ứng dụng phương pháp phân tích nhanh rapid'l.mono để phát hiện listeria monocytogenes trong thực phẩm thủy sản

Các phương pháp truyền thống ví dụ như ISO 11290-1:2004 hay BAM – FDA chương 10 phát hiện Listeria monocytogenes trong thực phẩm bao gồm các bước tăng sinh, phân lập trên môi trường chọ

Phần 1: ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1 Giới thiệu

Listeria monocytogenes có khả năng gây bệnh listeriosis với các triệu

chứng như sảy thai, thai chết lưu và đẻ non, gây nhiễm trùng máu và viêm

màng não đối với trẻ em và những người có hệ miễn dịch kém Vì vậy Listeria

monocytogenes là một chỉ tiêu được kiểm soát trong quản lý chất lượng thực

phẩm

Các phương pháp truyền thống ví dụ như ISO 11290-1:2004 hay BAM

– FDA (chương 10) phát hiện Listeria monocytogenes trong thực phẩm bao

gồm các bước tăng sinh, phân lập trên môi trường chọn lọc và thử nghiệm hóa

sinh để định danh Quá trình này thường kéo dài từ bốn ngày cho trường hợp

âm tính và trên bảy ngày cho các trường hợp dương tính Đây thật sự là một

trở ngại cho việc đánh giá chất lượng nói chung và phân tích vi khuẩn gây

bệnh trong sản phẩm thực phẩm vì thời gian chờ trả kết quả quá dài

Trong những năm qua, nhiều phương pháp phát hiện Listeria

monocytogenes dựa trên nguyên tắc sinh học phân tử và miễn dịch học như

phương pháp lai phân tử, PCR, ELISA, … đã được triển khai Trong đó nhiều

phương pháp đã được thiết kế theo hướng cho kết quả phân tích nhanh Vì vậy

việc ứng dụng phương pháp phân tích nhanh vào kiểm nghiệm thực phẩm là

vấn đề được nhiều phòng thí nghiệm quan tâm RAPID’L.mono là phương

pháp mới khắc phục được các nhược điểm của phương pháp truyền thống nhờ

khả năng phát hiện nhanh, dễ thực hiện, đọc kết quả phân tích dễ dàng, cho kết

quả cùng lúc về Listeria monocytogenes và các loài khác thuộc Listeria spp

trên cùng một đĩa môi trường chọn lọc Vì những lý do đó chúng tôi tiến hành

nghiên cứu “ứng dụng phương pháp phân tích nhanh RAPID’L.mono để

phát hiện Listeria monocytogenes trong thực phẩm thủy sản”

1.2 Mục tiêu của đề tài

Xác định độ tương đồng của phương pháp phân tích nhanh RAPID’L

mono so với phương pháp phân tích Listeria monocytogenes theo tiêu chuẩn

ISO 11290-1:2004 thông qua các chỉ tiêu thí nghiệm:

- Độ đặc hiệu

- Độ nhạy

- Độ lặp lại

1.3 Nội dung nghiên cứu

Để thực hiện đề tài chúng tôi dự kiến các nội dung nghiên cứu sau:

1 Xác định độ đặc hiệu của phương pháp phân tích nhanh

RAPID’L.mono bằng cách thử nghiệm trên mẫu gây nhiễm Listeria

monocytogenes và mẫu gây nhiễm vi sinh vật khác Trên cơ sở xác định

khuẩn lạc điển hình, thử nghiệm sinh hóa điển hình (nếu có) của

Listeria monocytogenes

2 Xác định độ nhạy (giới hạn pháp hiện – LOD) của phương pháp thông

qua phân tích dãy nồng độ pha loãng chủng Listeria monocytogenes để

tìm nồng độ thấp nhất mà phương pháp có khả năng phát hiện

3 Xác định độ lặp lại của phương pháp bằng cách phân tích mẫu thực

phẩm thủy sản nhiễm Listeria monocytogenes hay mẫu thực phẩm gây

nhiễm Listeria monocytogenes nhằm đánh giá sự ổn định của phương

pháp phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm

4 Phân tích song song mẫu sản phẩm thủy sản nhiễm Listeria

monocytogenes bằng cả hai phương pháp: RAPID’L.mono và ISO

11290-1:2004 Kết hợp kết quả thu được từ Mục 1 – 3 để đánh giá mức

độ tương đồng của phương pháp RAPID’L.mono so với phương pháp

chuẩn ISO 11290-1:2004

1.4 Thời gian thực hiện đề tài

Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về Listeria monocytogenes

2.1.1 Phân loại học

Theo khóa phân loại của Bergey’s (tái bản lần thứ 7), giống Listeria

được xếp vào họ Corynebacteriaceae Tuy nhiên theo nghiên cứu của

Stackebrandt và cộng sự (1983) về rRNA 16S, ông đã chứng minh rằng

Listeria monocytogenes hoàn toàn khác biệt trong nhánh

Lactobacillus-Bacillus thuộc cây phát sinh loại vi khuẩn do Woese xây dựng năm 1981 Năm

2001, Họ listeriaceae đã được tạo ra, bao gồm cả Staphylococcaceae,

Bacillaceae và các họ khác Trong phạm vi cây phát sinh loại này có sáu loại

thuộc loại Listeria: L monocytogenes, L seeligeri, L welshimeri, L ivanovii

L.innocua và L grayi Loại L grayi có hai loài phụ là L.grayigrayi và L

grayimurrayi

2.1.2 Hình thái học

Listeria monocytogenes là vi khuẩn hình que, gram dương, di động nhờ

tiêm mao, không sinh bào tử và đôi khi chúng tạo thành hình chuỗi ngắn Khi

kiểm tra kính phết, vi khuẩn này có dạng hình cầu, vì vậy thường lầm tưởng

chúng là vi khuẩn Streptococci Đôi khi xuất hiện những tế bào dài hơn có thể

có khả năng tạo tiêm mao (flagella), di động theo thể thức lộn nhào và tạo hình

tán dù trong môi trường motility agar Hoạt tính tiêu huyết (heamolysis) trên

môi trường thạch máu được dùng làm chỉ dấu để phân biệt Listeria

monocytogenes trong số các loài khác thuộc giống Listeria, nhưng đây không

phải là tiêu chí để xác định loài này

Để phân biệt các loại thuộc Listeria cần thêm các đặc tính sinh hóa

được thể hiện ở Bảng 2.1

Bảng 2.1: Đặc điểm khác nhau của các loài thuộc giống Listeria

Ghi chú: Cata: catalase, Henry: Henry illumination, Man: manitol,

Rham: Rhamnose, Xyl: Xylose

NaCl(%) cực đại

T0C tối thiểu

T0C cực đại

Nhu cầu oxy

2.1.3.2 Trong thực phẩm

Listeria monocytogenes có khả năng sống trong nhiều loại thực phẩm

đông lạnh, trong các sản phẩm chưa được gia nhiệt tốt, bề mặt sản phẩm đã bị

tách nước Sự phát triển của chúng phụ thuộc nhiều vào các yếu tố như nhiệt

độ, pH và các loại thịt cũng như sự hiện diện của quần thể vi sinh vật

2.1.4 Khả năng chịu đựng

Listeria monocytogenes là vi khuẩn gây bệnh ưa lạnh và có khả năng

có khả năng sống trong điều kiện kỵ khí, hiếu khí ngay cả môi trường hút chân

không hoặc có sự hiện diện của vi khuẩn lactic

Loài vi khuẩn này cũng có khả năng sống từ 10 đến 30 ngày trong

Các phản ứng phân biệt Listeria spp

CAMP test TÊN LOÀI Cata Gram Di

khí từ -260C đến 90

C Ở nước biển Listeria monocytogenes có thể sống đến 3

tuần hoặc lâu hơn nữa Việc tồn tại trong nước biển thì tùy thuộc vào nhiệt độ

và chủng vi khuẩn này

hợp vi khuẩn Listeria monocytogenes và Flavobacteria spp Có thể tồn tại hơn

75 ngày trên bề mặt thép không gỉ Thời gian để giết chết 90% các tế bào này

là 18,5 ngày

Vi khuẩn này có khả năng tồn tại trong các sản phẩm thủy sản xông

trường hợp chúng còn gia tăng số lượng tế bào Ví dụ: trong tôm, thịt cua,

surimi và cá được bảo quản ở nhiệt độ 70C trong vòng 14 ngày, Listeria

monocytogenes gia tăng đến 10.000 tế bào trên một gam sản phẩm (Nguồn:

Baron’s Medical Microbiology, Miscellaneous Pathogenic Bacteria (H Hof))

Khả năng chịu nhiệt của Listeria monocytogenes cũng là một yếu tố khá

quan trọng để đánh giá mức độ nguy hiểm của vi sinh vật này đối với an toàn

thực phẩm Theo cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ

(USFDA), khả năng kháng nhiệt của loài vi khuẩn này trên các sản phẩm thủy

sản khác nhau thì không giống nhau

Listeria monocytogenes là điển hình cho vi khuẩn không sinh bào tử có

khả năng kháng khá tốt các tác động có hại như đông lạnh, làm khô và gia

nhiệt

2.1.5 Phân bố, nguồn lây nhiễm

Mãi đến năm 1960, người ta vẫn còn nghĩ rằng Listeria monocytogenes

hầu như không liên quan đến các bệnh truyền nhiễm ở động vật và ít khi xuất

hiện ở người Tuy nhiên, trong những năm sau đó, người ta bắt đầu phân lập

được nhiều loài thuộc giống Listeria bao gồm cả các loài gây bệnh như

Listeria monocytogenes và L ivanovii từ nhiều nguồn khác nhau Đến nay vi

khuẩn này được công nhận là phân bố rộng rãi trong tự nhiên Ít nhất có 42

loài động vật có vú hoang dã và thuần dưỡng, 17 loài chim bao gồm thuần

dưỡng và gà chọi là nơi ẩn náo của Listeria Có khoảng từ 5 – 10% trong số

chúng ta có Listeria monocytogenes hiện diện trong đường ruột nhưng không

biểu hiện bất cứ triệu chứng nào về bệnh do listeria Listeria cũng được phân

lập từ giáp xác, cá, sò, ve ký sinh và ruồi Ngoài ra có thể phân lập vi khuẩn

này từ đất, thức ăn động vật và các nguồn khác từ môi trường

2.1.6 Đặc điểm gây bệnh

Hiện nay theo quan điểm của Rocourt, L ivanovii và L monocytogenes

là đối tượng gây bệnh cho chuột và các động vật khác Tuy nhiên chỉ có loài L

monocytogenes là đối tượng gây bệnh cho người Bệnh do L ivanovii, và L

seeligeri thì rất hiếm khi xảy ra ở người

Thuật ngữ bệnh do listeria (listeriosis) bao gồm nhiều triệu chứng bệnh

giống nhau ở người và động vật Listeria monocytogenes gây bệnh ở người và

động vật; L.ivanovii chỉ gây bênh ở động vật, chủ yếu ở cừu Bệnh viêm màng

não là hình thức bệnh thường gặp nhất ở động vật nhai lại Ở những động vật

còn nhỏ, thường xuất hiện nhiễm trùng nội tạng hoặc nhiễm trùng máu Nhiễm

trùng cổ tử cung ở bào thai qua đường nhau thường làm cừu và gia súc đẻ non

Tác động thật sự bệnh do Listeria ở người đến nay vẫn còn chưa sáng

tỏa, vì bình thường đối với người trưởng thành khỏe mạnh, các bệnh truyền

nhiễm thường ít có triệu chứng hoặc có chăng chỉ là triệu chứng cảm nhẹ

Biểu hiện lâm sàng dao động từ triệu chứng trông giống như là bệnh cảm cúm

nhẹ và/hoặc viêm não và màng não Bệnh do Listeria hầu hết chỉ xuất hiện ở

phụ nữ mang thai, trẻ sơ sinh, người già và người suy giảm hệ miễm dịch,

nhưng đối với những người khỏe mạnh cũng có thể bị ảnh hưởng Hình thức

bệnh nghiêm trọng thể hiện rõ ràng nhất là ở bệnh viêm màng não và thường

đi kèm theo nhiễm trùng máu Tuy nhiên ở phụ nữ mang thai, mặc dù triệu

chứng thường xuất hiện là bệnh giống như cúm nhẹ không bị viêm màng não,

nhưng dễ có khả năng thai nhi bị bệnh và dẫn đến phải phá bỏ hoặc sinh non

Ở người bệnh do listeria biểu hiện rõ ràng nhất là do L monocytogenes

thường ít xảy ra, nhưng đã xuất hiện những đợt bùng phát thành dịch Vào

năm 1981, xuất hiện đợt bùng phát liên quan đến 100 người ở Canada Ba

phần tư những trường hợp bị nhiễm bệnh là phụ nữ mang thai, trong trường

hợp này có 9 thai nhi bị chết, 23 trẻ sơ sinh bị nhiễm trùng và 2 trẻ còn sống

khỏe mạnh Trong số 77 người trưởng thành không mang bầu bị nhiễm khuẩn

đã biểu hiện bệnh do listeria một cách rõ ràng, tỷ lệ chết gần 30% Nguồn

bùng phát là từ xà lách trộn được sản xuất tại một nhà máy tại địa phương

Các biểu hiện bệnh do Listeria bao gồm nhiễm trùng máu, viêm màng

não, viêm não và nhiễm trùng tử cung hoặc cổ tử cung ở phụ nữ mang thai dẫn

đến khả năng xẩy thai hoặc phá bỏ thai nhi Khởi đầu các biểu hiện này

thường xuất hiện các triệu chứng tương tự như các bệnh cúm bao gồm sốt kéo

dài Có thể xuất hiện các triệu chứng rối loạn tiêu hóa như buồn nôn, nôn mữa

và tiêu chảy là những triệu chứng biểu hiện sớm bệnh nghiêm trọng do

Listeria gây ra hoặc có thể là những triệu chứng thoáng qua Các triệu chứng

này có thể kéo dài hơn 12 giờ

2.2 Phương pháp định tính chỉ tiêu Listeria monocytogens trong thực

phẩm

2.2.1 Theo ISO 11290 -1:2004

Phương pháp này (tham chiếu theo ISO 11290-1:2004) được áp dụng

để định tính Listeria monocytogenes trong thực phẩm dành cho người và thức

ăn gia súc

2.2.1.1 Nguyên lý

Phương pháp này thực hiện qua các giai đoạn:

· Tăng sinh: giai đoạn này là cần thiết vì Listeria monocytogenes thường

có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ và dễ bị tổn thương trong quá trình

chế biến cùng sự tồn tại một số lượng các loại vi sinh vật khác, do đó

bước tăng sinh đầu tiên rất quan trọng làm tăng sự phát triển của vi

khuẩn

· Phân lập: Mục đích của giai đoạn này nhằm phân biệt vi khuẩn Listeria

spp và các vi khuẩn không phải là Listeria spp Thông qua các đặc

điểm của khuẩn lạc Do đó, môi trường phân lập có chứa các thành

phần sao cho Listeia spp có thể sinh trưởng tạo thành các khuẩn lạc rời

rạc đồng thời ức chế sinh trưởng của các vi khuẩn không phải là

Listeria spp tồn tại được trong giai đoạn tăng sinh Phân lập trên hai

môi trường chọn lọc ALOA, Oxford (hoặc Palcam)

· Khẳng định: cấy chuyển khuẩn lạc Listeria monocytogenes nghi ngờ

sang thạch không chọn lọc để làm thuần vi khuẩn và thực hiện các thử

nghiệm sinh lý, sinh hóa để định danh Khẳng định là Listeria spp bằng

các thử nghiệm Henry-illumination, catalase, nhuộm Gram, khả năng di

động phương pháp giọt treo Sau khi các thử nghiệm trên đều nghiệm

đúng Listeria spp., kế tiếp khẳng định Listeria monocytogenes qua các

thử nghiệm bổ sung sau: khả năng tan huyết, khả năng biến dưỡng

đường, thử nghiệm CAMP, di động trong ống nghiệm tạo hình tán dù

2.2.1.2 Sơ đồ quy trình phân tích theo ISO 11290-1:2004

Quy trình (I) và (II) thực hiện song song nhau Nếu quy trình (I) cho kết

quả dương tính thì ngưng không tiếp tục thực hiện quy trình (II), nếu quy trình

(I) cho âm tính thì phải tiếp tục quy trình (II)

Thời gian cho kết quả của phương pháp từ 4- trên 7 ngày

2.2.1.3 Thuyết minh quy trình phân tích

A Tăng sinh lần 1: Cân 25gam mẫu cho vào bao PE vô trùng Thêm

vào 225ml Half Fraser Đồng nhất mẫu trong khoảng 30-60 giây tùy theo đặc

điểm của mẫu Ủ dịch mẫu trong tủ ủ ở 30±10C trong 24±2giờ Sau bước

tăng sinh lần 1 thực hiện hai quy trình (I), (II)

D Đọc kết quả trên ALOA, Oxford

E Chọn khuẩn lạc điển hình cấy sang TSYEA, TSYEB

C Cấy ria trên ALOA +

Palcam hoặc Oxford

- Thử nghiệm CAMP

- Di động

D Đọc kết quả trên ALOA, Oxford

E Chọn khuẩn lạc điển hình cấy sang

B Tăng sinh lần 2: Chuyển 0.1ml từ dịch tăng sinh lần 1 sang ống

nghiệm chứa 10ml môi trường Fraser để tăng sinh lần 2 Ủ ống nghiệm trong

tủ ủ ở 37±10

C trong 24 giờ

C Cấy ria trên ALOA, Oxford hoặc Palcam: Dùng que cấy kim loại

hoặc que cấy nhựa vô trùng cấy ria dịch mẫu tăng sinh lần 1 theo quy trình (I)

và dịch mẫu tăng sinh lần 2 theo quy trình (II) sang môi trường thạch ALOA

và Oxford hoặc Palcam sao cho khuẩn lạc mọc rời, ủ trong tủ ủ ở 37±10C

trong 24 giờ

D Đọc kết quả trên ALOA, Oxford hoặc Palcam Thường sau 24 giờ ủ

phải kiểm tra Nếu khuẩn lạc mọc yếu hoặc không có khuẩn lạc nào thì phải ủ

tiếp 48 giờ Sau khi ủ ghi nhận các khuẩn lạc điển hình trên các loại môi

trường thạch

E Chọn khuẩn lạc điển hình cấy sang TSYEA, TSYEB: Chọn khuẩn

lạc nghi ngờ Listeria monocytogenes trên mỗi loại môi trường phân lập dùng

Kiểm tra khuẩn lạc Listeria spp bằng nguồn sáng trắng, kiểm tra khuẩn

lạc theo hướng vuông gốc với đĩa thạch hoặc trực tiếp bằng mắt thường hoặc

qua kính hiển vi phân tích (có gương riêng) hoặc kính hiển vi có độ phân giải

thấp Nguồn sáng chiếu vào đĩa thạch với góc nghiêng 450, quan sát theo

hướng vuông góc với đĩa thạch

Trên môi trường TSYEA khuẩn lạc Listeria spp điển hình qua nguồn

ánh sáng trắng có màu xanh óng ánh (xanh xám đến xanh)

- Thử nghiệm Catalase

+ Thực hiện: Lấy sinh khối ở tâm khuẩn lạc trên môi trường thạch dinh

dưỡng sau 18-24 giờ ủ Chuyển sinh khối lên miếng lam Nhỏ lên sinh khối

sự hình thành bọt khí và ghi nhận kết quả Bỏ miếng lam vào dung dịch khử

Thử nghiệm KOH dùng để phân biệt vi khuẩn gram dương và gram âm:

nhỏ 1-2 giọt KOH 3% lên lam kính, sau đó lấy khuẩn lạc đã được làm thuần từ

TSYEA trộn vào thuốc thử KOH trên lam Sau khi trộn nếu gặp hiện tượng

đặc quánh kéo thành dây thì dùng khuyên cấy nhích lên là phản ứng dương

tính và ngược lại là phản ứng âm tính

Vi khuẩn gram (-): thử nghiệm KOH dương tính

Vi khuẩn gram (+): thử nghiệm KOH âm tính

Listeria spp cho phản ứng gram (+)

- Thử tính di động

ü Khả năng di động phương pháp giọt treo: Lấy một khuyên dịch từ

TSYEB đặt lên lamem và quan sát dưới kính hiển vi Listeria spp là

những tế bào hình que, mảnh, ngắn và thể hiện những chuyển động

xoay quanh trục thân thành từng đợt (luân phiên nghĩ và động) rất đặc

trưng

ü Thử tính di động trong ống nghiệm: Lấy vi khuẩn đã được làm thuần từ

TSYEA đâm sâu vào thạch của ống nghiệm chứa môi trường Motility

agar Ủ ở 250C±10C trong 48 giờ Kiểm tra sự phát triển xung quanh

đường cấy đâm sâu Thử nghiệm là dương tính khi vi sinh vật mọc lan

khỏi đường cấy làm môi trường có màu đỏ cam và tạo hình tán dù

- Thử nghiệm tan huyết

Dùng que cấy ria lấy sinh khối từ khuẩn lạc trên môi trường làm thuần

TSYEA cấy ria lên đĩa thạch Blood Agar Ủ đĩa trong tủ ở 37±10C trong

24±2 giờ

Kết quả: Listeria monocytogenes cho thấy vùng sáng, trong và hẹp

(dung huyết beta)

- Thử nghiệm sử sụng đường

Dùng que cấy vòng, lấy sinh khối từ môi trường TSYEB cấy lần lược

sang các ống nghiệm chứa khoảng 5ml dung dịch đường Xylose và sang các

ống nghiệm chứa khoảng 5ml dung dịch đường Rhamnose Ủ các ống trong tủ

ủ ở 37±10C trong 24 – 48 giờ

Kết quả: Dương tính khi dung dịch đường có màu vàng Âm tính khi

dung dịch đường không đổi màu Listeria monocytogenes Xylose (-),

Rhamnose (+)

- Thử nghiệm CAMP

Cấy ria 2 đường chủng vi khuẩn S.aureus và Rhodococcus equi theo

các đường thẳng đứng song song, cách nhau 4 cm trên mặt thạch máu cừu Sau

đó cấy ria thẳng góc ở giữa các chủng nghi ngờ Listeria monocytogenes đã

được làm thuần từ TSYEA lên thạch máu, gần như không chạm vào 2 đường

cấy S.aureus và Rhodococcus equi khoảng 1-2mm Cấy đồng thời các chủng

chứng L.monogenes, L.innocua, L.ivanovi để kiểm tra trên cùng một đĩa Ủ ở

370C±10C trong 18- 24h

Phản ứng dương tính khi xuất hiện vùng cộng hưởng tan huyết phát

triển ngay tại ranh giới giữa chủng cần thử với các chủng R.equi và S.aureus

Phản ứng CAMP (+) với R.equi sẽ tạo vùng tan huyết rộng 5-10mm và

có hình dạng đầu mũi tên, phản ứng (-) vùng tan huyết yếu và nhỏ (khoảng

1mm) Phản ứng (+) với S.aureus thường tạo vùng tan huyết hẹp (khoảng

2mm) có dạng hình tròn

Listeria monocytogenes cho phản ứng CAMP (+) với S.aureus và

CAMP (-) với R.equi

G Đọc kết quả: Phát hiện hay không phát hiện Listeria monocytogenes

trong 25 gam mẫu

2.2.2 Phương pháp phân tích nhanh trên RAPID’L.mono theo AOAC

2000 Alfred Nobel Drive Hercules, Ca 94547

RAPID’L.mono là môi trường được thiết kế đặc hiệu nhằm phát hiện

enjyme phospholipase trong Listeria monocytogense và Listeria monocytogens

không sử dụng Xylose Sau 24 giờ nuôi cấy, Listeria monocytogenes thể hiện

khuẩn lạc có màu xanh dương không có quầng màu vàng xung quanh Khuẩn

lạc được thể hiện ở những chủng loài khác của Listeria spp là màu trắng có

hoặc không có quầng màu vàng xung quanh Khuẩn lạc của Listeria ivanovii

có màu xanh dương - xanh lá cây có quầng màu vàng xung quanh (Xylose (+))

Các chất hòa tan có tuyển chọn trong môi trường RAPID’L.mono cho phép ức

chế hầu hết các loại vi sinh vật khác

2.2.2.1 Nguyên lý

RAPID’L.mono là môi trường nuôi cấy cơ bản dựa trên phản ứng chất

tạo sắc

- Hoạt động của một enzyme đặc hiệu cho phép dò tìm ra Listeria

monocytogenes, chất nền tạo sắc là phospholipase tạo khuẩn lạc có màu xanh

- Sự lên men đường cho phép phân biệt các loài Listeria spp Listeria

monocytogenes âm tính với phản ứng Xylose nên không tạo quầng sáng màu

vàng xung quanh khuẩn lạc

2.2.2.2 Sơ đồ quy trình phân tích nhanh trên RAPID ’ L.mono theo

AOAC

2.2.2.3 Thuyết minh quy trình phân tích

A Tăng sinh: giống như tăng sinh lần 1 của phương pháp định tính chỉ

B Phân lập trên RAPID’L.mono: dùng que cấy nhựa hoặc que cấy kim

loại vô trùng cấy ria dịch mẫu tăng sinh lên môi trường RAPID’L.mono Ủ ở

370C trong 24-48 giờ

C Đọc kết quả trên RAPID’L.mono Thường sau 24 giờ ủ phải kiểm

tra Nếu khuẩn lạc mọc yếu hoặc không có khuẩn lạc nào thì phải ủ tiếp 48

giờ Sau khi ủ ghi nhận các khuẩn lạc điển hình trên RAPID’L.mono

D Khẳng định: chọn khuẩn lạc điển hình của Listeria monocytogenes

trên RAPID’L.mono cấy ria lên ALOA, ủ ở 370C trong 24 giờ, hoặc khẳng

định theo phương pháp ISO 11290-1:2004

E Đọc kết quả trên ALOA dựa vào màu sắc điển hình của khuẩn lạc

Kết luận có hay không có Listeria monocytogenes trong 25 gam mẫu

C Đọc kết quả trên RAPID’L.mono

D Chọn khuẩn lạc điển hình khẳng định bằng cách cấy ria lên ALOA

370C trong 24h

A Tăng sinh 25g mẫu + 225ml Half Fraser

C Đọc kết quả trên RAPID’L.mono

D Chọn khuẩn lạc điển hình khẳng định bằng cách cấy ria lên ALOA

Ủ 370

C, 24 giờ

A Tăng sinh 25g mẫu + 225ml Half Fraser

2.3 Một số môi trường chính

2.3.1 Môi trường Half Fraser Broth (HF)

a) Fraser Listeria Base Broth (Merck, 1.10398.0500)

Thành phần môi trường (gam/lít)

- Di-Sodium hydrogen phosphate 9,6

- Potassium dihydrogen phosphate 1,35

- Acriflavine hydrochloride solution

c) Ammonium Iron (III) citrate (Merck,1.10399/1)

Cách pha chế môi trường Half Fraser (HF)

Cân 55gam Fraser Listeria Base Broth cho 1000ml nước cất Khuấy

Trong lúc chờ thanh trùng môi trường tiến hành tan rã thành phần của một lọ

nhỏ ammonium iron (III) citrate và một lọ nhỏ supplement selective trong 1ml

nước vô trùng, cho hai lọ nhỏ trên vào môi trường Fraser Listeria Base Broth

2.3.2 Môi trường Fraser Borth

Môi trường Fraser chứa các thành phần chọn lọc như ở tăng sinh lần 1

nhưng với hàm lượng cao hơn

Thành phần môi trường: Half Fraser Broth cộng thêm một lọ nhỏ

Supplement selective (b)

2.3.3 Thạch ALOA

a) Listeria selective Agar Base acc OTTAVIANI and AGOSTI

Thành phần môi trường (gam/lít)

- Peptone from meat 18.0

- Peptone from Casein 6.0

Cân 35 gam Listeria selective Agar Base acc OTTAVIANI and

AGOSTI vào 476 ml nước cất vô trùng sau đó làm tan bằng Microwave Sau

C Bổ sung thêm 1 chai A.L supplement

1 và 1 chai A.L supplement 2 Lắc nhẹ và tiến hành đổ đĩa ngay Sau đó sấy

A.L Supplement 1: dạng chai nhỏ dạng bột: hút 4ml dung dịch

cồn/nước = 1:1 vào Supplement 1 hòa tan

A.L Supplement 2 dạng trai lớn dung dịch chứa 20ml

2.3.4 Thạch Oxford

a) Oxford Listeria selective Agar (base) (Merck,1.07004.0500)

Thành phần môi trường (gam/lít)

Cân 29,25 gam Oxford Listeria selective Agar (base) cho vào 500ml

nhiệt ở nhiệt độ 45-500C Sau đó bổ sung 5 ml Oxford Listeria Selective

Supplement vào môi trường Lắc đều và tiến hành đổ đĩa khoảng 15-20ml/đĩa

Oxford Listeria Selective Supplement: chứa trong chai nhỏ dạng bột

phải hòa tan bằng dung dịch cồn/nước= 1:1

2.3.5 Môi trường không chọn lọc TSYEA, TSYEB

a) Trytone soya broth (Merck, 1.5459.0500)

Thành phần (gam/lít)

- Peptone from casein 17.0

- Peptone from Soymeal 3.0

- D(+) Glucose 2.5

- Sodium chloride 5.0

- Di- potasodium hydrogen phosphate 2.5

b) Yeast extract (Merck, 1.03753.0500)

c) Agar (Merck, 1.01614.1000)

Cách pha chế

- TSYEA: Cân 30gam/lít Trytone soya broth, 6gam/lít Yeast extract,

15gam/lít Agar, 1000ml nước Hòa tan hỗn hộp trên Chỉnh pH hỗn hợp

dung dịch 7,3±0,2 Sau đó hấp thanh trùng ở 1210

C trong 15 phút, sau

lớp thật mỏng để xem Henry illumination

- TSYEB: Cân 30gam/lít Trytone soya broth, 6gam/lít Yeast extract,

1000ml nước Hòa tan hỗn hộp trên Chỉnh pH hỗn hợp dung dịch

7,3±0,2, sau đó tiến hành đỗ vào ống nghiệm khoảng 3ml/ống Hấp

- Pancreactic Digest of Gelatin 10.0gam

- Sodium chloride 5.0gam

- Bromcresol purple 0.02gam

b) Đường D(+)(-) Xylose (Merck, 1.08689.0100)

c) Đường L(+)- Rhramnose monohydrate (Merck, 1.07361.0025)

Cách Pha chế môi trường

Cân 15gam/lít Purple Broth Base thêm vào 1000ml nước cất, khuấy tan

15 phút Làm nguội ta có chất nền purple Broth Sau đó bổ sung đường

Rhramnoes hoặc xylose bằng cách dùng nền purple broth hòa tan đường sau

đó lọc qua màng lọc và cho vào nền purple broth Phân ống 5ml/ống

2.3.7 Môi trường thạch máu (Blood agar)

Tryptic Soy Agar (TSA) (Merck, 1.05458.0500)

Thành phần môi trường

- Casein peptone

- Soymeal pepton

- Agar

Pha môi trường thạch máu: Cân 40gam/lít TSA, làm tan đều và chỉnh

pH 7,3±0,2 Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút, làm nguội ở bể điều nhiệt

nguội ở bể điều nhiệt Đổ đĩa 10-15ml/đĩa

Pha môi trường Motility agar: Cân 22gam/lít motility agar, bổ sung

Làm tan dung dich bằng Microwave Phân ống (5-7ml/ống) Sau đó hấp thanh

trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút

2.3.9 Môi trường lỏng BHI (Brain Heart Infusion)

Cân 37gam/lít Brain Heart Infusion hòa tan chỉnh pH 7,4±0,2 Phân

C trong 15 phút

Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

3.1 Vật liệu

3.1.1 Mẫu thực phẩm

Mẫu thực phẩm sử dụng trong nghiên cứu được lấy từ các công đoạn

trong quy trình chế cá tra fillet đông lạnh tại nhà máy chế biến thủy sản

3.1.2 Môi trường, hóa chất

-Canh thang Fraser Listeria selection Enrichment Broth (Merck 1

-AL supplement 1 (Biorad 356-4039)

-AL supplement 1 (Biorad 356-4040)

-Palcam Listeria selection agar (Merck VM 1.07004)

-Palcam Listeria selection supplement (Merck VM 1.12122)

-Oxford Listeria selective agar (Merck 1.07004)

-Oxford Listeria selective supplement (Merck 1.07006)

-Purple carbonhydrate Broth (Difco 217510 hoặc Merck 1.07361)

-Xylose (BDH 305905B)

-Tripptose Soya Broth (Merck 1.05459)

-Yeast extract (Difco 212750)

-Agar (Difco 214010)

-Motility agar

-Thuốc thử H2O2 30%

-Thuốc thử KOH 3% hoặc bộ thuốc nhuộm gram

-Thạch Blood Agar (Merck 1.10328)

-Máu cừu, máu bò

3.1.4 Lấy mẫu

Mẫu phải đại diện cho sản phẩm không bị hư hỏng và không bị thay đổi

trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản

3.2 Phương pháp thí nghiệm

3.2.1 Thí nghiệm 1: Xác định độ đặc hiệu của phương pháp phân tích

nhanh định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes trên RAPID’L.mono

a) Mục đích

Xác định độ đặc hiệu của phương pháp phân tích nhanh

RAPID’L.mono với vi khuẩn Listeria monocytogenes và các chủng vi sinh vật

khác không phải Listeria monocytogenes bằng phương pháp phân tích nhanh

RAPID’L.mono Phân tích trên nền mẫu cá tra nhiễm Listeria monocytogenes

và các chủng vi sinh vật khác để khẳng định tính đặc hiệu của môi trường

RAPID’L.mono

b) Sơ đồ thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí một cách ngẫu nhiên, nhân tố thay đổi là các

chủng loại vi sinh vật Thí nghiệm được lặp lại 10 lần Thí nghiệm được tiến

hành theo sơ đồ sau đây:

A1 A2 A3 A4 A5 A6

A Tăng sinh trong BHI

Ủ 370C, 8 giờ

C Đọc kết quả trên RAPID’L.mono

D Chọn khuẩn lạc điển hình khẳng định bằng cách cấy ria lên ALOA

Bảng 3.2.1 Danh mục các chủng vi sinh vật thử nghiệm

Chuẩn bị các chủng vi sinh vật chuẩn như Bảng 3.2.1 Các chủng vi

sinh vật chuẩn được lấy từ phòng thí nghiệm của Nafiquad 6 - Cần Thơ, được

hiệu chủng, ngày, số lần cấy chuyển Các ống môi trường lỏng BHI đã được

chuẩn bị sẵn, đánh ký hiệu lên các ống BHI tương ứng Cấy chuyển từ ống

Cấy ria từng chủng vi sinh vật chuẩn trong ống BHI tương ứng lên từng

đĩa RAPID’L.mono tương ứng Các bước sau thực hiện theo quy trình phân

tích nhanh định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes trên RAPID’L.mono như

d) Phương pháp thu thập số liệu

Quan sát khuẩn lạc trên môi trường RAPID’L.monno ở các đĩa cấy các

vi sinh vật khác nhau Có hình thành hay không hình thành khuẩn lạc, hình

dạng và màu sắc khuẩn lạc

3.2.2 Thí nghiệm 2: Xác định độ nhạy của phương pháp phân tích định

tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes trên RAPID’L.mono

a) Mục đích thí nghiệm

Xác định độ nhạy (giới hạn pháp hiện – LOD50) của phương pháp

thông qua phân tích dãy nồng độ pha loãng chủng Listeria monocytogenes để

tìm nồng độ thấp nhất mà phương pháp có khả năng phát hiện

b) Sơ đồ bố trí thí nghiệm:

c) Cách tiến hành

-Xác định hàm lượng tế bào từ 10-100 tế bào/ml dựa vào độ đục

McFarland

Độ đục chuẩn McFarland 0.5 có thể mua từ nhà sản xuất Nếu tự pha thì

theo công thức sau: thêm 0.5ml dung dịch BaCl2.2H20 1,175% vào 99,5ml

nhỏ chuyển sang các ống nghiệm giống nhau Các ống này được dùng để so

sánh dịch vi khuẩn Trước khi sử dụng, lắc đều để dung dịch đồng nhất

- Thực hiện dãy pha loãng nhị phân

So sánh độ đục của dịch khuẩn chuẩn có độ đục gần giống độ đục của

ống McFarland khi đó ống dung dịch khuẩn chuẩn có mật độ tế bào khoảng

Dựa vào độ đục chuẩn McFarland để xác định hàm lượng tế

bào Listeria monocytogenes có từ 10-100 tế bào/ml

Pha loãng dịch tế bào có mật độ 10-100 thành dãy nhị phân

(20, 2-1, 2-2, 2-3,….)

Mỗi nồng độ hút 1ml cho vào bao PE chứa 25 gam mẫu

trắng (mẫu không có Listeria monocytogenes), mỗi nồng độ

lặp lại 10 lần)

Mỗi bao PE chứa 25 gam mẫu đã spike chủng được phân

tích định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes bằng phương

pháp phân tích nhanh RAPID’L.mono

Dựa vào các số liệu phân tích và áp dụng công thức tính

Hình 3.2.2: Sơ đồ thí nghiệm 2

loãng nhị phân (bằng cách hút 15ml ở nồng độ 20 cho vào chai nước muối sinh

lý 15ml) tương tự pha loãng 2-1, 2-2 , 2-3 , 2-4

- Cho chủng vào mẫu

Tại mỗi nồng độ pha loãng 20, 2-1, 2-2 , 2-3 , 2-4 hút 1ml vào bao PE chứa

25gam mẫu trắng + 225ml dung dịch Half Fraser (lặp lại 10 lần), và 1ml vào

đĩa petri (hai đĩa petri), cho vào các đĩa petri 15-20ml PCA lắc đều và ủ ở

- Phân tích trên RAPID’L.mono

Mỗi bao PE chứa 25 gam mẫu đã cho chủng được phân tích định tính chỉ

tiêu Listeria monocytogenes bằng phương pháp phân tích nhanh

RAPID’L.mono được mô tả ở Mục 2.2.2.3 Trang 12

d) Thu thập số liệu

· Đếm số khuẩn lạc trên PCA

· Chọn tất cả các kết quả có cùng số lượng chủng cho vào thấp nhất mà

tại đó các kết quả đều dương tính

· Chọn tất cả các kết quả có cùng số lượng chủng cho vào mà tại đó

>50% kết quả dương tính

· Chọn tất cả các kết quả có cùng số lượng chủng cho vào mà tại đó các

kết quả đều dương tính

Cách tính toán LOD 50

· Xác định giá trị L: log của số lượng tế bào được cho vào thấp nhất mà

tại đó 100% phép thử cho kết quả dương tính

· Xác định d: log của nồng độ pha loãng (VD sử dụng dãy pha loãng thập

phân d=log10, sử dụng dãy pha loãng nhị phân d=log2)

pha loãng thứ i

Sau khi xác định các giá trị trên tính LOD50 như sau:

Karber

(10m-2SQRT(Um); 10m-2SQRT(Um))

Trong đó

cho kết quả dương tính

· Um= d2åP

i(1-Pi)/(n-1)

· n: số lần lặp lại đối với nồng độ pha loãng thứ i

3.2.3 Thí nghiệm 3: Xác định độ lặp lại của phương pháp phân tích định

tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes trên RAPID’L.mono

a) Mục đích

Xác định độ lặp lại của phương pháp phân tích định tính chỉ tiêu

Listeria monocytogenes trên RAPID’L.mono trên cùng một mẫu thử

b) Bố trí thí nghiệm

monocytogenes) thêm chủng Listeria monocytogenes tại giá trị số lượng tế bào

được cho vào thấp nhất mà tại đó 100% phép thử cho kết quả dương tính từ thí

nghiệm 2 Cách tiến hành được thực hiện theo sơ đồ sau:

A Tăng sinh 25g mẫu + 225ml Half Fraser

Đồng nhất, gây nhiễm

Ủ 300

C trong 24 giờ

C Đọc kết quả trên RAPID’L.mono

D Chọn khuẩn lạc điển hình khẳng định bằng cách cấy ria lên ALOA

c) Cách tiến hành thí nghiệm

Sử dụng nồng độ dịch pha loãng ở thí nghiệm 2, gây nhiễm ở mật độ tế

bào nói trên vào 25gam mẫu + 225ml Half Fraser tiến hành phân tích định tính

chỉ tiêu Listeria monocytogenes theo phương pháp phân tích nhanh trên

RAPID’L.mono Thí nghiệm được lặp lại 10 lần trên cùng mẫu thử Thực hiện

song song mẫu trắng không gây nhiễm Listeria monocytogenes

d) Thu thập số liệu

Tống số cho kết quả dương tính

3.2.4 Thí nghiệm 4: Kiểm tra độ tương đồng của phương pháp phân tích

nhanh RAPID’L.mono so với phương pháp phân tích Listeria

monocytogenes theo ISO 11290-1:2004

a) Mục đích

Kiểm tra độ tương đồng của phương pháp phân tích nhanh

RAPID’L.mono so với phương pháp phân tích Listeria monocytogenes theo

tiêu chuẩn ISO 11290-1: 2004 trên các mẫu nhiễm được lấy từ công đoạn sản

xuất cá tra phi lê đông lạnh

b) Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ sau:

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần trên mẫu cá tra phi lê đông lạnh

Phân tích song song mẫu bằng hai phương pháp định tính chỉ tiêu

Listeria monocytogenes trên RAPID’L.mono và theo ISO 11290-1:2004

D Đọc kết quả trên ALOA, Oxford

E Chọn khuẩn lạc điển hình cấy sang

D Đọc kết quả trên ALOA, Oxford

E Chọn khuẩn lạc điển hình cấy sang TSYEA, TSYEB

C Cấy ria trên ALOA +

Palcam hoặc Oxford

J Cấy ria lên RAPID’L.mono

370C, 24giờ