Ứng Dụng Nấm Men Lên Men Xylose Trong Sản Xuất Cồn Nhiên Liệu

Trong quá trình thủy phân sử dụng axit một lượng đáng kể các đường bị phân hủy và sản sinh những chất độc hại như furfuran đối với vi sinh vật trong công đoạn lên men tiếp theo [13, 14,

-o0o -

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGÀNH : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

ỨNG DỤNG NẤM MEN LÊN MEN XYLOSE TRONG

SẢN XUẤT CỒN NHIÊN LIỆU

NGUYỄN THANH THỦY

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ỨNG DỤNG NẤM MEN LÊN MEN XYLOSE TRONG

SẢN XUẤT CỒN NHIÊN LIỆU

NGÀNH : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

NGUYỄN THANH THỦY Người hướng dẫn khoa học: TS VŨ NGUYÊN THÀNH

HÀ NỘI - 2007

MỞ ĐẦU

Ethanol hay ethyl alcohol (cồn) là chất lỏng không màu, hoà tan trong nước, sôi

ở 78,32oC và có công thức hoá học là C2H5OH Ethanol có tác dụng diệt khuẩn mạnh, một ưu điểm của ethanol trong phạm vi ứng dụng diệt khuẩn là sau khi tác dụng, nó bốc hơi nhanh và không để lại dư lượng Ethanol cũng được dùng để nâng cao hiệu quả của các hoá chất khác Nó là một hoá chất cơ bản, quan trọng dùng trong các ngành công nghiệp hoá học và công nghiệp dược phẩm Đối với ngành công nghiệp thực phẩm, ethanol là một loại thành phần quan trọng để sản xuất các loại đồ uống như bia, vang, rượu mạnh Đặc biệt ngày nay, ethanol được coi là một nguồn nhiên liệu sạch, nhiên liệu của tương lai, sẽ có vị trí thay thế các nguồn nhiên liệu hoá thạch đang ngày càng cạn kiệt như than đá, dầu mỏ [2, 8] Chính vì thế, giải pháp ứng dụng cồn nhiên liệu là xu hướng tất yếu của thế giới [12]

Trên thực tế, việc sản xuất cồn có thể thực hiện dựa trên hai hướng chính: Công nghệ hyđrat hóa ethylen và theo phương pháp sinh học Trong đó, phương pháp sinh học với khả năng tận dụng các chất thải nông nghiệp như là nguồn nguyên liệu ban đầu cho quá trình lên men có một ưu thế vượt trội và đầy tiềm năng Quá trình này nếu được thực hiện sẽ có ý nghĩa to lớn về mặt thương mại cũng như tận dụng và xử lý được các chất thải từ các ngành công nghiệp mía đường, ngành công nghiệp giấy và các nguồn lignocellulose từ thiên nhiên Trong số các nguồn nguyên liệu sinh học cho sản xuất ethanol, nguồn nguyên liệu cellulose thực sự dồi dào và ít được khai thác [15]

Sản lượng sinh khối thực vật toàn cầu hàng năm vào khoảng 200 tỷ tấn, và 90% trong số đó là lignocellulose Khoảng 8-20 tỷ tấn trên thực tế có thể sử dụng để sản xuất ethanol Mặc dù đã có nhiều cố gắng nhưng việc sản xuất ethanol từ nguồn tài nguyên tái sinh này trên quy mô công nghiệp vẫn gặp nhiều khó khăn Sinh khối thực vật giàu lignocellulose là nguyên liệu phức tạp hơn nhiều so với tinh bột Thành phần chủ chốt của chúng bao gồm cellulose, hemicellulose và lignin gắn kết chặt chẽ với

nhau bởi những liên kết hydro và liên kết đồng hóa trị Để có thể sản xuất ethanol, các polymer sinh học này cần được phân huỷ thành đường đơn và sau đó hỗn hợp đường hexose (chủ yếu là glucose) và pentose (chủ yếu là xylose) sẽ được lên men thành ethanol [10] Có hai hướng tiếp cận vấn đề này, đó là thông qua thủy phân bằng axit

và thủy phân bằng enzyme [9, 11, 12] Công nghệ thủy phân bằng axit đã có từ trước Đại chiến Thế giới lần thứ II và được sử dụng rộng rãi trong thời kỳ này Trong quá trình thủy phân sử dụng axit một lượng đáng kể các đường bị phân hủy và sản sinh những chất độc hại (như furfuran) đối với vi sinh vật trong công đoạn lên men tiếp theo [13, 14, 16] Hiện nay, công nghệ thủy phân bằng axit không được nghiên cứu nhiều

do nó tương đối ổn định và khó có thể hạ được giá thành

Một khó khăn khác trong sản xuất cồn nhiên liệu từ lignocellulose liên quan tới khả năng lên men đường xylose (chiếm 20-30% lượng đường tạo ra) thành ethanol đó

là chủng nấm men Trong số hơn một nghìn loài nấm men được biết chỉ có 4 loài có

khả năng lên men xylose ở các mức độ khác nhau Hiện nay, nấm men Pachysolen

tannophilus đang được sử dụng trong lên men dịch thuỷ phân hemicellulose (sản phẩm

chủ yếu là xylose) để tạo thành ethanol Tuy nhiên nấm men P tannophilus không tích

luỹ được quá 2 % ethanol trong canh trường và điều này là hạn chế rất lớn trong sản xuất [9] Vì vậy, một trong những nhiệm vụ quan trọng trước mắt là tìm kiếm các chủng nấm men có khả năng lên men hiệu quả ethanol ở quy mô công nghiệp

Ở Việt Nam, lĩnh vực nghiên cứu ứng dụng cồn nhiên liệu đã bắt đầu được quan tâm trong những năm gần đây Để đáp ứng mục tiêu của nghiên cứu sản xuất cồn nhiên liệu là giải quyết được khâu chủ chốt trong toàn bộ quá trình sản xuất, điều này đồng nghĩa với việc giải quyết tốt những khó khăn trong quá trình thủy phân nguyên liệu ban đầu và tuyển chọn chủng giống cho công nghệ lên men ethanol Chính vì vậy mà chúng

tôi chọn đề tài nghiên cứu Ứng dụng nấm men lên men xylose trong sản xuất cồn

nhiên liệu

Nội dung nghiên cứu :

-Phân lập, tuyển chọn chủng giống lên men xylose

+ Phân lập và sàng lọc chủng giống có khả năng lên men xylose

+ Xác định đặc điểm sinh lý của các chủng lựa chọn

+ Định tên các chủng lựa chọn bằng giải trình tự gen 26S rDNA

-Xây dựng phương pháp xác định cồn bằng enzyme

+Tìm được công thức các chất cho một phản ứng enzyme trong kit ALCOTEST +Xây dựng đường chuẩn ethanol

-Tinh chế và thu hồi enzyme AOX và HRP để thay thế enzyme thương phẩm

tăng của nhu cầu năng lượng tương đương với việc phát hiện các mỏ mới thì trữ lượng dầu mỏ toàn cầu chỉ còn đủ cho nhân loại trong vòng 4 thập kỉ tới Hơn nữa việc sử dụng xăng dầu làm nhiên liệu đã thải vào không khí một lượng rất lớn khí nhà kính (thành phần chính là CO2) cũng như các khói bụi hữu cơ Hậu quả là làm nhiệt độ không khí trên trái đất đã tăng lên 0.6-0.8°C, mực nước biển dâng cao 15-20cm, và ô nhiễm môi trường Nếu không quyết tâm hành động thì trái đất sẽ có nguy cơ bị nóng lên thêm 2-3°C cũng như thiên tai, bão lũ, hạn hán và bệnh tật hiểm nghèo xuất hiện Chính vì những lý do cấp bách này mà nhiều quốc gia trên thế giới kể cả các nước có nguồn dầu khí lớn như Mỹ, Brazin, Ấn Độ, Trung Quốc… và các tập đoàn năng lượng

đã và đang chú trọng nghiên cứu và đưa vào ứng dụng các loại nhiên liệu sạch như nhiên liệu sinh học để thay thế xăng dầu Một trong những loại nhiên liệu sinh học đang được đầu tư phát triển đó là nhiên liệu cồn

Toàn thế giới năm 2002 đã sản xuất gần 33 triệu tấn cồn, trong đó 70% dùng làm nhiên liệu được phân bổ ở Châu Mỹ 65%, Châu Á 19%, Châu Âu 3%, các lục địa

khác 13% Brazil là nước tiên phong sử dụng cồn thay xăng cách đây gần 40 năm Ở

Mỹ đến nay đã có 20 nhà máy sản xuất cồn với công suất khoảng 13 triệu tấn Ấn Độ

là nước dẫn đầu Châu Á sử dụng cồn làm nhiên liệu, chính phủ Ấn Độ dự kiến đầu tư khoảng 4 tỷ USD để xây dựng các nhà máy sản xuất cồn nhiên liệu Trung Quốc đã sử dụng cồn thay xăng ở 5 thành phố lớn (Trịnh Châu, Lạc Dương, Cáp Nhĩ Tân, Hắc Long Giang, Triều Đông) với các nhà máy có công suất từ 200.000 - 800.000 tấn/năm

Ở Đông Nam Á như Thái Lan, Inđônêxia, Malayxia đã phát triển công nghệ sản xuất cồn dùng thay xăng Thái Lan đã thành lập ủy ban Cồn Quốc gia để nghiên cứu phát triển dạng nhiên liệu sinh học này, thay cho dầu diesel Năm 1981, đã có Pilot đầu tiên

để sản xuất thực nghiệm cồn (99,5%), đến năm 1985 đã thiết lập một số trạm phân phối

2 dạng nhiên liệu sinh học Gasohol (thay xăng) và Diesohol (thay diesel) ở ngoại ô Băngcốc Năm 2004, nước này đã sản xuất trên 280.000 m3 cồn, đầu tư thêm 20 nhà máy để năm 2015 có trên 2,5 triệu m3cồn dùng làm nhiên liệu

Ở Việt Nam cho đến nay cồn sản xuất ra hầu hết chỉ sử dụng cho ngành công nghiệp đồ uống và hoá chất Một số nhà máy sản xuất cồn với công suất lớn là: Công

ty Rượu Hà Nội có công suất thiết kế 10 triệu lít cồn/năm và Công ty Rượu Bình Tây (thành phố Hồ Chí Minh) với công suất thiết kế 20 triệu lít cồn/năm Ngoài ra cả nước

có 26 doanh nghiệp Nhà nước và tư nhân sản xuất rượu cồn tại các địa phương như: Công ty Cổ phần Rượu Đồng Xuân (Phú Thọ) với công suất thiết kế 0,6 triệu lít cồn/năm, nhà máy cồn Tam Hiệp (Hà Tây), nhà máy Đường - Giấy - Rượu Hưng Nhân (Thái Bình) v.v Sản lượng cồn vào những năm 80 của thế kỉ trước mới đạt được 30 triệu lít/ năm Đến năm 2005 đạt khoảng 50 triệu lít/ năm

Nhận thấy tầm quan trọng của nguồn nhiên liệu sinh học này đối với an ninh năng lượng Quốc gia, ngày 09/3/2007 ngành dầu khí Việt nam đã ký kết hợp đồng hợp tác đầu tư xây dựng nhà máy sản xuất cồn từ sắn lát với Tập đoàn Itochu (Nhật Bản), trên khu đất 30 ha tại Khu Công Nghiệp Hiệp Phước Nhà máy có công suất là 100.000

tấn sản phẩm/năm với tổng mức đầu tư ban đầu khoảng 80-100 triệu USD Sản phẩm Cồn của nhà máy sẽ được pha chế với xăng thương phẩm theo tỷ lệ 10% cồn và 90% xăng để tạo ra 1 hỗn hợp nhiên liệu mới với tên gọi “Xăng E10” [1, 2, 19]

1.2 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CỒN NHIÊN LIỆU

Hai phương pháp chính để sản xuất cồn nhiên liệu đó là phương pháp hydrat hoá etylen dầu mỏ bằng xúc tác axit và bằng phương pháp sinh học thông qua quá trình lên men Trong đó, phương pháp sinh học là phổ biến hơn cả Nguyên tắc của phương pháp sinh học đó là các hydrat cacbon trong nguyên liệu tinh bột và cellulose phải được thủy phân thành đường đơn, tiếp đến là quá trình lên men đường thành rượu và cuối cùng là quá trình chưng cất rượu thành cồn Tùy thuộc nguồn nguyên liệu sử dụng

mà công đoạn thuỷ phân hydrat cacbon ban đầu có khác nhau Có ba nguồn nguyên liệu chính để sản xuất cồn là nguyên liệu chứa đường (nước mía ép, rỉ đường mía, rỉ đường củ cải…), nguyên liệu chứa tinh bột (ngô, khoai, sắn…) và nguyên liệu chứa cellulose (rơm, rạ, thân ngô, bã mía …) [19]

1.2.1 Công nghệ sản xuất cồn từ đường

Đường mía là nguyên liệu giàu saccaroza Brazil là nước dẫn đầu về sản xuất cồn nhiên liệu từ đường mía Hiện nay, ở Brazil có trên 60.000 đồn điền trồng mía với 6,5 triệu ha và trên 4 nhà máy sản xuất đường, cồn [18, 19]

Công nghệ sản xuất cồn từ mía là đơn giản nhất, mía sau khi ép dịch được tiếp men giống và lên men Tuy nhiên, mía là cây công nghiệp quan trọng là nguyên liệu chính của công nghiệp sản xuất đường và sản lượng hạn chế

Ngoài nước ép mía, rỉ đường - phụ phẩm của công nghệ sản xuất đường, cũng là một nguồn nguyên liệu được sử dụng phổ biến để sản xuất cồn Rỉ đường thường chiếm từ 3-5% so với lượng mía đưa vào sản xuất và tỷ lệ này phụ thuộc vào chất

lượng mía và công nghệ sản xuất Trước khi đưa vào lên men, mật rỉ phải được xử lý

axit để loại bỏ các tạp chất, cặn can xi, các chất phi đường giúp cho quá trình lên men cũng như chưng cất sau này được thuận lợi

Theo số liệu của Tổng công ty mía đường Việt Nam, đến năm 2000 đã có 40 nhà máy đường đi vào hoạt động với tổng công suất khoảng 12 triệu tấn mía Nếu tỷ lệ mật rỉ chiếm 3% thì các nhà máy này sẽ thải ra 420.000 tấn Từ 1 tấn mật rỉ chúng ta có thể thu được 300 lít cồn 100% (v/v) [3 ]

1.2.2 Công nghệ sản xuất cồn từ tinh bột

- Thủy phân tinh bột: Nguyên liệu chứa tinh bột như: Ngô, khoai, sắn, gạo hoặc tấm,

đầu tiên phải được chuyển hoá thành đường lên men (glucose) nhờ hoạt động của enzym λ amylaza và β amylaza có sẵn trong hạt nảy mầm, hoặc được tổng hợp từ vi sinh vật dưới dạng enzym thương phẩm

- Lên men: Tiếp đến là quá trình lên men nhờ nấm men Saccharomyces cerevisiae với

phản ứng hóa học tổng quát như sau:

C6H12O6 → 2 CH3CH2OH + 2CO2 + Q

Thông thường nấm men tích lũy khoảng 4-8% rượu trong dịch lên men, nhưng nồng độ

của rượu trong sản phẩm cuối cùng có thể tăng lên nhờ quá trình chưng cất

- Chưng cất: Hiện nay, ở Việt nam công nghệ chưng cất cồn đã khá hoàn thiện với độ

cồn lên tới 99% Việc tinh chế cồn 96% thành cồn tuyệt đối sử dụng rây phân tử cũng

đã được nhiều nơi quan tâm nghiên cứu và chuẩn bị đưa ra ứng dụng

Có thể nói công nghệ sản xuất cồn từ rỉ đường mía và từ tinh bột cho đến nay là khá hoàn thiện, hơn nữa nguồn nguyên liệu tinh bột và đường mía là những sản phẩm nông nghiệp quan trọng với số lượng hạn chế, trong khi đó nguồn nguyên liệu cellulose

từ phế phụ phẩm nông nghiệp khá dồi dào vẫn chưa được sử dụng Vì vậy, việc nghiên cứu, hoàn thiện công nghệ sản xuất cồn từ nguồn nguyên liệu cellulose sẽ rất có ý nghĩa cả trong thời điểm hiện tại và trong tương lai [3]

1.2.3 Công nghệ sản xuất cồn từ nguyên liệu chứa cellulose

Trong số những nguồn nguyên liệu sinh học có thể sử dụng cho sản xuất ethanol, nguyên liệu cellulose thực sự dồi dào và ít được khai thác Sản lượng sinh khối thực vật toàn cầu hàng năm vào khoảng 200 tỷ tấn, và 90% trong số đó là lignocellulose Có khoảng 8-20 tỷ tấn trên thực tế có thể sử dụng để sản xuất ethanol Sinh khối thực vật giàu lignocellulose là nguyên liệu phức tạp hơn nhiều so với tinh bột Thành phần chủ chốt của chúng bao gồm cellulose, hemicellulose và lignin gắn kết chặt chẽ với nhau bởi những liên kết hydro và liên kết đồng hóa trị Để có thể sản xuất ethanol, các polymer sinh học này cần được phân huỷ thành đường đơn và sau đó hỗn hợp đường hexose (chủ yếu là glucose) và pentose (chủ yếu là xylose) sẽ được lên men thành ethanol Việc thủy phân lignocellulose theo con đường hóa học và enzyme đều không đơn giản Ngoài ra, trong quá trình thủy phân sử dụng axit (một công đoạn không thể thiếu trong các công nghệ hiện có) còn phân hủy một lượng đáng kể các đường tạo thành (tới 60% tùy theo chế độ thủy phân) và sản sinh những chất độc hại như furfuran đối với vi sinh vật trong công đoạn lên men tiếp theo Bản thân việc lên men đường xylose (chiếm 20-30% lượng đường tạo ra) thành ethanol cũng gặp nhiều khó khăn bởi có rất ít các chủng vi sinh vật có khả năng thực hiện công đoạn này một cách hiệu quả

Công đoạn chủ chốt trong sản xuất cồn nhiên liệu từ biomass là thủy phân nguyên liệu thành đường Hiện nay có hai hướng thủy phân chính đó là thủy phân bằng axit và thủy phân bằng enzym Công nghệ thủy phân bằng axit đã có từ trước Đại chiến Thế giới lần thứ II và cho đến nay không được nghiên cứu nhiều do công nghệ của nó không có tính kinh tế cao Có hai dạng công nghệ thủy phân bằng axit đó là thủy phân bằng axit đặc và thủy phân bằng axit loãng Trong những năm gần đây, với rất nhiều thành tựu của công nghệ sinh học, việc sản xuất các enzym thương phẩm đã có những bước tiến rất mạnh Các sản phẩm enzym đa dạng về chủng loại với hoạt tính enzym

cao Dẫn đầu trong lĩnh vực sản xuất enzym thương mại phải kể đến là hãng Novo (Đan mạch) Một số ưu điểm của công nghệ thủy phân bằng enzym là tốc độ phản ứng

nhanh, điều kiện phản ứng đơn giản và có tính chuyên hóa cao

1.2.3.1 Cấu tạo thành tế bào thực vật

Để thủy phân các loại sinh khối thực vật đạt hiệu quả cao, để có thể đưa ra được các quy trình công nghệ phù hợp, việc tìm hiểu cấu tạo thành tế bào của thực vật là rất cần thiết

Thành tế bào thực vật có chức năng quan trọng trong việc duy trì hình dạng tế bào, tạo độ bền cấu trúc và cơ học cho tế bào, bảo vệ tế bào chống lại những mầm bệnh

và các tác động môi trường bên ngoài

Hình 1.1 Cấu trúc thành tế bào thực vật

Thành phần hóa học chính của thành tế bào sơ cấp là cellulose (ở dạng sợi siêu

vi, hình 1), glycan liên kết chéo (hemicellulose) và pectin Pectin và glycan liên kết chéo là hai loại polysaccarit mạch nhánh được tổ chức trong cùng một mạng lưới với

các sợi cellulose siêu nhỏ Các glycan liên kết chéo có tác dụng làm tăng độ bền của cellulose, trong khi pectin giúp thành tế bào chống chịu lại được sức nén Thêm vào đó,

người ta còn tìm thấy trong thành tế bào sơ cấp một lượng nhỏ protein Chủ yếu là các glycoprotein giàu nhóm hydroxyproline, arabinogalactan protein, các protein giàu glycine và các protein giàu proline Người ta cho rằng, một số protein này có khả năng làm tăng sức bền cơ học của tế bào, một phần của các protein này là thành phần của một số enzym khơi mào các phản ứng tạo thành, kết cấu lại hoặc cắt giảm các mạng cấu trúc của thành tế bào thực vật

Thành tế bào thứ cấp của thực vật thường hình thành bên trong thành tế bào sơ cấp khi tế bào đã hoàn thiện Thành tế bào thứ cấp có thành phần cấu tạo gần giống với thành phần cấu tạo của thành tế bào, thêm vào đó thường thấy có thêm một số chất khác như cutin, suberin và đặc biệt là lignin- một nhóm polyme của alcohol thơm Lignin cứng, và tạo độ bền đáng kể cho cấu trúc của thành thứ cấp Lignin cung cấp những đặc tính thuận lợi của gỗ tới các tế bào sợi của các mô gỗ Lignin cũng làm cho thành tế bào thực vật ít bị tổn thương hơn khi bị nấm hay vi khuẩn tấn cống

Cuối cùng là một lớp khá đặc biệt, liên kết các thành tế bào của thực vật lại với nhau, và đôi khi được cho là một thành phần thêm vào của chúng Đó chính là phiến mỏng ở giữa, hay còn gọi là màng gelatin (Hình 1) Nó giàu pectin, chủ yếu là magiê

và canxi pectat Nó được các tế bào dùng chung với nhiệm vụ gắn chặt chúng lại với nhau [14, 20]

1.2.3.2 Nguyên liệu bã mía

Việt Nam là một nước nông nghiệp, phế phụ phẩm nông nghiệp thải ra hàng năm rất lớn Trong số các loại phế phụ phẩm nông nghiệp, thì bã mía là loại nguyên liệu có sản lượng lớn và dễ thu gom hơn cả Hàng năm, các nhà máy đường tiêu thụ khoảng 10-12 triệu tấn mía cây, ứng với nó là khoảng 2.5 triệu tấn bã mía, đây sẽ là

một nguồn nguyên liệu dồi dào cho sản xuất cồn

Cũng như các loại thực vật khác thì cây mía cũng có cấu tạo thành tế bào như trên Thành phần chủ yếu của bã mía gồm cellulose, hemicellulose, lignin, ngoài ra còn

có protein, cutin, suberin….[4, 20]

Bảng 1.1 Hàm lượng phần trăm các thành phần cấu tạo của bã mía

Thành phần Hàm lượng (%) Cellulose 39.2

Hemicellulose 19.7 Lignin 17.8 Protein 1.5 Các chất khác 21.8

Hình 1.2 Cấu tạo của Cellulose

Hình 1.3 Cấu tạo của Hemicellulose

Hình 1.4 Cấu trúc của lignin

1.2.3.3 Các công đoạn sản xuất cồn nhiên liệu từ cellulose

Hình 1.5 Qui trình s ản xuất cồn từ cellulose

- Quá trình tiền xử lý

Quá trình tiền xử lý thường bao gồm các công đoạn: Rửa, cắt hoặc xay nhỏ để đưa nguyên liệu về kích thước phù hợp, thuận lợi cho phản ứng và xử lý với dung môi kết hợp với áp suất và nhiệt độ Như đã biết, thành phần bã mía chủ yếu là cellulose, hemicellulose và lignin Lignin chiếm từ 15-20% thành phần bã mía Nó không những

Cắt/nghiền

nhỏ

Quá trình tiền xử lý

Thuỷ phân cellulose bằng

Sản xuất enzym

Xử lý

bã thải rắn

Quá trình lên men cồn

Quá trình chưng cất

không thể chuyển hoá được thành cồn mà còn gây khó khăn cho quá trình thuỷ phân và lên men Chính vì vậy việc xử lý nguyên liệu bằng dung môi trong quá trình tiền xử lý rất quan trọng Nó nhằm mục đích tách lignin cũng như các thành phần cản trở khác

có trong bã mía ra khỏi cấu trúc khiến cho enzym dễ dàng tiếp xúc với cellulose trong quá trình thuỷ phân cũng như làm cho quá trình lên men diễn ra thuận lợi và triệt để

hơn

Hiện nay, có ba phương pháp tiền xử lý phổ biến để xử lý các phế phụ phẩm nông nghiệp Đó là phương pháp xử lý bằng axít loãng, kiềm loãng và xử lý bằng nước kết hợp với nhiệt độ cao Tuỳ vào đặc điểm của từng loại nguyên liệu mà chọn được

phương pháp tiền xử lý thích hợp nhất [10, 12, 13]

- Quá trình thuỷ phân bằng enzym

Bốn phương pháp chuyển hoá cellulose thành đường có thể lên men đó là thuỷ phân bằng axít đặc, thuỷ phân bằng axit loãng, nhiệt hoá và thuỷ phân bằng enzym Hai phương pháp thuỷ phân bằng axit đặc và loãng được người Đức xây dựng và đưa vào sử dụng trên quy mô thương mại từ những năm 30, 40 của thế kỉ trước với axit sử dụng là H2SO4 Hai phương pháp này đều dựa trên cơ sở sử dụng axit phá huỷ liên kết hidro giữa các mạch cellulose và chuyển chúng sang trạng thái vô định hình Sau khi cấu trúc tinh thể bị phá vỡ, cellulose sẽ hình thành trạng thái gelatin với axit và trở nên mẫn cảm với phản ứng tự thuỷ phân Khi pha loãng với nước và dưới tác dụng của nhiệt, cellulose sẽ nhanh chóng bị thuỷ phân thành glucose Mặc dù với hai công nghệ này có thể cho phép ta thu được lượng cồn với hiệu suất tốt, chúng chỉ thực sự thích hợp trong những thời điểm bắt buộc khi không tính toán nhiều đến mặt giá trị kinh tế [2, 15]

Hiện nay hướng sử dụng enzym trong việc sản xuất cồn từ các loại nguyên liệu cellulose được tập trung nghiên cứu rộng hơn cả vì nó hứa hẹn sẽ đem lại nhiều đột phá

về mặt công nghệ

Quá trình thuỷ phân cellulose thành đường bằng enzym dựa trên khả năng phân cắt mạch cellulose của enzym, làm cho mạch cellulose tách thành các mạch nhỏ hơn, sau đó tiếp tục bị phân cắt nữa và trở thành các loại đường

Quá trình thuỷ phân cellulose thành đường bằng enzym có vai trò then chốt

trong việc sản xuất cồn

- Quá trình lên men cồn

Hiện nay trên thế giới tồn tại hai công nghệ liên quan tới việc thuỷ phân và lên men Đó là công nghệ lên men sau khi đã thủy phân (Separate hydrolysis and fermentation, SHF) và công nghệ thủy phân và lên men diễn ra đồng thời (Simultaneous saccharification and fermentation, SSF) Ưu điểm của công nghệ SHF là quá trình thuỷ phân bằng enzym được diễn ra trong các điều kiện tối ưu, nên hiệu quả thủy phân thường cao Theo công nghệ này quá trình lên men diễn ra sau khi quá trình thuỷ phân được kết thúc Do đó hàm lượng đường trong dịch thủy phân khá cao nên thường ức chế ngược trở lại ảnh hưởng đến hiệu suất của toàn bộ quá trình [12]

Đối với công nghệ SSF là công nghệ mà sự thuỷ phân và lên men diễn ra đồng thời Theo một số tác giả công bố thì công nghệ SSF đã tỏ rõ một số ưu việt về hiệu suất chuyển hoá Tuy nhiên phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm về sự khác biệt nhiệt độ thích hợp giữa hai quá trình lên men và thuỷ phân Để giải quyết vấn

đề này cần phải đánh giá dựa trên so sánh hiệu quả việc sử dụng hai phương pháp Một trong những khả năng sẽ được xem xét là tìm một biện pháp trung gian kết hợp cả hai công nghệ, theo đó quá trình thuỷ phân trong giai đoạn đầu sẽ được thực hiện ở nhiệt

độ cao (50ºC - 60ºC) sau đó khi nồng độ đường đạt mức nhất định sẽ chuyển về nhiệt

độ thích hợp cho nấm men (30ºC - 35ºC) và tiến hành đồng thời cả hai quá trình thủy phân và lên men đồng thời

Trong giới hạn của đề tài này, chúng tôi sử dụng phương pháp SSF để tận dụng được sự thuỷ phân triệt để và hiệu suất chuyển hoá thành cồn cao của nấm men Còn

việc so sánh và lựa chọn công nghệ nào tối ưu cho sản xuất cồn sẽ được nghiên cứu tiếp trong thời gian tới

- Nấm men sử dụng trong lên men cồn nhiên liệu

Trong nhóm các loại vi sinh vật sinh ethanol, nấm men Saccharomyces

cerevisiae là vi sinh vật có ứng dụng rộng rãi nhất S cerevisiae có khả năng tích lũy tới 18% ethanol trong các môi trường có thành phần tương đối đơn giản Nấm men S

cerevisiae có thể lên men nhiều đường đơn như glucose, galactose, đường đôi như

sucrose hoặc đường ba như raffinose Chủng nấm men S cerevisiae được sử dụng khá

phổ biến để lên men các dịch thủy phân có chứa đường glucose Trong nghiên cứu này,

chủng nấm men S cerevisiae CNTP Y7028 sẵn có trong bộ sưu tập giống Vi sinh vật

CNTP của Viện Công nghiệp Thực phẩm được sử dụng

Hình 1.6 Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng nấm men

Saccharomyces cerevisiae

1.3 CƠ CHẾ CHUYỂN HOÁ CELLULOSE NHỜ VI SINH VẬT

1.3.1 Cellulose và cơ chế chuyển hóa

1.3.1.1 Thành phần cấu trúc cellulose

Cellulose là thành phần cơ bản của tế bào thực vật, chiếm khoảng 30% hàm lượng chất khô, cellulose liên kết với lignin và hemicellulose tạo nên độ cứng cho thành tế bào

Về mặt cấu trúc hóa học, cellulose là một polysaccarit mạch thẳng gồm 1400 đến 1200 gốc β-D-glucopyranoza được nối với nhau qua liên kết β-1,4-glucozit tạo thành dạng chuỗi (đơn vị cấu trúc chính là cellobiose gồm hai đơn vị glucose) Trong phân tử cellulose, các gốc β-D-glucose có cấu tạo hình ghế và quay một góc 180° với nhau, do đó các nhóm hydroxyl (-OH) đều nằm trên mặt phẳng nằm ngang Mức độ polyme hóa của phân tử cellulose thay đổi nhiều (từ vài trăm đến 15.000) trung bình là

3000 Tùy theo từng loại thực vật mà các phân tử cellulose có khối lượng phân tử rất khác nhau (từ 50.000 đến 2.500.000) [8,15]

Nhờ phương pháp phân tích bằng tia Rơnghen người ta biết rằng cellulose có cấu tạo sợi, các chuỗi cellulose có đường kính khoảng 3nm kết hợp với nhau tạo thành

vi sợi có đường kính 10 - 40 nm Các vi sợi lại liên kết với nhau bằng các liên kết hydrro và liên kết vanderwalls tạo thành những bó nhỏ gọi là các microfibrin có cấu trúc không đồng nhất, gồm hai vùng:

- Ở vùng kết tinh có cấu trúc trật tự rất cao, cấu trúc sợi dày đặc và chặt chẽ, chiếm khoảng 3 /4 cấu trúc cellulose vì thế nó rất bền vững với những tác động bên ngoài

- Ở vùng vô định hình có cấu trúc xốp, không chặt chẽ bằng vùng kết tinh, do đó

nó kém bền vững và dễ bị tác động hơn Vùng này có thể hấp thụ nước và trương nở tạo điều kiện cho enzym cellulase dễ dàng tấn công

Ở vùng kết tinh enzym chỉ có thể tác dụng lên bề mặt của các sợi [15,30,32] Các sợi microfibrin có chiều rộng khoảng 100-300 A° (1A° = 10-7 mm) và chiều dài khoảng 40-100 A°, được bao bọc bởi lignin và hemicellulose

1.3.1.2 Cơ chế phân giải cellulose

Cellulose là một cơ chất rất khó chuyển hóa và chuyển hóa rất chậm trong điều kiện tự nhiên Cellulose là một trong những hợp chất tự nhiên khá bền vững về mặt cơ học, không tan trong nước mà chỉ có thể bị trương lên do hấp thụ nước Cellulose không được tiêu hóa trong bộ máy tiêu hóa của người và các động vật có dạ dày một túi Tuy nhiên, trong dạ dày của các động vật nhai lại, trong đất và trong các nguồn nguyên liệu chứa cellulose có rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng sản sinh enzym cellulase xúc tác cho quá trình thủy phân cellulose, hoặc có thể bị phân hủy khi đun nóng với axit hoặc kiềm ở nồng độ khá cao

Trong tế bào thực vật, cellulose liên kết chặt chẽ với hemicellulose (một loại

hetepolyme chứa nhiều loại monosaccarit như galactoza, manoza, glucose, xitose, arabinose…), với pectin (hợp chất polyme của axit D-galacturonic), với lignin (homopolyme của N-axetylglucozamin) Điều này ảnh hưởng rất nhiều đến sự phân hủy cellulose của enzym Chỉ trong một số trường hợp (ví dụ trong sợi bông) cellulose mới tồn tại trong trạng thái một polyme gần tinh khiết Chính vì vậy, dể có thể phân giải được cellulose tự nhiên cần phải có sự kết hợp giữa các enzym trong phức hệ emzym

♣ Hệ enzym cellulase [10,14,16]

Cellulose bị thủy phân bởi một phức hệ enzym gồm ba loại enzym sau:

♦ endo-β-glucanase( 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase, EC 3.2.1.4 Enzym này thuỷ phân liên kết β-1,4-glucozit một cách ngẫu nhiên để giải phóng ra cellodextrin, cellobiose và glucose Enzym này phân giải một cách mạnh mẽ các cellulose hoà tan (vô định hình), nhưng lại tác động yếu trên cellulose kết tinh và không phân giải được cellulose Chính nhờ sự phân giải ngẫu nhiên của endo-cellulase đã tạo ra các đầu không khử tạo điều kiện cho enzym cellobiohydrolase hoạt động dễ dàng

♦ exo-β-glucanase (1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase, EC 3.2.1.91) Enzym này tấn công chuỗi cellulose từ đầu không khử và giải phóng ra các cellobiose Enzym này không thuỷ phân cellulose kết tinh cũng như cellulose hoà tan nhưng thuỷ phân được cellulose đã bị cắt ngắn mạch, vai trò chính của enzym này là giúp cho enzym endo-cellulase tác động lên cellulose tinh thể

♦ β-glucozidase (cellobiase, EC 3.2.1.21) Enzym này thuỷ phân cellobiose và các cello-oligosacarit mạch ngắn thành glucose Enzym này không phân giải cellulose hoặc các celodextrin cao hơn

♣ Cơ chế phân giải

Cellulase là một hệ enzym phức tạp xúc tác thủy phân cellulose thành cellobiose

và cuối cùng thành glucose Sự phân giải cellulose dưới tác dụng của hệ enzym cellulase xảy ra theo ba giai đoạn chủ yếu sau:

- Giai đoạn một : dưới tác dụng của tác nhân C1, cellulose nguyên thể chuyển thành cellulose hòa tan Người ta cho rằng tác nhân C1 gây ra sự biến đổi cellulose trong giai đoạn này không phải là enzym mà là bao gồm một số tác nhân nào đó đặc trưng của môi trường có vi sinh vật phát triển Thực chất vấn đề này cho đến nay vẫn chưa được giải thích rõ

- Giai đoạn hai : cellulose (đã biến đổi sau giai đoạn 1) bị thủy phân dưới tác dụng xúc tác của hệ enzym thủy phân Cx tạo thành đường cellobiose Enzym Cx còn gọi là enzym β-1,4-glucanase Chữ x cho ta biết dây là loại enzym có nhiều thành phần khác nhau Người ta thường chia làm hai loại: exo-β-1,4-glucanase và endo-β-1,4-glucanase

♦ Exo-β-1,4-glucanase xúc tác quá trình tách ra một cách liên tiếp các đơn vị glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose

♦ Endo-β-1,4-glucanase có khả năng phân cắt liên kết β-1,4-glucozit ở bất kỳ chỗ nào bên trong chuỗi cellulose phân tử

Các tác giả Ogawa và Toyama (1967) cho rằng còn có một enzym khác có tác dụng trung gian giữa C1 và Cx đó là enzym C2 Enzym này tác động vào các cellulose

đã bị C1 làm trương lên và thủy phân chúng thành những cellodextrin hòa tan Enzym

Cxsẽ tiếp tục thủy phân các loại cellodextrin này thành cellobiose

Để xác định hoạt tính enzym C1 người ta thường sử dụng các loại cellulose tự nhiên (nhất là sợi bông thấm nước), còn để xác định hoạt tính enzym Cx người ta thường sử dụng CMC (cacboxyl metyl-cellulose)

- Giai đoạn ba: dưới tác dụng của enzym β-glucozidase, đường cellobiose bị thủy phân thành glucose Enzym β-glucozidase là những enzym rất đặc hiệu, β-glucozidase làm thủy phân cellobiose thành cellohexoza (D-glucose)

Có thể nêu lên cơ chế tác dụng của cellulase theo các tác giả khác nhau như sau:

♦ Theo Mandels và Reese (1964)

Cellulose cellulose cellobiose glucose

phản ứng

C1 Cx β-glucosidase

♦ Theo Ogawa và Toyama (1967)

cellulose cellulose sản phẩm cellobiose glucoza

bị trương hòa tan

C1 C2 Cx β-glucozidase

♦ Theo King (1965)

Cellulose vô định hình Endo-glucanase

Enzym cellulase thường được tổng hợp mạnh mẽ ở các giống nấm mốc như

Aspergillus, Penicillium, Trichoderma…, nhiều vi khuẩn và xạ khuẩn cũng có khả năng tổng hợp cellulase cao

Trong khoảng vài chục năm gần đây, nhiều nước trên thế giới đã chú trọng nghiên cứu sản xuất các chế phẩm cellulase nhằm phân giải cellulose là loại nguyên liẹu rất dồi dào trong tự nhiên

1.3.2 Hemicellulose và cơ chế chuyển hóa

1.3.2.1 Thành phần và cấu trúc

Trong tế bào thực vật, hemicellulose đứng thứ hai về khối lượng Trong thành phần của hemicellulose có nhiều loại đường khác nhau Chính vì vậy tên của chúng thường được gọi theo một loại đường chủ yếu có trong thành phần của chúng

Khối lượng phân tử của hemicellulose nhỏ hơn và cấu trúc đơn giản hơn rất nhiều so với cellulose Thông thường chúng có khoảng 150 gốc đường đơn, các gốc đường này nối với nhau bằng liên kết β-1,3; β-1,4; β-1,6 glucozit Các hemicellulose thường tạo thành mạch ngắn và phân nhánh So với cellulose thì hemicellulose có cấu trúc không chặt chẽ, chúng dễ bị phân giải dưới tác dụng của kiềm hoặc axit loãng, thậm chí trong nước nóng Hemicellulose rất dễ bị hemicellulase tác dụng

1.3.2.2 Cơ chế phân giải hemicellulose

♣ Hệ enzyme hemicellulase

Khi nghiên cứu hemicellulose, người ta thấy chúng có cấu tạo rất giống với cellulose nên nhiều tác giả cho rằng enzyme hemicellulase cũng có những tính chất tương đồng với cellulase Tuy nhiên nhiều tác giả cũng cho thấy giữa hemicellulase và cellulase có những điểm khác biệt Hemicellulase có phân tử nhỏ hơn, cấu trúc đơn giản hơn cellulase

Trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật, hemicellulase thường được tạo thành sớm hơn Trong tự nhiên, quá trình phân hủy hemicellulose thường xảy ra song song với cellulose

♣ Cơ chế phân giải

Sự thủy phân hemi cellulose trong giai đoạn đầu thường rất nhanh, sau đó chậm dần, có lẽ là do cấu trúc không đồng đều của hemicellulose

Enzyme hemicellulase là enzyme ít người nghiên cứu, ngoại trừ enzyme xylanase vì xylan là một hemicellulose rất phổ biến trong tự nhiên Các tác giả cho

rằng quá trình sinh tổng hợp xylanase diễn ra đồng thời với quá trình tổng hợp cellulase

Các nhóm vi khuẩn sinh tổng hợp hemicellulose như: Bacillus, Bacteriodes,

Clostridium…

Các nhóm nấm như Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Mycothecium,

Rhizopus…

Ngoài ra còn có các xạ khuẩn như: Streptomyces

1.4 VI SINH VẬT PHÂN GIẢI CELLULOSE

Cellulose là thành phần cấu tạo cơ bản của thành tế bào thực vật, là hợp chất khá bền vững Phân giải cellulose có vai trò đặc biệt quan trọng trong vòng tuần hoàn cacbon Trong tự nhiên, hệ vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose vô cùng đa dạng

và phong phú Nhiều loài nấm và vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose rất mạnh

mẽ, được thực hiện cả trong điều kiện hiếu khí và kị khí, trong môi trường kiềm hay axit, ở độ ẩm thấp hoặc cao và ở các nhiệt độ khác nhau (ưa ấm, ưa nhiệt) Trong điều kiện hiếu khí, các loại nấm phân hủy cellulose mạnh hơn rất nhiều so với vi khuẩn Nhưng trong điều kiện yếm khí thì các loại vi khuẩn lại có khả năng phân giải nổi trội hơn các loại nấm sợi Nhiều vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose thuộc loại dị dưỡng hóa năng hữu cơ Chúng hình thành các enzyme cellulase phân giải cellulose thành cellobiose, glucose và sử dụng các hợp chất sinh ra làm nguồn cacbon và nguồn năng lượng

Cellulase là một phức hệ enzyme rất phức tạp Các vi sinh vật thường không có khả năng tạo được tỷ lệ giữa các hợp phần của enzyme một cách cân đối Có loài tạo được nhiều enzyme này, có loài tạo được nhiều enzyme khác Chẳng hạn như vi khuẩn thường không có khả năng sinh tổng hợp exo-glucanase, trong khi đó đa số các loại nấm lại có khả năng này, mặc dù là khả năng đó khác nhau

Trong quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ giàu cellulose, nấm và vi khuẩn tạo ra các sản phẩm sinh khối, khí CO2 hoặc CH4 và các sản phẩm phụ khác Đáng kể nhất là những loài sau: [3,27,34]

1.4.1 Nấm mốc (nấm sợi)

Nấm sợi là nhóm có khả năng tiết ra ngoài môi trường một lượng lớn enzyme cellulase hoàn chỉnh, đầy đủ các thành phần nên có thể phân giải cellulose rất mạnh mẽ

và triệt để

Trong số các loại nấm sợi có khả năng thủy phân nguyên liệu thực vật, nấm mốc

Trichoderma reesei được quan tâm nhiều hơn cả Nấm mốc T reesei có khả năng sinh

một loạt các enzyme phân hủy lignocellulose thành đường và các cấu thành khác

Một số loài nấm khác cũng có hoạt tính phân giải cellulose khá cao như :

Aspergillus niger, Aspergillus wenttii, Fusarium solani, Fusarium lini, Penicillium fumiculosum, Penicillium inophinum, Sporotrichum pulverulentum, Sclevotium rolfsii

Một số nghiên cứu cho thấy, các loại nấm ưa nhiệt như Chaetormium

thermophile có khả năng tổng hợp được cả Exo-glucanase, Endo-glucanase, glucosidase là những enzym bền nhiệt, có thể giữ được hoạt tính ở 77°C trong 1/2 giờ

β-và ở 58°C trong 10 giờ Chúng phát triển ở nhiệt độ tối ưu là 45-50°C, nhiệt độ tối thiểu là 27°C với pH=5

1.4.2 Vi khuẩn

Vi khuẩn là nhóm vi sinh vật được quan tâm nghiên cứu nhiều Nó có khả năng phân giải cellulose mạnh nhưng cường độ không bằng nấm do lượng enzym tiết ra môi trường ít hơn và các thành phần của enzym không đầy đủ Có rất ít vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp đầy đủ 3 loại enzym cellulase, do đó để có thể phân giải cellulose

tự nhiên thì phải phối hợp các loài vi khuẩn lại với nhau để cùng phân giải trong mối quan hệ hỗ sinh

Từ thế kỷ 19, các nhà khoa học đã nghiên cứu và nhân thấy một số vi sinh vật

kỵ khí có khả năng phân giải cellulose Những năm đầu thế kỷ 20, người ta đã phân lập được các vi khuẩn hiếu khí cũng có khả năng này, trong đó niêm vi khuẩn là quan trọng nhất Chúng có dạng hình que nhỏ bé, có thành tế bào mỏng, bắt màu thuốc

nhuộm kém, đáng chú ý là các giống Cytophaga, Sporocytophaga, Soragium Ngoài ra còn thấy các loại thuộc giống Cellvibrio cũng có khả năng phân giải cellulose Các

niêm vi khuẩn chỉ thủy phân cellulose khi tiếp xúc trực tiếp với chúng [3,4]

Trong điều kiện yếm khí, các loại vi khuẩn ưa ấm và ưa nhiệt cũng có khả năng phân giải cellulose Đại diện điển hình cho các vi khuẩn ưa ấm phân giải cellulose ở nhiệt độ 30-40°C là loài Clostridium omelanskii, vi khuẩn ưa nóng là loài Clostridium thermocellum và Bacillus dellulosae, nhiệt độ tốt nhất cho sự hoạt động của chúng là 60-65°C Các vi khuẩn ưa ấm, ưa nóng thích ứng khá nghiêm ngặt đối với việc sử dụng cellulose Chúng phát triển trên môi trường chứa đường đơn Khi phân giải cellulose thành glucose và cellobiose, chúng sử dụng các đường này như nguồn năng lượng và nguồn cacbon,kèm theo việc tạo thành các axit hữu cơ, CO2 và H2O

1.4.3 Xạ khuẩn

Trong tự nhiên, ngoài nấm sợi, vi khuẩn thì xạ khuẩm cũng đuợc các nhà nghiên cứu chú ý đến Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật đặc biệt, tế bào của chúng rất đặc trưng bởi sự phân nhánh, đa số sống trong đất và phát triển trong điều kiện hiếu khí Có một

số ít loài thuộc vi hiếu khí hoặc có thể sống trong điều kiện kỵ khí

Dựa vào nhiệt độ sinh trưởng mà người ta chia xạ khuẩn thành hai dạng sau đây :

- Xạ khuẩn ưa ấm : phát triển tốt ở nhiệt độ T = 25-30°C

- Xạ khuẩn ưa nhiệt : phát triển tốt ở nhiệt độ T = 50-70°C

Cellulase của xạ khuẩn là enzym ngoại bào, chúng thường sinh sản bằng cách đứt đoạn hay phân chia tế bào bình thường Các môi trường có dịch chiết nấm men, pepton, dịch thủy phân casein thường thuận lợi cho sự sinh trưởng của xạ khuẩn

Viegia và cộng tác viên dẫ phân lập được 36 chủng xạ khuẩn từ bùn ở vịnh Lacoruva (Tây Ban Nha), trong đó có 19 chủng có khả năng tổng hợp cellulase và sinh trưởng tốt trên môi trường chứa 3,5% NaCl

Một số xạ khuẩn có hoạt tính phân giải cellulose là : Streptomyces,

Streptosporagium, Actinomyces nocardia, Micromonospora …

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU

2.1.1 Hóa chất

Hóa chất dùng trong môi trường phân lập, nuôi cấy và lên men

Malt extract (Difco); Yeast extract (Difco); Pepton (Difco); Glucose (Việt Nam); xylose (Đức, Trung Quốc); Agar (Việt Nam)

D-Methanol; YNB (yeast nitrogen base with ammonium sulphate without amino acids); glycerol

Hóa chất dùng cho phản ứng enzyme:

AOX: Alcohol oxidase (Thuy sĩ)

HRP: horse radish peroxidase (Thuy sĩ)

Thang ADN mẫu dùng trong điện di gen (Gibco)

Agarose dùng trong điện di gen (Pharmacia-Biotech)

Ethidium bromide dùng để nhuộm gen (Pharmacia-Biotech)

Đệm TAE (Tris Acetate EDTA) (Pharmacia-Biotech)

Hóa chất chạy điện di

♦ Acrylamide/Bis solution:

50ml = 14,6g Acrylamide + 0,4g N’N’- bis-methylene-acrylamide + nước cất

Bảo quản ở 40C

♦ 1,5M Tris-HCl, pH=8,8:

100ml = 18,15g Tris-base + 50ml nước cất, chỉnh pH lên 8,8 bằng HCl, sau đó định mức thành 100ml Bảo quản ở 40C

♦ 1M Tris-HCl, pH =6,8

100ml = 12g Tris base + 60ml nước cất, chỉnh pH lên 6,8 bằng HCl, sau đó định mức thành 100ml

♦ SDS solution

20ml = 2g + nước cất Bảo quản ở nhiệt độ thường

♦ Dung dịch điện giải

500ml= 7,5g Tris base + 36g Glycine + 2,5g SDS + nước cất Bảo quản ở nhiệt độ phòng

♦ Dung dịch APS 30% (Amonium per sulphate)

1ml = 0,3g APS + nước cất Bảo quản ở 40C

♦ Dung dịch nhuộm SDS- PAGE

100ml = 0,1g CBB (comasin brilliant blue) + Destain I

♦ Sample buffer

Glycerol 2g

SDS 0,4g Bromophenol blue 0,02g b-mercaptoethanol 0,5ml Tris-HCl pH 6,8 1ml Định mức lên 10ml bằng nước cất

♦ Pha đệm phosphat (PB) 1M

* Dung dịch A:

Hoà tan 137,99: 2 = 68,995g NaH2PO4.1H2O trong 500ml nước cất

* Dung dịch B:

Hoà tan 358: 2 = 179g Na2HPO4.12H2O trong 500ml nước cất

Đổ từ từ dung dịch A sang dung dịch B và dùng máy pH để đưa về pH=7,0

Trước khi dùng pha loãng thành 0.1M

Hóa chất dùng cho tinh sạch enzyme AOX và HRP:

Tris HCl 20mM, pH 7,5; NaCl 1M trong đệm Tris HCl 20mM, pH 7,5; Nước cất 2 lần; gel Sephadex G50; nhựa trao đổi ion DEAE; gel Superdex 200

2.1.2 Thành phần các môi trường dùng trong nghiên cứu

Môi trường phân lập và giữ giống

Môi trường được hấp thanh trùng ở nhiệt độ 115°C trong 20phút

Môi trường nhân giống

Môi trường được hấp thanh trùng ở nhiệt độ 115°C trong 20phút

Môi trường thử khả năng sinh ethanol

Yeast extract (cao nấm men) 5 g

Xylose 100 g

Nước cất vừa đủ 1000 ml

Môi trường được hấp thanh trùng ở nhiệt độ 115°C trong 20phút

M ôi trường để thu nhận enzyme alcohol oxidase (MM)

YNB (Yeast nitrogen base with

ammonium sulfate without amino acids) 13,4g Methanol 5ml

Nước cất vừa đủ 1000 ml Môi trường được hấp thanh trùng ở nhiệt độ 115°C trong 20phút

Bộ điện di ngang Pharmacia Biotech, Gibco

Box cấy BioblockScientific - Pháp

Cân điện tử Precisa - Thụy Điển

Kính hiển vi quang học Eclipse E600-Nikon - Nhật

Lò vi sóng LG - Hàn Quốc

Máy chụp ảnh gel Olympus

Máy đo pH Toledo - Anh

Máy lắc ổn nhiệt Eppendorf - Đức

Máy lắc ống nghiệm IKA*KS 130 basic - Nhật

Máy ly tâm cao tốc Heraeus - Sepatech

Máy PCR PE-GeneAmp PCR System 9700

Máy so mầu Genios - Áo

Máy soi gel Benchtop UV-Transilluminator VWR

Máy FPLC AKTA prime-Mỹ

Nồi hấp thanh trùng Himayatoko - Nhật

Tủ lạnh giữ giống Electrolux - Thụy Điển

Tủ nuôi cấy Sanyo - Nhật

Tủ sấy Sanyo - Nhật

Đĩa petri, ống nghiệm có nắp, ống Eppendorf, ống Falcon, Pipetman, đầu côn các loai, que cấy các loại

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phân lập các chủng sinh xylose

Mẫu đất và mẫu rác thải được lấy từ các địa điểm khác nhau trên địa phận Hà Nội và các vùng lân cận Nấm men có trong mẫu được phân lập sử dụng môi trường phân lập

có thành phần được nêu trong mục phần phương pháp Quy trình phân lập được tiến hành như sau:

Đối với các mẫu đất: Pha loãng các mẫu đất trong các ống Falcon có nước cất đã hấp

thanh trùng (121°C/30 phút) Dùng micro pipet hút 200 µl nhỏ lên đĩa petri có môi trường phân lập Dùng que gạt thuỷ tinh gạt đều mẫu trên bề mặt môi trường Lấy que gạt đó gạt tiếp sang đĩa thứ 2, làm tương tự với đĩa thứ 3 Như vậy mỗi mẫu được cấy trên 3 đĩa môi trường với nồng độ giảm dần Sau mỗi mẫu, khử trùng lại que gạt hoặc thay que gạt mới Các đĩa petri sau khi cấy được ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 28°C trong 2-

4 ngày sau đó lây ra quan sát và thu nhận các chủng nấm men

Đối với mẫu rác thải: Đồng hóa các mẫu hoa quả trong điều kiện vô trùng Dùng

micropipet hút 200 µl dịch nhỏ lên đĩa petri có chứa môi trường phân lập và làm tương

tự như đối với mẫu đất

Sau khi ủ từ 2 đến 4 ngày, các đĩa petri được đem ra quan sát, các khuẩn lạc nghi là nấm men được làm tiêu bản và soi dưới kính hiển vi quang học Chọn lấy các khuẩn lạc đại diện, tiến hành làm sạch và giữ trong ống nghiệm có chứa thành phần môi trường giống môi trường phân lập

2.2.2 Quan sát hình thái tế bào

Các chủng nấm men được nuôi cấy trên môi trường xylose 2% Sau một tuần, tiêu bản được chuẩn bị và quan sát hình thái tế bào bằng kính hiển vi quang học với vật kính x40 và x100

2.2.3 Thử khả năng chuyển hóa xylose thành ethanol

Tiến hành thử khả năng chuyển hóa xylose thành xylitol của các chủng nấm men đã tuyển chọn được bằng cách: nhân giống các chủng trong môi trường nhân giống sau đó ly tâm loại bỏ canh trường và chuyển tế bào sang môi trường thử khả năng chuyển hóa xylose thành ethanol Nuôi cấy lắc trong ống nghiệm ở 28°C Sau 10 ngày canh trường được ly tâm để loại bỏ tế bào sau đó xác định cồn bằng phương pháp enzyme (sẽ trình bày ở phần sau)

2.2.4 Phương pháp tách chiết enzyme

a Phương pháp tách chiết enzyme AOX

Chủng Pichia pastoris được nuôi cấy trên môi trường MM dùng để thu nhận

enzyme Quá trình nuôi cấy được tiến hành ở 28°C, lắc 250 vòng/phút Sau 24 giờ tế bào được thu nhận bằng cách ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút Tế bào được rửa một lần bằng nước cất vô trùng Rửa thêm 2 lần nữa bằng đệm photphate natri 0,05 M,

pH 7,5 Sau khi rửa tế bào được bổ sung một thể tích tương đương đệm photphate natri 0,05 M, pH 7,5 và một lượng tương đương bi thủy tinh (2,5-5mm) vô trùng Hỗn dịch

tế bào, đệm và bi thủy tinh vô trùng được vortex trong 1 phút ở 4°C, sau đó giữ lạnh trong đá 1 phút, qui trình lặp lại 8 lần để tế bào nấm men được phá vỡ hoàn toàn Sau khi vortex, làm tiêu bản quan sát mức độ vỡ của tế bào Nếu tế bào chưa vỡ thì tiến hành vortex tiếp Khi nào luợng tế bào vỡ đạt khoảng 2/3 trở lên thì tiến hành ly tâm ở 15.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C Phần dịch sau khi ly tâm được dùng làm enzyme thô để tinh sạch bằng máy FPLC

b Phương pháp tách chiết enzyme horse-radish peroxidase (HRP)

Củ cải trắng được nghiền nhỏ bằng đệm Tris HCl 20mM, pH 7,5, ly tâm 10000 vòng/phút, nhiệt độ 40C, dịch enzyme thô được kết tủa trong (NH4)2SO4 80% Sau 10 giờ, ly tâm 10000 vòng/ phút, thu lấy phần kết tủa Hòa lại phần kết tủa bằng đệm Tris HCl 20mM, pH 7,5 Dịch enzyme thô này được tinh sạch bằng máy FPLC