ứng dụng kỹ thuật pcr genotyping (orf75) trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng trên tôm sú (penaeus monodon)

Trong đó, bệnh đốm trắng do White spot syndrome virus gây ra là một trong những bệnh nguy hiểm nhất đối với tôm nuôi.. Do vậy đề tài “Ứng dụng kỹ thuật PCR- genotyping ORF75 trong nghiê

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

DIỆP THỊ DIỆU

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR GENOTYPING (ORF75) TRONG NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG

TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2009

LỜI CẢM TẠ

Xin chân thành cảm tạ Quý Thầy – Cô giảng viên Khoa Thủy Sản, trường Đại học Cần Thơ đã tận tâm giảng dạy, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian em học tập tại trường

Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn cô Trần Thị Tuyết Hoa - Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy Sản thuộc khoa Thủy Sản – trường Đại Học Cần Thơ đã tận tình giúp

đỡ, hướng dẫn em hoàn thành luận văn tốt nghiệp, tạo điều kiện để em có cơ hội học tập và nắm bắt thêm các phương pháp nghiên cứu khoa học

Chân thành cảm ơn các anh, chị ở bộ môn Sinh học và Bệnh thủy sản đã nhiệt tình

hỗ trợ, giúp đỡ tận tình trong suốt thời gian thực hiện luận văn

Xin cám ơn các bạn lớp Bệnh học thủy sản khóa 31 đã động viên, giúp đỡ, và trao đổi kiến thức trong suốt thời gian học tập, làm luận văn tốt nghiệp tại Khoa Thủy Sản

Xin chân thành cảm ơn và chúc Quý thầy cô và các anh, chị, bạn bè lời chúc sức khỏe và thành đạt

TÓM TẮT

Bệnh do tác nhân là virus gây ra trên tôm đang là một vấn đề nan giải cho nuôi

trồng thủy sản Việt Nam và thế giới Trong đó, bệnh đốm trắng do White spot

syndrome virus gây ra là một trong những bệnh nguy hiểm nhất đối với tôm nuôi

Các nghiên cứu về đặc điểm dịch tể của WSSV được thực hiện nhằm đề ra những biện pháp phòng ngừa hiệu qủa nhất để hạn chế đến mức thấp nhất thiệt hại do WSSV gây ra Và kỹ thuật PCR là một trong những công cụ quan trọng trong nghiên cứu dịch tể học của WSSV Do vậy đề tài “Ứng dụng kỹ thuật PCR-

genotyping (ORF75) trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng (White spot

syndrome virus – WSSV) trên tôm sú (Penaeus monodon)” được thực hiện

Qui trình PCR genotyping (ORF75) thực hiện với kết quả được ghi nhận: (i) thành phần hóa chất tham gia phản ứng là: PCR buffer nồng độ là 1X, nồng độ MgCl2 là 1,5 mM, nồng độ dNTPs là 200µM, nồng độ mồi xuôi và mồi ngược là 20 pmol, nồng độ taq ADN polymerase là 2 U, nồng độ ADN chiết tách 1 µl Tổng thể tích cho mỗi phản ứng là 25 µl, (ii) điều kiện phản ứng được thực hiện theo chu kỳ nhiệt là: máy được làm nóng đến 85oC Sau đó đến giai đoạn 94oC trong 3 phút,

94oC trong 30 giây, 49oC trong 30 giây, 72oC trong 60 giây lặp lại 30 chu kỳ và cuối cùng là 72oC trong 7 phút Tổng thời gian khuếch đại khoảng 1giờ 20 phút

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ i

TÓM TẮT ii

MỤC LỤC iii

DANH SÁCH BẢNG v

DANH SÁCH HÌNH vi

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh trên thế giới 3

2.1.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới 3

2.1.2 Tình hình dịch bệnh ở trên thế giới 3

2.2 Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh ở nước ta 4

2.2.1 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam 4

2.2.2 Tình hình dịch bệnh ở Việt Nam 6

2.3 Sơ lược về bệnh đốm trắng 8

2.3.1 Đặc điểm cấu tạo của WSSV 9

2.3.2 Dấu hiệu bệnh lý 10

2.3.3 Loài và giai đoạn cảm nhiễm 10

2.3.4 Phương thức lây nhiễm 11

2.3.5 Một số phương pháp phát hiện WSSV 12

2.3.6 Một số kết quả nghiên cứu dịch tể về bệnh đốm trắng 12

2.4 Kỹ thuật PCR và các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 14

2.4.1 Nguyên tắc phản ứng PCR 14

2.4 2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 15

2.4.3 Ứng dụng của PCR 16

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 18

3.1.1 Địa điểm 18

3.1.2 Thời gian thực hiện 18

3.2 Vật liệu nghiên cứu 18

3.2.2 Hóa chất thí nghiệm 18

3.2.3 Dụng cụ thí nghiệm 18

3.3 Phương pháp nghiên cứu 19

3.3.1 Qui trình phát hiện WSSV 19

3.3.2 Qui trình PCR genotyping (ORF75) 20

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 22

4.1 Ứng dụng qui trình PCR genotyping (ORF75) 22

4.2 Chu kỳ nhiệt 23

4.2.1 Chu kỳ phản ứng 23

4.2.2 Nhiệt độ gắn mồi 24

4.3 Hàm lượng ADN khuôn 25

4.4 Nồng độ mồi 25

4.5 Nồng độ MgCl2 26

4.6 Nồng độ taq ADN polymerase 27

4.7 Điều kiện phản ứng 28

4.8 Ứng dụng kỹ thuật PCR genotyping sau khi đã tối ưu 29

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 32

5.1 Kết luận 32

5.2 Đề xuất 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33

PHỤ LỤC 38

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Diện tích nuôi nước lợ qua các năm 5

Hình 2.2 Sơ đồ của phản ứng PCR 16

Hình 4.1: Kết quả 3 mẫu chạy với qui trình PCR genotyping (ORF75 22

Hình 4.2: Kết quả 10 mẫu chạy với qui trình PCR genotyping (ORF 75) 23

Hình 4.3: Kết quả qui trình PCR genotyping (ORF75) với các nhiệt độ gắn mồi khác nhau 24

Hình 4.4: Kết quả qui trình PCR genotyping (ORF75) với các nồng độ mồi 28

Hình 4.5: Kết quả qui trình PCR genotyping (ORF75) với các nồng độ MgCl2 27 Hình 4.6: Kết quả qui trình PCR genotyping (ORF75) với các nồng độ taq ADN polymerase 28

Hình 4.7: kết quả ba mẫu có cường độ nhiễm khác nhau 29

Hình 4.8: Kết quả ứng dụng 8 mẫu nhiễm WSSV thu ở Cà Mau 31

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

Việt Nam là một nước có điều kiện tự nhiên rất thuận lợi cho việc phát triển thủy sản Ngành thuỷ sản là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của quốc gia Trong những năm gần đây phong trào nuôi tôm ở Việt Nam đã đạt những thành tựu khả quan Tuy nhiên, song song với việc tăng diện tích nuôi, tăng sản lượng, tăng mức độ thâm canh thì bệnh dịch thủy sản là một mối nguy lớn đối với nghề nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là bệnh do virus gây ra đã làm sản lượng tôm giảm một cách đáng kể

Với khả năng lan truyền bệnh và gây chết tôm hàng loạt, bệnh virus đã gây thiệt hại lớn và ảnh hưởng không nhỏ đến nền kinh tế của nhiều quốc gia có nghề nuôi tôm phát triển Đặc biệt là bệnh đốm trắng (White spot disease-WSD), bệnh đầu vàng (Yellow head disease - YHD), bệnh đỏ đuôi (do Taura syndrome virus-TSV)… Vì hiện nay bệnh virus trên tôm chưa có thuốc đặc trị, nên công tác phòng ngừa và chẩn đoán bệnh sớm là điều rất cần thiết Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như mô bệnh học hay dựa trên dấu hiệu bệnh lý bên ngoài không giúp phát hiện sớm và chính xác tác nhân gây bệnh Vì vậy, việc ứng dụng công nghệ sinh học vào trong chẩn đoán bệnh là một bước phát triển giúp người nuôi tôm có những giải pháp kịp thời nhằm làm giảm thiệt hại do virus gây ra Kỹ thuật PCR là một trong những kỹ thuật chẩn đoán bệnh khá nhạy Kỹ thuật này không những giúp phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm mà còn được dùng như là 1 công cụ để nghiên cứu dịch tể học của bệnh và tác nhân gây bệnh Qua đó, các phương pháp phòng và trị bệnh được xây dựng để giúp ngươi nuôi hạn chế thiệt hại đến mức thấp nhất do dịch bệnh gây ra và nâng cao năng suất nuôi Do vậy,

đề tài “ứng dụng kỹ thuật PCR genotyping (ORF75) trong nghiên cứu tác

nhân gây bệnh đốm trắng trên tôm sú (Penaeus monodon)” được thực hiện

Mục tiêu đề tài

Chuẩn hóa qui trình PCR- genotyping (ORF 75) để góp phần vào việc nghiên cứu dịch tể học của tác nhân gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long

Nội dung thực hiện

Xác định chu kỳ nhiệt, thành phần và nồng độ hóa chất thích hợp cho phản ứng PCR- genotyping (ORF75)

Xác định khả năng ứng dụng của qui trình PCR- genotyping (ORF75) sau khi đã tối ưu để phân tích một số mẫu tôm bị nhiễm WSSV

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh trên thế giới 2.1.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới

Hiện nay, nghề nuôi tôm biển đã và đang giữ vai trò quan trọng trong nền kinh tế của nhiều nước trên thế giới Từ những năm 1980 với sự phát triển mạnh mẽ của nghề nuôi tôm biển cả về qui mô và mức độ thâm canh đã làm cho sản lượng tôm tăng vọt Trong giai đoạn 2000-2003, sản lượng nuôi trồng thủy sản của châu Á hiện chiếm tới 90% về sản lượng và 80% về giá trị nuôi trồng thủy sản của thế giới

Theo thống kê của FAO (2004), hàng năm tỉ lệ tăng trung bình của nuôi trồng thủy sản tính từ năm 1970 đến năm 2002 là 8,9 % Sản lượng nuôi trồng thủy sản thế giới năm 2002 đạt 51,4 triệu tấn Trong đó sản lượng tôm đạt khoảng 1,29 triệu tấn (trích dẫn bởi Phạm Minh Đức, 2004) Các loài tôm được nuôi nhiều

nhất là tôm sú (Penaeus monodon), tôm thẻ Trung Quốc (Penaeus chinensis) và tôm chân trắng (Penaeus vannamei) Riêng 3 loài tôm này chiếm trên 86% sản

lượng tôm nuôi của thế giới Tôm sú hiện nay được nuôi ở khắp nơi trên thế giới, đặc biệt là ở khu vực Châu Á Thái Bình Dương (chiếm 72%) và Mỹ La Tinh (chiếm 28%) Năm 2003, hai loài tôm sú và tôm thẻ chân trắng chiếm tới 77% tổng sản lượng tôm nuôi (thông tin chuyên đề Bộ Thủy Sản, sô 4/2003)

2.1.2 Tình hình dịch bệnh ở trên thế giới

Do việc gia tăng hoạt động nuôi trồng thủy sản đã dẫn tới sự bùng nổ dịch bệnh, bệnh do vi khuẩn và virus trên tôm, gây tổn thất lớn về kinh tế trong ngành thủy sản Bệnh trên tôm, nhất là bệnh do virus luôn là nỗi lo của người nuôi trồng và là mối quan tâm hàng đầu của các nhà khoa học Mặc dù virus gây bệnh trên tôm thì không có ảnh hưởng gì đến sức khỏe con người nhưng nó gây tổn thất lớn cho người nuôi tôm

Trong những năm 1980 Đài Loan dẫn đầu thế giới về sản lượng tôm Nhưng đến

1988 dịch bệnh xảy ra đã làm sụp đổ nghề nuôi tôm của nước này Còn Indonesia

là một nước có nghề nuôi tôm xuất hiện lâu đời nhất ở Châu Á và là một trong những nước dẫn đầu về sản lượng tôm nuôi trong vùng Tốc độ phát triển của

nghề nuôi tôm tương đối vững chắc Nhưng vào năm 1992 dịch bệnh xuất hiện và

đã gây thiệt hại khoảng 80% cho các trang trại nuôi tôm thâm canh ở nước này Cũng như Đài Loan, Trung Quốc là một trong những nước dẫn đầu thế giới về sản lượng tôm nhưng vào năm 1993 bệnh dịch đã làm cho những người nuôi tôm tại Trung Quốc thiệt hại 400 triệu USD; năm 1994 Ấn Ðộ thiệt hại 17,6 triệu USD, năm 1997 nghề nuôi tôm ở Thái Lan thiệt hại 600 triệu USD; năm 1999 bệnh tôm đã làm Ecuađor thiệt hại 280 triệu USD

Theo số liệu thống kê của bộ thủy sản cho thấy sản lượng tôm nuôi trên thế giới giảm từ 676.262 tấn (2001) còn 593.011 tấn (2002) (thông tin chuyên đề Bộ Thủy

Sản số 4/2005)

Ở khu vực Đông Nam Á - bệnh đốm trắng được xem là nguy hiểm nhất đối với tôm nuôi Mọi nghiên cứu đều tập trung ngăn ngừa sự lây nhiễm và bùng nổ bệnh đốm trắng ở các ao nuôi Virus đốm trắng có thể nhiễm vào tôm nuôi từ giai đoạn

ấu trùng Vì vậy, các biện pháp chọn lựa con giống tốt không mang mầm bệnh là một trong những biện pháp góp phần làm hạn chế dịch bệnh (Nguyễn Văn Hảo, 2004)

2.2 Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh ở nước ta 2.2.1 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam

Việt Nam là một nước có nhiều tiềm năng để phát triển nuôi trồng thuỷ sản ở khắp mọi miền đất nước cả về nuôi biển, nuôi nước lợ và nuôi nước ngọt Theo điều tra sơ bộ của tổng cục thống kê năm 2007 tổng diện tích mặt nước nuôi trồng thủy sản cả nước là 1008 nghìn ha trong đó diện tích nuôi tôm chiếm 625,6 nghìn

ha Tôm luôn là đối tượng nuôi chủ lực của Việt Nam do giá trị xuất khẩu của chúng cao Diện tích nuôi tôm ngày càng tăng qua các năm, diện tích tôm nuôi trong năm 2007 tăng gấp 2 lần so với măn 2000 Sự gia tăng diện tích nuôi được biểu hiện qua hình 2.1 (số liệu của tổng cục thống kê, 2007)

0.0 100.0 200.0 300.0 400.0 500.0 600.0 700.0

Năm nghìn ha

Hình 2.1: Diện tích nuôi nước lợ qua các năm Trong năm 2007, diện tích nuôi tôm nước lợ chiếm 62% tổng diện tích mặt nước nuôi trồng thủy sản của cả nước, với sản lượng là 386,6 nghìn tấn, chiếm 19% tổng sản lượng nuôi trồng thủy sản cả nước Theo số liệu của tổng cục thống kê cho thấy ở diện tích và sản lượng tôm nuôi chủ yếu tập trung ở đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) Trong năm 2007 diện tích nuôi tôm của ĐBSCL chiếm 71% tổng diện tích nuôi tôm của cả nước, với sản lượng là 315.435 tấn, chiếm 82% tổng sản lượng tôm nuôi của cả nước Các tỉnh có diện tích nuôi tôm nhiều nhất là các tỉnh thuộc ĐBSCL, gồm Cà Mau (279,2 nghìn ha), Bạc Liêu (123,8 nghìn ha), Kiên Giang (103,5 nghìn ha), Sóc Trăng (64,3 nghìn ha), Trà Vinh (48,3 nghìn ha) Song song với việc mở rộng diện tích, sản lượng tôm nuôi cũng tăng mạnh từ 32,7 nghìn tấn (1990) lên đến 386,6 nghìn tấn (2007) Năm 2003 sản lượng tôm của Việt Nam đứng hàng thứ 3 trên thế giới Các loài tôm nuôi chính ở

Việt Nam gồm tôm sú (Penaeus monodon), tôm he mùa (Penaeus merguiensis), tôm nương (Penaeus orientalis), tôm đất/rảo (Metapenaeus ensis), trong đó tôm

sú là loài nuôi chủ đạo, đóng góp sản lượng cao nhất (thông tin chuyên đề Bộ Thủy Sản số 2/2005)

Theo thông tin do Bộ Thủy sản (2008) đưa ra tại hội nghị tổng kết công tác nuôi trồng thủy sản giai đoạn 2001 – 2005 là: so với năm 1999, sản lượng nuôi trồng thủy sản năm 2005 đã tăng gấp 3 lần (đạt 1,437 triệu tấn); diện tích nuôi trồng tăng 0,83 lần (đạt 959.945 ha); sản lượng tôm sú giống sản xuất trong nước tăng gấp 4 lần (đạt 28,8 tỉ con P15)…Với tổng số vốn đầu tư 13.822 tỉ đồng (ngân

sách trung ương) giai đoạn 2000 - 2005, nhiều dự án nuôi trồng đã được triển khai mạnh mẽ và có hiệu quả cao tại các địa phương (Quảng Ninh, Thái Bình, Thanh Hoá, Quảng Bình, Trà Vinh…)

2.2.2 Tình hình dịch bệnh ở Việt Nam

Trong những năm qua từ 1990- 2007, sản lượng tôm nuôi của nước ta tăng một cách đáng kể Tuy nhiên do sự phát triển quá ồ ạt của nghề nuôi tôm ven biển còn dẫn đến sự bùng nổ dịch bệnh trên diện rộng, gây thiệt hại không nhỏ cho người dân cũng như các ngành kinh tế liên quan Vào giữa năm 1994, bệnh tôm xảy ra rộng khắp các tỉnh phía Nam đã gây thiệt hại lớn về kinh tế và ảnh hưởng sâu rộng về xã hội ở những nơi có bệnh (http://www.fistenet.gov.vn/details.asp? Object=101262&news_ID=261151456)

Theo ước tính của Bộ Thuỷ sản (1996), dịch bệnh tôm ở các tỉnh ĐBSCL trong các năm 1994-1995 đã ảnh hưởng tới 85.000 ha và gây thiệt hại 294 tỉ đồng Và trong các năm 2001, 2002 dịch bệnh tôm tiếp tục đe doạ và gây ảnh hưởng lớn ở khu vực ĐBSCL Theo báo cáo kết quả nuôi trồng thủy sản năm 2003 của ngành:

cả nước có 546.757 ha nuôi tôm nước lợ thương phẩm, trong đó diện tích có tôm nuôi bị bệnh và chết là 30.083 ha Các tỉnh, thành ven biển từ Ðà Nẵng đến Kiên Giang có tới 29.200 ha nuôi tôm bị chết nhiều, chiếm 97,06% diện tích có tôm bị chết trong cả nước Nguy hiểm nhất là bệnh đốm trắng, bệnh đầu vàng, bệnh MBV, bệnh do ký sinh trùng, do dinh dưỡng và gần đây xuất hiện thêm bệnh phân trắng, teo gan ở một vài nơi Bệnh thường lan truyền từ mẹ sang con, lây lan

từ nơi này sang nơi khác, lây nhiễm từ nguồn tôm giống chưa sạch bệnh (thông tin chuyên đề Bộ Thủy Sản 2/2005)

Bệnh do virus gây ra trên tôm đang là một thảm họa cho nền sản xuất nuôi trồng thủy sản cho Việt Nam và thế giới Hiện tại các loại virus gây bệnh trên tôm sú

đang phổ biến tại Việt Nam là virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV – White

spot syndrome virus), virus gây hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô

(Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus -IHHNV), virus gây còi (Monodon baculovirus- MBV), virus gây đầu vàng (Yellow head virus -

YHV ), …Trong đó, WSSV gây chết tôm hàng loạt, tác hại lớn đến năng suất, sản lượng tôm của khu vực (Nguyễn Văn Hảo, 2003) Các tỉnh ở Bắc Trung Bộ (2004) như Thanh Hóa có hơn 40% diện tích nuôi tôm bị bệnh; Nghệ An có 9,1- 47,8% diện tích nuôi tôm bị bệnh đốm trắng; 25,6 - 30,4% bị bệnh MBV; 25- 54,5% bị bệnh đầu vàng Ở Hà Tĩnh, trong số 150 ha nuôi tôm bị bệnh, có 67 ha

bị bệnh đốm trắng, trong đó 27 ha có tôm nuôi bị chết Trong năm 2004 các tỉnh miền Trung và Nam Trung Bộ thì Ninh Thuận là tỉnh có có tỉ lệ diện tích nuôi tôm bị bệnh cao nhất (52,4%) Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm trắng ở tôm nuôi tại khu vực này tuy có giảm nhưng bệnh phân trắng, teo gan lại xảy ra hầu hết ở các vùng nuôi trọng điểm như Ninh Hải, Phan Rang, Ninh Phước có những nơi lên tới 90- 95% tôm bị nhiễm bệnh, đặc biệt là ở những vùng nuôi trên cát (Quang, 2007) Theo kết quả nghiên cứu của Viện nghiên cứu NTTS II trong năm 2004 tại các tỉnh Nam Bộ - khu vực nuôi tôm lớn nhất của cả nước, tỉ lệ nhiễm bệnh virus đốm trắng ở đầm nuôi quảng canh cải tiến là 56%, còn bệnh MBV là 50% Bệnh virus đốm trắng gây chết tôm hàng loạt, tác hại lớn đến năng suất, sản lượng tôm của khu vực Theo ước tính của Bộ Thủy sản, thất thoát do bệnh virus gây ra cho tôm

sú vào khoảng 30% – 50% sản lượng thu hoạch (Hà Anh, 2007)

Do tác động của dịch bệnh đến năng suất nuôi, Bộ Thủy sản đã có những nỗ lực lớn và phối hợp với chính quyền địa phương và các trường đại học, các viện nghiên cứu trong và ngoài ngành thủy sản để phòng ngừa và dập tắt dịch bệnh Bên cạnh đó, để góp phần giảm thiểu sự lan truyền dịch bệnh thông qua việc xuất nhập động vật thủy sản tài liệu “hướng dẫn kỹ thuật về quản lý thú y thủy sản đối với việc vận chuyển có trách nhiệm các động vật thủy sinh của khu vực châu Á”

đã được xây dựng, nhằm làm giảm thiểu nguy cơ lan truyền mầm bệnh và lây lan bệnh giữa các nước trong cùng khu vực

Riêng bệnh đốm trắng, để phòng bệnh hiệu qủa cần phải áp dụng các phương pháp sau: (i) Tránh vận chuyển tôm từ nơi có bệnh đến nơi chưa phát bệnh để hạn chế lây lan bệnh sang vùng lân cận, (ii) Quản lý chế độ cho ăn tốt, (iii) Nước trong ao tôm bệnh trước khi thải ra ngoài phải xử lý bằng vôi nung hoặc chlorine, (iv) Tôm chết phải vớt ra khỏi ao tốt nhất là nên chôn trong vôi nung hoặc đốt, (v) Nếu tôm quá nhỏ không đáng thu hoạch thì cần xử lí nước ao trước khi tháo bỏ (Bùi Quang Tề , 2006)

Bên cạnh đó cần: kiểm tra giống đầu vào đảm bảo là giống không nhiễm bệnh, không nuôi mật độ quá dày, chọn mùa vụ nuôi thích hợp, không thả tôm nuôi khi nhiệt độ thấp, thời tiết có nhiều biến động, ao nuôi phải được rào lưới xung quanh

để ngăn chặn cua còng mang mầm bệnh vào ao, phải có ao lắng xử lý nước trước khi cấp vào ao nuôi, sử dụng hoàn toàn bằng thức ăn công nghiệp, tốt nhất không nên sử dụng thức ăn tươi sống vì mầm bệnh dễ lây lan, tránh gây sốc cho tôm (Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Hải, 2004)

2.3 Sơ lược về bệnh đốm trắng

Trong những năm 90 sản lượng nuôi tôm trên thế giới tăng chậm Nguyên nhân chủ yếu dẫn đến sự suy giảm này là do virus gây ra (Lotz, 1997) Những tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng có thể dùng kháng sinh hoặc vacxin

để trị, còn tác nhân gây bệnh là virus thì không thể dùng cách như vậy để trị

(Teunissen et al., 1998). Bệnh đốm trắng là một trong những bệnh nguy hiểm nhất đối với tôm nuôi hiện nay (Rosenberry, 2004 )

Năm 1992, WSSV lần đầu tiên xuất hiện ở Đài Loan và gây thiệt hại lớn cho tôm nuôi ở miền Bắc Đài Loan Và bệnh đốm trắng nhanh chóng lây lan sang nhiều nước ở Đông Nam Á Cuối năm 1993 virus này được tìm thấy ở Nhật Bản và trong những năm gây đây virus này nó đã xuất hiện và gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm ở nhiều nước trên thế giới Lúc đầu bệnh đốm trắng chỉ xuất hiện ở châu

Á nhưng cho đến tháng 11-1995 người ta đã phát hiện ra bệnh đốm trắng ở Mỹ (Texas và South-Carolina) và nó đã gây chết hàng loạt tôm nuôi ở đây Đầu năm

1999 nó đã được tìm thấy ở Nam Mỹ, và nó đã gây ra thiệt hại lớn cho các trang trại nuôi tôm ở Nam Mỹ Cuối năm 1999 bệnh đốm trắng xuất hiện ở Ecuador

(van Hulten ,2001) Đến năm 2002, bệnh đốm trắng được báo cáo là phát hiện

trên các loài giáp xác ngoài tự nhiên ở châu Âu (Pháp) và vùng Trung Đông

(Iran) (Rosebery, 2002 trích dẫn bởi Marks et al., 2005) WSSV xuất hiện ở nhiều vùng khác nhau và với nhiều tên gọi khác nhau như hypodermal and

haematopoietic necrosis baculovirus (HHNBV) (Durand , 1997), third Penaeus monodon non-occluded baculovirus (PmNOB III) (Wang , 1995), rod- shapednuclear virus of penaeus japonicus (RV-PJ) (Inouye et al, 1996), penaeid rod-shaped ADN virus (Venegas et al, 2000), systemic ectodermal and mesodermal baculovirus (SEMBV) (Wongteerasupaya et al 1995) hoặc white spot baculovirus (WSBV) (Lightner, 1996) Cho đến năm 2002 Hội nghị quốc tế

phân loại virus lần thứ 12 (International committee on Taxonomy of viruses - ICTV) tại Paris mới thống nhất, virus gây Hội chứng đốm trắng thuộc giống

Whispovirus – họ Nimaviridae, với tên gọi chung là White spot syndrome virus

(trích dẫn bởi Trần Thị Tuyết Hoa, 2004)

Bảng 2.1 : Quá trình bộc phát bệnh đốm trắng ở châu Á và châu Mỹ

(Escobedo-Bonilla C M et al., 2008)

Thời gian bệnh được phát hiện

Quốc gia Tài liệu tham khảo

1992 Đài Loan Chou et al 1995

1993 Trung Quốc, Nhật Bản,

Hàn Quốc

Zhan 1998; Inouye et al 1994; Park et al 1998

1994 Thái Lan, Ấn Độ, Bangladesh Lo et al 1996a; Karunasagar

1997; Mazid & Banu 2002

1995 Mỹ Lightner, 1996; Wang et al

1999a

1996 Indonesia, Malaysia, Sri Lanka

Durand et al 1996;

Kasornchandra et al 1998; Rajan et al 2000

1997 Việt Nam Bondad-Reantaso 2001

1998 Pe-ru Rosenberry 2001

1999

Philippin, Ecuador, Colombia, Panama´ ,Honduras, Nicaragua, Guatemala, Belice

Magbanua , 2 000; Reantaso et al 2001; Hossain et

Bondad-al 2001; Wu et Bondad-al 2001

1999 -

2000 Mehico Bondad-Reantaso et al, 2001

2002 Pháp, Iran Dieu et al 2004; Marks 2005

2005 Brazil APHIS-USDA 2005

2.3.1 Đặc điểm cấu tạo của WSSV

WSSV có dạng hình trứng, có đuôi, acid nhân là ADN 2 mạch, không có thể ẩn, chỉ có thể vùi trong nhân của tế bào mang, biểu bì ruột, dạ dày và tế bào biểu bì dưới vỏ, cơ quan lympho (trích dẫn bởi Trần Thị Tuyết Hoa, 2004) Trong hệ gen

của WSSV có A và T chiếm 59% (Escobedo-Bonilla et al., 2008), WSSV có kích

thước khá lớn đường kính khoảng 65-70 nm và dài 300 -350 nm (van Hulten el

al.; 2001)

WSSV là một trong những virus có hệ gen lớn nhất được phát hiện (khoảng 300kb) Kích cỡ hệ gen của WSSV khác nhau tùy theo từng vùng khác nhau,

virus được phân lập ở Thái Lan (WSSV- TH) là 292.967 bp (van Hulten et al.,

2001) Còn hệ gen của WSSV được phân lập từ Đài Loan (WSSV-TW) kích thước là 307.287 bp, hệ gen của WSSV được phân lập từ Trung Quốc (WSSV-

CN) là 305.107 bp (Marks et al, 2005)

Virus có ít nhất 5 lớp protein VP28, VP26, VP24, VP19, VP15 với trọng lượng

phân tử tương ứng là 28, 26, 24, 19, 15 kDa (Escobedo-Bonilla , 2008) VP28 và VP19 cấu tạo nên màng bao, VP26, VP24, VP15 cấu tạo nên nucleocapsid (van

Hulten et al., 2000 trích dẫn bởi Marks et al., 2005)

Hệ gen của WSSV có chứa khoảng 531 đến 684 ORF (open reading frames), trong đó có từ 181- 184 ORF có chức năng mã hóa protein có kích thước từ 51 đến 6077 acid amin Trong đó vùng ORF75, ORF94 và ORF125 có thể được sử dụng để nghiên cứu về dịch tể học của WSSV bằng phương pháp PCR

(Escobedo-Bonilla , 2008)

WSSV có thể tồn tại trong môi trường nước ít nhất là 30 ngày ở 300C (điều kiện

phòng thí nghiệm) (Momoyama et al., 1998) và có thể tồn tại ít nhất 3-4 ngày

trong môi trường nước ở 250C (Chang et al., 1998).

2.3.2 Dấu hiệu bệnh lý

Tôm bị bệnh đốm trắng thường xuất hiện các dấu hiệu bệnh lý như sau: trên vỏ tôm có nhiều đốm trắng có đường kính từ 0,5 -2,0 mm (Lightner, 1996) Những đốm trắng thường xuất hiện ở phần đầu ngực và ở phần đuôi (đốt bụng thứ 5 và 6) Các đốm trắng thường có kích thước đều nhau tròn và có tâm trong Ngoài ra, khi tôm bị bệnh còn có các dấu hiệu khác như: khi tôm bị bệnh đốm trắng ở giai đoạn đầu tôm thường tập trung ở gần bờ ao, cơ thể và phụ bộ có màu hơi đỏ, tôm giảm ăn, virus đốm trắng gây ảnh hưởng đến dạ dày, mang, lớp biểu bì dưới vỏ, gan tụy Ở giai đoạn sau nó ảnh hưởng đến tế bào lympho, tuyến râu, cơ, ruột giữa, ở giai đoạn sau khi tôm bị bệnh nặng các cơ quan như dạ dày, mang, lớp tế bào biểu mô dưới vỏ, cơ quan lympho, gan tụy, tuyến râu sẽ bị hoại tử (Chang , 1996) Tỉ lệ chết tích lủy là 100% sau khi bệnh bộc phát khoảng 3-10 ngày (Lightner, 1996)

2.3.3 Loài và giai đoạn cảm nhiễm

Virus này gây bệnh trên nhiều đối tượng tôm nuôi như F setiferus and L

vannamei (ở Mỹ), F Chinensis và M japonicus (Trung Quốc), P monodon

(Indonesia, Thái Lan, Malaysia, Đài Loan), M japonicus (Nhật Bản) Ngoài ra,

WSSV còn có thể ký sinh trên các loài giáp xác khác ở vùng nước ngọt, nước lợ, vùng nước mặn như cua biển và tôm hùm Tuy nhiên WSSV không gây chết cho

những loài này mà những loài này chỉ là vật mang mầm bệnh (Lo et al., 1996)

WSSV không những gây bệnh cho các loài tôm nuôi mà còn gây bệnh cho các loài tôm ngoài tự nhiên Vì vậy cần phải có nhiều biện pháp để phòng bệnh hợp lý Virus này gây bệnh trên tất cả các giai đoạn tôm nuôi từ giai đoạn trứng cho đến giai đoạn bố mẹ Tuy nhiên bệnh thường gặp nhất là ở giai đoạn hậu ấu trùng, tiền trưởng thành và trưởng thành Và tỉ lệ chết cao nhất là khi tôm nuôi 1-2 tháng Bệnh thường xuất hiện khi tôm bị sốc (chẳng hạn như khi nồng độ muối thay đổi đột ngột hoặc nhiệt độ nước xuống thấp dưới 300

C thì bệnh sẽ bệnh bộc phát nhanh chóng) (Jiravanichpaisal , 2004)

2.3.4 Phương thức lây nhiễm

WSSV có thể lây theo chiều dọc và chiều ngang Lây nhiễm theo chiều ngang chủ yếu là do ăn thịt lẫn nhau (tôm khỏe ăn thịt tôm bệnh, hoặc ăn các thức ăn bị

nhiễm WSSV), hoặc lây nhiễm theo nguồn nước (Chou et al., 1998)

Theo Bùi Quang Tề (2006) bệnh đốm trắng lây truyền theo phương ngang là chủ yếu Virus này chủ yếu lây từ các giáp xác khác (tôm cua, chân chèo) nhiễm bệnh đốm trắng từ môi trường bên ngoài ao hoặc ngay bên trong ao nuôi tôm Những con tôm khỏe ăn những con tôm bị bệnh đốm trắng chết bị làm cho bệnh lây lan càng nhanh hơn Có thể một số loài chim nước đã ăn tôm bệnh đốm trắng từ ao khác và bay đến ao nuôi đã mang theo các mẫu thừa vào ao nuôi Theo ông bệnh đốm trắng không có khả năng lây truyền qua theo phương thẳng đứng vì trứng bị bệnh đốm trắng thì không thể thành thục được Nhưng trong quá trình đẻ trứng tôm bố mẹ thải ra các virus đốm trắng từ trong buồng trứng, do đó ấu trùng tôm

dể dàng bị nhiễm virus ngay từ giai đoạn sớm Theo Lo (1997) thì WSSV ngoài

lây truyền theo phương ngang thì nó cũng có lây từ mẹ sang con nhưng những virion của WSSV có hiện diện bên trong trứng hay không thì chưa xác định được

2.3.5 Một số phương pháp phát hiện WSSV

Chẩn đoán là việc xác định căn nguyên của bệnh thông qua các triệu chứng của bệnh (bệnh lý học lâm sàng) Kỹ thuật được sử dụng để chẩn đoán bệnh rất đa dạng và phong phú, từ quan sát đơn giản cho đến các thiết bị hiện đại dựa trên cơ

sở kỹ thuật sinh học phân tử Hiện nay có nhiều phương pháp chẩn đoán bệnh do WSSV gây ra như:

– Dự chẩn: dựa vào dấu hiệu bên ngoài, làm tiêu bản ướt (wet-mounts)

– Kiểm tra khẳng định: kính hiển vi điện tử (TEM), lai tại chổ (In situ

hybridisation –ISH), PCR (Polymerase chain reaction), hóa mô miễn dịch

Trong đó, phương pháp chẩn đoán dựa vào dấu hiệu bệnh lý bên ngoài, TEM, hóa

mô miễn dịch, lai tại chổ ít được sử dụng trong chẩn đoán bệnh đốm trắng cho tôm ở giai đoạn ấu trùng (larvae), hậu ấu trùng do những phương pháp này có hạn chế về mặt chi phí và độ chính xác

2.3.6 Một số kết quả nghiên cứu dịch tể về bệnh đốm trắng

WSSV là một trong những virus gây thiệt hại cho nghề nuôi tôm biển trên thế giới Vì vậy, WSSV đã làm cho không ít nhà khoa học tham gia vào nghiên cứu dịch tể học phân tử của virus gây bệnh WSSV Và đã đạt được nhiều thành tựu quan trọng Hiện nay, trình tự bộ gen của WSSV đã được giải mã và cho thấy WSSV là một trong những virus với acid nhân là ADN có kích thước lớn So sánh trình tự cả bộ gen của 3 dòng WSSV phân lập trên tôm từ Thái Lan, Đài Loan và Trung Quốc cho thấy sự tương đồng của 3 dòng WSSV là 99,32% và xác định được một số vùng có trình tự lặp lại thuộc ORF75, ORF94 và ORF125 Đây

là một trong những ORFs được sử dụng để phân tích sự khác nhau và các dòng

đặc trưng của WSSV (Pradeep et al., 2007)

ORF75 ở tất cả những WSSV được phân lập thì vùng ORF75 có 2 loại trình tự lặp lại (repeat units- RUs), với kích cỡ là 102bp và 45bp Trong đó, 45 nucleotide đầu tiên của trình tự lặp lại 102 bp giống với trình tự lặp lại 45bp Đối với ORF94 vùng lặp lại có kích thước là 54 bp, vùng lặp lại thuộc ORF125 có kích thước là

69 bp (Bui Thi Minh Dieu , 2004) ORF75 và ORF94 đều mã hóa cho đoạn protein chỉ hiện diện trong virion của WSSV, vùng lặp lại của 2 ORFs này mã hóa cho đọan protein có trình tự như sau: đầu tiên là arginine hoặc lysine, tiếp theo là 2 alanine, đến 2 hoặc 3 proline sau đó là một dãy các acid amimo acid (aspartate, glutamate) (Bui Thi Minh Dieu , 2004) Còn ORF125 có trình tự lặp lại là 69 bp (Bui Thi Minh Dieu , 2004)

Ở Thái Lan Wongteerasupaya et al (2003) đã phân tích 65 mẫu tôm từ 55 ao để

xác định số lần lặp lại của trình tự lặp lại thuộc ORF94 Nghiên cứu đã phát hiện như sau: trình tự lặp lại thuộc ORF94 có số lần lặp lại nằm trong khoảng 6 đến 20, trong đó các mẫu có 8 vùng lặp lại chiếm đa số (32%)

Ở Việt Nam vào năm 2004, Bui Thi Minh Dieu et al cũng nghiên cứu về vùng lặp

lại thuộc ORF94 (6 ao ở miền Trung, 2 ao ở miền Nam) Kết quả được ghi nhận như sau: số vùng lặp lại thuộc ORF94 của tôm bị bệnh đốm trắng ở Việt Nam nằm trong khoảng 7 đến 17 vùng Tiếp theo, năm 2006 Lê Vân Hải Yến đã khảo sát vùng lặp lại thuộc ORF94 ở 2 tỉnh Trà Vinh và Sóc Trăng Kết quả nghiên cứu

đã xác định ở Trà Vinh số vùng lặp lại thuộc ORF94 chỉ có 3 nhóm là: 5, 8, 9 còn

ở Sóc Trăng thì có số vùng lặp lại thuộc ORF94 là 5, 7, 8, 12 Trong đó các mẫu

có 8 vùng lặp lại chiếm tỉ lệ cao nhất (50% ở Sóc Trăng và 57,1% ở Trà Vinh)

Kế tiếp là nhóm tác giả Trần Thị Tuyết Hoa đã khảo sát 169 mẫu tôm bệnh đốm trắng thu từ 19 ao ở Cà Mau, Bạc Liêu đã ghi nhận: ở ao nuôi tôm Bạc Liêu số trình tự lặp lại thuộc ORF94 trên bộ gen của WSSV là từ 4 đến 16 vùng; trong đó kiểu gen WSSV với 5 vùng lặp lại chiếm tỉ lệ cao nhất (48.8%) (Trần Thị Tuyết

Hoa và ctv, 2008) Vào năm 2008, Lý Ngọc Hà cũng khảo sát sự biến đổi của

trình tự lặp lại thuộc ORF94 của WSSV trên tôm tại Bạc Liêu và được ghi nhận

là số vùng lặp lại thuộc ORF94 gồm 6 nhóm là: 4, 6, 7, 8, 9, 12 Trong đó, kiểu gen WSSV với 7 vùng lặp lại thuộc ORF94 chiếm tỉ lệ cao nhất (34,48%) Đặc biệt là có sự nhiễm đa dòng WSSV trong cùng một ao, và kiểu gen WSSV đang tồn tại ở Bạc Liêu là rất đa dạng Còn ở Cà Mau có 3 nhóm vùng lặp lại thuộc

ORF94 trên bộ gen WSSV, từ 5 đến 9 vùng lặp lại (Trần Thị Tuyết Hoa và ctv,

2008)

Ở Ấn Độ, vùng lặp lại thuộc ORF94 có 13 kiểu gen được tìm thấy với số lần lặp lại từ 2 đến 16, trong đó số lần lặp lại 7 lần là phổ biến nhất chiếm 11,3%, trong những mẫu phân tích không có mẫu nào có số lần lặp lại là 11, 15 (Pradeep B, 2007) Vì vậy có thể nói rằng số vùng lặp lại thuộc ORF94 trên bộ gen WSSV ở

các thời điểm thu mẫu và ở các khu vực địa lí khác nhau thì khác nhau (Trần Thị

Tuyết Hoa và ctv, 2008)

Còn ORF125, ở Ấn Độ có 11 kiểu gen khác nhau được tìm thấy với số lần lặp lại

từ 2 đến 14, số lần lặp lại được tìm thấy nhiều nhất là 7 lần chiếm 47,1%, không tìm thấy mẫu nào có số lần lặp lại 6 lần hoặc 13 lần (Pradeep B, 2007) Bui Thi

Minh Dieu et al đã khảo sát vùng lặp lại ORF125 vào năm 2004 đã ghi nhận như

sau: vùng lặp lại thuộc ORF125 có 3 kiểu gen được tìm thấy với số lần lặp lại từ 5 đến 7 Ở Bạc Liêu được vùng lặp lại thuộc ORF125 có 3 nhóm là: 5, 6 và 7 Trong đó, kiểu gen WSSV với 6 vùng lặp lại thuộc ORF125 chiếm tỉ lệ cao nhất (67,9 %) (Lý Ngọc Hà, 2008)

Đối với ORF75 khi Bui Thi Minh Dieu et al ( 2004) phân tích 8 ao tôm bị bệnh

đốm trắng ở Việt Nam (6 ao ở miền Trung, 2 ao ở miền Nam) tìm thấy 3 kiểu gen khác nhau của vùng lặp lại ORF75 là 5, 6, 14 Theo Pradeep B (2007) ở Ấn Độ vùng lặp lại thuộc ORF75 có 6 kiểu gen Trong đó các mẫu có cùng số lần lặp lại trên một ORF thì có số lần lặp lại không giống nhau trên một hoặc cả hai ORF khác

Từ những kết quả trên cho thấy cả 3 ORFs trên đều có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu dịch tể học của virus đốm trắng Trong 3 ORFs trên thì ORF94 có vai trò lớn nhất trong nghiên cứu dịch tể học, tiếp theo là ORF125 và ORF75 (Pradeep B, 2007)

2.4 Kỹ thuật PCR và các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 2.4.1 Nguyên tắc phản ứng PCR

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh năm 1985 và kể từ đó đã tạo nên một tác động to lớn đối với các nhà nghiên cứu sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền trên toàn thế giới (Phạm Thành Hổ, 2003)

Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của ADN polymerase trong quá trình tổng hợp ADN mới từ mạch khuôn Tất cả các ADN polymerase đều cần những mồi,

là những đoạn ADN ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn Ðoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của ADN polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba bước, mỗi bước kéo dài khoảng vài chục giây đến vài phút, trình tự như sau :

Bước 1: Biến tính (denaturation) nhiệt độ được nâng lên khoảng 940C để làm biến tính ADN từ dạng sợi đôi (dsADN) thành sợi đơn (ssADN)

Bước 2: Bắt cặp (anealing) trong bước này nhiệt độ trong buồng PCR hạ xuốngnhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi, các đoạn mồi (primer) bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung vào hai đầu của chuỗi nucleic acid đích, đây là giai đoạn quyết định nên tính đặc hiệu của sản phẩm PCR

Bước 3: Kéo dài (extension) trong giai đoạn này nhiệt độ được nâng lên khoảng

720C Vì taq popymerase hoạt động tốt ở khoảng nhiệt độ là 70-720C Ở khoảng

nhiệt độ này, hoạt động đặc biệt của taq popymerase cao khoảng 150

nucleotide/giây/enzime (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999) Sự tổng hợp này cần phải có sự hiện diện các deoxy nucleoside triphosphate (dNTPs)

Như vậy từ một số lượng N ADN đích ban đầu, sau n chu kỳ nhiệt, thử nghiệm

PCR đã tổng hợp được N.2n bản sao Với một số lượng bản sao, hay còn gọi là sản phẩm PCR (PCR product), chúng ta dễ dàng được phát hiện bằng phương

pháp điện di (Nguyễn Viết Khuê, 2006)

2.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR ADN mạch khuôn: Theo Khuất Hữu Thanh (2003), trong kỹ thuật PCR khuôn

ADN có vai trò rất quan trọng, nó ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả của phản ứng PCR Phản ứng PCR tối ưu khi các đoạn mạch khuôn hoàn toàn tinh sạch, nhưng khi các đoạn mạch khuôn không sạch có lẩn các protein thì hiệu quả sẽ giảm, nó

sẽ giảm theo tỉ lệ thuận với độ tinh sạch của mạch khuôn ADN Hàm lượng ADN khuôn nằm trong khoảng 100 ng - 1 µg (Newton và Graham,1995 trích dẫn bởi Trần Thị Mỹ Duyên, 2006)

Enzyme: Lượng enzyme cần thiết là phụ thuộc vào lượng ADN mẫu và kích

thước phản ứng PCR

Nồng độ Mg 2+ : Nồng độ ion Mg2+ tối ưu phụ thuộc vào loại ADN polymerase, ADN khuôn và thành phần buffer (một số buffer thương mại đã có sẵn 1 lượng nhất định ion Mg2+)

Nồng độ dNTPs: Lượng dNTPs thường được sử dung ở nồng độ 20- 200 µM của

mỗi loại dNTPs Nếu mất cân bằng trong thành phần các dNTPs sẽ dẫn tới lỗi sao chép của ADN polymerase (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998) Việc tăng dNTPs

không làm tăng đáng kể lượng sản phẩm PCR so với việc hiệu chỉnh các yếu tố

khác

Mồi (Primer): Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuếch đại của một

đoạn ADN đặc trưng Mồi luôn luôn gắn với ADN khuôn ở đầu 3’ và ADN polymerase kéo dài tổng hợp theo chiều 5’- 3’ Trình tự mồi, nhiệt độ gắn mồi và nồng độ trong phản ứng PCR là nhân tố quyết định sự thành công của phản ứng PCR Khi chọn mồi cần tính toán đảm bảo Tm của mồi xuôi và mồi ngược không chênh lệch nhau quá lớn Trình tự ADN cần khuếch đại, là trình tự nằm giữa hai

mồi không nên quá 1 kb (Khuất Hữu Thanh, 2003)

Chu kỳ phản ứng: trong thực tế số chu kỳ của phản ứng PCR không vượt quá 40

chu kỳ cho một phản ứng Vì phản ứng PCR diễn ra 2 giai đoạn Giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu Sau đó hiệu quả khuếch đại giảm do các nguyên nhân sau: (i) hoạt tính của enzyme polymerase giảm theo thời gian ở nhiệt độ cao (ii) Sự cạn kiệt của các thành phần phản ứng (iii) Các bản sao vừa tổng hợp không kết hợp với mồi mà kết hợp với nhau (iv)

Sự xuất hiện của các sản phẩm phụ ức chế phản ứng (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998)

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 3.1.1 Địa điểm: phòng thí nghiệm của bộ môn Sinh Học và bệnh Thủy Sản, khoa

Thủy Sản, trường Đại Học Cần Thơ

3.1.2 Thời gian thực hiện: 12/2008 – 5/2009

3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Vật liệu thí nghiệm

Mẫu tôm sú (31 mẫu) được thu từ các ao nuôi quãng canh ở Cà Mau, kích cỡ trung bình từ 15-25 g/con

3.2.2 Hóa chất thí nghiệm

– Dung dịch DTAB, CTAB, chloroform, cồn tuyệt đối, nước cất tiệt trùng… – PCR buffer 5X, dNTPs 25 mM, MgCl2 10mM, mồi ORF75-flank Forward, ORF75-flank Reverse, taq ADN polymerase 5U/µl (Promega)

– Agarose, TAE 1X, ethidium bromide, dung dịch nạp mẫu, thang ADN (100bp plus- Fermentas, 1kb plus- Invitrogen )

3.2.3 Dụng cụ thí nghiệm

– Dụng cụ chiết tách: que nghiền, đầu col (xanh, vàng), pipet (1000µl, 200µl), ống eppendorf, máy vortex, máy ly tâm, máy ủ, tủ hút…

– Dụng cụ khuếch đại: đầu col (xanh, vàng), pipet, ống eppendorf, tủ hút, máy

ly tâm, máy vortex, máy PCR…

– Dụng cụ điện di: đầu col vàng, pipet, lò vi sóng, bồn điện di, máy chụp hình gel…