đánh giá sự kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh trên cá tra (pangasianodon hypophthalmus) nuôi ở vùng nước lợ tỉnh trà vinh - bến tre

Khi việc sử dụng kháng sinh quá mức, không được kiểm soát để trị bệnh cho cá, tôm thì một điều tất yếu sẽ xảy ra đó là vấn đề kháng thuốc của các chủng vi khuẩn gây bệnh đồng thời gây ản

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN

NUÔI Ở VÙNG NƯỚC LỢ TỈNH TRÀ VINH - BẾN TRE

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2009

LỜI CẢM TẠ Xin bài tỏ long biết ơn sâu sắc và chân thành đến

Cô Từ Thanh Dung đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, đóng gớp nhiều ý kiến quý báu và tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp Thầy cô và các anh chị bộ môn Sinh Học và Bệnh Học Thủy Sản-Khoa Thủy Sản-trường Đại Học Cần Thơ đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện đề tài

Thầy cô và các bạn khoa Nông Nghiệp – Thủy Sản, trường Đại Học Trà Vinh

đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện đề tài Tập thể lớp bệnh học thủy sản K31 đã giúp đỡ tận tình

MỤC LỤC

Trang

Mục lục i

Danh sách bảng iii

Danh sách hình iv

PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Tình hình dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản 3

2.2 Các bệnh thường xuất hiện trên cá tra 3

2.3 Đặc điểm của vi khuẩn Edwardsiella và Aeromonas 4

2.4 Các nghiên cứu về sự kháng thuốc của vi khuẩn 5

2.5 Thuốc kháng sinh dùng trong nuôi trồng thủy sản 7

2.6 Các nhóm kháng sinh thường sử dụng trong nuôi trồng thủy sản 9

PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

3.1 Vật liệu nghiên cứu 11

3.1.1 Đối tượng 11

3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm 11

3.2 Hóa chất và môi trường 11

3.2.1 Hóa chất 11

3.2.2 Môi trường 11

3.3 Phương pháp nghiên cứu 11

3.3.1 Phương pháp điều tra 11

3.3.2 Phương pháp thu mẫu 12

3.3.3 Phương pháp định danh vi khuẩn 12

3.3.4 Phương pháp lập kháng sinh đồ 12

3.3.5 Phương pháp xác định MIC 13

PHẦN IV: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 15

4.1 Kết quả điều tra 15

4.1.1 Thông tin chung 15

4.1.2 Thông tin về kỹ thuật nuôi: 16

4.1.3 Tình hình bệnh và sử dụng thuốc-hóa chất 17

4.2 Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn 19

4.2.1 Kết quả phân lập và chỉ tiêu sinh hóa 19

4.2.2 Kết quả định danh vi khuẩn E ictaluri và Aeromonas sp bằng bộ kit

API 20E 21

4.3 Kết quả kháng sinh đồ 21

4.3.1 Kết quả làm kháng sinh đồ Aeromonas sp 23

4.3.2 Kết quả làm kháng sinh đồ E ictaluri 25

4.4 Kết quả giá trị MIC 26

4.4.1 Giá trị MIC của vi khuẩn Aeromonas sp 27

4.4.2 Giá trị MIC của vi khuẩn E ictaluri 27

PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 29

5.1 Kết luận 29

5.2 Đề xuất 29

PHẦN VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO 30

PHỤ LỤC 34

DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Diện tích mặt nước trung bình của các hộ nuôi 16 Bảng 4.2 Kết quả kiểm tra các đặc điểm hình thái, sinh hóa của vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri và Aeromonas sp 19

Bảng 4.3 Giá trị MIC của vi khuẩn Aeromonas sp 27 Bảng 4.4 Giá trị MIC của vi khuẩn E ictaluri 28

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Các con đường trao đổi sự kháng thuốc của vi khuẩn giữa động vật

và con người (Prescott , 2000) 8

Bảng 4.1 Bản đồ địa chính tỉnh Bến Tre và Trà Vinh 15

Hình 4.2 Các loại kháng sinh thường được sử dụng ở Trà Vinh và Bến Tre 18

Hình 4.3 Cá tra bị bệnh mủ gan 20

Hình 4.4 Cá tra bị bệnh xuất huyết 20

Hình 4.5 Khuẩn lạc Aeromonas spp phát triển trên môi trường TSA 20

Hình 4.6 Khuẩn lạc E ictaluri phát triển trên môi trường TSA 20

Hình 4.7 Vi khuẩn E ictaluri gram âm, que ngắn 21

Hình 4.8 Vi khuẩn Aeromonas sp gram âm, que ngắn 21

Hình 4.9 Kết quả định danh Aeromonas spp bằng bộ kit API 20E 22

Hình 4.10 Kết quả kháng sinh đồ chủng Aeromonas sp 22

Hình 4.11 Tỷ lệ phần trăm kháng thuốc kháng sinh của các chủng vi khuẩn Aeromonas sp 23

Hình 4.12 Tỷ lệ phần trăm kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 25

Hình 4.13 Kết quả MIC của Aeromonas sp ở nồng độ 2 µg/ml 28

TÓM TẮT

Mục tiêu của nghiên cứu là đánh giá sự kháng thuốc của hai loại vi khuẩn

Aeromonas spp và Edwardsiella ictaluri bệnh trên cá tra (pangasianodon hypophthamus) nuôi ở vùng nước lợ tỉnh Trà Vinh và Bến Tre Kết quả khảo

sát ban đầu cho thấy 100% số hộ nuôi được phỏng vấn đều sử dụng thuốc kháng sinh để phòng và trị bệnh Kết quả phân lập, kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản và định danh bằng bộ kit API 20E xác định được 20 chủng vi khuẩn gây

bệnh trên cá tra trong đó có 12 chủng E ictaluri và 8 chủng Aeromonas spp

Để đạt được mục tiêu đề ra, phương pháp lập kháng sinh đồ với 7 loại thuốc kháng sinh được thực hiện trên 20 chủng vi khuẩn đã tìm được Kết quả cho

thấy đa số chủng E ictaluri đã kháng với florfenicol (50%), chloramphenicol

(58%) và tetracycline (42%), nhưng với ampicillin và cefazoline đều nhạy với

100% số vi khuẩn E ictaluri phân lập được Kết quả không tìm thấy vi khuẩn

Aeromonas spp kháng với florfenicol và chloramphenicol, trong khi đó có tới

50% vi khuẩn Aeromonas spp kháng với streptomycine và 100% kháng với

cefazoline Phương pháp pha loãng thuốc kháng sinh trên môi trường lỏng dựa theo tài liệu Clinical and Laboratory Standards Institure (CLSI), (2006b) được

sử dụng làm MIC trên ba loại kháng sinh chloramphenicol, oxytetracycline và

streptomycine Kết quả đã tìm thấy E ictaluri kháng với chloramphenicol ở

mức cao (6/8 chủng)

PHẦN I ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu

Thủy sản được xem là một trong những ngành kinh tế quan trọng của Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) Những năm gần đây đã phát triển rất nhanh, góp phần tích cực vào việc nâng cao nguồn thu nhập của cộng đồng và tăng kim ngạch xuất khẩu Trong vòng 10 năm từ 1995 đến 2005, diện tích nuôi trồng thủy sản vùng ĐBSCL đã tăng hơn 2,37 lần và sản lượng tăng vọt hơn 3,68 lần (Lê Tuấn Anh, 2008)

Cùng với sự phát triển khá nhanh về sản lượng, diện tích nuôi và mô hình nuôi thủy sản, nghề nuôi cá tra có tốc độ phát triển cao nhất Theo thống

kê của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn cho thấy sự phát triển khá nhanh về diện tích nuôi cá tra Sáu tháng đầu năm 2007 tổng diện tích nuôi gần 5.000 ha và đến sáu tháng đầu năm 2008, diện tích đã tăng lên đạt gần 6.000 ha, và sản lượng cá cũng tăng theo rất nhanh từ 1 triệu tấn của năm 2007

có thể tăng lên 1,2 triệu tấn trong năm 2008 Ngoài những tỉnh có truyền thống nuôi cá tra như Đồng Tháp, An Giang, gần đây những tỉnh như Sóc Trăng, Trà Vinh và Bến Tre cũng đầu tư phát triển

Năm 2007, ngành thủy sản Bến Tre tập trung nuôi các đối tương: tôm

sú, tôm càng xanh, nghêu và cá da trơn Tổng diện tích nuôi thủy sản năm

2007 là 43.000 ha Trong đó, diện tích nuôi cá da trơn 230 ha, với năng suất 35.000 tấn (http://www.fistenet.gov.vn, cập nhật ngày 28/11/2008) Nuôi trồng thủy sản đang phát triển mạnh trên nhiều khía cạnh về diện tích nuôi, mức độ thâm canh, loại hình nuôi, đầu tư cơ sở hạ tầng và chế biến sau thu hoạch Việc sử dụng thuốc, hóa chất đóng góp không nhỏ cho sự phát triển của ngành trong việc cải tạo, duy trì chất lượng môi trường nuôi và trong các trường hợp bệnh bộc phát cần đến sự can thiệp của thuốc-hóa chất Tuy nhiên, việc sử dụng và quản lý thuốc, hóa chất trong nuôi trồng thủy sản còn rất nhiều hạn chế do trình độ của người nuôi và người cung cấp Điều đó dẫn đến việc sử dụng không đúng các loại thuốc kháng sinh Theo điều tra của Mai Văn Tài (2004) có tới 138 loại kháng sinh đã được sử dụng trong các loại hình nuôi và sản xuất giống thủy sản ở Việt Nam

Khi việc sử dụng kháng sinh quá mức, không được kiểm soát để trị bệnh cho cá, tôm thì một điều tất yếu sẽ xảy ra đó là vấn đề kháng thuốc của các chủng vi khuẩn gây bệnh đồng thời gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người Và như vậy thì việc phòng và xử lý bệnh cho động vật thủy sản củng như con người sau này sẽ gặp rất nhiều khó khăn

Vấn đề kháng thuốc kháng sinh của các chủng vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản từ lâu cũng đã được nhiều tác giả nghiên cứu và đã xác được nhiều nhóm vi khuẩn phân lập được từ các ao nuôi cá da trơn đã kháng với nhiều loại kháng sinh như Oxytetracycline, Tetracycline, Ampiciline,

…(Depaola et al, 1995; Matyar et al., 2004; Mohamed Nawaz et al., 2006) Ở

Việt Nam sự kháng thuốc kháng sinh của các dòng vi khuẩn phân lập từ các ao nuôi thủy sản ở ĐBSCL cũng đã được nghiên cứu và cũng tìm thấy được 169 dòng vi khuẩn kháng với 6 loại kháng sinh thường dùng để trị bệnh cho động vật thủy sản (Nguyễn Thanh Phương và ctv., 2005) Gần đây, Từ Thanh Dung

và ctv (2008) nghiên cứu sự kháng thuốc của 64 chủng Edwardsiella ictaluri

gây bệnh trên cá tra đã tìm ra đa số kháng với streptomycin (83%), oxytetracyline (81%)…

Trong thời gian gần đây thì cá tra cũng đã được nhiều người dân ở các tỉnh Trà Vinh, Bến Tre, Sóc Trăng đưa về nuôi ở những vùng nước lợ, hiện nay việc kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh trên cá tra nuôi ở vùng nước ngọt khá phổ biến vậy còn cá tra nuôi ở vùng nước lợ thì sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh sẽ như thế nào? Do đó, vấn đề hết sức cấp thiết hiện nay là nghiên cứu sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh trên cá tra nuôi ở vùng nước

lợ xảy ra như thế nào để góp phần giảm thiểu thiệt hại về kinh tế, tăng năng suất và sản lượng cá tra do sự kháng thuốc của vi khuẩn gây ra Vì vậy mà đề

tài “Đánh giá sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh trên cá tra

(Pangasianodon hypophthalmus) nuôi ở vùng nước lợ tỉnh Trà Vinh và

Bến Tre” được thực hiện

1.2 Mục tiêu đề tài

Đánh giá sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh mủ gan, xuất huyết trên cá tra nuôi ở vùng nước lợ tỉnh Trà Vinh và Bến Tre đồng thời tìm những loại thuốc đặc hiệu để tạm thời điều trị 2 loại bệnh nguy hiểm này khi cần thiết nhằm làm giảm thiệt hại cho người nuôi

1.2.1 Nội dung thực hiện:

Điều tra tình hình sử dụng kháng sinh của các hộ nuôi cá tra ở vùng nước lợ hai tỉnh Trà Vinh và Bến Tre

Phân lập, định danh và lập kháng sinh đồ của 20 chủng vi khuẩn gây

bệnh (E.ictaluri và Aeromonas spp)

Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chủng vi khuẩn gây bệnh trên

PHẦN II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản

Nghề nuôi trồng thủy phát triển rất mạnh ở nước ta nói chung và ở Đồng Bằng Sông Cửu Long nói riêng trong thời gian gần đây làm cho môi trường nuôi ngày càng xấu đi nghiêm trọng, sự bùng phát của dịch bệnh xảy ra ngày càng nhiều Sự lan truyền dịch bệnh trong thủy sản đã dẫn đến những hậu quả nghiêm trọng về kinh tế - xã hội, môi trường và thương mại quốc tế khó mà tính toán được Tại Việt Nam, mỗi năm có hàng nghìn hộ dân nuôi luân canh tôm lúa bị thua lỗ do tôm bị chết, tổng thiệt hại trên 4,5 tỉ đồng, trong các năm 1995-1997 có khoảng 4.000 trong số 5.000 lồng nuôi cá trắm cỏ

bị bệnh đốm đỏ gây thiệt hại 500.000 USD (Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản I., 1998, trích dẫn bởi www.fistenest.gov.vn cập nhật ngày 31/10/2008)

Trong số các bệnh của thuỷ sản thì nguyên nhân chủ yếu là do vi khuẩn gây ra với những vụ dịch bệnh có qui mô lớn Thông thường, người ta sử dụng thuốc kháng sinh để kiểm soát các vi khuẩn gây bệnh Do việc sử dụng không đúng cách và quá nhiều các loại thuốc kháng sinh được sử dụng sai nên đã gây

ra hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc và tích tụ dư lượng thuốc kháng sinh trong thịt thuỷ sản Một nguyên nhân khác gây ra hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc

là việc sử dụng các loại kháng sinh với hàm lượng nhỏ trong thức ăn của thuỷ

sản như một chất kích thích sinh trưởng (Mai Văn Tài và ctv., 2004)

Đối với tác nhân gây bệnh là vi khuẩn thì các loài vi khuẩn gây bệnh

cho một số đối tượng nuôi quan trọng mà Việt Nam phải đối mặt đó là Vibrio

harveyi, Aeromonas hydrophila, Pseudomonas flouresent, Streptococcus sp., Edwardsiella tarda, Edwardsiella ictaluri…(Bùi Quang Tề, 2006) Riêng đối

với cá tra một số tác giả đã tìm thấy một số bệnh phổ biến như: bệnh gan thận

mủ do vi khuẩn E ictaluri, bệnh xuất huyết do vi khuẩn A hydrophila, A

sobria và A caviae Trong đó, vi khuẩn E ictaluri là nguyên nhân gây thiệt

hại kinh tế nguy hiểm nhất trong các mô hình nuôi công nghiệp ở ĐBSCL Ký sinh trùng thuộc nhóm nội ký sinh protozoa bao gồm vi bào tử trùng

(Microsporidium), bào tử trùng (Myxobolus spp., Henneguya spp.), trùng roi (Trypanosoma sp.), trùng lông nội ký sinh (Balantidium, Ichthyonyctus sp.), Nhóm ngoại ký sinh gồm trùng quả dưa (Ichthyophthirius multifiliis), trùng mặt trời (Trichodina spp.) và trùng loa kèn (Epistylis sp.) Một số loài ký sinh

trùng thuộc nhóm ký sinh đa bào như Metazoa đã tìm thấy trên cá như

Monogenea (Thaparocleidus spp.) và 1 số loài khác thuộc nhóm trematoda

Một số bệnh chưa rõ tác nhân như hội chứng thịt philê có những đốm đỏ hoặc

vàng da (Dung et al., 2008)

2.2 Các bệnh thường xuất hiện trên cá tra

Dịch bệnh trên cá tra nuôi xảy ra quanh năm, kể cả mùa khô và mùa mưa nhưng nặng nhất vào lúc giao mùa, thời tiết và nhiệt độ thay đổi đột ngột

kế đó là mùa mưa và mùa nước đỗ (Từ Thanh Dung và ctv., 2005) Các bệnh

thường gặp trên cá tra là: bệnh nhiễm khuẩn, xuất huyết, bệnh đốm đỏ, bệnh gan thận có mủ, lở loét, bệnh ký sinh trùng…(Bùi Quang Tề, 2006)

Bệnh mủ gan trên cá tra xuất hiện đầu tiên vào mùa lũ năm 1998 ở các tỉnh nuôi thâm canh cá tra phát triển như An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ Sau đó bệnh lây lan sang các vùng nuôi cá tra lân cận Đặc biệt, những năm gần đây bệnh xuất hiện cả một số tỉnh mới phát triển nuôi cá tra như Trà Vinh, Bến Tre và Sóc Trăng Bệnh mủ gan đã được nghiên cứu và mô tả đầu tiên ở

Việt Nam vào năm 2001 do Fugerson và ctv Qua nghiên cứu của Từ Thanh Dung và ctv (2004) cho thấy bệnh xuất hiện cuối năm 1998 và trở nên trầm

trọng vào năm 1999 Ở ĐBSCL bệnh thường xuất hiện trong suốt mùa lũ Tuy nhiên, bọc phát cao điểm vào tháng 7-8 Bệnh xuất hiện và gây thiệt hại chủ yếu ở giai đoạn cá con, cả cá nuôi ao và nuôi bè

Theo điều tra của Trần Anh Dũng (2005), tần số xuất hiện bệnh mủ gan

do Edwadsiella ictaluri gây ra chiếm 61% Nguyễn Tấn Duy Phong (2008),

tần số này lên đến 93,8% số hộ nuôi cá ở Cần Thơ và An Giang, tỉ lệ cá chết khi bị bệnh này có thể lên đến 90,0% Ngoài ra, trên cá tra còn có một số bệnh như bệnh xuất huyết đốm đỏ xảy ra ở mọi lứa tuổi, tần số 75,0% số hộ nuôi Bệnh trắng mang, bệnh vàng da, lồi mắt, nổ mắt có tần số xuất hiện thấp hơn

2.3 Đặc điểm của vi khuẩn Edwadsiella và Aeromonas 2.3.1 Vi khuẩn Edwadsiella

Edwardsiella thuộc họ Enterobacteriaceae có đặc điểm Gram âm, hình

que mãnh, yếm khí tuỳ tiện, catalase dương, Cytocrom oxidase âm oxy hoá âm

và lên men trong môi trường O/F glucose Thường gặp hai loài: E tarda và E

ictaluri (Bùi Quang Tề, 2006)

Vi khuẩn E ictaluri được báo cáo đầu tiên vào năm 1979, là tác nhân

gây bệnh viêm ruột nhiễm khuẩn huyết (ESC-Enteris Septicaemia of Catfish)

trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) (Hawke, 1979) Năm 2001, ở Việt Nam

E ictaluri đã được Fugerson và ctv (2001) phân lập và ghi nhận xuất hiện đầu

tiên trên cá tra bị bệnh mủ gan ở ĐBSCL vào năm 1998 (Fugerson et al., 2001; Crumlish et al., 2002; Nguyễn Hữu Thịnh và Trương Thanh Loan, 2007) Ngoài ra, theo Từ Thanh Dung và ctv (2005) vi khuẩn này là tác nhân

gây bệnh mủ gan trên cá tra ở cá tỉnh nuôi cá tra thâm canh như An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, sau đó bệnh lan dần sang các vùng nuôi lân cận Đặt biệt, trong thời gian gần đây bệnh này cũng đã xuất hiện ở một số tỉnh mới nuôi cá tra như Bến Tre, Trà Vinh Sóc Trăng…gây thiệt hại lớn cho người nuôi

2.3.2 Vi khuẩn Aeromonas

Giống Aeromonas thuộc Aeromonadaceae gồm 2 nhóm: không di động (A salmonicada) và di động (A hydrophyla, A caviae, và A sobria) Đặc tính

chung của ba loài vi khuẩn thuộc nhóm di động là vi khuẩn Gram âm, dạng

hình que ngắn, yếm khí tùy tiện Vi khuẩn Aeromonas di động phân lập từ cá nước ngọt nhiễm bệnh, thường gặp nhất là loài A hydrophyla.(Bùi Quang Tề,

2006)

Trong các chủng vi khuẩn gây bệnh thuộc giống Aeromonas thì A

hydrophyla được xem là loài gây bệnh cho cá nước ngọt quan trong nhất Vi

khuẩn này gây bệnh đốm đỏ trên cá tra và basa (Từ Thanh Dung và ctv., 2005), bệnh treo râu trên cá trê và bệnh tuột nhớt trên cá bống tượng, bệnh lở loét và xuất huyết trên baba (Bùi Quang Tề, 2006)

2.4 Các nghiên cứu về sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản

Sự kháng thuốc của vi khuẩn nói chung và của vi khuẩn gây bệnh trên trên động vật thủy sản nói riêng đã được quan tâm, nghiên cứu từ rất lâu Từ những năm 50 của thế kỉ XX các nhà nghiên cứu Nhật Bản đã nghiên cứu tới

sự lan truyền rộng rãi của các loài vi khuẩn có khả năng kháng cùng lúc nhiều loại thuốc kháng sinh thông dụng (Bùi Thị Tho, 2003)

Việc sử dụng kháng sinh để phòng và trị bệnh trong nuôi trồng thủy có thể dẫn đến sự hình thành các mầm bệnh vi khuẩn kháng kháng sinh và gây

tác hại đến động vật nuôi và con người (Nguyễn Thanh Phương và ctv., 2005)

Vì vậy, vấn đề sử dụng kháng sinh từ lâu đã được nhiều quốc gia trên thế giới quan tâm kiểm soát nhưng cũng không triệt để

Từ lâu việc sử dụng kháng sinh để phòng và trị bệnh cho động vật thủy sản đã được nhiều người dân sử dụng một cách rộng rải, không đúng qui định

Trong một nghiên cứu phỏng vấn ở Thái Lan vào năm 2000 cho thấy 20% số người nuôi tôm đã sử dụng kháng sinh để phòng chống lại các bệnh về vi rút, thêm vào đó hơn 60% các trại nuôi đã sử dụng kháng sinh để phòng bệnh (Aquaculture., 2002 trích dẫn bởi vietlinh.com, truy cập ngày 6/11/2008) Còn

ở Việt Nam, việc sử dụng thuốc và hóa chất trong nghề nuôi tôm biển ngày càng gia tăng nhất là việc sử dụng kháng sinh do sự chuyển đổi nhanh chống

từ nuôi quảng canh sang thâm canh Theo một điều tra của Mai Văn Tài và ctv

(2004) có ít nhất 373 loại thuốc và hóa chất sử dụng trong nuôi trồng thủy sản

thì có 138 loại kháng sinh và Huỳnh Thị Tú và ctv (2006) cho thấy có 74 loại

thuốc và hóa chất được sử dụng trong nuôi tôm, trong đó có 19 loại kháng sinh Theo kết quả khảo sát về việc sử dụng kháng sinh ở các nước Châu Á của Mudd (2003), (Trích dẫn bởi Tangtrongpiros., 2005) cho thấy lượng kháng sinh các nước sử dụng là khá lớn: Trung Quốc 1.500 tấn, Nhật Bản 1.100 tấn, Hàn Quốc 550 tấn, Thái Lan 420 tấn, Ấn Độ 400 tấn, Philippine

350 tấn, Pakistan 200 tấn, Đài Loan 180 tấn, Malaysia 150 tấn, Bangladesh

100 tấn, Việt Nam 50 tấn và Indonesia 20 tấn

Các kết quả nghiên cứu đó đã cho thấy sự sử dụng sai rộng rãi các loại thuốc kháng sinh Từ đó đã tạo ra nhiều chủng vi khuẩn kháng thuốc

Miranda et.al (2003) đã tìm ra 25 chủng vi khuẩn khác nhau đã kháng

với Oxytetraxyline từ 4 nông trại nuôi cá ở Chile Ở ĐBSCL đã phân lập được

169 dòng vi khuẩn từ các ao nuôi thủy sản và thử với 6 loại kháng sinh và kết quả cho thấy 2% kháng với Chloramphenicol, có 59% dòng vi khuẩn kháng với 4 hay 5 loại kháng sinh trong đó có Chloramphenicol Có 34% kháng nhiều loại kháng sinh như Chloramphenicol, Ampicilline, Tetracycline,

Trimethoprim + Sulfamchoxazole, Nitrofurantion (Nguyễn Thanh Phương và

ctv., 2005) Trong thời gian gần đây, Pender et al (2008) đã nghiên cứu sự

kháng thuốc của Aeromonas được phân lập từ môi trường nước của các ao

nuôi cá da trơn, cá chình và trại sản xuất giống ở Hà Lan, kết quả cho thấy sự

kháng thuốc của Aeromonas như sau ampicilin và oxytetracyclin là 100%,

sulfamethoxazole 24%, trimethoprim 3% và ciprofloxacin và chloramphenicol

là 0%

Depaola et al., (1988) khảo sát sự kháng thuốc kháng sinh Tetracycline

và Oxytetracycline của vi khuẩn Aeromonas gây bệnh trên cá nheo nuôi ở Mỹ (Ictalurus punctatus) đã phân lập được 146 dòng vi khuẩn của giống

Aeromonas Trong đó, có 89 dòng vi khuẩn kháng với Oxytetracycline chiếm

61% và 32 dòng vi khuẩn kháng với Tetracycline chiếm 22% Ở Mỹ,

Mohamed et.al., (2006) đã phân lập được 81 (90%) dòng vi khuẩn thuộc giống

Aeromonas đã kháng với Tetracycline Qua kết quả cho thấy sự kháng thuốc

của vi khuẩn đã tăng lên về số lượng chủng vi khuẩn kháng và loại kháng sinh

bị kháng Waltman and Shotts (1986) đã kiểm tra sự kháng thuốc trên 118

chủng vi khuẩn E ictaluri phân lập được ở Mỹ với 37 loại kháng sinh Kết quả

nghiên cứu cho thấy, đa số các vi khuẩn Gram âm nhạy với hầu hết các loại thuốc đã thí nghiệm Tuy nhiên, hơn 90% số chủng vi khuẩn kháng với colistin và sulfamid Khi được kiểm tra sự nhạy cảm tự nhiên đối với 71 loài

kháng sinh của 102 dòng vi khuẩn Edwarsiella (trong đó có 41 chủng E

ictaluri) cho rằng tất cả các dòng Edwarsiella đều nhạy cảm tự nhiên với

nhóm kháng sinh tetracycline, β-lactamin, quinolone, chloramphenicol, nitrofurazion… Đồng thời tất cả các chủng đều kháng tự nhiên với nhóm

kháng sinh macrolid và kháng sinh oxonilic acid (Stock et al., 2001)

Đối với bệnh mủ gan trên cá tra nuôi ở Việt Nam thì vi khuẩn phân lập

được từ cá bệnh là vi khuẩn E ictaluri và nghiên cứu sự kháng thuốc của loài

vi khuẩn này Kết quả nghiên cứu cho thấy loài vi khuẩn này thể hiện tính đề kháng và đa kháng với các loại kháng sinh thường được sử dụng trong điều trị bệnh Tuy nhiên, số lượng, tỷ lệ chủng đề kháng và loại kháng sinh bị kháng khá khác nhau theo địa phương có bệnh xảy ra (Nguyễn Hữu Thịnh và Trương Thanh Loan., 2007) điều này cũng phù hợp với một nghiên cứu của Crumlish

et al (2002) Kết quả nghiên cứu này cho rằng vi khuẩn E ictaluri phân lập

trên cá tra nuôi thuộc tỉnh An Giang chỉ kháng với oxolinic acid trong khi vi khuẩn được phân lập từ cá nuôi thuộc tỉnh Cần Thơ lại cho kết quả kháng với oxytetracycline và sulphomamid Đồng thời, cùng với nghiên cứu của Depaola

et al (1995) còn cho thấy số lượng và tỉ lệ chủng đề kháng khác nhau theo mùa

vụ nuôi Ngoài ra, thì sự kháng kháng sinh cũng rất khác nhau giữa các loài vi

khuẩn gây bệnh ví dụ như sự kháng Aminoglycoside của E coli được phân lập vào mùa xuân thì cao hơn các loài khác (Depaola et al., 1995) Theo một điều tra của Matyar et.al (2004) sự kháng thuốc của vi khuẩn còn khác nhau tùy

theo vị trí phân lập được chúng Kết quả từ nghiên cứu cho thấy vi khuẩn phân lập từ mang của cá thì đã kháng với 7 loại kháng sinh trong khi vi khuẩn phân lập được trong nội tạng thì chỉ kháng với 5 loại kháng sinh

2.5 Thuốc kháng sinh dùng trong nuôi trồng thủy sản

thông qua phát hiện qua chất penicillin do một loại nấm có tên là penicillium

notatum sản sinh ra Đến năm 1940 người ta đã sản xuất thành công penicillin,

thử nghiệm trên động vật đã cho kết quả tốt, đến năm 1946 đã sản xuất được penicillin kết tinh, từ đó đã bắt đầu thời kỳ mới của kháng sinh (Prescott,

2000; Bùi Quang Tề và ctv., 2005)

Việc phát minh ra kháng sinh đã làm thay đổi mang tính cách mạng trong điều trị các bệnh lý nhiễm trùng Lúc mới phát hiện chúng được xem như một loại thần dược để trị bệnh nhiễm khuẩn trên cơ thể người và trên động vật Trong nuôi trồng thủy sản, việc sử dụng kháng sinh trong điều trị bệnh do vi khuẩn, nấm…đã góp phần không nhỏ trong việc tăng năng suất và sản lượng của ngành Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh như là sử dụng một con dao hai lưỡi: nếu biết rõ tính chất, tác dụng, dùng đúng bệnh, đúng liều đúng cách, nó giúp ta trị được nhiều bệnh nguy hiểm mang lại hiệu quả kinh tế cao Ngược lại, sử dụng bừa bãi không đúng nguyên tắc sẽ gây ra những hậu quả nghiêm trọng, chẳng những không trị được bệnh mà còn dẫn đến hiện tượng lờn thuốc của vi khuẩn, nghiêm trọng hơn là có thể làm chết sinh vật và biến đổi hệ vi khuẩn của người tiêu dùng hoặc làm cho người tiêu dùng cũng

bị kháng thuốc (Bùi Thị Tho, 2003)

Ảnh hưởng của vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh trên động vật nuôi đến sức khỏe con người là một vấn đề hết sức gay gắt và còn nhiều tranh luận bằng nhiều con đường khác nhau, vi khuẩn gây bệnh trên động vật nuôi có thể truyền gen kháng thuốc kháng sinh sang vi khuẩn gây bệnh ở người Khi đó, việc điều trị bệnh cho con người trở nên khó khăn và phức tạp hơn (Prescott, 2000)

Sự trao đổi của vi khuẩn gây bệnh giữa con người và động vật với nuôi trồng thủy sản (hình 2.1)

Hình 2.1: Các con đường trao đổi sự kháng thuốc của vi khuẩn giữa động vật và con người

(Prescott , 2000)

2.5.2 Sự kháng thuốc trong nuôi trồng thuỷ sản

Hiện tượng kháng thuốc kháng sinh là khả năng mà một sinh vật có thể chịu được tác động của các loại kháng sinh Các gen kháng thuốc thường có sẵn trong các loài vi sinh vật tạo ra kháng sinh bảo vệ chúng khỏi tác động của thuốc kháng sinh này Những gen này có thể được hình thành trong các loài vi khuẩn khác thông qua sự trao đổi gen với một vi khuẩn tạo ra kháng sinh, do vậy chúng có khả năng tạo ra cơ chế làm trung hoà hoặc phá huỷ các loại thuốc kháng sinh (Bùi Thị Tho, 2003)

2.5.3 Cơ chế của sự kháng thuốc

Một số loài vi sinh vật có sẵn khả năng chịu được một số loại kháng sinh nhất định Sự kháng thuốc kháng sinh có thể coi như là đặc tính vốn có hoặc có thể được hình thành của các vi sinh vật này Có nhiều cách khác nhau gây ra sự kháng thuốc của vi sinh vật Có ba cơ chế thường gặp của hiện tượng

đề kháng kháng sinh ở vi khuẩn: Thay đổi vị trí đích tác động; Thay đổi sự thu nhận kháng sinh, và bất hoạt kháng sinh (Bùi Kim Tùng, 2001) Ngoài ra, hiện tượng kháng thuốc có thể xảy ra theo một trong những cơ chế sau đây

Ø Làm thay đổi mục tiêu tác động của thuốc trên vi khuẩn ví dụ làm thay đổi protein trên vi khuẩn mà thuốc kháng sinh sẽ bám vào để tác động

CON NGƯỜI

Bệnh viện, thành phố, nông thôn

ĐỘNG VẬT TRÊN CẠN

Cừu, Ngựa, Heo, Gia Cầm, Bò

Sông, suối

Thịt

Chế biến

Nước uống UỐNG

HỆ THỰC VẬT

Rau Cây ăn quả

Nước uống

Nước thải

Bơi lội

Thức ăn gia súc

Biển

MÔI TRƯỜNG NUÔI THUỶ SẢN

Vật nuôi trong nhà

Phế phẩm

Nguồn nước , chất thải của nông trại

Ø Vô hiệu hóa thuốc bằng enzyme bêta lactamase

Ø Làm giảm độ thẩm thấu của màng tế bào vi khuẩn nên thuốc không tác động được

2.6 Các nhóm kháng sinh thường sử dụng trong nuôi trồng thủy sản 2.6.1 Nhóm beta-lactamin

Là nhóm kháng sinh có tác dụng diệt khuẩn có phổ kháng khuẩn hẹp, chủ yếu có tác dụng trên vi khuẩn Gram (+) và một ít vi khuẩn Gram (-) Do màng tế bào của vi khuẩn Gram (-) có tỉ lệ lipit cao nên nó kỵ nước, còn nhóm

β-lactamin phải khuếch tán qua các ống dẫn protein nằm trên bề mặt màng (Prescott, 2000; Bùi Kim Tùng, 2001) β-lactamin không có ảnh hưởng độc đối với cơ thể, trừ một số cơ thể có cơ địa dị ứng Đối với kháng sinh thuộc nhóm này có thể sử dụng liều cao Liều độc gấp 7.600 lần so với liều điều trị (Bùi Thị Tho, 2003) Đại diện của nhóm này thường được dùng trong thủy sản

là Amoxilline, ampicillin (Lê Thị Kim Liên và Nguyễn Quốc Thịnh, 2005)

Ampicillin

Là thuốc kháng sinh có phổ tác dụng rộng, có tác dụng với mốt số lượng lớn vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) Có thể so sánh ampicillin với các thuốc có phổ tác dụng rộng như chloramphenicol, tetracyclin…Thuốc có tính acid, khi ở dạng muối rất dể tan trong nước (Bùi Thị Tho, 2003) Khi được dùng để điều trị, thuốc phân tán điều trong cơ thể nhưng tập trung nhiều ở gan, thận, một phần nhỏ ngấm vào dịch não tủy Thuốc được thải trừ qua thận ở dạng nguyên thủy (Võ Văn Ninh, 2001) ra môi trường ngoài nên rất dễ gây ra hiện tượng kháng với loại thuốc này của vi khuẩn

2.6.2 Nhóm Tetracyclin

Là thuốc ức chế vi khuẩn ở nồng độ thấp và diệt khuẩn ở nồng độ cao

Nó phụ thuộc vào độ mẫn cảm của vi khuẩn đối với thuốc Đây là nhóm kháng sinh có phổ hoạt rất rộng Tác dụng cả đối với nhóm vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) nhưng vi khuẩn Gram (+) mẫn cảm với thuốc hơn là Gram (-), virus

có kích thướt lớn, ký sinh trùng (Bùi Thị Tho, 2003; Bùi Quang Tề và ctv., 2005)

Nhóm này gồm các loại kháng sinh tetracyclin (oxytetracycline, clortetracyclin, dimeclocyclin, methylencyclin) doxycyclin, minocyclin… Trong đó, doxycyclin không bị ảnh hưởng bởi thức ăn trong ruột và hấp thu qua ruột cao gấp 10 lần so với các kháng sinh khác cùng nhóm Do đó các kháng sinh thuộc nhóm này ngoài doxycyclin thì không nên điều trị bằng cách trộn vào thức ăn Tetracycline dùng để trị nhiễm khuẩn toàn thân và nhiễm trùng ruột khi điều trị bệnh bằng các kháng sinh thuộc nhóm này không nên kết hợp với ampicillin, erythromycin, colistin… như thế sẽ gây ra tác dụng đối kháng làm giảm tác dụng của thuốc chẳng những không khỏi bệnh mà còn gây

ra hiện tượng kháng thuốc (Bùi Kim Tùng, 2001) Clortetracyclin,doxycyclin khi được dùng để kiểm tra kháng sinh đồ kết quả vẫn còn nhạy với nhóm vi

khuẩn Vibrio sp Nên được dùng để điều trị bệnh phát sáng trên tôm sú và

dùng để thay thế các thuốc bị cấm như chloramphenicol, nitrofuran…(Bùi

Quang Tề và ctv., 2005)

Theo Bùi Thị Tho (2003) thì thuốc thuốc kháng sinh thuộc nhóm này

đã bị nhiều loài vi khuẩn kháng lại do nó được sử dụng rộng rãi trong điều trị cũng như dùng làm thức ăn bổ sung Thực tế đã phân lập được nhiều chủng vi

khuẩn kháng với tetracycline (Depaola el al., 1995; Waltman et al., 1996; Mohamed Nawaz et al., 2006)

2.6.3 Nhóm Quinolone

Là nhóm kháng sinh có tác dụng diệt khuẩn, chúng có tác dụng ức chế tổng hợp AND Các thuốc thuộc nhóm này được phát triển qua 2 thế hệ với phổ kháng sinh và cơ chế kháng khuẩn khác nhau Thế hệ thứ nhất có phổ kháng khuẩn hẹp, tác dụng chủ yếu trên vi khuẩn Gram (-) Thế hệ thứ hai có phổ kháng khuẩn vừa nhanh vừa mạnh, phổ kháng khuẩn được mở rộng trên

vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) Các loại kháng sinh thuộc nhóm này là enrofloxacin, norfloxacin, ofloxacin,ciprofloxacin, oxonilic acid… (Bùi Thị Tho, 2003)

Trong nuôi trồng thủy sản các kháng sinh thuộc nhóm Quinolone được

sử dụng khá phổ biến trong điều trị bệnh mủ gan do vi khuẩn E ictaluri như

enrofloxacin, norfloxacin rất có hiệu quả (Từ Thanh Dung và ctv., 2005)

Trong điều trị bệnh phát sáng trên tôm do vi khuẩn Virio sp thì các loại kháng

sinh norfloxacin và oxonilic acid thường được sử dụng (Đỗ Thị Hòa và ctv., 2005)

2.6.4 Nhóm phenicol

Đây là nhóm kháng sinh có tác dụng kìm khuẩn nhưng cũng có tác dụng diệt khuẩn trong một số trường hợp bệnh truyền nhiễm với những điều kiện nhất định và nồng độ cao hơn Thuốc có tác dụng ức chế vi khuẩn với nồng độ thấp hoạt phổ của nó rất rộng, tác dụng trên nhiều loài vi khuân Gram (+) và Gram (-), vi rút có kích thướt lớn ( Bùi Thị Tho, 2003)

2.6.5 Nhóm Sulphamid (sulfonamide)

Đây là nhóm kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng trên vi khuẩn Gram (-) và một số vi khuẩn Gram (+) Sulphamid với liều kiềm khuẩn sẽ ức chế sự sinh sản phát triển của vi khuẩn do thuốc cạnh tranh với acid para amonozenzoic một yếu tố sinh trưởng cần cho sự phát triển của mọi loại tế bào trong đó có cả tế bào vi khuẩn (Bùi Thị Tho, 2003)

Các loại thuốc thuộc nhóm này thường được dùng trong thủy sản là trimethoprim, sulfamethizole và dạng kết hợp để trị bệnh đỏ mỏ, viêm ruột, xuất huyết, đốm đỏ, trắng đuôi do vi khuẩn gây ra trên cá và phát sáng do vi khuẩn gây ra trên tôm (Đỗ Thị Hòa và ctv., 2004), (Bùi Quang Tề, 2002)

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu

Dụng cụ thu mẫu, chai nút mài 100 ml, chai nhựa 1 lít, bao nilon, dây thun, dụng cụ thu mẫu cá

Tủ ấm, tủ cấy vi khuẩn, tủ lạnh, nồi autoclave, tủ sấy

3.2 Hóa chất và môi trường 3.2.1 Hóa chất

Nước cất, muối NaCl, dung dịch nhuộm Gram, cồn tuyệt đối, Chlorine viên, paraffin

3.2.2 Môi trường

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: TSA (Tryptone soya agar), EMB (Eosin methylen blue Lactose sucrose Agar), BHI (Brain heart in broth), EIA

(Edwadsiella ictaluri agar), MHA (Mueller-Hinton Agar), glycerol…(các môi

trường có nguồn gốc từ Merck) Các hóa chất môi trường test sinh hóa: O/F test, H2O2, giấy test oxidase, Bộ kit API 20E (BIOMÉRIEUX)

Các loại kháng sinh dùng trong nghiên cứu kháng sinh đồ ): Cefazoline (CEZ), Chloramphenicol (CHL), Tetracycline (TE), Flofenicol (FFC), Doxyciline (DO), Streptomycine (SM), Ampiciline (AM) (các đĩa khnág sinh mua từ Biorad)

Kháng sinh tinh dùng trong xác định MIC: Chloramphenicol, Oxytetracycline, Streptomycine (nguồn gốc Oxoid)

Các loại dụng cụ và hóa chất cần thiết khác

3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp điều tra

Tiến hành điều tra những hộ nuôi cá tra trên vùng nước lợ ở Trà Vinh

và Bến Tre về tình hình dịch bệnh trên cá và những loại thuốc/hóa chất thường được dùng để phòng và xử lý khi có bệnh xảy ra bằng các phiếu câu hỏi đã chuẩn bị trước (phiếu điều tra xem phụ lục 1)

Địa điểm thu mẫu và điều tra được chọn theo vùng có nuôi thâm canh

cá tra cao ở Trà Vinh và Bến Tre

Số liệu điều tra được xử lý bằng phần mền Excel

3.3.2 Phương pháp thu mẫu

Chọn điểm thu mẫu: ao nuôi cá tra thịt thâm canh ở vùng nước lợ hai tỉnh Trà Vinh và Bến Tre

Mỗi lần thu 5 con cá tra Nếu ao bệnh thì thu 3-4 con cá bệnh và 1-2 con cá khỏe Đồng thời với việc thu mẫu cá phân tích thì cũng cần ghi nhận thông tin thêm về kỹ thuật nuôi, hiện trường ao nuôi, dấu hiệu bên ngoài, bên trong của cá (phiếu thu thập thông tin xem phụ lục 2)

Phương pháp thu mẫu cá theo tài liệu của Furones (2001) Khi mẫu được tiến hành thu tại chỗ, tối thiểu 5-10 con cá có biểu hiện

lờ đờ được lấy mẫu Giết chết cá bằng cách ấn mạnh lưỡi dao mổ xuyên qua đỉnh hộp sọ hoặc gây chết cá với phương pháp hủy tỷ bằng kim mũi giáo Mẫu được chuyển đến phòng thí nghiệm, tối thiểu 5-10 con cá còn sống phải được lựa chọn cẩn thận được chứa trong các thùng chứa nước thích hợp với nồng độ oxy bão hòa Nếu như cá được chuyển đi sau khi chết, chúng được đóng gói riêng và để trong nước đá

Gan, thận và tỳ tạng của từng con cá được cấy trên môi trường TSA (Tryptone soya agar), trong điều kiện tiệt trùng Những khuẩn lạc rời và hình

dạng đặc trưng của Edwardsiella và Aeromonas được tách ròng và lưu giữ để

định danh, lập kháng sinh đồ và MIC

3.3.3 Phương pháp định danh vi khuẩn

Phương pháp định danh vi khuẩn: xác định các đặc điểm về hình thái , sinh hóa, kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản và sử dụng bộ kit API 20E (BIOMÉRIEUS)

Vi khuẩn được định danh theo phương pháp của Frerichs và Millar (1993)

v Các bước thực hiện ( phụ lục 3)

3.3.4 Phương pháp lập kháng sinh đồ

Phương pháp làm kháng sinh đồ của hai nhóm vi khuẩn Aeromonas spp

và E.ictaluri bằng phương pháp Kirbry-Bauer, sử dụng môi trường MHA

(Mueller-Hinton Agar), chọn 7 loại kháng sinh: cefazoline (CEZ), chloramphenicol (CHL), tetracycline (TE), florfenicol (FFC), doxyciline (DO), streptomycine (SM), ampicilline (AM)

v Các bước lập kháng sinh đồ theo phương pháp của Kirbry-Bauer,

1966

Ø Mật số vi khuẩn được xác định dựa vào phương pháp so màu trên

máy quang phổ

Vi khuẩn sau khi được phục hồi và tách ròng đến thuần thì tiến hành kiểm tra kháng sinh đồ

Dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc trên đĩa vi khuẩn cho vào ống nghiệm chứa 10 ml nước muối sinh lý (0,85% NaCl) đã tiệt trùng Trộn đều trên máy voxtec sau đó đem đo trên máy so màu quang phổ ở bước sóng 610nm, điều chỉnh độ đục ở mức OD=0,1 ± 0,02 Khi đó mật độ vi khuẩn trong ống nghiệm vào khoảng 1x108 cfu/ml

Ø Sau khi đã xác định mật số vi khuẩn thì tiến hành cho vi khuẩn lên

môi trường thạch

Sử dụng tăm bông tiệt trùng nhúng vào dung dịch vi khuẩn, quét đều lên môi trường thạch MHA Sau đó để yên khoảng 1 phút rồi dùng pel tiệt trùng lấy đĩa thuốc kháng sinh đặt vào đĩa Petri sao cho khoảng cách giữa 2 tâm của các đĩa thuốc kháng sinh khoảng 24 mm và khoảng cách giữa tâm đĩa kháng sinh với mép đĩa Petri 10-15 mm Mỗi đĩa Petri (Φ 100 mm) môi trường đặt tối đa 6 đĩa kháng sinh

Ø Đọc kết quả

Đo đường kính vòng vô trùng (mm) dựa vào chuẩn đường kính vòng vô trùng của tài liệu CLSI (2006b) để xác định loại kháng sinh nhạy, trung bình nhạy và kháng

3.4.5 Phương pháp xác định MIC

Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của vi khuẩn dựa trên phương pháp pha loãng môi trường loãng (Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) 2006b), Các bước tiến hành như sau:

Ø Chuẩn bị môi trường-hóa chất

Vi khuẩn được lấy từ tủ âm 80oC sau khi rã đông thì được cấy lên môi trường TSA, ủ trong tủ ấm từ 28oC sau 24 giờ với vi khuẩn Aeromonas và 48 giờ với vi khuẩn Edwardsiella Riêng với vi khuẩn đối chứng E coli (ATCC

25922), ủ ở 37oC trong 24 giờ

Kiểm tra và ghi nhận các đặc điểm hình thái của vi khuẩn, hình dạng, kích thước màu sắc khuẩn lạc và nhuộm Gram để xác định tính thuần Nếu vi khuẩn chưa thuần thì tiếp tục tách ròng cho đến khi đạt được đĩa cấy thuần Khi vi khuẩn đã thuần, lấy lấy một ít khuẩn lạc trên đĩa TSA cho vào ống nghiệm chứa 5 ml BHIB, ủ ở 28o

C, trong 18-20 giờ

Ø Chuẩn bị dung dịch thuốc

Sau khi lập kháng sinh đồ chọn 3 loại kháng sinh kháng làm MIC Chuẩn bị dung dịch thuốc gốc: Chuẩn bị 2 chai dung dịch thuốc gốc có nồng độ 1024 và 256 µg/ml bằng dung môi thích hợp cho mỗi loại thuốc kháng sinh

Pha loãng 2 lần để có các nồng độ: 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 8; 16; 32; 64; 128; 256; 512; 1024 µg/ml Pha loãng bằng nước muối sinh lý (Bảng 8 phụ luc 4)

Ø Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn

Xác định mật số vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng

610 nm và điều chỉnh mật độ vi khuẩn bằng môi trường BHIB (không dùng nước cất) ở điểm OD = 0,1 ± 0,02 (mật số vi khuẩn khoảng 1x108 CFU/ml) rồi pha loãng xuống 1000 lần để mật độ vi khuẩn còn khoảng 1x105 CFU/ml Sau

đó, mỗi chủng vi khuẩn đều được cấy trên môi trường TSA để kiểm tra sự thuần chủng và được ủ trong điều kiện với các ống MIC

Cho 3 ml dung dịch vi khuẩn vào từng ống nghiệm có chứa 3 ml dung dịch thuốc ở các nồng độ khác nhau: 0,25; 0,5…1024 µg/ml (cần lắc đều ống kháng sinh trước khi cho vào ống nghiệm)

Thí nghiệm có 2 đối chứng:

Đối chứng âm: (3 ml BHIB + 3 ml nước muối sinh lý) Đối chứng dương: (3 ml dung dịch vi khuẩn + 3 ml nước muối sinh lý) Tất cả các ống nghiệm được ủ ở 28oC, trong 20-24 giờ

Ø Đọc kết quả

Kiểm tra sự thuần chủng của vi khuẩn, nếu có tạp khuẩn thì loại bỏ kết quả hoặc loạt ống nghiệm của chủng vi khuẩn nào phát triển không liên tục, làm lại thí nghiệm

Đọc kết quả bằng cách so sánh độ đục của ống MIC với ống đối chứng

âm và dương

Giá trị nồng độ MIC được xác định là nồng độ thấp nhất của thuốc kháng sinh, ở đó không có sự phát triển của vi khuẩn

PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả điều tra

Bảng 4.1 Bản đồ địa chính tỉnh Bến Tre và Trà Vinh (địa điểm điều tra và thu mẫu được

104 ha với tổng sản lượng cá tra thương phẩm là 4.700 tấn

Nhưng do tình hình sản xuất, tiêu thụ cá tra gần đây của Trà Vinh và Bến Tre không ổn định nên có xu hướng giảm diện tích, sản lượng Nguyên nhân do những năm qua đa phần người nuôi cá tra đều không có lãi, giá thành giá thành sản xuất cao nhưng giá bán cá không đủ bù chi Bên cạnh đó, các hộ nuôi chưa liên kết được với nhà máy chế biến, số cơ sở nuôi đã cho thuê hoặc sang nhượng cho doanh nghiệp có nhà máy chế biến xuất khẩu Nguyên nhân sâu xa là do thiếu thông tin về thị trường nên việc bố trí sản xuất chưa hợp lý,

sản phẩm có lúc thừa, lúc thiếu; giá cả con giống, thức ăn, thuốc thủy sản ngày càng cao, đặc biệt là môi trường ngày càng ô nhiễm, dịch bệnh ngày càng nhiều, khả năng kháng thuốc của các chủng vi khuẩn gây bệnh ngày càng tăng gây khó khăn trong việc điều trị.

4.1.2 Thông tin về kỹ thuật nuôi

Kết quả điều tra cho thấy diện tích nuôi cá tra trung bình ở Trà Vinh và Bến Tre là tương đối nhỏ (2.132 ± 975m2) hơn so với các tỉnh có truyền thống nuôi các tra như Cần Thơ và An Giang (15.439 ± 25.436 m2) (Nguyễn Tấn Duy Phong, 2008) Diện tích nuôi của các hộ ở đây còn nhỏ là do nơi đây vừa mới chuyển đổi từ làm ruộng, vườn sang nuôi cá và hiệu quả mang lại từ nuôi

cá trong thời gian gần đây không cao nên nhiều người dân khu vực này chưa dám mạnh dạng đầu tư nuôi với diện tích lớn Bên cạnh đó, diện tích nuôi nhỏ

và đa số các ao nuôi lại nằm giữa các vườn cây ăn trái nên làm cho ao nuôi kém thông thoáng, không tạo được sự ổn định của các yếu tố môi trường nước nhất là khi thời tiết thay đổi làm ảnh hưởng đến sức khỏe cá nuôi dẫn đến cá

dễ bị bệnh

Qua bảng 4.1 cho thấy diện tích nuôi trung bình của các hộ ở Trà Vinh (1.910 ± 1.009 m2) là nhỏ hơn và có sự dao động lớn về diện tích giữa các hộ nuôi hơn so với Bến Tre (2.483 ± 932 m2)

Bảng 4.1 Diện tích mặt nước trung bình của các hộ nuôi

ao nuôi cá tra vùng An Giang, Cần Thơ là từ 2,5-5 m và trung bình là 3,8m (Nguyễn Tấn Duy Phong, 2008), trong khi độ sâu trung bình của các ao nuôi ở Trà Vinh và Bến Tre là 3.17 ± 0.58 (m), so với các tỉnh có truyền thống và nhiều kinh nghiệm nuôi cá tra thì độ sâu mực nước ở đây có thấp hơn không lớn Theo ý kiến của các hộ nuôi nơi đây độ sâu ao thấp hơn là do điều kiện địa lý nơi đây có lớp đất phèn tiềm tàng, nếu đào sâu sẽ ảnh hưởng đến môi trường và sức khỏe cá nuôi

Theo kết quả điều tra về mật độ nuôi ở An Giang và Cần Thơ của Nguyễn Chính (2005) là 26 con/m2, Trần Anh Dũng (2005) là 27,7 con/m2, thì mật độ nuôi trung bình của hai tỉnh Trà Vinh và Bến Tre là tương đối cao (34.58 ± 8.78 con/m2) Mật độ nuôi ở đây cao là do tâm lý chung của đa số các

hộ nuôi là họ muối thả cá giống để trừ hao lượng cá hao hụt sau khi thả và các

hộ lại cho rằng trên cùng diện tích thì thả mật độ cao thì sẽ cho năng suất cao

dù không tốn nhiều công chăm sóc hơn thả thưa Mặc khác, diện tích nuôi của

các hộ ở đây là tương đối nhỏ, chi phí đầu tư con giống ban đầu thấp nên họ thường thả với mật độ cao

Mật độ nuôi của các hộ dân ở Trà Vinh và Bến Tre là tương đối cao mà kinh nghiệm và kiến thức về nuôi cá của họ là không cao nên rất dễ dẫn đến ô nhiễm môi trường nuôi, thường xuyên xuất hiện bệnh trên cá nuôi từ đó dẫn đến hiệu quả đầu tư thấp

4.1.3 Thông tin về tình hình dịch bệnh và sử dụng thuốc-hóa chất

Cũng như nhiều hộ nuôi ở các tỉnh khác, các hộ nuôi cá ở Trà Vinh và Bến Tre đều mua con giống từ cá trại ương cá tra giống ở tại địa phương và các tỉnh lân cận, 100% số hộ được điều tra đều không có ương cá giống tại nhà

do đó nguồn con giống không ổn định và tỉ lệ hao hụt cao trong quá trình vận chuyển

Theo kết quả điều tra 100% hộ nuôi đều sử dụng thức ăn viên trong khi

ở An Giang chỉ có 80% và Cần Thơ 50% (Nguyễn Tấn Duy Phong, 2008) Tất

cả các hộ nuôi cá ở đây đều dùng thức ăn công nghiệp là do nơi này không có nguồn thức ăn tự chế hoặc có nhưng giá thành cao sử dụng không kinh tế Việc sử dụng thức ăn viên tạo điều kiện dễ dàng cho các hộ nuôi ở đây trong việc quản lý chất lượng môi trường nước và chủ động được nguồn thức ăn Chi phí thức ăn chiếm khoảng 80% tổng chi phí đầu tư nuôi cá, do đó quản lý tốt nguồn thức ăn và khâu cho ăn sẽ mang lại hiệu quả cao trong nuôi cá, điều này rất cần thiết cho những tỉnh mới đầu tư nuôi cá như Trà Vinh và Bến Tre Thời gian nuôi cá trung bình của cá hộ nuôi ở Trà Vinh và Bến Tre là 6,95 ± 0,55 tháng cao hơn so với thời gian nuôi của các hộ nuôi ở An Giang 6,7 tháng và Cần Thơ 6,9 tháng (Nguyễn Tấn Duy Phong, 2008) Thời gian nuôi phụ thuộc vào nhiều yếu tố như kích cỡ con giống ban đầu, dịch bệnh, thời tiết, giá cả thị trường, trong đó giá cả thị trường ảnh hưởng rất lớn đến thời gian nuôi Trong đợt khảo sát và thu mẫu lần này vào thời điểm giá cá nguyên liệu đang sụt giảm mà giá thức ăn lại tăng cao nên nhiều người dân đã hạn chế cho ăn hoặc cho ăn cầm chừng làm thời gian nuôi kéo dài

Biện pháp phòng và xử lý bệnh của người nuôi ảnh hưởng lớn đến thành công trong quá trình nuôi, như nhiều hộ nuôi cá có kinh nghiệm ở cá tỉnh Đồng Tháp, An Giang và Cần Thơ thì các hộ nuôi ở đây cũng sử dụng các loại thuốc và hóa chất thông dụng để cải tạo ao trước khi nuôi như vôi (87%), BKC (87%), Zeolite (51,61%)…Biện pháp cải tạo ao của những người nuôi của hai tỉnh này đều là cải tạo ước, không phơi đáy ao trong quá trình xử lý, và khi lấy nước vào ao nuôi đa số không dùng lưới lọc dẫn đến lượng cá tạp trong

ao nuôi khá nhiều sẽ cạnh tranh thức ăn và chổ ở với cá nuôi

Từ việc cải tạo ao không tốt, nguồn nước cấp không qua xử lý và nhiều nguyên nhân chủ quan khác làm cho cá nuôi dễ xảy ra bệnh Qua kết quả khảo sát của các hộ dân ở đây thì trong suốt vụ nuôi hầu hết đều có bệnh xảy ra Các bệnh nhiễm khuẩn mà các hộ nuôi ở Trà Vinh và Bến Tre thường gặp phải là bệnh gan thận mủ (100% hộ nuôi đều gặp phải), bệnh xuất huyết (70,96%), hai loại bệnh này thường xuất hiện ở giai đoạn cá nhỏ (dưới 3 tháng

nuôi) và vào thời điểm giao mùa, là bệnh nguy hiểm nhất, nếu không kịp thời

xử lý và điều trị thì tỉ lệ cá chết có thể lên đến 80-90% Ngoài ra, cá nuôi ở khu vực này còn xuất hiện bệnh vàng da và gần đây có xuất hiện thêm bệnh trắng gan trắng mang trong giai đoạn mới thả nuôi Đa số nhiều hộ nuôi ở đây được hỏi đến đều ít quan tâm đến bệnh do ký sinh trùng mà chỉ quan tâm nhiều đến bệnh nhiễm khuẩn Theo kết quả điều tra về tình hình xuất hiện bệnh mủ gan ở An Giang của Trần Anh Dũng (2005) là 61%, ở An Giang và Cần Thơ của Nguyễn Chính (2005) là 82% vào năm 2005 và đến năm 2008 là 93,8% (Nguyễn Tấn Duy Phong, 2008) Như vậy, tình hình xuất hiện bệnh mủ gan ở Trà Vinh và Bến Tre là rất cao nhưng nó phản ánh đúng về tình hình nuôi ở đây như kinh nghiệm nuôi thấp, mật độ nuôi cao, xử lý môi trường và quản lý ao nuôi không tốt

80 61.3

Qua kết quả khảo sát đa số các hộ được phỏng vấn đều cho rằng so với các năm mới bắt đầu nuôi thì trong những năm gần đây tỉ lệ cá mắc bệnh và hao hụt cao hơn mặc dù liều lượng thuốc điều trị lại cao hơn Điều này đã cho thấy phần nào việc sử dụng thuốc không đúng cách, điều trị không đúng liều dẫn đến hình thành các chủng vi khuẩn kháng thuốc, môi trường nuôi đã bị ô nhiễm

Tình hình sử dụng thuốc của người nuôi ở khu vực khảo sát là vấn đề hết sức quan tâm, với tần số xuất hiện bệnh cao thì việc sử dụng thuốc để phòng và trị bệnh là không thể thiếu Theo kết quả khảo sát thì có 100% số hộ được phỏng vấn sử dụng kháng sinh khi có bệnh xảy ra, điều đáng lưu tâm là việc sử dụng kháng sinh của hầu hết các hộ nuôi là theo hướng dẫn của người bán hàng thuốc thú y thủy sản ở địa phương, mà người sử dụng không có hiểu biết nhiều các sản phẩm mà mình sử dụng

Các loại kháng sinh mà người nuôi nơi đây thường sử dụng là enrofloxacin (70,97%), florfenicol (61,29%), doxycycline (41,94%), các loại

kháng sinh này được dùng để điều trị bệnh nhiễm khuẩn cho cá bằng cách trộn vào thức ăn Qua kết quả điều tra nhìn chung là phù hợp với các kết quả điều tra trước đây của Nguyễn Chính (2005), Nguyễn Tấn Duy Phong (2008) là thuốc kháng sinh thuộc nhóm Quinolone (enrofloxacin, …) được sử dụng nhiều để điều trị bệnh nhiễm khuẩn trong nuôi cá tra Tuy nhiên enrofloxacin

là loại kháng sinh được sử dụng nhiều nhất mà đây là loại kháng sinh đã bị đưa vào danh sách các loại kháng sinh hạn chế sử dụng tại Việt Nam tháng 2/2005, do enrofloxacin là loại kháng sinh có phổ kháng khuẩn mạnh và còn khá nhạy với vi khuẩn gây bệnh trên cá tra nên được sử dụng vào giai đoạn cá nhỏ, theo một nghiên cứu của Huỳnh Thị Tú và ctv (2006) thì độ tồn lưu của enrofloxacin trong tôm sú là 28 ngày Nhìn chung, người nuôi cá ở Trà Vinh

và Bến Tre sử dụng ít chủng loại kháng sinh hơn (7 loại) so với ở các tỉnh nuôi

cá lâu năm như An Giang và Cần Thơ 15 loại (Nguyễn Chính, 2005) và đến năm 2008 đã tăng lên 22 loại (Nguyễn Tấn Duy Phong, 2008)

Việc sử dụng kháng sinh để phòng và trị bệnh cho cá nuôi của đa phần những người dân ở đây là không khoa học và hoàn toàn theo kinh nghiệm, 100% số hộ được phỏng vấn đều sử dụng tăng gấp 2, 3 lần so với liều khuyến cáo Khi có bệnh xuất hiện trên cá mà biểu hiện tương tự bệnh trước đây thì sẽ

sử dụng lại loại kháng sinh đã điều trị trước đó, nếu sau 2, 3 ngày không hết sẽ chuyển sang sử dụng loại kháng sinh khác Tất cả những việc này đã làm cho các chủng vi khuẩn gây bệnh đã kháng với nhiều loại kháng sinh Việc sử dụng kháng sinh của người nuôi cá nơi đây vẫn đang diễn ra một cách bừa bãi

và thiếu kiểm soát cùng với việc không có hiểu biết về những sản phẩm đang dùng dẫn tới nhiều loại kháng sinh thông dụng được phép sử dụng trong nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam đã bị kháng với nhiều loại vi khuẩn gây bệnh Từ

đó, việc sử dụng các loại kháng sinh hạn chế sử dụng hoặc cấm sử dụng ngày càng trở nên phổ biến hơn, nhất là vào giai đoạn cá nhỏ

4.2 Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn từ mẫu cá bệnh

Tất cả những vấn đề từ việc điều tra nêu ra ở trên đòi hỏi cần phải có một nghiên cứu đánh giá sơ bộ về vấn đề bệnh và kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh trên cá tra nuôi ở vùng nước lợ tỉnh Trà Vinh và Bến Tre nên việc thu mẫu, định danh và làm kháng sinh đồ được tiến hành

4.2.1 Kết quả phân lập và chỉ tiêu sinh hóa

Mẫu cá được thu từ những ao có dấu hiệu bệnh Trong điều kiện tiệt trùng, gan, thận và tỳ tạng của các mẫu cá có dấu hiệu bệnh mủ gan, xuất huyết và mẫu cá khỏe được cấy trên môi trường chung TSA (Tryptone soya agar), những khuẩn lạc chiếm ưu thế có màu sắc, hình dạng và kích thước đặc

trưng của nhóm E ictaluri (sau 48 giờ) dựa theo mô tả của Hawke et al., (1981), Từ Thanh Dung (2004) và nhóm Aeromonas spp (sau 24 giờ) theo mô

tả của Marja-liisa Hänninen (1997), Austin & Austin (2007), được tách ròng, một số chỉ tiêu cơ bản gồm: nhuộm Gram, hình dạng, tính di động, phản ứng catalase, oxydase, phản ứng O/F, được thực hiện trước khi định danh bằng bộ

kit API 20E Ngoài ra đối với nhóm vi khuẩn Aeromonas spp còn được kiểm