ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA HÓA HỌC NGUYỄN HẢI ANH NIÊN LUẬN NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP LÀM GIÀU FLAVONOID TRONG LÁ HỒNG (DIOSPYROS KAKI) BẰNG CÁC CHẤT HẤP PHỤ Người hướng dẫn 1 PGS TS Chu Ngọc Châu 2 TS Nguyễn Văn Tài Nơi thực hiện Khoa Hóa Thực vật Viện Dược liệu HÀ NỘI 2020 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài niên luận này, em xin gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo, cán bộ cùng các anh chị tại Khoa hóa thực vật Viện Dược liệu và các thầy cô tại Khoa hóa học Trường Đại h.
Trang 1ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘITRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA HÓA HỌC
NGUYỄN HẢI ANH
NIÊN LUẬN:
NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP LÀM GIÀU
FLAVONOID TRONG LÁ HỒNG (DIOSPYROS KAKI)
BẰNG CÁC CHẤT HẤP PHỤ
Người hướng dẫn: 1 PGS.TS Chu Ngọc Châu
2 TS Nguyễn Văn Tài Nơi thực hiện: Khoa Hóa Thực vật - Viện Dược liệu
Trang 2
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đề tài niên luận này, em xin gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo, cán bộ cùng các anh chị tại Khoa hóa thực vật- Viện Dược liệu và các thầy cô tại Khoa hóa học- Trường Đại học Khoa học tự nhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội.
Em xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Chu Ngọc Châu, cảm ơn cô đã định hướng
cũng như tin tưởng và giới thiệu cho em có cơ hội được làm thực nghiệm, nghiên cứu tại Khoa hóa thực vật- Viện Dược liệu.
Em xin gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Văn Tài – Trưởng khoa Hóa thực vật,
Viện Dược liệu đã giao đề tài và luôn tận tình giúp đỡ về thời gian, kiến thức cũng như tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài niên luận này.
Em xin gửi lời cảm ơn tới TS Lê Thành Nghị đã tận tình truyền đạt kiến thức
và hướng dẫn, giúp đỡ để em hoàn thành đề tài một cách tốt nhất
Tuy nhiên do kiến thức và kinh nghiệm bản thân còn hạn chế nên đề tài niên luận này còn những thiếu xót, em mong nhận được lời góp ý, chỉ bảo của thầy cô để
đề tài được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn.
Hà Nội, ngày tháng 5 năm 2020
Sinh viên
Nguyễn Hải Anh
Trang 3MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
Chương 1 TỔNG QUAN VỀ LÁ HỒNG 2
1.1.Đặc điểm thực vật…… 2
1.1.1 Đặc điểm thực vật chi Diospyros L……… …… 2
1.1.2 Đặc điểm thực vật của cây hồng (Diospyros kaki)……… …………3
1.2 Thành phần flavonoid trong lá hồng 5
1.3 Tác dụng dược lý 7
1.3.1 Tác dụng bảo vệ thần kinh 7
1.3.2 Tác dụng hạ huyết áp 7
1.3.3 Tác dụng chống xơ vữa động mạch 7
1.3.4 Tác dụng chống oxy hóa 7
1.3.5 Tác dụng hạ đường huyết 8
1.3.6 Tác dụng chống ung thư 8
1.3.7 Hoạt động miễn dịch 8
1.3.8 Tác dụng chống dị ứng 8
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………….… 9
2.1 Đối tượng nghiên cứu – Nguyên liệu và thiết bị……… 9
2.1.1 Đối tượng……… 9
2.1.2 Dung môi, hóa chất, thiết bị……… 9
2.1.2.1 Dung môi, hoá chất, dụng cụ……… 9
2.1.2.2 Thiết bị……… 9
2.2 Phương pháp nghiên cứu……… 10
2.2.1 Phương pháp hấp phụ……… 10
2.2.2 Phương pháp HPLC……… 10
2.2.3 Đường chuẩn Kaempferol và Quercetin……… 10
2.3 Quy trình thực hiện……… 12
Trang 42.3.1 Chuẩn bị nhựa……… 12
2.3.2 Chuẩn bị dịch chiết……… 13
2.3.3 Chuẩn bị cột (đối với hấp phụ động) ……… 13
2.3.4 Quy trình……… 14
2.3.4.2 Hấp phụ động………
……… 15
2.3.4.1 Hấp phụ tĩnh………
…… 16
TÀI LIỆU THAM KHẢO……… ……… 17
Trang 5DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao ( (High Perfomance Liquid
Chromatography)
HDL Lipoprotein tỉ trọng caoLDL Lipoprotein tỉ trọng thấp
Trang 6DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng 1; Các đặc điểm thực vật của lá hồng……… … 3 Bảng 2: Các hợp chất flavonoid chính trong lá hồng 5
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1 Các dạng lá hồng ( Diospyros kaki L.f) 2
Hình 2: Cấu trúc hóa học của một số flavonoid chính trong lá hồng 6 Hình 3: Sự phụ thuộc giữa nồng độ và độ hấp thụ quang của Kaempferol 11 Hình 4: Sự phụ thuộc giữa nồng độ và độ hấp thụ quang của Quercetin……… 12
Trang 7MỞ ĐẦU
Thuốc Tây y có bản chất là các chất hóa học tổng hợp và luôn tồn tại hai mặt:tác dụng có lợi- có thể điều trị bệnh và tác hại- gây ra những tác dụng không mongmuốn cho người bệnh, mà y học gọi là tác dụng phụ Thuốc Tây y càng đặc trị thì tácdụng phụ càng nhiều Gan và thận là những cơ quan thường bị ảnh hưởng nhiều nhấtdẫn đến suy giảm chức năng của hai cơ quan này
Do vậy gần đây trên thế giới đã có xu hướng quay về sử dụng các sản phẩmthảo dược trong việc phòng bệnh, cải thiện sức khỏe cũng như điều trị những bệnhmạn tính nhờ ưu điểm là có hiệu quả đáng tin cậy, ít tác dụng không mong muốn
Cây hồng và đặc biệt là lá hồng với tiềm năng lớn cũng đang được các nướcnhư: Trung Quốc, Hàn Quốc nghiên cứu khai thác để sản xuất các sản phẩm chămsóc sức khoẻ Theo nghiên cứu cao chiết lá hồng với hàm lượng flavonoid cao có tácdụng như: hạ cholesterol, hạ đường huyết, ngăn ngừa sự tăng mỡ máu, chống xơ vữamạch máu, tăng lưu lượng máu lên não, phòng chống đột quỵ não Cây hồng ở ViệtNam hiện được trồng nhiều ở các vùng đồng bằng và vùng núi; có nhiều chủng đượcnhư là Hồng Lạng Sơn (hồng vuông) với quả hình cầu, chín màu vàng lục thịt dòn;Hồng Hạc ở Hạc Trì, tỉnh Vĩnh Phú có vỏ mỏng không hạt, ruột đỏ da cam Lợi thế
về số lượng cây trồng cộng với các tác dụng lớn kể trên là lý do để ta quan tâm đếnviệc sử dụng lá hồng làm nguyên liệu để phát triển các sản phẩm tăng cường, bảo vệsức khỏe
Qua tìm hiểu về đề tài “Nghiên cứu quy trình chiết xuất cao định chuẩn lá hồng (Diospyros kaki)” của anh chị khóa trước, nhận thấy với quy mô nhỏ (5,0 gdược liệu) thì hàm lượng Flavonoid mà cụ thể là tổng hàm lượng Kaempferol vàQuercetin thu đươc trong cao là 3,35% Tuy nhiên hàm lượng này không cao và cũngkhông được đồng đều, ổn định do còn phụ thuộc vào chất lượng của dung môi vànguyên liệu Điều này đặt ra yêu cầu cần phải có một quy trình làm giâu, nâng cao
hàm lượng flavonoid trong cao lá hồng Do đó, em thực hiện đề tài “Nghiên cứu phương pháp làm giàu flavonoid trong lá hồng (Diospyros kaki) bằng các chất hấp phụ” mà cụ thể ở đây là hạt nhựa D101 với mục tiêu làm giàu và ổn định hàm lượng
flavonoid trong cao lên mức 20%
Trang 8CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ LÁ HỒNG
1.1 Đặc điểm thực vật
1.1.1 Đặc điểm thực vật chi Diospyros L.
Chi Diospyros L gồm các loài là cây gỗ hoặc cây bụi, rụng lá hoặc thường
xanh, lá mọc so le, nguyên Hoa thường đơn tính, khác gốc hoặc cùng gốc; hiếm khilưỡng tính
Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajanc [8], vị trí phân loại của chi
Diospyros L được tổng kết như sau:
vực nhiệt dới và một số nơi thuộc khu vực ôn đới, trong đó đa dạng nhất ở là ở khuvực Đông và Đông Nam Á
Ở Việt Nam, chi Diospyros L có khoảng 70 loài; 9 loài cho gỗ có giá trị sử dụng, trong đó có gỗ mun (D.mun A.Chev.); hai loài có quả ăn được là hồng (D.kaki L.f.) và cậy (D.lotus L.) [10] Ở vùng Đông – Nam Á, có 2 loài hồng khác được trồng
là: D blancoi A.DC mọc hoang dại ở các cánh rừng nguyên sinh hoặc thứ sinh, thuộc vùng núi thấp, trung bình và D digyna Jacq có nguồn gốc ở Vùng Trung Mỹ (Mehico
và Guatemala), cây trồng ở Philippin do người Tây Ban Nha đưa vào
Trang 91.1.2 Đặc điểm thực vật của cây hồng (Diospyros kaki)
Tên khoa học: Diospyros kaki L.f - họ Thị ( Ebenaceae)
Tên tiếng Việt: Hồng, Thị đinh, Hồng thị, Mác pháp, Mạy chí (Tày)
Tên nước ngoài: Kaki- persimmon, kakier, plaqueminier kaki, plaqueminier
du Japon
Bộ phận Đặc điểm
Cây Cây rụng lá theo mùa, thường là cuối mùa thu hay đầu mùa đông, cây có
thể đạt tới độ cao 14m Vỏ xám đen, các cành tỏa rộng, trên thân có cácvết sần, có lông tơ ở các nhánh
Lá Lá mọc so le, hình trứng hay trái xoan, dài 5- 18 cm, rộng 2.8- 9 cm, đầu
có mũi lồi ngắn, gốc nhọn dần, mặt trên lá màu lục sẫm, mặt dưới cólông tơ nhạt
Cuống lá Rộng từ 8- 20mm
Hoa Ra hoa vào tháng 5
Hoa đực mọc thành xim 3 hoa ở nách lá, có 2 lá bắc, có 14-24 nhị,thường là 16; hoa cái mọc đơn độc, đài xẻ 5 thùy, bầu có vòi nhụy và 4
ô, thường có vách giả chia làm 8 ngăn; hoa lưỡng tính thường có từ 8-12nhị
Quả Ra quả vào tháng 9 và tháng 10
Quả mọng 3,5 – 8cm, hình cầu hoặc hình trứng , nhẵn, phẳng hoặc có
sống dọc, mang đài tồn tại cong lên, khi chín màu vàng hoặc đỏ Hạt dẹt,màu nâu vàng hoắc nâu đen
Bảng 1; Các đặc điểm thực vật của lá hồng [13]
Trang 10Hình 1 Các dạng lá hồng (Diospyros kaki): a lá non b lá điển hình
c.lá vàng d.lá khô
Phân bố: Hồng được trồng nhiều ở Trung Quốc, Nhật Bản, các nước ASEAN,
ở phía Bắc vùng Địa Trung Hải
Diospyros kaki L.f loài nguyên sản ở Nhật Bản và Trung Quốc, sau được du
nhập sang các nước Đông Nam Á khác như ở vùng Bắc Thái Lan; đảo Java, Sumatra(Indonesia); Malaysia Ở Italia,Israel, Brazil, Mỹ (California) cũng trồng loại hồng
này [1].
Nhật Bản và Trung Quốc sản xuất nhiều hồng nhất thế giới Năm 1986, Nhật Bản có 27.000 ha cây hồng màu với sản lượng quả là 291.000 tấn Riêng đảo Sumatra(Indonesia) mỗi năm thu hoạch khoảng 1500 tấn xuất khẩu sang Singapore hoặc
Israel thường xuyên có khoảng 1500ha trồng [7] Hồng trồng ở Việt Nam hiện nay
cũng rất phổ biến ở các tỉnh phía Bắc từ Thanh Hóa trở ra và ở phía Nam thì có Đà Lạt Tuy nhiên nhiên ở Việt Nam, cây hồng chỉ được trồng chủ yếu để ăn quả
Trang 111.2 Thành phần flavonoid trong lá hồng
Flavonoid là thành phần hoạt chất chính trong lá hồng Lá hồng có chứa nhiều
flavonoid có lợi bao gồm quercetin và phức hợp glycoside của nó ( ví dụ: hyperin và
isoquercitrin), kaempferol và glycoside của nó (astragalin)
Cấu trúc của các flavonoid khác nhau được tìm thấy trong lá hồng được tổng
Trang 12Hình 2: Cấu trúc hóa học của một số flavonoid chính trong lá hồng
Trang 131.3 Tác dụng dược lý
1.3.1 Tác dụng bảo vệ thần kinh
Weijian Bei và cộng sự đã nhận thấy flavonoid trong lá hồng Trung Naoxinquin (NXQ) có khả năng chống lại sự tổn thương do H2O2 gây ra cho tế bàothần kinh NG108-05 Kết quả này đề ra triểm vọng sử dụng NXQ để phòng ngừa và
Quốc-điều trị chấn thương do thiếu máu cục bộ và các bệnh thoái hóa thần kinh khác [11].
Nghiên cứu này đã được thử nghiệm trên chuột với mức liều 40 và 80
mg/kg/ngày Kết quả là làm giảm đáng kể khối lượng nhồi máu não [12].
Qin và cộng sự đã thử nghiệm trên chuột với liều tiêm 20, 40 và 80 mg/kg thể
trọng Sau 4 tuần, huyết áp giảm đáng kể theo cách phụ thuộc liều [13].
1.3.3 Tác dụng chống xơ vữa động mạch
Dịch chiết lá hồng cho thấy tác dụng chống xơ vữa động mạch bằng cách làm giảm triglyceide, cholesterol toàn phần và LDL-C, trong khi tăng tỷ lệ HDL trong huyết thanh ở chuột với chế độ ăn giàu chất béo ở chuột với chế độ ăn giàu chất béo
Sự tích tụ các giọt lipid gan ở những con chuột béo phì đã được giảm xuống Kết quảchỉ ra nồng độ lipid trong huyết tương và gan đã được cải thiện, một phần thông qua việc tăng lipid trong phân ở chuột ăn nhiều chất béo Nó có thể là do tính chất của các
hợp chất phenolic và hàm lượng chất xơ cao trong lá hồng [5].
bào MC3T3-E1 theo cách phụ thuộc liều [6].
Trang 14Weijian Bei và cộng sự đã nghiên cứu và nhận thấy cao chiết NXQ cải thiện sựsuy giảm các chất chống oxy hóa nội sinh như glutathione và GSH-Px cũng như CAT,
đồng thời làm giảm MDA [11].
1.3.5 Tác dụng hạ đường huyết
Một thử nghiệm trên những con chuột mắc bệnh tiểu đường đã được thực hiện:chúng sử dụng dịch chiết lá hồng hằng ngày bằng đường uống trong 8 tuần Kết quả giúp giảm trọng lượng cơ thể mà không cần giảm lượng thức ăn, các thông số lipid
máu, ức chế tích tụ mỡ ở gan đều cải thiện [9].
1.3.6 Tác dụng chống ung thư
Lá hồng có khả năng ức chế gây ung thư ở chuột Kawakami và các cộng sư đãnghiên cứu và nhận thấy điều trị bằng PLE (chiết xuất từ lá hồng) và PLEg (200- galloly moiety) làm tăng đáng kể độc tính tế bào của doxorubicin (DOX) trong các tế bào biểu mô tuyến A549 Kết quả cho thấy đây có thể là một chất hữu ích trong điều
trị ung thư bằng hóa trị [4].
1.3.7 Tác dụng miễn dịch
Xie và các cộng sự đã nghiên cứu tác dụng trên hệ thống miễn dịch của mộthợp phần được chiết xuất từ lá hồng Hoạt tính ức chế của nó đối với miễn dịch dịchthể có thể làm giảm tác động có hại đến tim mạch bằng cách ức chế sản xuất kháng
thể hoặc giúp cải thiện các nguy cơ viêm tim [13].
1.3.8 Tác dụng chống dị ứng
Có một số chất chống dị ứng trong dịch chiết lá hồng có thể ức chế giải phóng histamine từ người Thử nghiệm trên chuột (bằng đường uống) của Muhammad Kashif và các cộng sự đã cho kết quả về khả năng ức chế sự phát triển của viêm da và
hiện tượng sừng hóa cũng giảm đi đáng kể [3]
Trang 15CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu – Nguyên liệu và thiết bị
2.1.1 Đối tượng
Đối tượng nghiên cứu: là mẫu lá hồng được thu hái tại Lạng Sơn, được giám
định tên khoa học là Diospyros kaki L.f bởi khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dượcliệu
Thời gian thu hái: tháng 9 năm 2019
Mẫu lá hồng sau khi thu hái được sấy tại 50°C đến khô và bảo quản trong túinylon kín Mẫu được lưu trữ tại khoa Hóa thực vật –Viện Dược liệu trong điều kiệnnhiệt độ phòng, để nơi khô ráo, thoáng mát
2.1.2 Dung môi, hóa chất, thiết bị
2.1.2.1 Dung môi, hoá chất, dụng cụ
- Hạt nhựa D101
- Hóa chất: Dung môi dùng trong chiết xuất là dung môi công nghiệp đã cất lại.
- Các dụng cụ cần thiết trong quá trình thực nghiệm như bình nón, cốc có mỏ,ống nghiệm, pipet, phễu chiết,
- Xác định độ ẩm trên máy PRECISA HA60
- Cân phân tích Precisa XT 220A, độ chính xác 0,0001 g
- Thu hồi dung môi bằng máy cất quay Rotavapor R-114 của hãng BUCHI
- Máy rung siêu âm Power Sonic 405
Trang 162.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp hấp phụ
Hấp phụ là quá trình hút khí (hơi) hoặc lỏng trên bề mặt vật liệu xốp nhờ cáclực bề mặt Các vật liệu xốp được gọi là chất hấp phụ Chất khí (hơi) hoặc một chấttan nào đó trong dung dịch có khả năng được làm giàu trên bề mặt chất hấp phụ gọi làchất bị hấp phụ
Hấp phụ xảy ra do lực hút (lực Van der Waals, lực hóa trị) tồn tại ở trên và gầnsat bề mặt trong các mao quản
Quá trình chuyển chất hấp phụ xem như gồm ba giai đoạn:
- Giai đoạn khuyếch tán chất bị hấp phụ từ môi trường khí hay lỏng đến bề mặthạt chất hấp phụ
- Các chất bị hấp phụ khuyếch tán theo mao quản đến bề mặt chất hấp phụ
- Giai đoạn cuối cùng là tương tác hấp phụ
Giai đoạn đầu phụ thuộc vào tính chất vật lý và thủy động lực của môi trường.Hai giai đoạn sau phụ thuộc vào tính chất và cấu trúc chất hấp phụ
2.2.3 Đường chuẩn Kaempferol và Quercetin.
Việc định lượng K và Q lá hồng được dựa trên kết quả của đề tài: “Nghiên cứu tạo chế phẩm từ lá hồng (Diospyros kaki) để phòng và hỗ trợ điều trị tai biến mạch máu não” thuộc “Chương trình khoa học và công nghệ trọng điểm quốc gia phát triển
công nghiệp hóa dược đến năm 2020” Đề tài này đã xây dựng được phương phápđịnh lượng Q và K trong lá hồng Chương trình chạy được khảo sát các thông số phùhợp cho phân tích định lượng flavonoid tại Khoa Hoá Thực vật – Viện Dược liệu
Trang 17Tiến hành chạy HPLC
Sau khi chuẩn bị mẫu tiến hành chạy HPLC trên hệ thống
Chương trình chạy như sau:
+ Cột tách: Vertisef C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm)
+ Detector UV-VIS: bước sóng 360 nm
+ Pha động: Dung dịch đệm (A) – Methanol
+ Dung dịch đệm H3PO4 0,43% (A): Hút 3,0 ml H3PO4 85%, định mức chínhxác bằng nước thành 1000 ml, lắc đều, lọc, siêu âm loại bọt khí
Sau khi tiến hành khảo sát một số điều kiện: thể tích mẫu tiêm vào cột và hệdung môi pha động, thu được kết quả sau:
+ Hệ dung môi pha động: MeOH- H3PO4 0,43% = 55 – 45
Trang 18Hình 4: Sự phụ thuộc giữa nồng độ và độ hấp thụ quang của Quercetin
Phương trình đường chuẩn Kaempferol là y = 83101x- 117938 với hệ sốtương quan R² = 0.9998
Phương trình đường chuẩn Quercetin là y = 70003x – 24032 với hệ số tươngquan là R² = 1,0000
2.3 Quy trình thực hiện
2.3.1 Chuẩn bị nhựa
- Ngâm hạt nhựa D101 trong C96 (24h)
- Lọc, gạn D101
- Rửa lại nhựa D101 bằng nước
- Số gam nhựa được đem đi hấp phụ:
+ Đối với hấp phụ tĩnh: m(D101 ướt)= 3 x m(D101 khô)= 3 x n x m(cao)
(n là tỷ lệ số gam D101 khô/ số gam cao cần khảo sát)
+ Đối với hấp phụ động: m(D101 ướt)= 3 x m(D101 khô)= 8 x m(cao)