ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO THỰC HÀNH ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN SINH HÓA HỌC KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngày 01 tháng 04 năm 2022 ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD I THÔNG TIN SINH VIÊN Ca 2 Nhóm 18 Họ tên sinh viên Nguyễn Thị Huỳnh Như MSSV 20180341 Họ tên sinh viên Nguyễn Việt Kiều Oanh MSSV 20180346 Họ tên sinh viên Trần Xuân Phú MSSV 20180350 II CÂU HỎI LÝ THUYẾT Hãy nêu ưu và nhược điểm của phương pháp Bradford trong định lượng protein ? Ưu điểm Độ nhạy cao, c.
Trang 1ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO THỰC HÀNH
KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngày 01 tháng 04 năm 2022
ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD
I THÔNG TIN SINH VIÊN:
Họ tên sinh viên: Nguyễn Việt Kiều Oanh MSSV: 20180346
II CÂU HỎI LÝ THUYẾT:
Hãy nêu ưu và nhược điểm của phương pháp Bradford trong định lượng protein ?
Ưu điểm:
- Độ nhạy cao, có thể xác định ít nhất từ 1 µg đến 20 μg protein.g protein
- Hợp chất đơn giản
- Ít tốn thời gian Tổng thời gian cần thiết để thiết lập và hoàn thành xét nghiệm là dưới 30 phút
- Ít bị cản trở bởi các hợp chất sử dụng trong nghiên cứu protein, nhất là ammonium sulfate
- Thuốc nhuộm Coomassie Blue G250 tạo ra các mối liên kết không lưu trú mạnh mẽ với các protein, thông qua các tương tác tĩnh điện với các nhóm amino và carboxyl, cũng như các tương tác Van der Waals Từ đó, loại bỏ khả năng các phân tử không liên kết của thuốc nhuộm có thể đóng góp vào quá trình thực nghiệm
- Ít tốn kém, dễ sử dụng và có độ nhạy cao của thuốc nhuộm cho protein
- Toàn bộ thí nghiệm được thực hiện ở nhiệt độ phòng
- Biểu đồ tuyến tính có được từ xét nghiệm (độ hấp thụ so với nồng độ protein trong μg protein.g/ml) có thể
dễ dàng xác định nồng độ protein bằng cách sử dụng độ dốc của dòng
Nhược điểm:
- Phương pháp Bradford là tuyến tính trong phạm vi ngắn, thường từ 0 µg/mL đến 2000 µg/mL nên thường phải pha loãng trước khi phân tích mẫu
- Các lỗi trong quá trình pha loãng có thể dẫn đến mối quan hệ tuyến tính của các số liệu không được chính xác
- Phụ thuộc vào chuỗi protein Nếu protein không chứa một phần dư các amino acid thơm thì thuốc nhuộm sẽ không thể liên kết với protein một cách hiệu quả
Trang 2- Phụ thuộc vào việc so sánh độ hấp thụ của protein với protein tiêu chuẩn Nếu protein không phản ứng với thuốc nhuộm theo cách tương tự như protein tiêu chuẩn, có thể nồng độ đo sẽ không chính xác
- Thuốc thử có xu hướng nhuộm các ống nghiệm, các vết bẩn sẽ ảnh hưởng đến việc đọc độ hấp thụ
- Nhạy cảm với thời gian nên cần đảm bảo mẫu được ủ trong cùng một lượng thời gian để so sánh chính xác
- Bị ức chế bởi sự hiện diện của chất tẩy rửa
- Thuốc nhuộm Coomassie Blue G250 ban đầu dễ dàng liên kết với các nhóm protein arginine và lysine Sự ưu tiên của thuốc nhuộm với các axit amin này có thể dẫn đến các phản ứng khác nhau của xét nghiệm giữa các protein khác nhau
III KẾT QUẢ THỰC HÀNH:
Đo giá trị hấp thu (OD) ở bước sóng 595 nm:
OD595nm đối chứng 0,440
OD595nm mẫu tủa protein 0,555
ΔOD595nm mẫu tủa protein 0,115
Đường chuẩn:
ΔOD595nm 0 0.033 0.069 0.107 0.142 0.176
Trang 3Sử dụng phần mềm excel để xây dựng đường chuẩn:
Trình bày cách tính nồng độ protein trong các mẫu:
ΔOD595nm mẫu tủa protein = OD595nm mẫu tủa protein - OD595nm đối chứng = 0,555 – 0,440 = 0,115
ΔOD595nm mẫu thô = OD595nm mẫu thô - OD595nm đối chứng = 0,728 – 0,440 = 0,288
Dựa vào đường chuẩn tuyến tính y = 0,0036x – 0,0011 đã dựng, ta suy ra được x = 0,0036y + 0,0011
Với x: giá trị nồng độ µg/ml protein trong mẫu
y: giá trị OD595nm đo được từ thực nghiệm
Vì ban đầu thể tích dung dịch mẫu tủa protein lấy 0,5 ml mà dung dịch mẫu thô lấy 1 ml nên nồng độ mẫu tủa protein phải nhân 2
Kết quả nồng độ protein
Nồng độ protein (µg/mL) x = 0,1 15 + 0,0011
0,0036 ×2 = 64,5 x = 0,288 + 0,0011
Hiệu suất tách chiết protein:
H (%) = [Mẫu tủa protein]
[Mẫu thô] x100% =
64,5 80,3 x100% = 80,3%
Nhận xét:
y = 0,0036x – 0,0011
R 2 = 0,9997
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
0.18
0.2
Protein chuẩn (µg)
Đồ thị đường chuẩn
Trang 4 Lượng protein trong mẫu thô thu được : 80,3 µ gml
Lượng protein trong mẫu tủa protein thu được: 64,5 µ gml
Lượng protein trong mẫu thô cao gấp 1,2 lần lượng protein trong mẫu tủa protein
Hiệu xuất kết tủa đạt thấp hơn 100%
Giải thích:
+ Sau khi lấy mẫu ra khỏi máy ly tâm không gạn bỏ phần dung dịch phía trên ra ngay, làm cho lượng protein kết tủa bị hoà tan một phần
+ Quá trình hoà tan mẫu protein trong ống nghiệm diễn ra không hoàn toàn, lượng tủa protein còn nằm dưới đáy ống
+ Bấm giờ và canh thời gian giữa các bước khi thực hành thí nghiệm chưa chính xác nên thuốc thử không liên kết tốt với protein, làm cho protein có trong mẫu không hấp thụ tốt các bước sóng từ ánh sáng
+ Ống cuvette khi đo máy OD chưa được rửa sạch, bị dính dấu vân tay
+ Các thao tác khi dùng máy OD chưa được chính xác
HẾT