TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN LACTIC NHẰM ỨNG DỤNG LÊN MEN THỨC ĂN THÔ XANH CHO LỢN Giáo viên hướng dẫn ThS NCS Vũ Thị Hạnh Nguyên Sinh viên Phùng Thị Huệ Lớp 1402 Hà Nội 2018 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SI

TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN LACTIC NHẰM ỨNG DỤNG LÊN MEN THỨC ĂN THÔ XANH CHO LỢN Giáo viên hướng dẫn ThS NCS Vũ Thị Hạnh Nguyên Sinh viên Phùng Thị Huệ Lớp 1402 Hà Nội 2018 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN LACTIC NHẰM ỨNG DỤNG LÊN MEN THỨC ĂN THÔ XANH CHO LỢN

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THỨC ĂN THÔ XANH CHO LỢN

Giáo viên hướng dẫn: ThS NCS Vũ Thị Hạnh Nguyên

Sinh viên : Phùng Thị Huệ Lớp : 1402

Hà Nội - 2018VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘIKHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Đề tài: TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH

HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN LACTIC NHẰM ỨNG DỤNG LÊN MEN THỨC ĂN THÔ XANH CHO LỢN

Giáo viên hướng dẫn : ThS NCS Vũ Thị Hạnh Nguyên Sinh viên thực hiện : Phùng Thị Huệ

Lớp : 1402

Hà Nội - 2018

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu trong luận văn này, tôi đãnhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô và cán bộ phòng Công nghệ lênmen, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ ViệtNam

Với tấm lòng chân thành và sự biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin được gửi lời cảm

ơn đặc biệt tới ThS NCS Vũ Thị Hạnh Nguyên – cán bộ phòng Công nghệ lên

men, người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tàinày

Đồng thời, tôi cũng xin cảm ơn PGS TS Phí Quyết Tiến, Phó Viện

trưởng Viện Công nghệ Sinh học, Trưởng phòng Công nghệ lên men đã tạo điềukiện để tôi được thực tập tại phòng Công nghệ lên men

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ sinhhọc – Viện Đại học Mở Hà Nội đã đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian học tập

và nghiên cứu

Và cuối cùng, tôi xin được cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã giúp

đỡ, động viên và là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi suốt thời gian qua

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Sinh viên

Phùng Thị Huệ

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Thức ăn thô xanh dạng lỏng dùng cho chăn nuôi lợn 3

1.2 Vi sinh vật trong sản xuất thức ăn thô xanh dạng lỏng 3

1.3 Tổng quan về probiotic 5

1.3.1 Lịch sử nghiên cứu probiotic 5

1.3.2 Thành phần và đặc điểm của vi sinh vật được sử dụng trong probiotic 6

1.3.3 Vai trò của probiotic trong chăn nuôi 7

1.4 Một số loài vi khuẩn lactic thường sử dụng trong chăn nuôi 8

1.5 Đánh giá hoạt tính probiotic của các chủng vi khuẩn lactic sử dụng trong lên men thức ăn thô xanh 10

1.5.1 Khả năng sinh acid lactic 10

1.5.2 Khả năng sinh các hợp chất kháng khuẩn 11

1.5.2.1 Bacteriocin 11

1.5.2.2 Các hợp chất kháng khuẩn khác 12

1.5.3 Khả năng kháng kháng sinh 13

1.5.4 Khả năng chịu muối mật 13

1.5.5 Khả năng chịu pH acid 14

1.6 Tình hình nghiên cứu và sử dụng các chủng vi khuẩn lactic trong lên men thức ăn thô xanh ………14

1.6.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 15

1.6.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 16

PHẦN 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Vật liệu và hóa chất dùng trong nghiên cứu 18

2.1.1 Chủng giống vi sinh vật 18

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 18

2.1.3 Môi trường nuôi cấy 18

2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotic phù hợp cho lên men thức ăn thô xanh 18

2.2.1.1 Khả năng sinh acid lactic 18

2.2.1.2 Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định 20

2.2.1.3 Khả năng kháng kháng sinh 21

2.2.1.4 Khả năng chịu muối mật 22

2.2.1.5 Khả năng chịu pH acid 22

2.2.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng được tuyển chọn 23

2.2.2.1 Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào 23

2.2.2.2 Xác định khả năng sử dụng nguồn carbon, nito 24

2.2.2.3 Xác định khả năng chịu muối và dải nhiệt độ, pH thích hợp cho sinh trưởng của chủng vi khuẩn 24

2.2.3 Phân loại chủng vi sinh vật được tuyển chọn bằng phương pháp sinh học phân tử 25

2.2.3.1 Tách chiết DNA tổng số 25

2.2.3.2 Khuếch đại gen 16S rDNA của chủng vi khuẩn 26

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 26

PHẦN 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có đặc tính phù hợp cho lên men thức ăn thô xanh 28

3.1.1 Đánh giá khả năng sinh catalase và nhuộm Gram 28

3.1.2 Sàng lọc các chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid tổng số 29

3.1.3 Khả năng sinh acid lactic 30

3.1.4 Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định 32

3.1.5 Khả năng kháng kháng sinh 34

3.1.6 Khả năng chịu muối mật 35

3.1.7 Khả năng chịu pH acid 37

3.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn được tuyển chọn 38

3.2.1 Đặc điểm hình thái, tế bào 38

3.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 39

3.3 Phân loại chủng vi khuẩn được tuyển chọn bằng phương pháp sinh học phân tử… 41

3.3.1 Khuếch đại gene 16S rDNA của chủng được tuyển chọn 41 3.3.2 Giải và phân tích trình tự gene 16S rDNA của chủng được tuyển chọn

41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tên đầy đủ

CTAB Cetyltrimethylammonium bromide

rDNA Deoxyribonucleic acid ribosome

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Đường chuẩn acid lactic 20

Hình 3.1 Khuẩn lạc vi khuẩn lactic phân giải CaCO3 trên môi trường MRS 30

Hình 3.2 Phản ứng với thuốc thử Uphenmen của các chủng vi khuẩn 30

Hình 3.3 Hàm lượng acid lactic của các chủng vi khuẩn lactic 31

Hình 3.4 Khả năng kháng kháng sinh của một số chủng vi khuẩn đại diện 35

Hình 3.5 Tỷ lệ (%) sống sót của các chủng vi khuẩn tại nồng độ muối mật 0,3% theo thời gian 36

Hình 3.6 Tỷ lệ (%) sống sót của các chủng vi khuẩn tại pH 2 theo thời gian 37

Hình 3.7 Hình thái khuẩn lạc (A) và hình thái tế bào (B) của chủng LTX6 và LTX31 39

Hình 3.8 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gene 16S rDNA của chủng LTX31 trên gel agarose 1,0% 42

Hình 3.9 Cây phát sinh chủng loại của chủng LTX31 43

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Trong những năm gần đây, chăn nuôi lợn là một trong những ngành kinh tếmũi nhọn ở nước ta Các sản phẩm của ngành chăn nuôi không những đã đápứng nguồn thực phẩm cho nhu cầu tiêu dùng trong nước mà còn xuất khẩu thungoại tệ cho kinh tế quốc dân Trong chăn nuôi lợn, thức ăn chiếm tới 70% chiphí và là yếu tố chính quyết định chất lượng, giá thành sản phẩm Vì vậy việcchế biến và bảo quản thức ăn vô cùng quan trọng đối với ngành chăn nuôi

Từ xưa, thức ăn thô xanh đã đóng vai trò quan trọng đối với người chănnuôi lợn Tùy thuộc chủng loại nguyên liệu, thức ăn thô xanh có thể chứa hầu hếtcác chất dinh dưỡng mà vật nuôi cần như protein, các vitamin, khoáng đa lượng

và vi lượng thiết yếu và các chất có hoạt tính sinh học cao Ở Việt Nam, cácnguồn thức ăn thô xanh rất phong phú như cỏ, rơm, rạ Để không lãng phínguồn nguyên liệu này, người ta đã tìm ra biện pháp sử dụng chế phẩm sinh học

để lên men thức ăn thô xanh kết hợp với phế phụ phẩm nông nghiệp để tạo thức

ăn dạng lỏng cung cấp cho chăn nuôi lợn Đây là một phương thức chăn nuôihữu cơ - một giải pháp công nghệ phù hợp vì có nhiều ưu điểm vượt trội, đem lạihiệu quả về kinh tế (năng suất, chất lượng), xã hội (vệ sinh an toàn thực phẩm),môi trường (tận dụng hiệu quả nguồn tài nguyên sẵn có)

Nhóm vi sinh vật chủ yếu sử dụng trong công nghệ trên gồm nấm men

Saccharomyces cerevisiae, Bacillus spp., Lactobacillus spp Trong đó, vi khuẩn

lactic là nhóm vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic do lên men đồng hình và dị

hình, nó còn có thể sinh hàng loạt các hợp chất có hoạt tính kháng sinh được gọichung là bacterioxin gồm nizin, diplocoxin, acidofilin, lactoxindin, lactolin,brevin,… Các chất này được sử dụng rộng rãi trong bảo quản thực phẩm, trong

chăn nuôi với vai trò là chất kích thích sinh trưởng, ứng dụng trong việc phòng

và trị các bệnh đường tiêu hóa cho người và vật nuôi

Từ đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Tuyển chọn và nghiên cứu

đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn lactic nhằm ứng dụng lên men thức ăn thô xanh cho lợn” Nghiên cứu này góp phần tìm kiếm các chủng vi

khuẩn phù hợp có thể định hướng tạo chế phẩm sinh học lên men và bảo quảnthức ăn thô xanh, tận thu phế phụ phẩm nông nghiệp nâng cao hiệu quả trongchăn nuôi và giảm ô nhiễm môi trường

2 Mục đích nghiên cứu

Tuyển chọn, nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại được chủng vikhuẩn lactic có hoạt tính probiotic nhằm ứng dụng trong lên men thức ăn thôxanh cho lợn

3 Nội dung nghiên cứu

- Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotic phù hợp nhằmứng dụng trong lên men thức ăn thô xanh cho lợn

- Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn lactic được tuyển chọn

- Phân loại chủng vi khuẩn lactic được tuyển chọn

PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Thức ăn thô xanh dạng lỏng dùng cho chăn nuôi lợn

Thức ăn thô xanh dạng lỏng (Fermented Liquid Feed, FLF) là thức ăn đã

được trộn với nước ở tỷ lệ khác nhau, từ 1: 1,5 đến 1: 4 (Missotten et al.,

2015) Thức ăn thô xanh dạng lỏng có thể được sản xuất bằng cách lên men mộthoặc một số loại nguyên liệu như hạt ngũ cốc, nguyên liệu giàu protein, nguyênliệu tổng hợp khác (bột đậu tương, bột cá, bột xương), sinh khối thực vật vàphối trộn thức ăn đã lên men này với các thành phần thức ăn không lên men khác

để cung cấp thức ăn hoàn chỉnh cho lợn Tuy nhiên, phương pháp lên men thức

ăn dạng lỏng có thể gặp một số vấn đề: gây ra mất các chất dinh dưỡng thiết yếunhư vitamin và acid amin, đặc biệt là sinh tổng hợp các acid amin thiết yếu đãđược bổ sung vào thức ăn Dù vậy, về tổng thể các nghiên cứu cũng đưa ra kếtluận cho lợn ăn nguồn ngũ cốc hoặc thức ăn đã lên men thay vì các loại thức ăntổng hợp thông thường hoặc là thức ăn khô sẽ mang lại hiệu quả về kinh tế, chất

lượng thịt và bảo vệ môi trường (Brooks et al., 2003; Canibe et al., 2012).

Ngoài ra, khi cung cấp thức ăn lỏng lên men đúng cách có thể làm tăng vaitrò của dạ dày như là hàng phòng vệ đầu tiên chống lại các bệnh nhiễm trùngbằng cách làm giảm pH trong đường tiêu hóa, giúp loại trừ các vi khuẩn gâybệnh đường ruột thức ăn lỏng lên men cho lợn đã được chứng minh là cải thiệnhiệu quả trong chăn nuôi đối với lợn con, lợn cai sữa và lợn trưởng thành Trênthực tế khi lợn con sử dụng FLF là đã được cung cấp đồng thời nước và thức ăn.Theo cách này lợn con không cần đào tạo riêng cho việc ăn và uống Để ức chế

sự phát triển của VSV gây bệnh, thức ăn lỏng lên men phải chứa đủ hàm lượngacid lactic Việc sản xuất acid lactic có thể phát sinh từ quá trình lên men tựnhiên hoặc bằng cách bổ sung vào thức ăn VK lactic trước khi lên men

(Missotten et al., 2015).

1.2 Vi sinh vật trong sản xuất thức ăn thô xanh dạng lỏng

Hệ VSV trong thức ăn dạng lỏng thông thường đạt 106-107CFU/ml (Royer

et al., 2003) Lên men thức ăn cho lợn hoàn chỉnh thường thông qua 3 pha Trộn

nguyên liệu với nước pH > 6 cho phép sự tăng nhanh của trực khuẩn đường ruột

(Pha 1) ( Russell et al., 1996) Lên men bằng LAB, ức chế vi khuẩn gây bệnh

nhờ acid hữu cơ (1 phần acid lactic), hydrogen peroxide và bacteriocin (chấtkháng khuẩn tự nhiên) và làm giảm pH (Lindgren và Dobrogosz, 1990) Sau khilên men thức ăn, pH xuống ~ 4.0 giúp hạn chế sự phát triển của các vi khuẩn

thuộc chi Enterobacteriaceae và các vi khuẩn gây bệnh đường ruột khác (Pha 2) (Russell et al., 1996) Tiếp theo, quần thể LAB giúp ổn định pH, mật độ nấm

men trong thức ăn tiếp tục tăng nhờ sử dụng các nguồn protein trong nguyên liệuthô xanh (Pha 3) (Plumed‐Ferrer và Von Wright, 2009), giúp thức ăn ổn định vàtăng cường hàm lượng protein nấm men đơn bào (yeast single cell protein) trongthức ăn

Chất lượng của FLF có thể được cải thiện khi bổ sung vi khuẩn sinh axit

lactic (Missotten et al., 2009) Khi bổ sung vi khuẩn lactic vào thức ăn dạng hạt

sẽ giúp làm lỏng thức ăn và tạo thành một hỗn hợp thức ăn hoàn chỉnh (Brooks,2008) Chủng vi khuẩn được sử dụng cho sản xuất phải có khả năng sinh axit

lactic cao để ức chế các loại VSV gây bệnh trong hệ tiêu hóa (Winsen et al.,

2000) Theo nhiều nghiên cứu đã chọn các chủng vi khuẩn axit lactic để sản xuất

thức ăn chăn nuôi lên men cho lợn (Missotten et al., 2009) Năm 2009, Missotten

và cộng sự đã tìm thấy 146 chủng vi khuẩn có khả năng kiểm soát Salmonella có

trong FLF Vi khuẩn LAB thường được sử dụng trong sản xuất FLF là

Lactobacillus plantarum và Pediococcus spp (Missotten et al., 2010)

Đa dạng nấm men trong FLF khá cao và đã được công bố trong một số

nghiên cứu Tại châu Âu, khi lên men sản xuất FLF từ ngũ cốc, phế phụ phẩmnông nghiệp các loài nấm men chủ yếu được phân lập và bổ sung vào mẻ lên

men sau chủ yếu gồm Pichia galeiformis, Pichia membranifaciens và Pichia

anomala Trong một vài nghiên cứu khác, nấm men chủ yếu sử dụng là Pichia fermentans Tuy nhiên, một số nghiên cứu tại Châu Á sản xuất FLF từ nguyên

liệu thức ăn thô xanh sử dụng chủ yếu Candida milleri (60%), Kazachstania

bulderi (20%), Saccharomyces cerevisiae (20%) Đối với vi sinh vật phân giải

chất xơ, vi khuẩn thuộc chi Bacillus, chủ yếu là Bacillus subtilis, B.

licheniformis, B amyloliquefaciens được sử dụng Nhóm vi khuẩn này vừa có

hoạt tính phân giải chất xơ, giàu enzym thủy phân và có hoạt tính probiotic (Gori

et al., 2011).

Theo một số công bố, quá trình lên men sẽ hiệu quả hơn khi sử dụngkhoảng 20% thức ăn đã được lên men để dùng làm giống cho lên men các mẻ

thức ăn tiếp theo (Salovaara, 1998; Nout et al., 1989) Tuy nhiên, việc này sẽ dẫn

đến sự phát triển nhanh chóng của các loài nấm men, tùy thuộc vào loài nấmmen phát triển sẽ có tác động tích cực hoặc tiêu cực đến chất lượng của thức ăn

được lên men (Missotten et al., 2010) Vì vậy, quá trình lên men thức ăn chịu tác

động của nhiều yếu tố như: tỷ lệ và chủng loại VSV bổ sung, lượng chất dinh

dưỡng và các thông số khác … (Missotten et al., 2010; Canibe et al., 2012).

1.3 Tổng quan về probiotic

1.3.1 Lịch sử nghiên cứu probiotic

Lịch sử nghiên cứu probiotic bắt đầu trong những năm cuối thế kỷ 19, khicác nhà vi sinh vật học phát hiện ra sự khác biệt giữa hệ VSV trong ống tiêu hóacủa người bệnh và người khỏe mạnh Hệ vi sinh vật có ích trong hệ thống ốngtiêu hóa được gọi là probiotic

Năm 1870, khi nghiên cứu tại sao những người nông dân Bungary có sứckhỏe tốt, nhà sinh lý học người Nga Eli Metchnikoff đã đưa ra thuật ngữ

“probiotic” có nguồn gốc từ Hy Lạp, theo nghĩa đen là “vì cuộc sống” để chỉnhững vi sinh vật đã được chứng minh có ảnh hưởng tốt đến sức khỏe của người

và động vật Năm 1925, Beach là người đầu tiên có những nghiên cứu thực

nghiệm về thức ăn có chứa "Lactobacilius acidophilus" (Kim et al., 2001).

Năm 1968, King đã nghiên cứu thành công trong việc kích thích sự tăng

trưởng của heo bằng thức ăn có bổ sung L acidophilus (King, 1968).

Theo Kim và cộng sự thì “Probiotic là chế phẩm sinh học hay là thức ăn bổsung có chứa tế bào VK sống hoặc những phần tử của VK mà nó ảnh hưởng có

lợi cho sức khoẻ của vật chủ” (Kim et al., 2001).

Một định nghĩa khác về probiotic là “các vi sinh vật sống có ích cho sức

khỏe của vật chủ khi được bổ sung một lượng vừa đủ” (Stackebrandt et al.,

2002) Đây là những nhóm VK sống trong đường tiêu hóa của người, chúng tạothành một khu hệ VSV, cản trở sự phát triển của một số VSV gây bệnh, cung cấpcho con người một số chất có lợi cho cơ thể, ảnh hưởng tốt đến hệ miễn dịch.Con người sử dụng các chế phẩm probiotic như một loại thực phẩm, thuốc phòng

và chữa bệnh (Stackebrandt et al., 2002).

1.3.2 Thành phần và đặc điểm của vi sinh vật được sử dụng trong probiotic

Vi sinh vật được sử dụng làm probiotic gồm nhiều nhóm khác nhau như vikhuẩn, xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc Tuy nhiên, vì những đặc tính ưu việt của

vi khuẩn lactic (LAB) phù hợp với việc tạo chế phẩm probiotic cho người cũngnhư vật nuôi nên thành phần của hầu hết các chế phẩm probiotic hiện nay chủyếu là các chủng LAB

Những VK lactic có lợi thường được sử dụng trong các chế phẩm probiotic

như L acidophilus, Lactobacillus deibrueckii subs, Lactobacillus casei, L.

plantarum, Lactobacillus bulgaricus, Bifidobacterium breve, Enterococcus faecium, (Vinderola et al., 2002).

Trong probiotic còn có một số loài như Bacillus subtilis, Bacillus clausii (vi khuẩn), S cerevislae (nấm men), Aspergillus niger và Aspergillus oryzae (nấm

mốc) (Power và Moore, 1994)

Các VK lactic trong chế phẩm probiotic có khả năng bám chặt vào màngnhầy của ruột, ức chế sự bám của vsv gây bệnh Chúng sản xuất các acid lacticlàm giảm pH đường ruột, tạo môi trường không thuận lợi cho vsv có hại pháttriển Ngoài ra, chúng còn sản xuất chất kháng sinh, sinh H2O2, sản xuất cácenzym tiêu hóa (amylase, cellulase, lipase, protease), các vitamin (B1, B2, B6,

B12), khử độc tố trong đường ruột (Carbonelle et al., 1987; Kim et al., 2001).

Nấm men trong chế phẩm probiotic tạo ra sinh khối chứa acid amin, cácvitamin nhóm B, hấp thu độc tố và bài thải ra ngoài Chúng chuyển hóa glucosethành acid pyruvic là cơ chất cho các VSV có lợi hoạt động và sinh sản Ngoài

ra, chúng còn tiết các enzym tiêu hóa như amylase, protease,

Nấm mốc trong chế phẩm probiotic có vai trò tạo sinh khối chứa nhiều acidamin, sản xuất amylase, protease nhằm làm tăng khả năng tiêu hóa thức ăn ở vật

nuôi (Carbonelle et al., 1987).

1.3.3 Vai trò của probiotic trong chăn nuôi

Sử dụng probiotic trong chăn nuôi gia súc và gia cầm sẽ làm tăng hiệu quảkinh tế cho người sản xuất Phần lớn chế phẩm probiotic đều bao gồm một haynhiều chủng VK lactic có chức năng cải thiện khu hệ VSV đường ruột, nâng caochất lượng sản phẩm, tận dụng thức ăn, … Hệ VSV đường ruột của động vậttrong đó có các VK lactic có một vai trò quan trọng trong sự tiêu hóa và hấp thuthức ăn của vật chủ Nó sản sinh nhiều acid lactic, acid acetic, acid pyruvic, acidpropionic, do đó có tác dụng ức chế VSV gây bệnh đường ruột Ngoài ra, nó còn

có vai trò quan trọng là tổng hợp vitamin nhóm B, vitamin nhóm K, sản sinh cácenzym (amylase, pectinase, cellulase) làm tăng khả năng tiêu hóa chất dinhdưỡng.Bên cạnh đó, độc tố đường ruột được sinh ra bởi các VK gây bệnh có thểđược trung hòa bởi probiotic.

Bảng 1.1 Ảnh hưởng của probiotic lên vật nuôi (Kim et al., 2001)

dụng

Ảnh hưởng

Bò đực cai sữa Bifidobacteriu

m pseudolongum

1 g/ngày Giảm sự xuất hiện bệnh tiêu

chảy

Heo còn bú Bifidobacteriu

m pseudolongum

0,5 g/ngày Giảm sự xuất hiện bệnh tiêu

1.4 Một số loài vi khuẩn lactic thường sử dụng trong chăn nuôi

Lactobacillus acidophilus: là vi khuẩn probiotic có mặt trong hầu hết các

men tiêu hóa Lần đầu tiên được phân lập bởi Moro từ phân của trẻ sơ sinh đãqua phẫu thuật Có dạng hình que kích thước từ 0,5-1 x 2-10 µm, là vi khuẩngram dương, đi theo cặp hoặc dạng chuỗi ngắn Đây là LAB ưa nhiệt, có thể pháttriển ở 45oC L acidophilus có lợi đối với hệ VSV đường ruột Chúng có khảnăng sống 2 ngày trong dịch vị, 5 ngày trong dịch mật tinh khiết và 8 ngày trongdịch ruột Hiện nay, người ta sử dụng sinh khối chủng này như là một loại thuốc

để chữa các bệnh như chứng rối loạn đường tiêu hóa, tiêu chảy cấp tính hoặcmãn tính, táo bón, trướng bụng, hoặc do dùng kháng sinh, dùng hoa trị làm phá

vỡ sự cân bằng của hệ VSV đường ruột (Paula et al., 1999).

Lactobacillus bulgaricus: đây là loài VK quen thuộc, cư trú thường xuyên

trong ruột người và động vật, cùng với các loài VK khác tạo thành một khu hệ

VSV không thể thiếu L bulgaricus đã được ứng dụng cho lên men sữa chua từ rất lâu (Carr et al., 2002).

Lactobacillus casei: trực khuẩn nhỏ, có kích thước rất ngắn Chúng có thể

tạo thành chuỗi, không chuyển động, gram dương Chúng có khả năng lên menđược các loại đường glucose, fructose, mannose, galactose, maltose, lactose,salicin Trong quá trình lên men chúng tạo thành acid L-lactic với nồng độ

khoảng 180 g/l trong tổng số 210 g/l acid lactic (Carr et al., 2002).

Lactobacillus kefir: có chứa nhiều tryptophan là một trong những acid amin

quan trọng có tác dụng an thần Ngoài ra, chúng cũng có thể cung cấp nhiều Ca

và Mg, là những khoáng chất rất quan trọng cho hệ thần kinh Chúng cung cấpphotpho, carbonhydrat, chất béo và các protein giúp tế bào cơ thể phát triển vàduy trì năng lượng Trong thành phần tế bào VK còn chứa nhiều vitamin B1, B12,

K rất tốt cho da (Carr et al., 2002).

Lactobacillus delbruckii: có thể lên men được các loại đường glucose,

maltose, fructose, galactose và dextrin Chúng không có khả năng lên men

xylose, arabinose, rhamnose, lactose, raffinose, trehalose, inulin, mannitol L.

delbrukii sản xuất 90% là acid L- lactic từ nguồn đường glucose Trong thành

phần tế bào có chứa các chất khoáng, acid amin quan trọng giúp cơ thể nhanh

chóng hồi phục sức khỏe (Carr et al., 2002)

Lactobacillus sporogenes: VK này đóng vai trò quan trọng trong quá trình

tiêu hóa và biến dưỡng của con người Ổn định ở nhiệt độ phòng, tăng sinh rấtnhanh trong ruột Quá trình lên men tạo acid L (+) lactic, cung cấp phức hợpvitamin B và các enzym tiêu hóa như protase, lipase, amylase, lactase,… Chúngcũng sản xuất bacteriocin, giúp kiểm soát sự tăng trưởng vượt mức của những

nhóm VSV gây thối trong ruột, duy trì sự cân bằng pH acid (Carr et al., 2002).

Streptococcus faecalis: tế bào hình cầu, đường kính nhỏ hơn 1 µm, thường

xếp dạng đôi hoặc 4 tế bào Phát triển tốt ở nhiệt độ từ 20oC – 40oC Nhiệt độ tốithích cho sự tăng trưởng là 37oC Chúng có thể phát triển trong điều kiện vi hiếukhí hoặc kị khí, 6,5% NaCl, pH 9,6 và trong sữa chứa 0,1% xanh methylen Khửcacboxyl tyrozin, không dịch hóa gelatin Lên men lactic đồng hình tạo ra lượngacid khoảng 90 - 95% Trong điều kiện pH trung tính, VK này còn tạo ra một sốchất có khả năng kháng khuẩn như ethanol, acid acetic, diacetyl, H2O2 Một sốchủng sinh bacteriocin dạng cytolysin, streptococcin và nisin Hiện nay, người ta

thường sử dụng chủng Streptococcus faecalis cùng với Lactobacillus

acidophilus và Bifidobacterium trong chế phẩm probiotic trị bệnh tiêu chảy cho

heo (Teuber et al., 1999).

Pediococcus: các dòng Pediococcus được tìm thấy trong thực phẩm, thực

vật Chúng sản xuất acid lactic và được dùng chủ yếu trong lên men dưa cải,nước ủ rượu, bia và hèm rượu Là dòng LAB đặc biệt, giúp cân bằng hệ VK

đường ruột (Cai et al., 1999).

1.5 Đánh giá hoạt tính probiotic của các chủng vi khuẩn lactic sử dụng trong lên men thức ăn thô xanh

Các VK được sử dụng làm probiotic phổ biến nhất là các VK lactic như

Bifidobacterium spp., L acidophilus Đây là các VK hiện diện bình thường trong

ruột người, động vật và có khá nhiều tài liệu nghiên cứu về hoạt tính probioticcủa chúng: khả năng sinh acid lactic, khả năng sinh các hợp chất kháng khuẩn,kháng kháng sinh, chịu pH acid, Vì vậy, VK lactic có nhiều đặc tính phù hợp

để tạo chế phẩm sinh học

1.5.1 Khả năng sinh acid lactic

Trong nhiều nghiên cứu cho thấy, LAB có hoạt tính kháng khuẩn trên diệnrộng Trong số các hoạt tính này, khả năng sản xuất acid lactic và acid acetic

được xem là quan trọng nhất Trong quá trình lên men, LAB sinh ra sản phẩmchủ yếu là acid lactic tạo ra môi trường không thích hợp cho sự phát triển củanhững VSV gây bệnh hay gây hư hỏng sản phẩm, tác động lên màng tế bào chấtcủa VK, ảnh hưởng đến chức năng bảo vệ và chức năng dinh dưỡng của màng tếbào, ức chế quá trình vận chuyển chủ động của màng tế bào Acid lactic dễ dàngthấm qua màng tế bào, làm giảm pH nội bào hoặc tự oxi hoá, làm ngưng quátrình trao đổi chất, gây chết những tế bào nhạy cảm với nó, loại trừ những VSV

gây hại trong đường ruột Chẳng hạn như các VSV gây bệnh như E coli (gây viêm ruột ở động vật non và trẻ em), Salmonella typhimurium, Salmonella

cholerasuis (gây bệnh thương hàn),… (Lee et al., 2009) Winsen và cộng sự đãchỉ ra rằng nồng độ acid lactic là chất chính chịu trách nhiệm về tác dụng kháng

khuẩn của FLF (Winsen et al., 2000) Các chủng được sử dụng như là chế phẩm

vi sinh để sản xuất FLF cần có khả năng sản xuất acid lactic cao để hoạt động

chống lại các bệnh đường ruột (Winsen et al., 2001) Do đó, một số nghiên cứu

đã được tiến hành để lựa chọn các chủng lactic có ích để sản xuất thức ăn lỏnglên men lợn Ví dụ, Missotten đã kiểm tra 146 chủng vi khuẩn về khả năng

kháng Salmonella (Missotten et al., 2007) Các loài vi khuẩn thường được sử dụng để bổ sung vào thức ăn gia súc để sản xuất thức ăn lỏng lên men là L.

plantarum và Pediococcus spp (Missotten et al., 2010).

1.5.2 Khả năng sinh các hợp chất kháng khuẩn

Vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng khuẩn diện rộng do có khả năng sản xuất

ra các chất ức chế: như một số acid hữu cơ, hydrogen peroxide, diacetyl, các chất

có khối lượng phân tử thấp và bacteriocin (Lê Ngọc Thùy Trang, 2014)

1.5.2.1 Bacteriocin

Bacteriocin là các peptide được sản sinh tự nhiên bởi một vài VK để ức chế

sự phát triển của các VSV cạnh tranh khác, chúng có phổ kháng khuẩn hẹp, chủ

yếu là ức chế các loài gần với các chủng sản sinh bacteriocin (Parada et al.,

2007) Bacteriocin có thể được tìm thấy ở nhiều loại VK khác nhau, tuy nhiênbacteriocin sinh ra bởi LAB vẫn thu hút được sự chú ý đặc biệt của các nhà khoahọc bởi tính an toàn và tác dụng ức chế nhiều VK gây bệnh nguy hiểm như

Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes,… (De Vuyst et al., 2007).

Trong số khoảng 200 bacteriocin đã được mô tả cho đến nay, bacteriocin từ LAB

chiếm tới 90% (Desriac et al., 2010) Trong những nghiên cứu gần đây cho thấy

một số bacteriocin có phổ kháng khuẩn rộng, có khả năng ức chế cả VK Gram

âm và VK Gram dương(Carbonelle et al., 1987) Bacteriocin được cho là đóng

vai trò quan trọng trong hoạt động của các probiotic, là một trong các tiêu chí lựachọn chủng vi sinh vật làm probiotic Đã có nhiều giả thiết được đưa ra về cơchế bacteriocin tham gia vào hoạt động của probiotic Một là, bacteriocin giúpprobiotic xâm nhập và chiếm ưu thế trong hệ VSV đường ruột Hai là,bacteriocin thể hiện tác dụng kháng khuẩn, trực tiếp ức chế các VK gây bệnh Ba

là, bacteriocin mang tín hiệu kích thích hệ miễn dịch của lợn (Dobson et al.,

2012) Chẳng hạn, khi cho lợn Đại Bạch (Large White pig) sử dụng

Lactobacillus fermentum 14 kết hợp với Streptococcus salivarius 312, sẽ làm

giảm số lượng lớn E coli trong dạ dày và tá tràng Khi chỉ dùng L fermentum

14, cũng có tác dụng làm giảm số lượng E coli trong dạ dày (Barrow et al.,

2001)

1.5.2.2 Các hợp chất kháng khuẩn khác

Kháng khuẩn do sinh H2O2: Một số chủng LAB như L lactics, Leuconostoc

cremoris có thể sản sinh H2O2 (hydrogen peroxide) khi chuyển từ môi trường kịkhí sang hiếu khí Vì VK lactic không có catalase nên trong điều kiện có oxygen,chúng sẽ sinh ra H2O2 Dahiya và cộng sự đã chứng minh khả năng ức chế

Staphylococus aureus của chủng L lactic nhờ khả năng sinh ra H2O2 (Dahiya etal., 1968).

Kháng khuẩn do sinh diacetyl: Diacetyl được sinh ra bởi nhiều loài VKlactic Đây là chất có khả năng ức chế sự phát triển nhiều VSV gây bệnh Hoạttính ức chế này tăng lên trong môi trường acid, ức chế mạnh hơn đối với VK

Gram âm và nấm mốc, đặc biệt với M turberculosis (VK gây bệnh lao) Tuy

nhiên, nồng độ tối thiểu có tác dụng của chúng thường cao hơn mức thường thấytrong thực phẩm Vì vậy, tác dụng của riêng diacetyl không thể giải thích cho

khả năng kháng khuẩn của VK lactic (DeVuyst et al., 1994)

1.5.3 Khả năng kháng kháng sinh

Kháng sinh đã được sử dụng rộng rãi để thúc đẩy tăng trưởng và dự phòngtiêu chảy ở động vật nuôi (Thacker, 2013) Là một chất phụ gia thông dụng trongthức ăn chăn nuôi, kháng sinh góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế Tuy nhiên,những tác động tiêu cực của kháng sinh ngày càng trở nên nổi bật Người tiêudùng đang ngày càng quan tâm đến dư lượng kháng sinh trong các sản phẩm thịt

(Vondruskova et al., 2010) Hơn nữa, việc sử dụng kháng sinh liên tục có thể

dẫn đến thay đổi sự cân bằng hệ VSV của ruột và gây ra một vài ảnh hưởng xấu

có thể tồn tại lâu dài ngay cả sau khi ngưng sử dụng cách điều trị này Việc sửdụng kháng sinh như chất kích thích tăng trưởng đã bị cấm ở nhiều quốc gia,chẳng hạn như Liên minh Châu Âu và Nhật Bản Ngoài ra, các nước khác baogồm cả Trung Quốc và Hoa Kỳ đang cấm hoặc có kế hoạch cấm việc đưa khángsinh vào khẩu phần của lợn Chính vì vậy, việc sử dụng probiotic thường đượcchỉ định uống trong thời gian điều trị bệnh bằng kháng sinh, để phòng mất cânbằng hệ VSV trong đường ruột Do đó, các chủng dùng làm probiotic cần phải

có khả năng chịu đựng được kháng sinh

1.5.4 Khả năng chịu muối mật

Vi sinh vật probiotic khi được bổ sung vào cơ thể qua đường tiêu hóa,chúng tác động thông qua một số cơ chế khác nhau Tuy nhiên, để có thể tácđộng lên hệ tiêu hóa vật chủ thì trước hết chúng phải có khả năng sống sót ở điềukiện khắc nghiệt trong đường tiêu hóa như pH acid, muối mật,…

Muối mật được coi là chất kháng khuẩn trong đường tiêu hóa, bảo vệ ruộtkhỏi sự xâm nhập của các VSV gây bệnh Ở hầu hết các sinh vật (bao gồmngười), quá trình tổng hợp muối mật chủ yếu thông qua sự tiêu thụ cholesterol

Cơ thể tổng hợp khoảng 8 mg cholesterol một ngày và dùng 4 mg cholesterol đểtổng hợp muối mật Tổng cộng có khoảng 20-30 g muối mật tiết vào ruột mỗingày (http://diaglab.vet.cornell.edu/clinpath/modules/chem/bileacids.htm)

Do vậy, khi thức ăn cùng VSV từ dạ dày chuyển xuống vùng ruột Tại đây,chúng chịu sự tác động của muối mật Khi muối mật đi vào khu vực tá tràng thì

số lượng VSV sẽ giảm Khả năng chịu đựng muối mật là một trong những đặc

tính cần thiết của VSV có hoạt tính probiotic (Stackebrandt et al., 2002).

1.5.5 Khả năng chịu pH acid

Đây là yếu tố cần thiết để tạo sự thích nghi ban đầu Các nhà khoa học đãchứng minh, các probiotic phải trải qua các quá trình tiêu hóa khắc nghiệt hơn 90phút trước khi được giải phóng từ dạ dày vào ruột Tuy nhiên, các quá trình tiêuhóa có thời gian xảy ra lâu hơn nên VSV probiotic phải chống lại được các điềukiện áp lực của dạ dày với pH acid đến khoảng 1,5 Do đó, các chủng được chọnlọc để sử dụng như trong chế phẩm probiotic cần phải chịu được môi trường pHacid ít nhất 90 phút Khả năng sống sót ở pH 3,0 trong 2 giờ và nồng độ acid

1000 mg/l được xem như là khả năng chịu acid tối ưu đối với các chủng

probiotic (Liong et al., 2005).

Tiếp đến, chúng phải gắn vào biểu mô và phát triển được trong ruột trướckhi chúng có thể bắt đầu phát huy vai trò đối với sức khỏe vật chủ

Ngoài ra, VSV probiotic phải chống lại được các enzym trong đường miệngnhư lysozyme Vì vậy, khả năng chịu acid là một trong những tính chất để sàng

lọc khi muốn tuyển chọn các dòng probiotic (Liong et al., 2006).

1.6 Tình hình nghiên cứu và sử dụng các chủng vi khuẩn lactic trong lên men thức ăn thô xanh

Với đặc điểm sinh lý, sinh hóa ưu việt, VK lactic là một nguồn gen phong

phú, được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: trong côngnghiệp thực phẩm, trong lĩnh vực công nghệ sinh học, trong lĩnh vực y học,…

Đặc biệt là trong chăn nuôi, con người đã sử dụng chúng một cách hiệu quả

trong việc tạo ra nhiều chế phẩm probiotic giúp phòng và điều trị một số bệnhđường tiêu hóa ở gia súc - gia cầm,…

1.6.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam, một số cơ sở nghiên cứu đã sản xuất và thử nghiệm chếphẩm VSV để lên men thức ăn gia súc, sử dụng làm probiotic phục vụ cho đờisống dân sinh nói chung và chăn nuôi nói riêng còn rất mới mẻ và bắt đầu đượcquan tâm trong khoảng một thập kỉ gần đây Năm 2002, Phạm Khắc Hiếu vàcộng sự nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của chế phẩm EM1 trên lợn con đã

cho thấy phế phẩm EM1 có tác dụng ức chế đối với E coli, Salmonella,

Klebsiella, Shigella, Proteus, Staphylococcus, Streptococccus, Clostridium, Sarcina lutea (Phạm Khắc Hiếu và cộng sự, 2002) Năm 2003, Phạm Thị Ngọc

Lan và Lê Thanh Bình đã phân lập được hai trong số 789 chủng VK lactic trongruột gà Bằng các phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử, nhóm tác giả đãxác định được các chủng CH123 và CH156 có những tính chất probiotic gần với

Lactobacillus agillis và Lactobacillus salivarius (có khả năng đề kháng được với

40% acid mật, sinh trưởng ở môi trường pH = 4,0 và nồng độ NaCl= 6%, có hoạt

tính đối kháng với Salmonella, E coli) được ứng dụng trong chăn nuôi (Phạm

Thị Ngọc Lan và Lê Thanh Bình, 2003) Cũng trong năm 2003, Nguyễn Thị

Hồng Hà và cộng sự đã sử dụng hai chủng Bifidobacterium bifidum và L.

acidophilus để sản xuất chế phẩm probiotic, bước đầu đã nghiên cứu được công

nghệ sản xuất bằng phương pháp sấy phun Chế phẩm sau 6 tháng vẫn có số tếbào VK sống ở mức 106 CFU/g và có khả năng ức chế VK Salmonella (Nguyễn

Thị Hồng Hà và cộng sự, 2003) Năm 2009, Phạm Quốc Việt và cộng sự thuộcViện Chăn nuôi Việt Nam đã nghiên cứu sản xuất probiotic và enzyme tiêu hóadùng trong chăn nuôi Kết quả đã tìm ra 2 quy trình sản xuất và 2 chế phẩmprobiotic làm tăng sinh trưởng vật nuôi 10%, tăng hiệu quả sử dụng thức ăn10%, hạn chế 15% tỉ lệ bệnh đường tiêu hóa ở vật nuôi [CITATION Phạ09 \l 1033 ]

1.6.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Năm 2002, Wutai và cộng sự sử dụng hai chế phẩm: chất A có L.

plantarum và Enterococcus faccium và chất B là L plantarum và Baccillus subtilis để ủ chua cây cao lương tại Trung Quốc cho thấy tác dung rõ rệt khi ủ

đơn chủng, cụ thể là làm giảm nhanh độ pH, tăng hàm lượng acid lactic (Wutai

et al., 2002) Theo Lema và cộng sự (2001), dùng probiotic cho lợn với L acidophilus (lô 1), Streptococcus faecium (lô 2), hoặc phối hợp giữa L acidophilus với Streptococcus faecium (lô 3), hoặc giữa L acidophilus với S faecium, L casei, Lactobacillus fermentum và L plantarum (lô 4) Để kiểm tra

sự bài thải của VK E coli Q157, ông đã trộn các VK trên với liều 6 x l06 CFU/kg

thức ăn liên tục trong 7 tuần Kết quả cho thấy lô 4 có sự bài thải VK E coli

trong phân thấp hơn các lô khác Khác biệt này hoàn toàn có ý nghĩa so với lô

đối chứng không dùng probiotic (Lema et al., 2001) Năm 2017, Balasingham và cộng sự đã sử dụng 2 chủng L plantarum và L acidophilus được phân lập từ ruột lợn để sử dụng làm chế phẩm probiotic (Balasingham et al., 2017) Cũng

trong năm 2017, Dlamini và cộng sự đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của VK

probiotic L reuteri ZJ625, L reuteri VB4, L salivarius ZJ614 và Streptococcus

salivarius NBRC13956 trong chăn nuôi lợn Kết quả cho thấy khi sử dụng các

chủng VK này đã làm giảm hiệu chứng tiêu chảy của lợn sau cai sữa (Dlamini et

al., 2017).

Tóm lại, dựa vào sự hiểu biết các đặc tính quan trọng của VK lactic như khảnăng chịu acid, chịu mật, đề kháng kháng sinh và sản xuất bacteriocin, Conngười đã biết sử dụng hiệu quả các chủng lactic trong việc tạo ra nhiều chế phẩmprobiotic hổ trợ đường tiêu hóa, điều trị tiêu chảy giúp duy trì cân bằng hệ VSVđường ruột cho người cũng như vật nuôi

PHẦN 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu và hóa chất dùng trong nghiên cứu

Thiết bị nghiên cứu: tủ ấm (Mỹ), máy ly tâm (Eppendorf, Đức), lò vi sóng(Sam Sung, Hàn Quốc), máy lắc ổn nhiệt (CPT inc, Hàn Quốc), máy chạy điện

di (Mupid, Nhật Bản), máy PCR (Applied biosystems, Mỹ), máy đo OD (S-300nano, Optima, Nhật Bản) và một số thiết bị nghiên cứu khác

2.1.3 Môi trường nuôi cấy

Các môi trường được sử dụng trong nuôi cấy, đánh giá khả năng khángVSV kiểm định và nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng VK lactic (Phụ lục1)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotic phù hợp cho lên men thức ăn thô xanh

2.2.1.1 Khả năng sinh acid lactic

a Xác định khả năng sinh acid tổng số bằng phương pháp cấy chấm điểm

Chuẩn bị các đĩa petri chứa môi trường MRS có bổ sung CaCO3 với lượng

5 g/l Tiến hành cấy chấm điểm các chủng VK trên đĩa, nuôi ở 37oC, 2 ngày Khikhuẩn lạc mọc, nếu chủng có sinh acid thì xung quanh KL có vòng phân giải.Vòng phân giải càng lớn chứng tỏ lượng acid sinh ra càng nhiều, ngược lại làchủng không sinh acid (Trần Thị Ái Liên, 2011)

b Định tính khả năng sinh acid lactic bằng thuốc thử Uphenmen

* Nguyên tắc: acid lactic khi phản ứng với nhân phenol có trong thuốc thửUphenmen làm đổi màu thuốc thử, từ màu tím sẽ chuyển sang màu vàng Nhờ

đó, xác định được VK có sinh acid lactic hay không

* Cách tiến hành (Trần Thị Ái Liên, 2011)

- Chủng giống được nuôi trong môi trường MRS lỏng ở 37oC trong 48 giờ

- Ly tâm 5000 vòng/phút trong 2 phút để loại bỏ sinh khối, thu dịch lên men

- Cho 50 µl dịch lên men vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc thử Uphenmen

- Ống đối chứng: 2 ml thuốc thử Uphenmen

- Quan sát và ghi nhận sự chuyển màu của thuốc thử: Màu vàng tạo thành càngđậm chứng tỏ lactic acid được tạo ra càng nhiều

c Định lượng acid lactic bằng phương pháp quang phổ

* Cơ sở của phương pháp là dựa vào sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đạicủa phản ứng giữa sắt (III) clorua và dung dịch acid lactic dẫn đến sự hình thành

sắt (III) lactat màu vàng, được hấp phụ cực đại ở bước sóng 390 nm Hàm lượngacid lactic được xác định thông qua đường chuẩn acid lactic(Borshchevskaya et al., 2016)

0 2 4 6 8 10 12

f(x) = 12.25 x − 0.32 R² = 1

Hình 2.1 Đường chuẩn acid lactic

* Xác định hàm lượng acid lactic của chủng vi khuẩn

- Nuôi lắc các chủng VK trên MRS lỏng ở 37oC trong 48 giờ

- Ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút để loại bỏ sinh khối, thu dịch lênmen

- Tiến hành phản ứng: 50 µl dịch lên men + 2 ml FeCl3 (0,2%); trộn đều

- Sau đó hỗn hợp được đo độ hấp phụ quang phổ ở bước sóng 390 nm

- Hàm lượng acid lactic của chủng VSV được tính theo công thức sau:

Y (mg/ml) = (12,253 X∆ - 0,3215) X DTrong đó: ∆: giá trị hấp phụ cực đại ở bước sóng 390 nm

D: hệ số pha loãng

2.2.1.2 Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định

* Nguyên tắc: Dựa vào sự khuếch tán của chất ức chế trong dịch nuôi cấy

VK vào môi trường thạch, hoạt tính ức chế dịch nuôi VK là tạo vòng vô khuẩn

quanh lỗ đục (Damayanti et al., 2014).

* Cách tiến hành

- Nuôi lắc các chủng VK lactic trên MRS lỏng ở 37oC trong 48 giờ

- Ly tâm 5000 vòng/phút (2 phút) để loại bỏ sinh khối, thu dịch lên mencủa chủng VK lactic

- Cấy trang VSV kiểm định lên môi trường MPA

- Dùng khoan nút chai vô trùng (đường kính d= 6 mm) khoan lỗ ở giữa đĩachứa VSV kiểm định

- Bổ sung dịch lên men của chủng VK lactic nghiên cứu vào lỗ khoan

- Đặt mẫu trong tủ lạnh từ 4 – 8 giờ để dịch từ các lỗ khoan khuếch tán ramôi trường nuôi cấy VSV Sau đó để tủ nuôi 24 giờ

- Quan sát vòng kháng khuẩn Hoạt tính đối kháng được xác định bằngcách đo đường kính vòng kháng khuẩn theo công thức D – d (mm)

Trong đó: D: Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)

d: Đường kính lỗ thạch (mm)

2.2.1.3 Khả năng kháng kháng sinh

* Nguyên tắc: Các chất kháng sinh có thể khuếch tán trên môi trường thạch,

ức chế các VSV mẫn cảm với chúng và tạo ra vòng vô khuẩn Những VSV nào

có khả năng kháng với chất kháng sinh thì có thể sinh trưởng và phát triển

(Damayanti et al., 2014).

* Cách tiến hành:

- Giống khảo sát được hoạt hóa trên MRS lỏng ở 37oC trong 48 giờ

- Trang 5 µl dịch nuôi cấy VK lên đĩa chứa môi trường thạch MRS

- Đặt các khoanh giấy đã được tẩm kháng sinh lên mặt thạch và để tủ lạnhtrong 4 giờ Sau đó để tủ nuôi 37oC.

- Quan sát kết quả sau 48 giờ nuôi cấy Độ nhạy kháng sinh được xác địnhbằng cách đo đường kính vùng ức chế D – d (mm) như mô tả trước đó của

William và cộng sự (William et al., 1989) Chủng VK được coi là nhạy cảm (S)

với kháng sinh khi D – d > 10 mm, trung gian (I) khi 5,0 < D – d < 9,9 mm hoặckháng (R) khi D – d < 4,9 mm

2.2.1.4 Khả năng chịu muối mật

* Nguyên tắc: muối mật được coi là chất kháng khuẩn trong đường tiêuhóa, bảo vệ ruột khỏi sự xâm nhập của các VSV gây bệnh Do vậy, VSVprobiotic khi qua ruột non chịu tác động của muối mật Ở ruột non, nơi dịch mậttoàn phần tiết ra có thể có nồng độ cao nhất khoảng 2% Khả năng sống sót sautác dụng của muối mật là một trong những tiêu chuẩn quan trọng của VSV

probiotic.

* Cách tiến hành: (Menconi et al., 2014)

- Tiến hành khảo sát khả năng chịu muối mật với các nồng độ muối mật

0,3%; 0,5%; 1%; 2%; 3% ở những thời điểm 0; 6; 12; 24 giờ

- Chuẩn bị giống: LAB được nuôi cấy 48 giờ trong môi trường MRS lỏng

- Chuẩn bị môi trường MRS lỏng có bổ sung mật lợn (Becton, Dickinsonand Company, USA) ở các nồng độ 0% (đối chứng); 0,3%; 0,5%; 1%, 2%

- Dùng pipet vô trùng hút 5 µl dịch nuôi cấy (107 – 108 tế bào/ml môitrường) vào môi trường MRS lỏng có bổ sung mật heo ở các nồng độ 0,3; 0,5; 1;

2 và đối chứng 0% (không chứa mật lợn)

- Nuôi ở nhiệt độ 37oC Tiến hành đo OD ở bước sóng 630 nm ở các thờiđiểm 0; 6; 12; 24 giờ

- Ghi nhận kết quả Tính tỷ lệ tế bào sống sót thông qua mối tương quangiữa giá trị OD với mật độ tế bào tại mẫu đối chứng và mẫu thí nghiệm.

2.2.1.5 Khả năng chịu pH acid

* Nguyên tắc: dựa vào khả năng chịu pH acid (1 - 3) của các chủngprobiotic Do vậy, chúng tôi khảo sát khả năng chịu đựng pH acid ở pH 1; 2; 3tại các thời điểm từ 0; 6; 12; 24 giờ

* Cách tiến hành: (Menconi et al., 2014)

- Chuẩn bị giống: VK được nuôi cấy 48 giờ trong môi trường MRS lỏng

- Chuẩn bị môi trường MRS lỏng với pH 1; 2; 3 và mẫu đối chứng (pH =7)

- Dùng pipet vô trùng hút 5 µl dịch nuôi cấy (107– 108 tế bào /ml môitrường) vào các môi trường đã chuẩn bị

- Nuôi ở nhiệt độ 37oC Tiến hành đo OD ở bước sóng 630 nm ở các thờiđiểm từ 0; 6; 12; 24 giờ

- Ghi nhận kết quả Tính tỷ lệ tế bào sống sót thông qua mối tương quangiữa giá trị OD với mật độ tế bào tại mẫu đối chứng và mẫu thí nghiệm

2.2.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng được tuyển chọn

2.2.2.1 Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào

* Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc

Các chủng VSV được nuôi cấy trên môi trường thạch MRS ở 37o C Hìnhthái khuẩn lạc và khả năng phát triển của chủng được quan sát sau 48 giờ nuôicấy

* Quan sát hình thái tế bào

Chủng VSV được nuôi trong môi trường lỏng MRS ở nhiệt độ 37oC trênmáy lắc tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian 48 giờ Tế bào vi khuẩn trong dịchnuôi cấy được nhuộm Gram và quan sát hình thái dưới kính hiển vi quang học

* Phương pháp nhuộm Gram (Nguyễn Lân Dũng, 1972):

+ Làm tiêu bản vi sinh vật

+ Cố định vết bôi

+ Nhuộm bằng tím gential (gential violet) Giữ trong 1 - 2 phút

+ Loại bỏ thuốc nhuộm, nhỏ dung dịch lugol lên tiêu bản và giữ trong 1phút

+ Loại bỏ dung dịch lugol, rửa tiêu bản bằng cồn 95oC trong 30 - 40 giây + Rửa lại bằng nước

+ Làm khô vết bôi

+ Nhuộm bổ sung bằng fucsin loãng trong 1 - 2 phút

+ Rửa lại bằng nước, để khô, sau đó đem quan sát

Nếu là chủng Gram (+) sẽ có màu tím, chủng Gram (-) có màu hồng

2.2.2.2 Xác định khả năng sử dụng nguồn carbon, nito

- Khả năng sử dụng nguồn carbon: VK lactic được nuôi lỏng ở 37oC trênmôi trường MT1 (phụ lục 1) có bổ sung 1% (w/v) các nguồn đường khác nhaunhư nguồn carbon duy nhất: glucose, maltose, fructose, saccharose, Môitrường sử dụng nguồn carbon bổ sung là glucose được lựa chọn làm đối chứngdương và môi trường không bổ sung đường được lựa chọn làm đối chứng âm.Sau 48 giờ quan sát khả năng phát triển trên các môi trường và đo mật độ quang

để xác định khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau của VK (Bayane et

al., 2006).

- Khả năng sử dụng nguồn nito: VK lactic được nuôi lỏng ở 37oC trên môitrường MT2 (phụ lục 1) có bổ sung 1% (w/v) các nguồn acid amin khác nhau: