NGHIÊN CỨU SỰ KHÁNG THUỐC CỦA NHÓM VI KHUẨN Aeromonas spp, Vibrio spp TRONG MÔI TRƯỜNG AO NUÔI CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) THÂM CANH Ở CẦN THƠ VÀ VÙNG NƯỚC LỢ TỈNH TRÀ VINH VÀ BẾN TRE

NGHIÊN CỨU SỰ KHÁNG THUỐC CỦA NHÓM VI KHUẨN Aeromonas spp, Vibrio spp TRONG MÔI TRƯỜNG AO NUÔI CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) THÂM CANH Ở CẦN THƠ VÀ VÙNG NƯỚC LỢ TỈNH TRÀ VINH VÀ BẾN TRE

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN

BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH HỌC THỦY SẢN

HỒ NGỌC THI

NGHIÊN CỨU SỰ KHÁNG THUỐC CỦA

NHÓM VI KHUẨN Aeromonas spp, Vibrio spp

TRONG MÔI TRƯỜNG AO NUÔI CÁ TRA

(Pangasianodon hypophthalmus) THÂM CANH

Ở CẦN THƠ VÀVÙNG NƯỚC LỢ TỈNH TRÀ VINH

VÀ BẾN TRE

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THUỶ SẢN

2009

LỜI CẢM TẠ

Xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành gởi đến

Cô Từ Thanh Dung đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và đóng góp nhiều ý kiến quý báu trong suốt thời gian thực hiện đề tài, giúp tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Thầy cô Khoa Thuỷ Sản đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong học tập cũng như hoàn thành tốt luận văn

Anh, chị lớp Bệnh Học Thuỷ Sản khoá 30 đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi làm việc ở phòng thí nghiệm

Tập thể lớp Bệnh Học Thuỷ sản khóa 31 đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

TÓM TẮT

Đề tài nhằm nghiên cứu sự kháng thuốc của vi khuẩn Aeromonas spp,

Vibrio spp trong môi trường ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)

thâm canh ở Cần Thơ, và vùng nước lợ tỉnh Trà Vinh, Bến Tre Vi khuẩn

Aeromonas spp trong môi trường (nước, bùn) được phân lập trên môi trường

GSP-Agar và Vibrio spp trên môi trường TCBS

Kết quả kháng sinh đồ cho thấy Cần Thơ có nhiều vi khuẩn Aeromonas

spp kháng thuốc hơn tỉnh Trà Vinh và Bến Tre: 3/9 chủng kháng với SM, TE, SXT; 2/9 chủng kháng với DO, không có chủng vi khuẩn nào kháng với CHL,

đồng thời Aeromonas spp đa kháng chiếm 3/9 chủng Trong đó 1 chủng kháng

với SXT-DO-TE-SM, 1 chủng kháng với SXT-DO-TE và 1 chủng kháng với SXT- SM Tỉnh Trà Vinh có 2/9 chủng đa kháng thuốc (một chủng kháng

CHL-SM, một chủng kháng SXT-TE), vi khuẩn Aeromonas spp kháng với

CHL, SXT, DO, TE có cùng số lượng 1/9 chủng, 3/9 chủng kháng với SM Bến Tre có số lượng vi khuẩn kháng, đa kháng thuốc tương đương với tỉnh Trà Vinh: 2/8 chủng đa kháng (1chủng kháng DO-TE, 1 chủng kháng SXT-SM),

vi khuẩn kháng thuốc SXT, DO, TE có cùng số lượng: 1/8 chủng, 5/8 chủng kháng với SM và không có chủng nào kháng với CHL Riêng các chủng

Vibrio spp tại Trà Vinh, Bến Tre có 9/11 chủng kháng với SM và không có

chủng nào kháng với CHL, SXT, DO, AM, TE

Kết quả nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các chủng vi khuẩn khảo sát khá cao Đối với SM có giá trị: 16-64 µg/ml, CHL là 1-32 µg/ml, OXT: 0,125- 64 µg/ml Riêng chủng Vibrio spp VBT0930 với nồng độ thuốc OXT

là: 0,125 µg/ml rất thấp so với các chủng Aeromonas spp (32-64 µg/ml)

MỤC LỤC

PHẦN I: GIỚI THIỆU 1

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thuỷ sản 3

2.2 Những nhóm thuốc kháng sinh đã được sử dụng phổ biến 4

2.2.1 Nhóm sulfamid 4

2.2.2 Nhóm β-lactamin 5

2.2.3 Nhóm tetracyclin 5

2.2.4 Nhóm phenicol 5

2.2.5 Nhóm aminosid 6

2.2.6 Nhóm trimethoprim 6

2.3 Vi khuẩn Aeromonas spp và Vibrio spp 6

2.4 Nghiên cứu về mật độ vi khuẩn tổng cộng trong môi trường nước 9

2.5 Nghiên cứu về sự kháng thuốc của các vi khuẩn trong nuôi thuỷ sản 9

2.6 Các thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 13

PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 15

3.2 Vật liệu nghiên cứu 15

3.2.1 Dụng cụ 15

3.2.2 Môi trường, hoá chất và vật liệu nghiên cứu 15

3.3 Phương pháp nghiên cứu 16

3.3.1 Địa điểm thu mẫu 16

3.3.2 Số mẫu 16

3.3.3 Phương pháp thu mẫu 16

3.3.4 Phương pháp phân lập vi khuẩn 16

3.3.5 Phương pháp định danh vi khuẩn 17

3.3.6 Phương pháp lập kháng sinh đồ 17

3.3.7 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 18

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20

4.1 Kết quả thu mẫu, phân lập và định danh vi khuẩn 20

4.2 Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ 22

4.2.1 Kết quả kháng sinh đồ của vi khuẩn Aeromonas spp ở Cần Thơ 22

4.2.2 Kết quả kháng sinh đồ của vi khuẩn Aeromonas spp ở Trà Vinh 24

4.2.3 Kết quả kháng sinh đồ của vi khuẩn Aeromonas spp ở Bến Tre 26

4.2.4 Kết quả kháng sinh đồ của vi khuẩn Vibrio spp ở Trà Vinh và Bến

Tre 27

4.3 Kết quả nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của kháng sinh lên vi khuẩn 29

PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 32

5.1 Kết luận 32

5.2 Đề xuất 32

PHẦN VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO 34

PHỤ LỤC 37

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 4.1 : Tính đa kháng thuốc vi khuẩn Aeromonas spp ở Cần Thơ 23

Bảng 4.2: Tính đa kháng thuốc vi khuẩn Aeromonas spp ở Trà Vinh 26

Bảng 4.3 : Tính đa kháng thuốc vi khuẩn Aeromonas spp ở Bến Tre 27

Bảng 4.4 : Giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 30

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long AM: ampicillin

CHL: chloramphenicol DO: doxycyclin FT: nitrofurantion NA: nalidixic NFXC: norfloxcin OXLA: oxolinic acid OXT: oxytetracyclin SM: streptomycin SMX: sulfamethoxazol SXT: trimethoprim + sulfamethoxazol TE: tetracyclin

TMP: trimethoprim R: kháng

I: trung bình nhạy S: nhạy

PHẦN I GIỚI THIỆU

Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) với ngành nuôi trồng thủy sản phát triển rất nhanh chóng góp phần tích cực vào việc nâng cao nguồn thu

(http://www.mekongdelta.com.vn) Vùng đã cung cấp hơn 80% tổng sản phẩm

thủy sản của cả nước Trong đó cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là một

sản phẩm rất quan trọng ở khu vực nước ngọt Năm 2007, tổng sản lượng cá tra, ba sa của toàn vùng 1,2 triệu tấn, theo dự đoán của ngành thủy sản: sản lượng quy hoạch cho đến năm 2010 là 1,5 triệu tấn Riêng tỉnh Bến

(http://www.vasep.com.vn) Tổng diện tích đất được sử dụng để nuôi trồng thủy sản Trà Vinh khoảng 29.187 ha (http://www.mdec.vn)

Với nổ lực tăng nhanh sản lượng thuỷ sản và kim ngạch xuất khẩu, các nước đang phát triển rất chú trọng tới nuôi trồng thuỷ sản Ðể đạt được sản lượng và lợi nhuận cao nhất, nhiều ngư dân hiện đang áp dụng các phương thức nuôi thâm canh và tăng cường mở rộng diện tích.Tuy nhiên, khi nghề nuôi được thâm canh hóa nhất là nuôi với mật độ cao thì vấn đề dịch bệnh xảy

ra thường xuyên hơn và thiệt hại cũng nhiều hơn Nghề nuôi thủy sản cũng đang phải đương đầu với tình trạng bệnh thường xuyên xuất hiện và ngày càng nghiêm trọng do môi trường ô nhiểm và sự lây lan mầm bệnh Nhất là bệnh do

vi khuẩn đã và đang gây thiệt hại nghiêm trọng đến sản lượng tôm cá Thông thường, người ta sử dụng thuốc kháng sinh để kiểm soát các vi khuẩn gây bệnh Do việc sử dụng không đúng cách nên đã gây ra hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc và tích tụ dư lượng thuốc kháng sinh trong sản phẩm Việc sử dụng kháng sinh bừa bãi trong nuôi trồng thuỷ sản có thể gây ra nhiều vấn đề nghiêm trọng như gây độc, biến đổi hệ vi khuẩn ở người tiêu dùng (www.nhanong.net)

Thực trạng cho thấy, việc sử dụng thuốc kháng sinh trong thủy sản không chỉ phổ biến ở ĐBSCL nói riêng, Việt Nam nói chung mà còn diễn ra ở nhiều nước trên thế giới Đây là vấn đề đáng quan tâm và đã được nhiều nhà

khoa học nghiên cứu (Phuong et al., 2005; Le et al., 2005; Sarter et al., 2006; Dung et al., 2008)

Do nhu cầu của thị trường, nhu cầu cải thiện đời sống, chuyển đổi đối tượng nuôi của các vùng nhằm hạn chế những rủi ro dịch bệnh cho đối tượng

nuôi của người dân Hiện tại cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) đã được

nuôi khá phổ biến ở các vùng nước lợ Song song với những việc làm này thì việc sử dụng thuốc kháng sinh của người dân là vấn rất quan trọng cần được quan tâm Việc sử dụng thuốc kháng sinh không đúng cách sẽ tạo ra nhiều chủng vi khuẩn kháng thuốc, tạo nên một mối nguy hiểm tiềm tàng Theo

Kruse (1994) và Prescott et al., (2000) các gen kháng thuốc từ vi khuẩn liên

quan đến động vật nuôi sẽ được truyền sang vi khuẩn liên quan đến người qua chuỗi thức ăn hoặc qua tiếp xúc trực tiếp (được thể hiện qua hình 2.1) và tác động đến khả năng kháng thuốc của các chủng vi khuẩn ở người Xuất phát từ

những vấn đề trên cho thấy việc thực hiện đề tài “Nghiên cứu sự kháng

thuốc của nhóm vi khuẩn Aeromonas spp, vibrio spp trong môi trường ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) thâm canh ở Cần Thơ và

vùng nước lợ tỉnh Trà vinh, Bến Tre” là rất cần thiết

Mục tiêu

Đánh giá, sự kháng thuốc của hai nhóm vi khuẩn Aeromonas spp và

Vibrio spp trong môi trường ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)

thâm canh ở Cần Thơ và vùng nước lợ Trà Vinh, Bến Tre Từ đó có cách nhìn sâu hơn về thuốc kháng sinh nhằm có biện pháp kiểm soát việc sử dụng thuốc kháng sinh trong chăn nuôi, thuỷ sản một cách triệt để hơn, và góp phần bảo

vệ sức khỏe cộng đồng

Nội Dung

Thu mẫu, phân lập, định danh đến giống 2 loại vi khuẩn Aeromonas spp, Vibrio spp trong môi trường nuôi cá tra (nước và bùn) thâm canh ở Cần

Thơ, Trà Vinh, Bến Tre

Lập kháng sinh đồ hai loại vi khuẩn Aeromonas spp và Vibrio spp

Xác định giá trị MIC bằng phương pháp pha loãng

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thuỷ sản

Trong nuôi trồng thuỷ sản việc sử dụng kháng sinh rất có hiệu quả trong các trường hợp trị bệnh nhiễm khuẩn, giúp động vật thuỷ sản phục hồi lại chức năng sinh lý bình thường, nâng cao tỷ lệ sống, nếu việc dùng đúng bệnh, đúng liều, đúng thời gian Nhưng khi sử dụng kháng sinh quá mức, tuỳ tiện, thiếu hiểu biết sẽ gây ra hậu quả nghiêm trọng: gây ra hiện tượng vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc, ảnh hưởng đến sức khoẻ của vật nuôi, tác động đến môi trường sinh thái và ảnh hưởng đến sức khoẻ con người Tuy vậy, việc dùng thuốc, đặc biệt là lạm dụng thuốc đang phổ biến rộng trong ngành nuôi thuỷ sản ở Việt Nam và các nước trong khu vực Điều này có thể sẽ mang lại nhiều hậu quả nặng nề và ngày càng nghiêm trọng khi những người nông dân tham gia nuôi trồng thuỷ sản có hiểu biết rất ít về hiệu quả và tác dụng phụ của từng loại thuốc mà họ đang dùng

Trong thuỷ sản, tuy việc dùng thuốc kháng sinh để phòng và trị bệnh nhiễm khuẩn cho vật nuôi bằng phương pháp cho ăn nhưng cũng đã thải vào môi trường nuôi một lượng kháng sinh không nhỏ do không được vật nuôi hấp thụ hoặc kháng sinh đã được vật nuôi hấp thụ và đào thải ra môi trường Lượng kháng sinh này sẽ theo nguồn nước lan toả ra môi trường xung quanh, một phần nhỏ sẽ hoà tan trong nước, nhưng một phần lớn lại lắng động cùng với các chất trầm tích gây tác động đến môi trường sinh thái và đe doạ sức khoẻ con người Theo Rosenthal (1989) đã thông báo rằng, để sản xuất 120.000 tấn cá hồi, người ta phải dùng 1800 kg kháng sinh, trong đó ước tính

cơ thể cá chỉ hấp thụ tối đa khoảng 20-30% số thuốc, còn lại 70-80% số thuốc

đã dùng được đào thải ra môi trường Cravedi (1987) đã xác định được rằng, chỉ có khoảng 7-9% khối lượng kháng sinh oxytetracycline đã dùng được cá hấp thu, còn lại 90% sẽ đào thải ra môi trường Trong khi đó kháng sinh oxytetracycline được dùng phổ biến trong nuôi trồng thuỷ sản ở khắp thế giới, chủ yếu bằng phương pháp trộn thuốc vào thức ăn Hanse (1992) đã thông báo: dư lượng kháng sinh trong chất trầm tích có thể giảm 40-50% mật độ vi khuẩn ở nền đáy, và giảm tới 90% hàm lượng phosphate trong chất trầm tích

(trích dẫn bởi Đỗ Thị Hoà và ctv, 2004)

Theo Prescott et al., (2000) tính kháng thuốc của vi khuẩn trên vật nuôi

có thể truyền sang vi khuẩn liên quan với con người bằng nhiều con đường khác nhau Những đối tượng có nguy cơ bị nhiễm các vi khuẩn kháng thuốc cao là: công nhân lò mổ, người chế biến thức ăn và đặc biệt là người nông dân

trực tiếp cho vật nuôi ăn thuốc kháng sinh thì có khả năng nhiễm vi khuẩn kháng thuốc nhiều hơn những người bình thường Khả năng truyền tính kháng thuốc có thể được thực hiện thông qua chuỗi thức ăn hoặc qua tiếp xúc trực tiếp

Hình 2.1: Các con đường trao đổi sự kháng thuốc của vi khuẩn giữa động vật và con người (Prescott

et al., 2000)

Tóm lại: dùng thuốc kháng sinh là sử dụng con dao hai lưỡi Nếu biết

rõ tính chất, tác dụng, dùng đúng bệnh, đúng liều, đúng cách, nó giúp con người trị được nhiều bệnh nguy hiểm Sử dụng bừa bãi sẽ gây những hậu quả trầm trọng: tăng tác dụng phụ, tăng độc tính, gây chủng vi khuẩn lờn thuốc làm cho việc chữa trị về sau gặp khó khăn, dễ bị bội nhiễm, đôi khi dẫn tới tử vong.Trị liệu bằng kháng sinh được coi như sự trợ giúp nhất thời khi khả năng chống bệnh suy giảm, vì thế ta nên tăng cường các biện pháp phòng bệnh hơn

là phải trị bệnh (Bùi Kim Tùng và ctv, 2001)

2.2 Những nhóm thuốc kháng sinh đã được sử dụng phổ biến 2.2.1 Nhóm sulfamid

Còn được gọi là sulfonamid Theo Bùi Kim Tùng, 2001 chất căn bản của sulfamid là sulfanilamid hay para-aminosulfamid Suldamid có tác dụng kìm khuẩn Hoạt phổ rất rộng gồm các vi khuẩn Gram âm và Gram dương Với cấu trúc tương tự, sulfamid thế vào vị trí của acid para aminobenzoic

CON NGƯỜI

Bệnh viện, thành phố, nông thôn

Động vật

MÔI TRƯỜNG NUÔI THUỶ SẢN (cá và giáp xác)

ĐỘNG VẬT TRÊN CẠN

Cừu, Ngựa, Heo, Gia Cầm, Bò

Sông, suối

Lò

Người tiêu thụ

Tiếp xúc trực

Chế biến

Phế

Nguồn nước, chất thải nông trại

Nước uống

HỆ THỰC VẬT

Rau Cây ăn quả

Nước uống Nước thải

Thức ăn gia xúc

Biển

MÔI TRƯỜNG NUÔI THUỶ SẢN

Vật nuôi trong

Phế phẩm

Nguồn nước , chất thải của nông trại

(APAB) là một tiền chất của acid folic mà vi khuẩn cần được cung cấp để tổng hợp các chất purin, pyrimidin, thymin, làm ức chế sự tổng hợp purin, thymin làm cho sự phân bào và tổng hợp protein khó thực hiện được (Bùi Kim Tùng, 2001) Một số vi khuẩn chủng kháng thuốc là do không sử dụng APAB, hoặc

tự thích ứng để không cần sử dụng APAB nữa Ngoài ra sự nhiểm plasmid cũng dẩn đến tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn

sulfamethoxazole,…và ở dạng kết hợp với trimethoprim để trị các bệnh như:

đỏ mỏ, viêm ruột, xuất huyết, đốm đỏ, trắng đuôi do vi khuẩn Vibrio gây ra

trên cá (Lê Thị Kiêm Liên và Nguyễn Thị Như Ngọc, 2006; Đỗ Thị Hoà và ctv, 2004)

2.2.2 Nhóm β-lactamin (penicillins và cephalosporins)

Penicillin là thuốc kháng sinh được phát hiện đầu tiên, mở đầu cho kỷ nguyên kháng sinh quang trọng Năm 1928, Fleming phát hiện ra penicillin từ

Penicillium notatum Nhưng mãi đến năm 1943 mới được sản xuất công

nghiệp (Bùi Kim Tùng và ctv, 2001) Theo Bùi Thị Tho (2003) các penicillin đều có chung một nhân hoá học cơ bản là: 6- amino penicillanic acid Nhóm kháng sinh này có tác dụng ức chế sự tổng hợp thành tế bào vi khuẩn

Ampicillin thuộc nhóm penicillin tổng hợp là loại thuốc hạn chế sử dụng trong thuỷ sản Thuốc có phổ kháng sinh rộng, chúng tác dụng cả với vi khuẩn Gram (+) và Gram (-), cả những chủng tụ cầu, liên cầu đã kháng lại

penicillin, cả với Pseudomonas (Bùi Thị Tho, 2003)

cá nước ngọt: cá tra, cá basa, cá trắm cỏ (Đỗ Thị Hoà và ctv, 2004) Theo Lê Thị Kim Liên và ctv (2006) các kháng sinh này dùng điều trị đỏ mỏ, đỏ kỳ, trắng da, lở loét, chướng hơi ngửa bụng trên cá, bệnh trầy da của ếch, bệnh phồng cổ của baba

2.2.4 Nhóm phenicol

Theo Bùi Kim Tùng và ctv (2001) có tác dụng ức chế sự tổng hợp protein của

vi khuẩn bằng cách ngăn cản bước chuyển đổi axid amin giữa ARN vận chuyển và ribosom 50S Chloramphenicol thường có tác dụng kiềm khuẩn nhưng có thể diệt khuẩn ở nồng độ cao hoặc đối với những vi khuẩn nhạy cảm cao Vi khuẩn lờn thuốc là do tiết ra acety transferaz làm chloramphenicol mất hoạt tính Hiện nay trên thế giới và ở Việt Nam đã ban hành luật cấm sử dụng chloramphenicol vì nếu dùng thường xuyên để trị bệnh cho động vật sẽ rất nguy hiểm cho chúng, thuốc có khả năng tồn lưu cao trong các sản phẩm thức

ăn của con người (Lê Thị Kim Liên và ctv, 2006)

Florfenicol là kháng sinh thế hệ mới nhất của nhóm Phenicol, có hiệu quả trong điều trị các bệnh do vi khuẩn Gram âm, Gram dương (www.laocai.gov.vn)

2.2.5 Nhóm aminosid

Là nhóm kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng đối với hầu hết vi khuẩn gram (-) và một số vi khuẩn gram (+) hiếu khí, ít tác dụng đối với vi khuẩn kỵ khí vì Aminosid thấm qua màng tế bào vi khuẩn một phần nhờ hệ thống vận chuyển hoạt động phụ thuộc vào oxygen nên vi khuẩn kỵ khí tuyệt đối không chịu tác động của Aminosid Aminosid là kháng sinh diệt khuẩn, chúng ức chế tổng hợp protein, (Trần Thị Thu Hằng, 2006) Streptomycin là loại thuốc thường được dùng trong thuỷ sản Bệnh chướng bụng đầy hơi do nhiễm khuẩn

ở cá, ếch, baba, tôm có thể dùng kháng sinh Aminosid trộn vào thức ăn cho ăn (Lê Thị Kim Liên và ctv, 2007)

2.2.6 Nhóm trimethoprim

Trimethoprim có tác dụng kìm khuẩn, ức chế enzyme reductase của vi khuẩn, thường phối hợp với sulfamethoxazole Thuốc hấp thu nhanh và hoàn toàn qua đường tiêu hoá, đào thải chủ yếu qua thận và phần lớn dưới dạng không đổi (www.thuocbietduoc.com.vn) Theo Nguyễn Phước Tương và Trần Diễm Uyên (2000) Trimethoprim là nhóm kháng khuẩn tổng hợp tương tự như kháng sinh Trimethoprim có tác dụng diệt khuẩn đối với

dihydroflolate-các vi khuẩn gram (-) và gram (+), đặc biệt rõ nét trên E coli, Salmonella,

Shigella, Enterobactera, Citrobacter và cầu ký trùng Eimeria …

2.3 Vi khuẩn Aeromonas spp và Vibrio spp

Theo Inglis et al., (1993) Vibrio spp là giống vi khuẩn Gram (-), dạng

que thẳng hoặc hơi cong, kích thước 0,5-0,3 µm x 1,4-2,6 µm Chúng không tạo bào tử và có khả năng di động bởi một hoặc nhiều roi Tất cả vi khuẩn

thuộc giống này đều kị khí không bắt buộc, hoá dưỡng, oxidase (+), nhạy với phản ứng (O/129) Hầu hết, các loài thuộc giống này phát triển tốt trong môi trường nước biển, vùng cửa sông và trên các con vật thuộc vùng nước mặn Ion Na+ có tác dụng kích thích cho sự phát triển của chúng Một vài loài có khả năng gây bệnh cho người và vật nuôi Các vi khuẩn thuộc giống này gây

bệnh phần lớn trên cá biển (V alginolyticus, V anguillarum, V ordalii, V

salmonicida và V Vulnificus), riêng Aeromonas spp gây bệnh trên cá nước

ngọt

Theo Đỗ Thị Hoà (2004) giống Vibrio spp thuộc họ Vibrionaceae, có

một số đặc điểm chung như sau: có dạng hình que hay hình dấu phẩy, kích thước tế bào 0,3-0,5 x 1,4-2,6 µm Vibrio spp không hình thành bào tử và có

khả năng chuyển động nhờ một tiên mao hoặc nhiều tiên mao mảnh Là các vi khuẩn bắt màu gram (-), đa số phản ứng Oxydase (+), có khả năng oxy hoá và lên men trong môi trường O/F Glucose, không có khả năng sinh H2S và mẫn

cảm với (O/129) Hầu hết các loài của giống Vibrio spp đều phân bố trong môi

trường nước mặn Môi trường thiosulphate citrate bile salt agar (TCBS) là môi

trường chọn lọc của Vibrio spp Dựa vào màu sắc khuẩn lạc trên môi trường này, Vibrio spp được chia thành hai nhóm: nhóm có khả năng lên men đường

Sucrose và có khuẩn lạc màu vàng và nhóm không có khả năng lên men đường Sucrose có khuẩn lạc màu xanh lá cây trên môi trường (TCBS)

Theo Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv (2006) một nhóm vi khuẩn thuộc

giống Vibrio spp đã gây thiệt hại kinh tế trong nuôi tôm công nghiệp ở

Philippin, Ấn Độ và Indonesia là nhóm vi khuẩn phát sáng Bệnh phát sáng do

một số vi khuẩn có khả năng phát sáng gây ra như Vibrio harveyi, V

splendida, V orientalis, V ifscheri, V vulnificus Ở Việt Nam, những dạng

nhiễm vi khuẩn phát sáng thường thấy ở trại sản xuất hoặc ương tôm giống Khi vi khuẩn phát sáng hiện trong cơ thể tôm với số lượng lớn có thể làm tôm

nhiễm bệnh phát sáng trong bóng tối Vibrio phát sáng có thể phát thành dịch

và gây chết đến 100% ấu trùng tôm, tôm giống và kể cả tôm trưởng thành

Do có đặc điểm tương tự nhau nên lúc đầu giống Aeromonas spp và

Vibrio spp nằm chung họ Vibrionaceae Giữa thập niên 80 Aeromonas spp lại

được tách ra một họ riêng là Aeromonadaceae (Horneman và Mori, 2007) do

Aeromonas spp không nhạy với phản ứng O/129 (150µg) (ngoại trừ A

caviae) Theo Barrow và Feltham (1993) Aeromonas spp được chia thành 2

nhóm dựa trên khả năng di động và ngưỡng nhiệt độ phát triển của chúng

Nhóm vi khuẩn A hydrophila, A sobria và A caviae có các đặc điểm là có

khả năng di động, 2 đầu hơi tròn, Gram âm, hình que ngắn, hiếu khí không bắt buộc, phát triển được ở 37oC Nhóm thứ hai A salmonicida (3 loài phụ gồm:

A salmonicida, A achromogenes và A nova) có đặc điểm tương tự nhưng

chúng chỉ phát triển tốt nhất ở 22oC hoặc thấp hơn và không có tiêm mao cũng như chúng không có khả năng di động (trích dẫn bởi Nguyễn Hà Giang, 2008) Trong báo cáo về dịch bùng phát bệnh của Sanarelli (1891) nhóm gây

bệnh thường gặp là A hydrophila, A caviae, A sobria được phát hiện đầu tiên

trên cá chình Kế đến, trong các nghiên cứu trên cá chép của Schaperclaus

(1930), phân lập được vi khuẩn A hydrophila và cho đây là tác nhân gây bệnh cho cá (trích dẫn của Inglis et al., 1993)

A salmonicida là nhóm gây bệnh chủ yếu cho cá vùng nước lạnh, như

gây bệnh Furunculosis cho loài cá hồi và bệnh lở loét một số loài cá khác hoặc chứng phù đỏ ở cá chép Bệnh Furunculosis được báo cáo đầu tiên ở các trại giống cá hồi ở Đức bởi Emmerich và Weibel (1984) Bệnh xuất hiện hầu hết ở các quốc gia có cá hồi như Châu Âu, Bắc Mỹ, Nhật Bản, Hàn Quốc, Úc, Nam Phi, nhưng lại không có có Nam Mỹ Bệnh có thể xâm nhập vào cơ thể cá do môi trường kém chất lượng, mật độ nuôi quá dày, cá bị sốc do nhiệt độ cao

hoặc cá bị tổn thương (trích dẫn của Inglis et al, 1993)

Bệnh do nhóm vi khuẩn Aeromonas spp đã gây thiệt hại không kém

nghiêm trọng cho nghề nuôi thuỷ sản nước ngọt ở Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung Bệnh nhiễm trùng máu (bệnh đốm đỏ, xuất huyết …) do nhóm vi khuẩn này gây ra và thường gặp ở các động vật thuỷ sản nước ngọt như: trắm cỏ, ba sa, chép, tai tượng,… Mặt khác, chúng còn có thể gây bệnh ở baba, cá sấu, bệnh đỏ chân ở ếch, đốm nâu ở tôm càng xanh Tỉ lệ tử vong thường từ 30-70% (Đỗ Thị Hoà và ctv, 2004)

A hydrophila được cho là tác nhân gây bệnh đốm đỏ hay còn gọi là

bệnh sởi, xuất huyết do nhiễm trùng máu (Bergey (1957) được trích dẫn bởi

(Từ Thanh Dung và ctv, 2005) Bên cạnh đó, A hydrophila và A caviae là tác

nhân gây bệnh tuột nhớt trên cá bống tượng (Nguyễn Thị Như Ngọc, 1997) Theo Từ Thanh Dung (2005) bệnh xảy ra quanh năm nhưng thường tập trung vào mùa xuân và mùa thu ở miền Bắc và miền Nam nhưng tần số xuất hiện cao nhất là đầu mùa mưa và tỉ lệ tử vong từ 30-70% Bệnh có thể xuất hiện ở tất cả các giai đoạn phát triển của cá (trích dẫn bởi Nguyễn Hà Giang, 2008)

Vi khuẩn A hydrophila không những gây ảnh hưởng cho nghề cá mà

chúng còn gây ảnh hưởng không kém trên giáp xác (tôm càng xanh) Bệnh do

vi khuẩn này xảy ra trên tôm càng xanh thường là bệnh đốm nâu Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể tôm khi có tổn thương trên lớp ngoại bì Vì thế nên môi trường bị nhiễm bẩn hay các yếu tố môi trường không ổn định cũng gây ảnh hưởng sức khoẻ của tôm Tôm mới bị bệnh thường yếu hoạt động chậm chạp

và nằm yên ở đáy ao, kém ăn hoặc bỏ ăn Trên các phần phụ như (râu, chân

bò, chân bơi và đuôi), vỏ có các vết ăn mòn chuyển từ màu nâu sang đen và các phần phụ cụt dần Phía trong vỏ kitin của mang có đốm đen (Bùi Quang

Theo Trần Anh Dũng (2005) mật độ vi khuẩn tổng cộng trong nước của các mô hình nuôi cá tra thâm canh dạng đăng quầng tại tỉnh An Giang dao động từ 9,3 x103

đến 7,5x105 (CFU/ml) và trong mô hình nuôi ao dao động từ 7,7x103 đến 9,85x104 (CFU/ml)

Theo kết quả khảo sát mật độ vi khuẩn tổng cộng trong nước ao nuôi cá tra của Nguyễn Mạnh Hùng (2008) phần lớn trong ao nuôi có mật độ vi khuẩn lớn nhất (dao động từ 1,5x103-56x103 CFU/ml), kế đến là ao lắng (dao động từ 1,5x103 - 43,5x103 CFU/ml) và nhỏ nhất lại là ao thải (dao động từ 1,05x103 – 23,5x103 CFU/ml)

2.5 Một số nghiên cứu về sự kháng thuốc của các vi khuẩn trong nuôi thuỷ sản

Theo nghiên cứu của Trần Thị Tuyết Hoa và ctv (2004) về thành phần

loài và khả năng gây bệnh của nhóm vi khuẩn Vibrio phân lập từ hệ thống ương tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) ở trại sản xuất giống Khoa

Thuỷ Sản-Trường Đại Học Cần Thơ và Long Mỹ-Cần Thơ đã có 50 chủng vi

khuẩn Vibrio được định danh với 4 nhóm loài chủ yếu: Vibrio choleerae (31 chủng), Vibrio alginolyticus (10 chủng), Vibrio carchriae (5 chủng) và Vibrio

mimicus (4 chủng) Các chủng vi khuẩn này đều cho kết quả nhạy với các

kháng sinh gentamicin, tetraciline, nalidix-Sav, chlortetracylin, neomycin, oxytetracylin Bên cạnh đó, một số kháng sinh cũng có khả năng kháng lại 50 chủng phân lập này với các tỷ lệ tương ứng: kanamicin (49/50), streptomicin (40/50), carbenicilin (42/50) và ) oleandomycin (33/50) Ngược lại, 50 chủng

vi khuẩn này lại kháng với các loại kháng sinh sau: penicilin (49/50), vancomycin (45/50) và polymycin-B (32/50) Ngoài ra, một số chủng vi khuẩn

( nồng độ 105-107 tế bào/ml) cũng thể hiện độc lực qua các thí nghiệm gây cảm nhiễm trên ấu trùng tôm càng xanh

Theo nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv (2006) về xác định

ví trí phân loại và khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn Vibrio phát sáng phân lập từ hậu ấu trùng tôm sú (Penaeus monodon) Kết quả kháng sinh

đồ 26 trong số 27 chủng vi khuẩn được phân loại với 6 loại thuốc kháng sinh thông dụng trong nuôi thuỷ sản cho thấy: 100% chủng thử nghiệm kháng với ampicilin, và có khoảng từ (hoặc ít hơn) 15% vi khuẩn kháng với trimethoprim/ sulfamethoxazole, tetracillin, chloramphenicol, nitrofurantoin

và noxfloxacin Phần lớn (77%) các chủng vi khuẩn chỉ kháng với một loại kháng sinh Số chủng khác kháng với 2 loại kháng sinh là 15% Có một chủng kháng 4 loại và một chủng kháng với 6 loại kháng sinh thử nghiệm

Theo Phuong et al., (2005) có nhiều loại thuốc kháng sinh thường được

sử dụng ở các trại nuôi và sản xuất giống cá da trơn tại ĐBSCL như: βlactamin, quinolone, aminosid, sulfammid, tetracycline Nhưng việc kết hợp nhiều loại kháng sinh với nhau trong phòng và trị bệnh cũng được người nuôi

-sử dụng phổ biến Những tác giả này đã kiểm tra sự kháng thuốc của các dòng

vi khuẩn phân lập từ môi trường nước và bùn đáy ở các trại nuôi các đối tượng khác nhau: cá da trơn (catfish), cá rô phi (tilapia), cá trích (common carp), cá chép (gouramy) ở 5 tỉnh thuộc Đồng Bằng Sông Cửu Long Kết quả cho thấy 90% dòng vi khuẩn kháng với tetracycline, 76% kháng với ampicillin, 100% kháng với chloramphenicol, 65% kháng với nitrofurantoin và 89% kháng với trimethoprim-sulphamethoxazole Từ kết quả, ta nhận thấy: sự kháng thuốc của các vi khuẩn trong môi trường ao nuôi thuỷ sản đang ở mức độ rất cao

(trích dẫn bởi Sarter et al., 2005)

Kết quả nghiên cứu của (Sarter et al., 2006) về sự kháng thuốc kháng

sinh của vi khuẩn phân lập từ ao nuôi cá da trơn, có 92 chủng vi khuẩn được phân lập từ môi trường thuộc 3 trại nuôi cá da trơn được chọn lựa ngẫu nhiên

khác nhau Trong đó, tổng số chủng vi khuẩn thuộc họ: Enterobacteriaceae chiếm 49,1%, Pseudomonads chiếm 35,2%, Vibrionaceae chiếm 15,7% Kết

quả nghiên cứu sự kháng thuốc của các chủng vi khuẩn với 6 loại thuốc kháng sinh (0xytetracyline, chloramphenicol, trimethoprim-sulphamethoxazol, nitrofurantion, nalidixic acid và ampicillin) cho thấy phần lớn các chủng vi khuẩn đều có hiện tượng đa kháng thuốc: kháng với AM-OXT-SXT-NA chiếm 17,8%, kháng với OXT-SXT-NA chiếm 15,1%, kháng với AM-CHL-FT-SXT-NA chiếm 13,7%, kháng với AM-FT-OXT chiếm 9,6%, kháng với AM-CHL-FT-OXT-SXT-NA chiếm 8,2% Từ kết quả cho thấy, sự kháng thuốc trong thuỷ sản đang ở mức cao Những kết quả này cho thấy được khả

năng kháng thuốc kháng sinh trong các loài vi khuẩn bản địa là một mối quan tâm lớn trong nuôi cá da trơn ở vùng ĐBSCL

Le et al., (2005) cũng đã nghiên cứu tính kháng thuốc của vi khuẩn đối

với norfloxacin (NFXC), oxolinic Acid (OXLA), trimethoprim (TMP) và sulfamethoxazole (SMX) tìm thấy ở bốn vùng nuôi tôm có trồng đước ở Việt Nam Kết quả nghiên cứu cho thấy, đều có sự tồn dư của NFXC, OXLA, TMP, và SMX trong tất cả các mẫu nước Lượng kháng sinh tồn dư trong nước ở Cà Mau cao hơn ở những tỉnh khác Trong số đó, NFXC và TMP tồn

dư có nồng độ rất cao với giá trị 1.64 và 1.69 ppm, nồng độ SMX không có sự khác biệt nhiều ở các tỉnh với nồng độ dao động từ 0.97-1.27ppm Mật độ vi khuẩn trong nước cao nhất ở tỉnh Cà Mau và thấp nhất ở Nam Định Sự kháng thuốc của vi khuẩn trong nước đối với NFXC, OXLA, TMP và SMX ở những khu vực khác nhau Phạm vi kháng thuốc của vi khuẩn đối với những loại thuốc kháng sinh giảm khi nồng độ của thuốc kháng sinh trên môi trường thạch gia tăng từ 0.1-10µg/ml Phạm vi kháng thuốc cao nhất của vi khuẩn đối với NFXC, OXLA, TMP và SMX khi có nồng độ 0.1µg/ml, được xác định

ở Cà Mau với giá trị lần lượt: 52.11%, 42.33%, 67.97%, và 67.22% Trong lúc

đó, phạm vi này thấp nhất ở Cần Giờ (NFXC – 22.47%, OXLA – 28.19%, TMP – 57.20%, và SMX – 54.11%) Sự phát hiện này đã chỉ ra được phạm vi kháng thuốc cao nhất của vi khuẩn đối với NFXC, TMP và SMX với nồng độ 0.1, 1 và 10µg/ml và OXLA với nồng độ 0.1µg/ml ở tỉnh Cà Mau, nơi có nồng

độ tồn dư thuốc kháng sinh cao nhất so với các tỉnh khác Phạm vi kháng thuốc của vi khuẩn đối với NFXC và OXLA được tìm thấy ở Cần Giờ - nơi có nồng độ thuốc kháng sinh trong mẫu nước là thấp nhất Điều đó cho thấy phạm vi kháng thuốc của vi khuẩn đối với các loại thuốc kháng sinh ở trong nước cao khi những loại thuốc kháng sinh tồn dư cao Tuy nhiên, đối với những nơi khác, phạm vi kháng thuốc của vi khuẩn đối với các loại thuốc kháng sinh cao được tìm thấy trong các ao nuôi có nồng độ thuốc kháng sinh thấp Điều này cho thấy phạm vi kháng thuốc đối với thuốc kháng sinh trong

ao nuôi tôm có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố khác bên cạnh tồn dư kháng sinh

Đối với nền bùn, có một sự khác biệt nhỏ về nồng độ NFXC trong mẫu bùn ở tỉnh Thái Bình, Nam Định và Cà Mau Nồng độ NFXC ở Cà Mau được tìm thấy thấp hơn so với các loại kháng sinh khác và thấp hơn 3 tỉnh còn lại Nồng độ OXLA ở Thái Bình, Nam Định và Cà Mau được tìm thấy thấp hơn 4.5ppm, nhưng nồng độ OXLA ở Cần Giờ khoảng 11.23µg/ml Trong khi đó, nồng độ TMP ở mức cao với 18.21µg/ml đối với mẫu bùn được thu ở Cà Mau

Thêm vào đó, nồng độ của SMX ở các tỉnh có sự khác nhau ở mức từ 6.87µg/ml đến 12.56µg/ml

Phạm vi kháng thuốc của vi khuẩn đối với NFXC, OXLA, TMP và SMX trong mẫu bùn cao hơn so với vi khuẩn trong mẫu nước ở cùng một vị trí thu mẫu.Trong số 4 tỉnh thu mẫu, với nồng độ kháng sinh 0.1µg/ml, phạm vi kháng thuốc của vi khuẩn đối với NFXC cao nhất ở tỉnh Cà Mau (60.91%), trong khi phạm vi kháng thuốc cao nhất là đối với OXLA, được tìm thấy ở Nam Định ở giá trị là 59.71% Ở môi trường có nồng độ thuốc kháng sinh cao (1 và 10µg/ml), phạm vi kháng thuốc của vi khuẩn cao nhất đối với OXLA và NFXC được tìm thấy ở tỉnh Nam Định Điều đang được quan tâm ở đây là phạm vi kháng thuốc của vi khuẩn đối với NFXC và OXLA cao nhất ở Nam Định trong khi nồng độ NFXC trong bùn ở Nam Định cũng cao nhất, nhưng nồng độ OXLA trong bùn lại cao nhất ở Cần Giờ Mặc dù nồng độ NFXC và OXLA trong mẫu bùn ở Cần Giờ hoàn toàn thấp (1.85 và 1.23ppm) nhưng phạm vi kháng thuốc của vi khuẩn đối với hai loại thuốc kháng sinh này lại cao, 38.24% đối với NFXC 0.1µg/ml và 39.87% đối với OXLA 0.1µg/ml

Theo nghiên cứu của Petersen et al., (2002) về sự tác động của mô

hình nuôi cá kết hợp đến mức độ kháng thuốc kháng sinh xảy ra trong mội trường ao nuôi Mô hình nuôi kết hợp giữa gà-cá đã được nghiên cứu trong vòng 2 tháng sau khi bắt đầu một chu kỳ nuôi mới Kết quả cho thấy có sự gia tăng có ý nghĩa về tính kháng thuốc đối với 6 loại thuốc kháng sinh khác nhau

của vi khuẩn Acinetobacter spp được phân lập từ mẫu nước và bùn đáy Mức

độ kháng thuốc ban đầu trước khi bắt đầu chu kỳ nuôi mới (trước khi tiến hành thí nghiệm) là 1-5% Sau 2 tháng mức độ kháng thuốc đối với oxytetracyline

và sulfamethoxazole đạt đến 100% và mức độ kháng với ciprofloxacin hơn 80% Ảnh hưởng lâu dài của tính kháng thuốc ở mô hình nuôi kết hợp cũng đã được nghiên cứu thêm trên 7 ao nuôi ( gồm các mô hình: gà-cá, heo-cá, vịt-

cá) Mức độ kháng thuốc của các dòng Enterococcus spp và Acinetobacter spp

được phân lập từ mẫu nước và bùn đáy ở các ao này đặc biệt cao so 4 ao đối chứng (mô hình đơn hoặc không sử dụng thuốc kháng sinh) Nhận thấy rằng

mô hình nuôi kết hợp dường như tạo cơ hội cho vi khuẩn phát sinh tính kháng thuốc trong môi trường ao nuôi Điều này có thể do yếu tố áp lực chọn lọc của thuốc kháng sinh hoặc do ảnh hưởng của các vi khuẩn mang tính kháng thuốc

từ trong phân của động vật

Ở Nhật Neela et al., (2006) đã nghiên cứu sự đa kháng thuốc của các dòng vi khuẩn Vibrio spp phân lập từ lớp bùn đáy và nước thuộc vùng ven

biển với tetracycline Nghiên cứu này đã kiểm tra tính đa kháng thuốc của

giống vi khuẩn Vibrio spp với kháng tetracycline nhằm xác định rõ tính mẫn

cảm của nó đối với 2 loại beta-lactams là ampicilline và mecillinam, cũng như với macrolide và erythcromycin Kết quả cho thấy có những kiểu kháng thuốc khác nhau trong các dòng được phân lập từ những vùng địa lý rất gần nhau trong cùng một thời điểm, điều đó chứng tỏ có những kiểu thay đổi tính kháng thuốc khác nhau của vi khuẩn ở ngoài môi trường thuộc khu vực này Ngoài

ra, sự khác biệt về tính đa kháng thuốc đã gợi lên khả năng di truyền tính

kháng thuốc trong Vibrio spp thu được cũng khác nhau ngay trong môi trường

nước và môi trường bùn đáy

Ở Bồ Đào Nha vi khuẩn thuộc giống Aeromonas spp là nguyên nhân

gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi cá Hồi với mô hình khép kín Kết quả nghiên cứu thực hiện tại các trạm thực nghiệm nuôi trồng thủy sản tại Bồ Đào Nha có

51 dòng vi khuẩn thuộc giống Aeromonas spp đã được phân lập từ 20 cá hồi,

lấy mẫu da và thận, cũng như lấy từ mẫu nước Kiểm tra bằng mắt thường và bằng kính hiển vi mẫu mô của cá đã phát hiện được vết thương hay sự thay đổi hình dạng của tế bào trên da và thận được xem như có liên quan đến các dòng

vi khuẩn trên Sự nhạy cảm của tất cả các dòng vi khuẩn với các nhóm kháng sinh beta-lactam khác nhau được đánh giá bằng cách sử dụng phương pháp khuếch tán trên đĩa Ta thấy được tỷ lệ kháng thuốc cao nhất của vi khuẩn đối với amoxicillin, carbenicillin và ticarcillin Thật bất ngờ khi phát hiện được tính kháng thuốc đối với imipenem một loại thuốc thông thường Điều đó cho thấy được rằng khả năng kháng thuốc từ môi trường có thể chuyển sang quần

thể vi khuẩn Aeromonas spp (Saavedra et al., 2004)

2.6 Các thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp pha loãng

Nguyễn Thị Tiên (2007) đã thực hiện đề tài “xác định đặc điểm sinh hoá và khả năng kháng thuốc của mầm bệnh vi khuẩn phân lập trên tôm sú

(Penaeus monodon) bệnh phấn trắng”

Thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp pha loãng Kháng sinh dùng trong thí nghiệm là chloramphenicol, loài vi khuẩn là

Vibrio Mật độ vi khuẩn được xác định bằng máy so màu quang phổ với bước

sóng 590 nm, điều chỉnh mật độ đạt giá trị OD = 0.1±0.02 (khoảng 108cfu/ml)

Kết quả nồng độ MIC của kháng sinh chloramphenicol lên vi khuẩn

Vibrio (Vibrio sp (P1O10), V ordalii (P2O3), V anguilyticus (P2O9), V

navarrensis (P5O2), V carchariae (P5O9), V minicus (P5O11)) lần lược: 64; 32;

256; 32; 16; 2 ppm, cao hơn so với Plesimonas shigelloides, Pseudomonas là:

8; 4 µg/ml

Huỳnh Thị Phượng Quyên (2008) đã tiến hành tiêu chuẩn hoá phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc kháng sinh lên vi

khuẩn Edwarsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila (được phân lập trên cá

tra và trữ lạnh ở điều kiện - 800C trong môi trường BHI và glycerol) Thí nghiệm được tiến hành với 2 loại thuốc kháng sinh: doxycyclin, cefalexin Mật

độ vi khuẩn được xác định bằng 2 cách: so màu quang phổ với bước sóng 590

nm điều chỉnh mật độ vi khuẩn bằng môi trường NB cho đạt OD = 0.1±0.02

và so sánh với ống chuẩn McFarland (số 1: 0,1ml 1% BaCl2:9,9ml 1%

H2SO4), mật độ vi khuẩn đạt khoảng 108 cfu/ml (A hydrophila)

Kết quả nồng độ MIC của chủng vi khuẩn A hydrophila CAF2 với 2

loại thuốc kháng sinh (doxycyclin, cefalexin) bằng phương pháp so màu quang phổ: 32; 128 ppm, phương pháp so màu Macfarland 16; 128 µg/ml và nồng độ

MIC của vi khuẩn A hydrophila CAF133 cũng lần lược là: 16; 64 và 16; 32

µg/ml

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện: từ 11/2008-5/2009 Địa điểm thực hiện:

- Thu mẫu nước và mẫu bùn tại tỉnh Cần Thơ, Trà Vinh và Bến Tre

- Phân tích mẫu tại phòng thí nghiệm Bệnh Học Thuỷ Sản- Khoa Thuỷ Sản-Trường Đại Học Cần Thơ

3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Dụng cụ

Phiếu ghi nhận thông tin khi thu mẫu (phụ lục 1), giấy vệ sinh, bao tay, giấy nhôm, giấy làm dấu, bọc nylon, dây thun, thùng trữ lạnh, …

Chai nút mài 100 ml, ống nghiệm 10ml, đĩa petri, đèn cồn, que trãi thuỷ tinh, bình xịt cồn, cốc đốt 250 ml, hộp đầu col pipet 0.5ml và 1ml, pipet 100-1000ml, lame, lamelle

Cân điện tử, máy trộn mẫu nước (vortex), máy khuấy từ, nồi khử trùng áp suất, tủ sấy khô, tủ ấm, tủ lạnh, tủ vô trùng

3.2.2 Môi trường, hoá chất và vật liệu nghiên cứu

Hoá chất: NaCl, cồn 96o, cồn 70o, glycerol, nước cất, các loại hoá chất nhuộm Gram,.…

Thuốc kháng sinh dùng trong kháng sinh đồ (6 loại): ampicillin-10µg (AM), chloramphenicol-30 µg (CHL), tetracyclin-30 µg (TE), doxycycline-30 µg (DO), streptomycin-10 µg (SM), trimethoprim + sulfamethoxazole-1,25/23,75

µg (SXT) của Bio-rad

Kháng sinh tinh dùng trong xác định MIC: chloramphenicol, oxytetracycline, streptomicine của Oxoid

Môi trường chung: TSA (Trypton Soy Agar) của Merck

Môi trường lập kháng sinh đồ: MHA (Mueller-Hinton Agar) của Merck

Môi trường chọn lọc: GSP Agar (Pseudomonas Aeromonas Selective Agar Base), TCBS (Thiosulphate citrate bile salt agar), BHIB (Brain heard in broth) của Merck

Nguồn vi khuẩn tham khảo: Aeromonas hydrophila, Vibrio anguillarum, vi khuẩn chuẩn E coli (ATCC 25922)

3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Địa điểm thu mẫu

Chọn dạng ao nuôi cá tra thâm canh ở Cần Thơ và hai tỉnh nước lợ Trà Vinh

và Bến Tre

3.3.2 Số mẫu

Tổng số ao được thu là: 30 ao (30 mẫu nước + 30 mẫu bùn) Mỗi tỉnh tiến hành thu 10 ao

3.3.3 Phương pháp thu mẫu

Mẫu nước và bùn được thu ở ba điểm khác nhau ở trong ao: điểm cấp nước vào, giữa ao và điểm thoát nước

Phương pháp thu mẫu nước và bùn theo tài liệu của Le, at al., (2005)

Đối với mẫu nước: tại mỗi điểm thu 100 ml bằng chai nút mài tiệt trùng và thu cách mặt nước 0-20 cm

Đối với mẫu bùn: tại mỗi điểm thu 10 ml bằng dụng cụ chuyên biệt (drivers)

và thu ở lớp mặt 1 cm, sau đó cho mẫu vào chai đã tiệt trùng

Tất cả mẫu thu được trữ lạnh ở 4oC và chuyển về phòng thí nghiệm phân tích trong vòng 24 giờ

3.3.4 Phương pháp phân lập vi khuẩn Mẫu nước

Các chai nước được lấy ra khỏi thùng và điều chỉnh về nhiệt độ phòng Sau đó rút bỏ một ít nước trong mỗi chai sao cho có thể đảo đều mẫu nước trong chai Ở mỗi chai hút 30ml/chai cho vào một chai rỗng đã được khử

trùng Trộn đều mẫu nước và tiến hành phân tích theo phương pháp của (Le, et