trung tâm Sâm Vi ệt Nam đã hợp tác v ới Đạ i h ọc Hiroshima Nh ậ t Bản đã chiế txuấ t t ừ vỏ thân đã xác định được 12 glycozid triterpenoid trong đó có 3 hợp ch ất đãbiế t là asiaticozid, caulozid, 3- α -hydroxylup-ene-23,28-dioic acid 28- α -rhamnosyl(1→4)-β-D-glucopyranozid (1→6)-β-D-glucopyranozid và chín hợp chất mới Trong

12 hợp chất được xác định từ vỏ thân có 6 cặp có cấu trúc ursen và oleanen tương

ứng, các cặp glycozid ursen và oleanen tương ứng được đặt tên là scheffursozid A,

B, C, D, E, F và scheffoleozid A, B, C, D, E, F [27]

R ễ

Rễ NGBCC dùng làm thuốc bổ nên còn gọi là Sâm nam [10] T ừ nguồ n nguyênliệ u là v ỏ r ễ c ủa NGBCC được thu th ậ p t ừ Quả ng Châu, t ỉnh Qu ảng Đông, TrungQuốc, Chen và c ộ ng s ự (2015) đã phân l ậ p, dùng k ỹ thu ậ t s ắ c ký, phân tích d ữ liệ u

quang ph ổ đã xác định được 6 triterpenoid là taraxerone (1), 3-epi-taraxerol (2),

aleuritolic acid (3), 3-oxofriedelan-28- oic acid (4), 3β,19α

-dihydroxy-urs-12-ene-24,28- dioic acid (5), asiatic aicd (6) Trong đó, các hợp ch ấ t t ừ 1-5 l ần đầ u tiên thu

được t ừ loài cây này Nh ữ ng ch ấ t hóa h ọc này có vai trò ch ống viêm, ch ống ung thư

và ch ống viêm kh ớp dạ ng thấ p [7]

1 1 3 2 Công dụng

Trung tâm Sâm Vi ệ t Nam h ợp tác v ới Vi ệ n nghiên c ứ u cây thu ố c Poznan (BaLan) cho thấy NGBCC có nhiề u tác d ụng [32]

Tác dụng trên hệ thần kinh trung ương: NGBCC tác động hai hướng trên h ệ

thần kinh trung ương liề u nh ỏ (1/500 c ủ a LD50) kích thích nh ẹ trên h ệ th ầ n kinh trungương, liề u cao (1/20 c ủ a LD50) làm ứ c chế hệ th ần kinh trung ương

Tác d ụ ng trên n ội ti ế t t ố sinh d ục: Th ự c hi ệ n trên hai nhóm súc v ật có cơ địa

bình thường, trưở ng thành và nhóm súc v ậ t b ị suy nhược sinh d ục Nhóm súc v ậ t có

cơ địa bình th ường, trưởng thành k ế t qu ả cho th ấ y sự tác động không có bi ể u hiệ n rõ

r ệ t Ở nhóm súc v ậ t b ị suy nhược sinh d ục đề u có s ự gia tăng trọng lượng cơ quansinh dụ c so v ới đố i ch ứng, đồ ng th ời s ự tác độ ng c ủa oestrogen và androgen đề u bi ể uhiệ n ở liề u th ấ p S ự tác động c ủa b ộ phậ n lá m ạnh hơn so với tác động c ủa b ộ ph ậ nthân NGBCC

Tác d ụ ng kháng viêm, gi ảm đau: Nghiên c ứ u ti ế n hành trên b ột chi ế t t ừ lá

NGBCC có tính kháng viêm rõ ở 2 li ề u th ử 0,1 g/kg và 0,5 g/kg trong đó ở liề u 0,1

g/kg tác d ụng điể n hình hơn Nghiên cứ u v ề tác d ụng gi ảm đau cho kế t qu ả 50% 60%

-Nhữ ng nghiên c ứ u v ề dược lý nh ững năm gần đây cho thấ y, các ch ấ t hóa h ọ cđược chiết xuất, phân tách, phân lập từ các bộ phận của NGBCC có nhiều hoạt tính

sinh học khác nhau như: kháng virus rất mạnh [3][4][5], tác d ụ ng ch ống các t ế bào

ung thư [6][7], ch ố ng viêm [7][32][33], ch ố ng viêm kh ớ p [7], giảm đau [ 7], ngoài raNGBCC còn được sử dụng theo cách truyền thống để chữa chảy máu do chấn thương,

và tác dụng tăng đông máu có liên quan đến việc điều hòa mạch hoạt chất nội mô và

các thông số huyết học [8]

Trong nghiên cứu về dược lý saponin triterpenoid loại damarane cũng như các

dẫn xuất của chúng có hoạt tính sinh học chống khối u, chống viêm, kích thích miễn

dịch, tăng sinh tế bào thần kinh, chống lão hóa, chống vi khuẩn, chống tiểu đường,

chống loãng xương

T ừ lâu trong dân gian ở Trung Qu ố c, Vi ệ t Nam các b ộ phậ n c ủ a cây NGBCC(lá, v ỏ thân, v ỏ r ễ , r ễ nhỏ) được s ử d ụng làm thu ốc, như rễ dùng làm thu ốc b ổ, v ỏ

thân ch ữ a th ấ p kh ớp, viêm h ọ ng, c ả m s ốt, v ết thương sưng đau, ngoài ra vỏ còn giúp

ăn ngon, ngủ tốt, ph ục h ồi và tăng cường s ứ c kh ỏe, h ạ nhiệ t, ch ố ng viêm, gi ảm đau,

tr ị thấ p kh ớp, đau xương, chữ a b ệ nh gan, tác d ụng t ốt đế n h ệ thần kinh trung ương,chống suy nhược th ần kinh, giúp tăng cườ ng trí nh ớ [27][10]

1 2 Tình hình nghiên cứu về phôi vô tính, rễ bất định ở một số loài thuộc các

chi quan trọng ở họ Ngũ gia bì (Araliaceae)

1 2 1 Chi Panax

1 2 1 1 Phôi vô tính

Qua sử dụng phôi hợp tử non Panax ginseng, Arya và cộng sự (1993) đã

nghiên cứu sự hình thành phôi vô tính và mô sẹo có khả năng sinh phôi Các phôi sơ

cấp đã tạo phôi thứ cấp cấp 1, cấp 2 và sự sinh trưởng của chúng phụ thuộc vào chất

điều hòa sinh trưởng (ĐHST) Một số loại auxin được sử dụng như 2,4-D, NAA và

IAA 1 mg/L rất thích hợp cho tạo phôi thứ cấp; ngược lại, kinetin, BA ức chế tạo

phôi thứ cấp [34]

Choi và cộng sự (2003) đã sử dụng các mảnh lá mầm phôi hợp tử sâm Panax

ginseng tạo phôi vô tính trực tiếp trên môi trường đặc MS không bổ sung chất ĐHST,

có 30 g/L đường; ngược lại, môi trường có nồng độ khoáng NH4NO3 cao (60 mM)

chỉ cảm ứng tạo mô sẹo có khả năng sinh phôi Mô sẹo có khả năng sinh phôi được

cấy chuyển nhiều lần trên môi trường vẫn có khả năng phát triển tiếp tục dù không

bổ sung chất ĐHST Mô sẹo được nuôi cấy trong bình tam giác (V500 mL) chứa môi

trường MS/½MS có 30 g/L đường để nhân lên phục vụ cho nuôi cấy quy mô lớn hơn

trong bioreactor (V20 lít); khối lượng tươi mô tăng lên 7,1 lần sau 5 tuần nuôi cấy

trong bioreactor chứa môi trường 1/3MS có 30 g/L đường Hàm lượng ginsenoside

tổng số thấp hơn 6 lần so với rễ cây sâm sinh trưởng ở điều kiện tự nhiên [35]

Cũng từ vật liệu mảnh lá mầm phôi hợp tử, Zhou và Brown (2006) đã xây

dựng được quy trình t ạ o cây sâm B ắ c M ỹ (Panax quinquefolius) có hi ệ u qu ả thông

qua nuôi c ấ y t ạ o phôi vô tính Ti ề n x ử lý m ả nh lá m ầ m v ới 1 M đường ở 4oC đã cả ithiện được s ố lượ ng phôi hình thành Vi ệ c k ế t h ợp tiề n xử lý v ới nuôi c ấ y dùng nồ ng

độ đường cao (7%) cũng đã nâng cao đượ c t ỷ lệ phát sinh phôi t ừ 40% lên 75%, s ốlượng phôi/mẫ u c ấ y từ 10 lên 21 Tỷ lệ hình thành phôi th ứ c ấp đạ t 90% khi mô phôi

vô tính sơ cấp đượ c nuôi c ấy trên môi trườ ng MS có 1 mg/L 2,4-D và 1 mg/L NAA Phôi phát tri ển đến giai đoạn trưởng thành (trong đó có ½ lượng phôi nẩy chồi) trên

môi trường SH có 1% than ho ạ t tính và 85% phôi phát tri ển thành cây con (đầy đủ r ễthân và lá) khi được nuôi cấy trên môi trường ½SH có 0,5% than hoạt tính Cây con

có kiểu hình bình thườ ng ở giai đoạ n ex vitro [36]

Nghiên c ứ u c ủa Kim và cộng sự (2012) đã thiết lập hệ thống tái sinh phôi vô

tính thứ cấp Panax ginseng trực tiếp từ phôi vô tính sơ cấp, nuôi cấy trên môi trường

MS không bổ sung chất ĐHST Môi trường EM (1/3MS, với ½ lượng NH4NO3 vàKNO3, có 20 - 30 g/L sucrose) tạo điều kiện thích hợp cho sự phát triển của phôi thứcấp đến giai đoạn cây con Cây con có rễ cọc hoàn chỉnh khi được nuôi cấy trên môitrường ½SH có 0,5% than hoạt tính Tần suất cao của hệ thống tái sinh này thông quaquá trình phát sinh phôi thứ cấp theo chu kỳ (cyclic manner) Sự tăng sinh liên tụccủa phôi vô tính thông qua tạo phôi thứ cấp, nên rất hữu ích cho nhân giống [37]

Kỹ thuật nuôi cấy lát mỏng tế bào (LMTB) đã được sử dụng trong tạo phôi

trực tiếp từ một số bộ phận khác nhau của cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis)

in vitro (3 tháng tuổi) như lá, cuống lá và củ Mô được nuôi cấy trên môi trường MS

bổ sung NAA và 2,4-D ở các nồng độ 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 và 2,0 mg/L Sau 10 tuần nuôicấy, kết quả thu được cho thấy nguồn mẫu từ lá là thích hợp nhất cho sự hình thànhphôi trực tiếp Mẫu cấy lá được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 2 mg/L NAAcho hiệu quả phát sinh phôi trực tiếp cao nhất (29,49 phôi/mẫu) Kết quả khảo sáthình thái giải phẫu cho thấy phôi phát triển trực tiếp từ các mẫu nuôi cấy [38] Trongnghiên cứu của Vũ Thị Hiền và cộng sự (2015) đã nghiên cứu sự phát sinh hình thái

từ LMTB (TCL) mẫu lá, cuống lá và thân rễ sâm Ngọc Linh in vitro Mẫu được nuôi

cấy trên môi trường đặc MS có bổ sung 30 g/L đường, các chất ĐHST (NAA, 2,4-D,

BA và TDZ riêng lẻ hoặc kết hợp) Sau 10 tuần nuôi cấy, kết quả cho thấy mẫu látTCL_L, mẫu cuống lá lTCL_C, mẫu thân rễ tTCL_R đều cho sự phát sinh phôi, môsẹo, rễ, trong khi mẫu cuống lá tTCL_C chỉ cho sự phát sinh mô sẹo và rễ Trong đó,

tỷ lệ phát sinh phôi cao nhất (89,6%), tỷ lệ phát sinh mô sẹo cao nhất (91 - 98,8%),

tỷ lệ phát sinh rễ cao nhất (98,8%) đã được ghi nhận tương ứng khi mẫu lá tTCL_Lđược nuôi cấy trên môi trường bổ sung 2 mg/L NAA và được đặt dưới điều kiện chiếusáng 16 h/ngày; lá tTCL_L, cuống lá tTCL_C, lTCL_C, thân rễ tTCL_R được nuôicấy trên môi trường có 2,4-D kết hợp với BA dưới điều kiện chiếu sáng 16 h/ngày,điều kiện tối hoàn toàn; môi trường có bổ sung 1 mg/L NAA và đặt trong điều kiệntối hoàn toàn Điều kiện chiếu sáng có tác động đáng kể lên khả năng phát sinh hình

thái của mẫu cấy Việc sử dụng đèn huỳnh quang chiếu sáng 16 h/ngày phù hợp cho

khả năng phát sinh phôi của mẫu cấy, những phôi thu được có dạng hình cầu, hình

tim, hình thủy lôi và cả dạng lá mầm Ngược lại, điều kiện tối lại kích thích sự hình

thành rễ và mô sẹo tốt hơn Rễ thu được có màu trắng đục, có phân nhánh, trong khi

mô sẹo lại xốp và có màu vàng nhạt [39] Ở sâm Ngọc Linh, Mai Trường và cộng sự(2014) đã nghiên cứu tạo và nhân phôi vô tính trong môi trường lỏng Lá chét của

cây sâm 6 tháng tuổi ở vườn ươm (sau khử trùng) được nuôi cấy trên môi trường MS

có 1 mg/L 2,4-D và 0,2 mg/L kinetin để tạo mô sẹo Sau đó, mô sẹo được cấy chuyềnsang môi trường MS lỏng (lắc) có 1 mg/L 2,4-D với 0,2 mg/L kinetin, 500 mg/L

casein hydrolysate để tạo huyền phù tế bào Sau 2 tháng, huyền phù tế bào được

chuyển sang nuôi cấy trong môi trường B5 lỏng (lắc) có 3 mg/L IBA Sau nhiều thángnuôi, rất nhiều phôi vô tính dạng cầu hình thành và có khả năng nhân ổn định Mảnh

lá mầm (của cây mầm từ phôi) và phôi vô tính non được nuôi cấy trên môi trường

MS có 10% nước dừa, có hoặc không có 0,2 mg/L IBA để tạo mô sẹo sinh phôi và

phôi thứ cấp Mô sẹo sinh phôi và phôi thứ cấp này cũng đã được dùng để nuôi nhântrong môi trường lỏng có và không có chất ĐHST ở quy mô bình tam giác và

bioreactor [40] Những kết quả đã tạo cơ sở để nhân giống quy mô lớn và thu hợp

chất thứ cấp

Rễ bất định c ủa cây Panax ginseng hoang d ại và cây đột bi ến được nuôi c ấ y

tạ o mô s ẹo trên môi trường MS có 0,5 mg/L 2,4-D và 0,3 mg/L kinetin Mô s ẹ o cókhả năng sinh phôi được c ấ y chuy ển sang môi trường MS có 0,5 mg/L 2,4-D nh ằ m

c ả m ứ ng t ạo phôi Các phôi hình thành trưởng thành trên môi trườ ng MS có 5 mg/L

GA3 và 85% phôi n ẩ y m ầ m [41]

Đỗ Mạnh Cường và c ộng s ự (2020) đã nghiên cứu làm tăng tỷ lệ phát sinh

phôi vô tính sâm Ng ọc Linh qua kh ử trùng lá sâm b ằ ng dung d ịch nano b ạ c và nuôi

c ấy dùng môi trường cũng bổ sung nano b ạ c K ế t qu ả cho th ấ y t ỷ lệ tạ o mô s ẹ o cókhả năng sinh phôi cao nhấ t (72,22%), kh ối lượng tươi cao nhấ t (0,77 g) khi s ử dụ ngdung d ị ch nano b ạ c x ử lý trong 20 phút T ỷ l ệ phát sinh phôi và phôi n ẩ y m ầ m caonhất trên môi trườ ng MS có 1 mg/L 2,4-D; 0,5 mg/L NAA; 02 mg/L Kin và 1,6 mg/Lnano b ạ c Vi ệ c b ổ sung 1 mg/L NAA và 1,2 mg/L nano b ạ c cho k ế t qu ả tốt nh ấ t v ềchiề u cao ch ồ i, chi ề u dài r ễ , số r ễ , kh ối lượng tươi/khô cây con [ 42]

Nguyễn Thị Ngọc Hương và cộng sự (2018) đã nghiên cứu hình thái học và tế

bào học quá trình phát sinh phôi vô tính gián tiếp qua giai đoạn mô sẹo ở Tam thất

hoang (Panax stipuleanatus) Ở nghiên c ứ u này, mô s ẹo được c ả m ứ ng t ừ mô thân r ễ

nuôi cấy trên môi trường MS (½ khoáng đa lượng) có b ổ sung 2 mg/L 2,4-D (giai

đoạ n nuôi 8 tu ần) và 1 mg/L (giai đoạ n nuôi 16 tu ầ n) Kh ối mô s ẹ o bao g ồm các c ụ m

tế bào r ời r ạ c và c ụ m t ế bào đẳng kính đượ c c ấ y chuyể n sang nuôi c ấy trên môi trường

có b ổ sung 5 m/L NAA để tạ o mô s ẹ o có kh ả năng sinh phôi, kế t qu ả cho th ấ y kh ối

mô sẹ o tr ở nên m ềm hơn với các c ụm t ế bào có kh ả năng tái sinh cao: kích thước nh ỏ,

đẳ ng kính, nhân to, nhân rõ và có t ế bào ch ất đậm đặ c Sự hình thành các th ể giố ngphôi c ầu được ghi nh ậ n sau 28 tu ần nuôi trên môi trường có NAA nêu trên Các c ấ utrúc gi ống phôi này ti ế p t ục phát tri ển đến giai đoạ n h ậ u phôi c ầ u, phôi d ạ ng trái tim

và dạ ng có lá m ầm trên môi trường MS như trên có bổ sung 0,5 mg/L BA và 1 mg/L

GA3 Ngoài ra, cũng ghi nhận được m ột s ố d ạ ng phát tri ể n b ất thườ ng c ủa phôi nhưchỉ phát tri ể n r ễ /ch ồi ho ặ c chỉ có lá m ầ m [43]

1 2 1 2 Rễ bất định

Gao và cộng sự (2005) đã nghiên cứu sự tái sinh trực tiếp rễ bất định từ đoạn

cuống lá (0,5-0,8 cm) và từ đoạn rễ nhánh (~ 1 cm) cây Panax notoginseng (3 năm

tuổi) Kết quả cho thấy rễ bất định hình thành tốt từ mô cuống lá nuôi cấy trên môi

trường MS có 3 mg/L IBA, có hoặc không bổ sung 0,1 mg/L kinetin Mô rễ nhánh

mẫn cảm hơn đối với IBA trong quá trình nuôi cấy tạo rễ bất định so với mô cuống

lá Khối lượng khô rễ bất định tăng 5,25 lần sau quá trình nuôi lỏng lắc trong môi

trường ½MS có 3 mg/L IBA [44]

Ba loại mô dùng tạo rễ bất định sâm Ngọc Linh bao gồm mô sẹo lá chét,

phôi/cụm phôi trưởng thành mang chồi và mô sẹo cứng Rễ bất định hình thành ngay

trong giai đoạn nuôi cấy mảnh lá (nuôi cấy một giai đoạn, không qua cấy chuyền)

trên môi trường MS bổ sung 2 mg/L 2,4-D và 10% nước dừa; rễ bất định cũng hình

thành từ mô sẹo cấy chuyền (nuôi cấy hai giai đoạn) trên môi trường MS có 3 mg/L

NAA, MS có 3 mg/L NAA, 2 mg/L 2,4-D, 5% (v/v) nước dừa và môi trường B5 có

5 mg/L IBA Ngoài ra, sự hình thành rễ bất định từ phôi/cụm phôi (đã loại bỏ hoàn

toàn rễ trụ) cũng đã được ghi nhận qua nuôi cấy trên môi trường ½MS bổ sung 2 - 3

mg/L NAA Rễ bất định từ mô sẹo cứng (từ môi trường B5 có 5 mg/L IBA) đã được

nghiên cứu nuôi cấy tiếp tục trên môi trường đặc/lỏng White có 5 mg/L NAA, B5 có

1 - 5 mg/L IBA/NAA nhằm tìm hiểu khả năng tăng sinh khối qua quá trình tạo rễ thứcấp Nghiên cứu khả năng hình thành các sơ khởi rễ và phân nhánh rễ trên các môitrường White/B5 có 1 - 5 mg/L IBA/NAA từ khúc cắt rễ bất định cũng đã được thựchiện [45]

Nguyễn Thị Ngọc Hương và cộng sự (2016) đã sử dụng các khúc cắt thân rễ

Panax stipuleanatus có đường kính 1 - 1,5 cm và dày 1 cm được nuôi cấy trên môi

trường MS có bổ sung 30 g/L đường, 6 g/L agar, 0,5 mg/L 2,4-D và đặt trong tối Môsẹo hình thành trên bề mặt thân rễ sau bốn tuần Sự phân chia đầu tiên trong quá trìnhhình thành mô sẹo xảy ra trong hai tuần đầu, ở các tế bào nhu mô vỏ cấp hai và tượngtầng libe – mộc Mô sẹo 26 tuần tuổi với các tế bào bên trong cụm chậm tăng trưởng

và các tế bào ở phía ngoài cụm có xu hướng kéo dài được chuyển sang môi trườnghoạt hóa có bổ sung 0,5 mg/L 2,4-D và 0,1 mg/L TDZ trong 6 tuần Mô sẹo phát triểntrên môi trường này trở nên chặt hơn và hình thành nhiều cụm Sự hình thành rễ bấtđịnh xảy ra sau 10 tuần khi mô sẹo được chuyển sang môi trường MS có bổ sung 0,5mg/L NAA Mô sẹo hình thành các cấu trúc hình cầu giống phôi tuy nhiên chỉ pháttriển một cực rễ Trong các rễ hình thành từ mô sẹo thân rễ có sự hiện diện của saponinthuộc nhóm olean [46]

Nghiên cứu cải tiến quy trình nhân nhanh sinh khối rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh

từ rễ bất định in vitro thông qua việc tối ưu nguồn mẫu, môi trường nuôi cấy và điều

kiện nuôi cấy đã được thực hiện Kết quả cho thấy, các rễ thứ cấp sâm Ngọc Linhđược hình thành từ vùng trụ bì tại vị trí của bó mạch dẫn trung tâm Các mẫu rễ bấtđịnh dài 2 cm tái sinh từ cuống lá với 8 g rễ bất định/1,5 L môi trường nuôi cấy trongbioreactor hình cầu có sục khí cho kết quả hình thành rễ thứ cấp tốt nhất trên môitrường MS cải biên với tỷ lệ ½NH4+/NO3- bổ sung 7 mg/L IBA, 0,5 mg/L BA và 30g/L đường trong 56 ngày (45 ngày đầu trong tối, 11 ngày sau ngoài sáng) ở 22oC và

pH 5,3 [47]

1 2 2 Chi Acanthopanax

1 2 2 1 Phôi vô tính

Chi Aucanthopanax còn có tên gọi khác là Eleutherococcus, đây là chi đã được

nghiên cứu khá nhiều về phôi vô tính Các mảnh lá mầm và thân phôi hợp tử

Acanthopanax senticosus tạo phôi vô tính qua nuôi cấy trên môi trường MS có 0,5

mg/L 2,4-D Phôi thứ cấp hình thành từ phôi vô tính sơ cấp khi được nuôi cấy trên

môi trường MS có 2,4-D (0,5 mg/L) hoặc IAA (1-3 mg/L) hoặc Zeatin (0,5 mg/L) vàNAA (0,2 mg/L) Các phôi vô tính nẩy mầm (93%) trên môi trường MS không bổ

sung 2,4-D Phôi vô tính có nguồn gốc từ cụm tế bào biểu mô và dưới biểu mô [48]

Các đoạn thân cây Acanthopanax koreanum Nakai tạo mô sẹo có khả năng

phát sinh phôi tốt qua nuôi cấy trên môi trường MS chỉ bổ sung 4,5 µM 2,4-D Môsẹo có khả năng phát sinh phôi chỉ tạo phôi cầu khi được nuôi cấy trong môi trườnglỏng có 0,45 µM 2,4-D; ngược lại, ghi nhận phôi phát triển đến giai đoạn trưởng

thành, nẩy mầm khi được nuôi cấy trong môi trường không có 2,4-D Cytokinin ứcchế sự phát triển bình thường của phôi nhưng kích thích sự phát sinh phôi thứ cấp

trên bề mặt của phôi sơ cấp [49]

Park và cộng sự (2005) đã thực hiện nghiên cứu tạo phôi vô tính

Eleutherococcus koreanum từ nuôi cấy các đoạn rễ bất định trong môi trường lỏng

lắc Kết quả cho thấy môi trường 1/3MS có 60 g/L đường, không bổ sung chất ĐHST

là thích hợp cho sự hình thành phôi vô tính Phôi vô tính phát triển đến giai đoạn

trưởng thành và nẩy mầm trong môi trường 1/3MS không bổ sung chất ĐHST Rễ

bất định, phôi và cây con đã được thu nhận đồng thời sau 12 tuần nuôi cấy rễ bất địnhbằng bioreactor trong môi trường như trên [50] Các kết quả nghiên cứu trên có ý

nghĩa trong nhân giống và thu hợp chất thứ cấp

Shohael và cộng sự (2007) đã nghiên cứu thu nhận các sản phẩm có giá trị nhưeleutherosides và acid chlorogenic từ phôi vô tính có nguồn gốc nuôi cấy huyền phù

tế bào có khả năng sinh phôi Eleutherococcus senticosus Mô tế bào được xử lý

methyl jasmonate (50 - 400 µM), kết quả cho thấy hàm lượng eleutherosides, acid

chlorogenic, khối lượng tươi/khô, tỷ lệ tăng trường phôi cao nhất khi được xử lý 200

µM methyl jasmonate [51]

1 2 2 2 Rễ bất định

Seo và cộng sự (2003) đã nghiên cứu nhân sinh khối rễ bất định Eleutherococcus

sessiliflorus bằng phương pháp nuôi lỏng lắc và bioreactor Cảm ứng tạo rễ được thực

hiện bằng nuôi cấy mảnh mô trụ dưới lá mầm, đoạn rễ phôi vô tính trên môi trường đặc

½MS có bổ sung NAA, IBA và IAA Kết quả cho thấy rễ hình thành từ mô trụ dưới lámầm tốt hơn từ đoạn rễ Trong các auxin được thí nghiệm, nhận thấy tỷ lệ tạo rễ cao nhấttrên môi trường có 0,5 mg/L NAA Ở nuôi cấy lỏng lắc, hiệu quả tạo rễ ở môi trường

MS (không có NH4NO3) cao hơn trong môi trường MS và ½MS Rễ tăng khối lượng

tươi tốt trong môi trường có 0,5 mg/L IBA Hệ số nhân (5,5 lần) sau 1 tháng khi rễ đượcnuôi trong bioreactor (V10 lít) [52]

Lee và Paek (2012) đã nghiên cứ u ảnh hưởng c ủa ngu ồn đạm đế n phát tri ể n

sinh kh ố i r ễ b ất định Eleutherococcus koreanum Nakai và s ự sả n sinh các ch ấ t có

hoạ t tính sinh h ọ c t ừ r ễ qua nuôi c ấ y trong bioreactor s ục khí (3 lít) K ế t qu ả cho thấ y

tỷ lệ đạ m NH4+:NO3- (5:25 mM và 10:20 mM) cho k ế t qu ả sinh kh ối tươi/khô cao

nhấ t sau 5 tu ầ n nuôi c ấy, hàm lượng eleutherosides B và E đạ t cao nh ấ t ở tỷ lệ

NH4+:NO3- là 5:25 Tăng lượng NH4+ làm gi ả m sinh kh ối, đạ m nitrate thích h ợp hơn

đạ m ammonium trong nhân sinh kh ối r ễ và thu h ợp ch ấ t th ứ c ấ p [53] K ế t qu ả tạ otiền đề cho s ả n xu ấ t sinh kh ối r ễ thu ho ạ t ch ấ t ở quy mô pilot nh ằm thương mạ i hóa

sả n phẩ m

1 2 3 Chi Polyscias

Sliwinska và cộng sự (2008) đã tạo thành công phôi vô tính loài đinh lăng lá

to (Polyscias filicifolia) Sau khử trùng, các mảnh lá (5 - 10 mm) của cây 2 năm tuổi

được nuôi cấy để tạo mô sẹo Mô sẹo loại I hình thành trên môi trường MS có 0,5

mg/L 2,4-D, 1 mg/L BAP và mô sẹo loại II hình thành trên môi trường MS có 2,4-D

2 mg/L, kinetin 0,01 mg/L Mô sẹo loại I là loại mô sẹo chắc và có màu xanh, mô sẹo

loại II là loại mô sẹo có cấu trúc xốp và màu trắng kem (cả hai loại mô sẹo trên đều

có khả năng tạo phôi) Phôi vô tính sơ cấp và phôi thứ cấp được hình thành trong môi

trường lỏng ½MS không bổ sung chất ĐHST Phôi tạo cây con tốt nhất trên môi

trường Nitsch và Nitsch cải tiến có bổ sung 0,5 mg/L kinetin, 0,1 mg/L IBA và 10

mg/L adenine sulfate [54]

Phôi vô tính đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa) nuôi lỏng lắc tăng sinh khối

do sự hình thành phôi bất định thứ cấp Phôi vô tính tăng trưởng sinh khối tốt khi

được nhân in vitro bằng hệ thống nuôi lỏng lắc với khối lượng phôi nuôi cấy ban đầu

là 1 g (1,25% - w/v), tốc độ lắc 100 vòng/phút; khối lượng tăng sinh đạt 7,5 g, hệ số

tăng sinh khối phôi đạt 8,5 lần tại thời điểm 30 ngày sau cấy Đã xây dựng được

đường biểu diễn tăng trưởng khối lượng, hệ số tăng trưởng sinh khối phôi dưới ảnh

hưởng của khối lượng phôi nuôi cấy ban đầu và tốc độ lắc Phôi vô tính đinh lăng lá

nhỏ có cấu trúc điển hình, trưởng thành và tạo cây hoàn chỉnh với tỷ lệ cao (95%) khi

được nuôi cấy trên môi trường ½MS không bổ sung chất ĐHST, cây có kiểu hình và

sinh trưởng bình thường trên môi trường nuôi cấy [55]

1 2 4 Chi Schefflera

1 2 4 1 Schefflera octophylla (Lour ) Harms

Li và cộng sự (2004) đã xây dựng thành công quy trình nhân giống Schefflera

octophylla bằng phương pháp nuôi cấy in vitro trong đó có giai đoạn tạo rễ bất định

Các đốt thân (mang chồi ngủ) của cây ở bầu đất, sau khử trùng, được nuôi cấy trênmôi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L BA và 2 mg/L kinetin nhằm thích chồi ngủ pháttriển Kết quả cho thấy, các chồi ngủ phát triển ở 5 ngày sau cấy (NSC) và tạo thànhcụm chồi nhỏ ở 20 NSC với tỷ lệ 91% Tiếp theo, các chồi nhỏ này phát triển chiềucao (3 - 4 cm), phát triển số lượng cá thể với hệ số nhân 3,4 lần ở giai đoạn 22 NSCqua nuôi cấy trên môi trường MS có 0,5 mg/L NAA và 1,5 mg/L BA Để tạo rễ, cácchồi được nuôi cấy trên môi trường ½MS và 0,2 mg/L NAA có 0,3% than hoạt tính

và kết quả cho thấy, rễ hình thành rất nhiều với chiều dài trung bình ~ 4 cm ở 30NSC Các cây con (cao 3 - 4 cm) đã được trồng thành công trong chậu chứa hỗn hợpperlite, vermiculite và cát mịn (1:1:1) với tỷ lệ sống ~ 75% [3]

1 2 4 2 Schefflera arboricola (Hayata) Merr

Sau khử trùng, các đốt thân được nuôi cấy trên môi trường nhằm kích thíchchồi ngủ phát triển và tạo cụm chồi; các mảnh lá và trục lá cũng được nuôi cấy nhằmtạo mô sẹo và tái sinh chồi Kết quả cho thấy, ở nuôi cấy đốt thân, 0,5 mg/L BA ởmôi trường MS kích thích chồi phát triển tốt trong 8 - 10 ngày, chồi cao 0,5 cm với 4

lá Thí nghiệm tạo cụm chồi đã cho kết quả âm tính dù đã bố trí thực hiện một sốnghiệm thức khác nhau về tổ hợp chất ĐHST như (NAA và BA); (IAA và kinetin);(2,4-D và BA) và (BA và kinetin) Mảnh lá tạo mô sẹo trên môi trường MS có 1 - 2mg/L 2,4-D sau 13 - 16 ngày nuôi cấy; trục lá tạo mô sẹo trên môi trường MS có

NH4NO3 200 mg/L bổ sung 0,5 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BAP sau 6 ngày Chỉ thuđược kết quả tái sinh rễ trên môi trường có BA/kinetin/BA và adenine sulphate quanuôi cấy tái sinh dùng mô sẹo [56]

Misra (2001) đã nêu một số kết luận như các chồi ngủ được cảm ứng, pháttriển trên môi trường MS có bổ sung 2,21 µM BA; nồng độ BA cao hơn (8,87 µM)

đã cảm ứng sự hình thành cụm chồi; các chồi tạo rễ sau khi được cấy chuyển sangmôi trường tạo rễ MS có bổ sung 2,63 µM NAA Các cây con được trồng thành côngtrong chậu chứa hỗn hợp vermiculite và perlite (tỷ lệ 1:1) và ở chậu đất giai đoạn tiếptheo [57]

Schefflera arboricola (dạng lùn – dwarf schefflera) là một trong các loại cây

cảnh dùng trang trí nội thất, thân và lá cây chứa tinh dầu ức chế đối với nhiều loài vi

khuẩn [58] Nhân giống vô tính in vitro 03 dòng (‘Luseane’, ‘Charlotte’ và ‘Gold

Capella’) đã được thực hiện [59] Sau khử trùng, các đốt thân được nuôi cấy trên môitrường MS có bổ sung cytokinin khác nhau Kết quả cho thấy số lượng chồi đạt giátrị cao nhất trên môi trường có bổ sung 0,5 mg/L thidiazuron (TDZ) đối với dòng

‘Luseane’, hoặc 8 mg/L BA đối với 02 dòng ‘Charlotte’ và ‘Gold Capella’ Nuôi cấy

các đốt thân cây in vitro cũng cho kết quả nhân giống tương tự Hai dòng ‘Luseane’

và ‘Gold Capella’ 100% chồi tạo rễ trên môi trường có bổ sung 2 mg/L NAA trongkhi dòng ‘Charlotte’ tạo rễ với tỷ lệ 93,75% trên môi trường có nồng độ NAA thấphơn - 1 mg/L Các cây hoàn chỉnh của 03 dòng nói trên đã được trồng thành côngtrong chậu với các giá loại giá thể khác nhau

1 2 4 3 Schefflera leucantha Viguier

Schefflera leucantha, tương tự các loài trên, cũng chứa nhiều thành phần hóa

học có khả năng ức chế khá nhiều loài vi khuẩn gây bệnh [60] Chirakiattikun vàPrakaisrithongkham (2004) đã thực hiện có kết quả nghiên cứu xây dựng môi trường

thích hợp cho vi nhân giống Schefflera leucantha Viguier – loài cũng hàm chứa nhiều

hợp chất có hoạt tính sinh học Chồi đã được bố trí nuôi cấy trên môi trường MSkhông bổ sung chất ĐHST hoặc có (BA, IAA) với các nồng độ khác nhau, và nướcdừa 15% Kết quả cho thấy, nghiệm thức ở môi trường có 2 mg/L BA kích thích tạochồi tốt nhất so với các nghiệm thức khác với chiều cao chồi 1,4 cm, số lá 3,6, số đốt6,9, số chồi nách 3,4, chiều cao chồi nách 0,5 cm Để tạo rễ bất định, chồi được nuôicấy trên môi trường có bổ sung 0; 1; 1,5; 2 và 2,5 mg/L IAA và kết quả cho thấy,chồi trên môi trường MS có 2 mg/L IAA tạo rễ tốt nhất ở các chỉ tiêu như tỷ lệ tạo

rễ, số rễ và chiều dài rễ, lần lượt là 66,7%; 3,2 rễ và 2 cm [61]

Như vậy, đến nay chưa ghi nhận được bất kỳ công bố kết quả nghiên cứu nào

liên quan đến tạo phôi vô tính ở 03 loài Schefflera nêu trên

1 2 4 4 Didymopanax morototoni (Aublet) Decaisne et Planchon

Didymopanax morototoni còn có tên đồng nghĩa là Schefflera morototoni

(Aublet) Macguire, Steyerm et Frodin

Schefflera morototoni – loài thân gỗ, cây có thân cao, quả có thể sử dụng vì có

giá trị dinh dưỡng; thành phần hóa học trong thân và lá cũng đã được nghiên cứu

[62] Franco và cộng sự (2006) [63] đã sử dụng một số vật liệu từ hạt nẩy mầm như

rễ, chồi, đốt thân và lá mầm để nghiên cứu tạo mô sẹo/phôi vô tính và tạo cây từ phôi Kết quả cho thấy mẫu lá mầm, đốt thân có đáp ứng tạo mô sẹo/phôi tốt hơn so vớihai vật liệu còn lại; môi trường WPM [64] có bổ sung 5 mg/L 2,4-D và 0,1 mg/Lkinetin cho tỷ lệ tạo phôi cao nhất (60%), thấp nhất là trên môi trường có 1 mg/L 2,4-

D và 1 mg/L kinetin (20%) Phôi được cấy chuyển sang môi trường WPM không bổsung chất ĐHST, có 10 g/L đường (hoặc có bổ sung 0,1 mg/L BAP và 0,5 mg/L GA3)

để tạo cây; cây được trồng ra đất với tỷ lệ sống 33%

1 3 Sự phát sinh phôi vô tính

1 3 1 Cơ sở khoa học của sự phát sinh phôi vô tính

Phôi vô tính/phôi soma/phôi sinh dưỡng (somatic embryogenis) đều là kháiniệm mô tả một cấu trúc lưỡng cực gồm cực chồi và cực rễ, bắt nguồn từ tế bào sinhdưỡng hay tế bào soma, dưới những điều kiện thích hợp sẽ phát triển thành một cơthể có chức năng hoàn chỉnh Quá trình hình thành phôi vô tính trải qua các giai đoạntương tự như phát sinh phôi hợp tử, trải qua các giai đoạn phôi hình cầu, hình trái tim,dạng thủy lôi và giai đoạn lá mầm, và sau đó phát triển thành cây con hoàn chỉnh Trong quá trình phát triển phôi vô tính, các giai đoạn hình thái không có kết nối với

mô mạch [65] Phôi vô tính rất giống phôi hữu tính về mặt hình thái, quá trình pháttriển cũng như về mặt sinh lý nhưng không phải là sản phẩm của sự thụ tinh giữa giao

tử đực và giao tử cái, không có quá trình tái tổ hợp di truyền, các phôi vô tính mangthông tin di truyền giống hệt tế bào soma đã sinh ra nó Phôi vô tính có thể được hìnhthành từ một tế bào đơn hay từ cả một cụm tế bào Thông qua một quá trình phân chia

có thứ tự phôi diễn ra sự biệt hóa, trưởng thành và phát triển thành cây con [66] Quá trình phát sinh phôi vô tính đại diện cho mô hình toàn thế hoàn chỉnh, liênquan đến hoạt động của các tín hiệu phức tạp, cũng như việc lập trình lại sự biểu hiệngen được điều chỉnh cụ thể Sự điều hòa này đáp ứng với các kích thích ngoại sinhđược tạo ra do các chất ĐHST thực vật [65] Cảm ứng phát sinh phôi vô tính có tínhnăng kích hoạt lại chu kỳ tế bào trong các tế bào thực vật đã được biệt hóa, dưới tácđộng của các kích thích bên ngoài Từ đó, mở ra con đường chuyển từ loại tế bàosoma sang loại tế bào sinh phôi [67] Các kích thích này khởi động chương trình ditruyền dẫn đến thiết lập các dòng tế bào có kiểu gen phiên mã bị thay đổi, đầu tiên là

sự hình thành cấu trúc không đối xứng đỉnh – đáy Phôi vô tính trưởng thành giống