tìm hiểu sự biến đổi của cùng lặp lại thuộc orf94, orf125 của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú

Nghiên cứu được thực hiện để tìm hiểu về đặc điểm gen của virut gây bệnh đốm trắng trên tôm sú nuôi tại Cà Mau và khả năng ứng dụng của vùng lặp lại thuộc ORF94 và ORF125 trong nghiên cứ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

2008

MỤC LỤC

Phần I: Giới thiệu 1

Mục tiêu của đề tài 2

Nội dung nghiên cứu 2

Phần II: Tổng quan tài liệu 3

2.1 Tình hình nuôi tôm biển 3

2.1.1Trên thế giới 3

2.1.2 Việt Nam 4

2.1.3 Đồng bằng sông Cửu Long 4

2.1.4 Cà Mau 5

2.2 Tình hình dịch bệnh trong nuôi tôm 6

2.2.1 Trên thế giới 6

2.2.2 Trong nước và khu vực Đồng bằng sông Cửu Long 6

2.3 Ảnh hưởng của bệnh đốm trắng đến nghề nuôi tôm 7

2.4 Đặc điểm của tác nhân gây bệnh đốm trắng 8

2.4.1 Tác nhân gây bệnh 8

2.4.2 Triệu chứng…… 8

2.4.3 Phương thức lây truyền và loài cảm nhiễm 8

2.4.4 Chẩn đoán……… 9

24.5 Phòng ngừa và xử lý bệnh 9

2.4 Một số nghiên cứu bệnh đốm trắng 10

2.6 Kỹ thuật PCR và các ứng dụng 14

2.6.1 Quy trình 14

2.6.2 Những ứng dụng của PCR 15

2.6.3 Hạn chế 15

Phần III: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 16

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 16

3.2 Vật liệu nghiên cứu 17

3.2.1 Mẫu vật 17

3.2.2 Dụng cụ 17

3.2.2.1 Dụng cụ thu mẫu 17

3.2.2.2 Dụng cụ phân tích PCR 17

3.2.3 Hóa chất 17

3.2.3.1 Phân tích PCR 17

3.4 Phương pháp Nested-PCR 17

3.4.1 Qui trình ly trích DNA 18

3.4.2 Qui trình khuếch đại 18

3.4.3 Cách chuẩn bị phản ứng 18

3.4.4 Chạy điện di 18

3.4.5 Đọc kết quả 19

3.5 PCR-genotyping 19

3.5.1 PCR-Genotyping khuếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 19

3.5.1.1 Điều kiện phản ứng 19

3.5.1.2 Thành phần hóa chất tham gia phản ứng PCR-genotyping 19

3.5.1.3 Đọc kết quả 20

3.5.2 PCR-Genotyping khuếch đại vùng lặp lại thuộc ORF125 21

3.5.2.1 Điều kiện phản ứng 21

3.5.2.2 Thành phần hoá chất tham gia phản ứng PCR-genotyping 21

3.5.2.3 Đọc kết quả 22

Phần IV: Kết quả và thảo luận 23

4.1 Kết quả xác định sự hiện diện của WSSV trong các mẫu tôm 23

4.2 Kết quả phân tích PCR-genotyping 27

4.2.1 Kết quả PCR-genotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 27 4.2.1.1 Phản ứng PCR-genotyping (ORF94) thực hiện theo qui trình của Trần Thị Mỹ Duyên, (2006) 27

4.2.1.2 Kết quả phân tích các mẫu WSSV thu tại Cà Mau (PCR-genotyping-ORF94) 29

4.2.2 Kết quả PCR-genotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF125 32

4.2.3 Mối liên hệ giữa số vùng lặp lại thuộc ORF94 và ORF125 35

Phần V: Kết luận và đề xuất 37

5.1 Kết Luận 37

5.2 Đề xuất 37 Phần VI: Tài liệu tham khảo 38 Phần VII: Phụ lục 42

DANH SÁCH HÌNH

Hình 4.1: Thể hiện tỉ lệ cảm nhiễm WSSV 25

Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR của mẫu tôm trong các ao có

dấu hiệu đốm trắng tại Cà Mau bằng gel 1% 25

Hình 4.3: Kết quả điện di kiểm tra 10 mẫu sau khi giảm thể tích 28

Hình 4.4: Kết quả điện di khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 trên

mẫu WSSV thu ở Cà Mau 30

Hình 4.5: Kết quả điện di khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 trên

mẫu thu ở Cà Mau 32

Hình 4.6: Kết quả điện di khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF125 trên

mẫu WSSV thu ở Cà Mau 34

Bảng 4.2: Cường độ nhiễm của 10 mẫu kiểm tra 28

Bảng 4.3: Kết quả phân tích các nhóm vùng lặp lại thuộc ORF94 trong

các ao tôm thu ở Cà Mau 29

Bảng 4.4: Kết qủa phân tích các nhóm vùng lặp lại thuộc ORF125 trong

các ao tôm thu tại Cà Mau 33

Bảng 4.5: Kết quả PCR-genotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc

ORF94, ORF125 35

TÓM TẮT

Cà Mau là tỉnh có diện tích và sản lượng tôm nuôi cao nhất cả nước Nhưng trong những năm gần đây thì tình hình dịch bệnh bùng phát ở nhiều nơi nó gây trở ngại đối với người nuôi tôm nhất là bệnh đốm trắng do tác nhân White Spot Syndrome Virus (WSSV) Theo những nghiên cứu gần đây cho thấy WSSV đã có nhiều biến đổi về mặt cấu trúc di truyền Nghiên cứu được thực hiện để tìm hiểu về đặc điểm gen của virut gây bệnh đốm trắng trên tôm sú nuôi tại Cà Mau và khả năng ứng dụng của vùng lặp lại thuộc ORF94 và ORF125 trong nghiên cứu dịch tể học của Virut gây bệnh đốm trắng Kết quả phân tích 60 mẫu tôm dương tính với WSSV của 12 ao trong tổng số 24 ao thu tại Cà Mau sử dụng phương pháp PCR-genotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 và ORF125 cho thấy có sự biến động về cấu trúc di truyền của WSSV trên tôm sú tại Cà Mau Kết quả cho thấy số vùng lặp lại trên bộ gen của WSSV giữa các ao thì khác nhau Trong cùng một ao nhiễm WSSV thì số vùng lặp lại thường giống nhau 9/12 ao đối với ORF94 và 10/12 ao đối với ORF125 Đối với ORF94 đã xác định được 7 nhóm vùng lặp lại (4 đến 10 vùng lặp lại) trong đó kiểu gen có 6, 8 vùng lặp lại chiếm tỉ lệ cao nhất 24,6% Còn ORF125 thì có 5 nhóm vùng lặp lại (từ 4 đến 8 vùng lặp lại) trong đó kiểu gen có 6 vùng lặp lại chiếm tỉ lệ cao nhất 47% Sự khác biệt giữa các vùng lặp lại thuộc ORF94, và ORF125 trên bộ gen WSSV trong các ao tôm bệnh đốm trắng cho thấy đang tồn tại nhiều kiểu gen WSSV khác nhau có khả năng gây bệnh đốm trắng trên tôm Kết quả nghiên cứu có thể ứng dụng trong nghiên cứu về

sự lan truyền và phân bố WSSV, làm cơ sở cho việc phòng ngừa và kiểm soát sự bùng phát của bệnh đốm trắng do WSSV gây ra

PHẦN I GIỚI THIỆU

Cà Mau là tỉnh nằm ở tận cùng cực nam của tổ quốc có ba mặt giáp biển và hệ thống sông ngòi chằng chịt nên rất thuận lợi cho nghề nuôi trồng thủy sản phát triển Từ những đầu thập niên 80 nghề nuôi trồng thủy sản ở Cà Mau (đặc biệt là nghề nuôi tôm sú) đã dần dần phát triển với hình thức nuôi quãng canh truyền thống nhưng năng suất nuôi thấp Để tăng năng suất thì việc chuyển đổi từ hình thức nuôi quãng canh truyền thống sang bán thâm canh và thâm canh là rất cần thiết Do hiệu quả kinh tế mà nghề nuôi tôm đem lại nên diện tích và sản lượng tôm nuôi ở Cà Mau không ngừng tăng trong những năm gần đây Xuất khẩu thủy sản được xem là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của tỉnh và trong khu vực

Việc thâm canh hóa trong nuôi tôm sú không những tăng năng suất mà còn làm tăng nguy cơ bùng phát dịch bệnh Theo thống kê của Bộ Thủy sản mỗi năm có hàng nghìn hecta ao nuôi tôm thương phẩm phải thu hoạch sớm do bệnh trong đó 80% là bệnh đốm trắng Đây là bệnh nguy hiểm chúng có khả năng lây lan nhanh trong ao và gây thiệt hại lớn (có thể gây chết đến 100% sau 3 - 10 ngày nhiễm bệnh) mà còn có khả năng lây lan qua các khu vực lân cận qua nguồn nước hay các loài giáp xác Nhưng mức độ gây hại của chúng rất khác nhau ở các vùng và các vụ trong năm (có những ao tôm bị nhiễm đốm trắng thì tôm chết rất nhanh nhưng cũng có ao nuôi bị nhiễm đốm trắng tôm vẫn phát triển bình thường đến khi thu hoạch) Vấn đề này cũng có nhiều giả thiết được đặt ra như: điều kiện môi trường, quản lý và chăm sóc sức khỏe tôm nuôi, tác nhân gây bệnh: sự biến đổi kiểu gen WSSV Do vậy,

Đề tài: "Tìm hiểu sự biến đổi của vùng lặp lại thuộc ORF94, ORF125 của

virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú (Penaeus monodon) tại Cà Mau" được

thực hiện

Mục tiêu của đề tài

Tìm hiểu về đặc điểm gen của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú nuôi tại Cà Mau và khả năng ứng dụng của vùng lặp lại thuộc ORF94, ORF125 trong nghiên cứu dịch tể học của virus gây bệnh đốm trắng

Nội dung nghiên cứu

* Xác định sự hiện diện của WSSV trong các mẫu tôm sú thu được tại Cà Mau bằng phương pháp Nested-PCR

* Phân tích các dòng WSSV thu được với phương pháp PCR-genotyping khuếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94, ORF125

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nuôi tôm biển

Nuôi trồng thủy sản trên Thế giới tăng nhanh trong những năm qua với tốc độ 7,6%, đạt 37,5 triệu tấn vào năm 2001, chiếm 29,1% tổng sản lượng thủy sản (Lê Xuân Sinh, 2005), đến năm 2003 sản lượng nuôi trồng thủy sản ước đạt 41,9 triệu tấn Sản lượng tôm biển tăng rất nhanh, năm 2000 thì sản lượng tôm biển đạt được 1.087.900 tấn (Lê Xuân Sinh, 2003), đến năm 2002 sản lượng này tăng lên 1.292.000 tấn Nhưng trước đó sản lượng nuôi tôm trên Thế giới có xu hướng giảm Cụ thể, năm 1994 sản lượng tôm biển trên thế giới là 733.000 đến năm 1995 giảm còn 712.000 và tiếp tục giảm còn 693.000 tấn vào năm 1996 đến năm 1997 còn 660.000 tấn (World Shrimp Farming,1997 trích dẫn bởi Lê Xuân Sinh, 2003) Sản lượng tôm giảm trong những năm này là do dịch bệnh bùng phát và gây thiệt

hại ở nhiều nước như Thái lan, Việt Nam (1994- 1996), Peru (1997), các quốc gia dọc bờ biển Đông và Tây Ấn Độ (1994-1995), Indonesia, Philippines (1996)

2.1.2 Việt Nam

Việt Nam với bờ biển trải dài 3.260 km từ Quảng Ninh đến Cà Mau vòng qua Kiên Giang nên rất có tiềm năng cho nuôi trồng thủy sản nước lợ phát triển Diện tích nuôi tôm gia tăng nhanh chóng từ 50.000 ha (1985) lên đến 295.000 ha (1998) với 30 tỉnh nuôi tôm sú và tăng lên 449.275 ha (2001) Đến năm 2004 diện tích nuôi tôm nước lợ cả nước khoảng 600.000 ha, với mô hình nuôi quãng canh cải tiến là chủ yếu, ngoài ra còn có các mô hình bán thâm canh, thâm canh chiếm diện tích nhỏ trong đó nuôi thâm canh đạt được năng suất cao khoảng 5 -7 tấn/ ha Đồng bằng sông Cửu Long là vùng có diện tích nuôi lớn nhất cả nước có khoảng 680.000 ha (2005) Sản lượng tôm cùng tăng theo từ 65.282 tấn (1999), tăng lên 103.845 (2000) đến năm 2001 sản lượng tôm nuôi là 162.713 tấn (Lê Xuân Sinh, 2003), và sản lượng tiếp tục tăng đến 210.000 tấn (2003) (Nguyễn Văn Hảo, 2004) Kim ngạch xuất khẩu các mặt hàng thủy sản năm 2005 là 2,65 tỷ USD (Tạp chí khuyến ngư Việt Nam số 45), Năm 2007, xuất khẩu thủy sản của cả nước đã đạt khoảng 925 nghìn tấn trị giá 3,756 tỷ USD, tăng 12,2% về khối lượng và 14%

về giá trị so với cùng kỳ năm ngoái Tuy nhiên, trị giá xuất khẩu trên khi được bổ sung đầy đủ số liệu luỹ kế của cả năm, rất có thể đạt đến mức 3,8 tỷ USD (Báo thương mại, 2008) Việc xuất khẩu thủy sản được xem là một trong các ngành kinh tế mũi nhọn ở Việt Nam

2.1.3 Đồng bằng sông Cửu Long

Đồng bằng sông Cửu long là vùng nuôi trồng thủy sản lớn nhất cả nước và cũng là một trong các ngành kinh tế mũi nhọn của vùng Tổng diện tích nuôi tôm của khu vực ở năm 2003 chiếm 88% diện tích nuôi tôm của cả nước, sản lượng 146.000 tấn, chiếm 69.5% sản lượng tôm của cả nước, với hình thức nuôi quãng canh cải tiến là chủ yếu như tôm rừng tập trung chủ yếu ở Cà Mau, Bạc Liêu, Trà Vinh, tôm lúa ở Cà Mau, Kiên Giang, Sóc Trăng, bán thâm canh ở Sóc Trăng, Thâm

Canh ở Sóc Trăng, Bạc Liêu Sóc Trăng là tỉnh có nghề nuôi tôm với tốc độ thâm canh hóa cao, năng suất bình quân cao nhất vùng Năm 2005, tổng diện tích nuôi tôm của Sóc Trăng là 43.211 ha, sản lượng 42.817 tấn, trong đó diện tích nuôi thâm canh và bán thâm canh là 17.481 ha, sản lượng tôm nuôi thâm canh là 13.400 tấn, bán thâm canh là 17.850 tấn, quãng canh cải tiến là 11.567 tấn (Sở Thủy Sản Sóc Trăng, 2005) Năm 2005, Bạc Liêu có diện tích nuôi tôm là 116.473 ha, trong

đó có 10.929 ha nuôi thâm canh và bán thâm canh, sản lượng đạt 63.616 tấn (Sở Thủy Sản Bạc Liêu, 2005)

2.1.4 Cà Mau

Cà Mau là tỉnh có diện tích và sản lượng nuôi trồng thủy sản lớn nhất cả nước mà chủ yếu là thủy sản nước lợ Do Cà Mau có ba mặt giáp biển, hệ thống sông ngòi chằng chịt, nguồn tài nguyên và nguồn lao động dồi dào nên rất thuận lợi cho thủy sản phát triển Diện tích và sản lượng nuôi tôm trong những năm 1981 có 14.000

ha đạt 4.500 tấn, năm 1991 tăng lên 60.000 ha, 28.600 tấn, và năm 2000 có tới 153.373 ha với 35.700 tấn (Phùng Văn, 2005)

Năm 2001 có 217.898 ha; năm 2002 có 239.398 ha; năm 2003 có 245.338 ha; năm

2004 có 248.174 ha Trong diện tích nuôi năm 2004 có các loại hình nuôi chủ yếu là: tôm-rừng 46.300 ha, tôm-lúa 43.600 ha, tôm-vườn 22.000 ha, nuôi tôm công nghiệp 580 ha, còn lại là nuôi tôm dạng sinh thái (Phùng Văn, 2005)

Năm 2008, Cà Mau có diện tích nuôi tôm 249.000 ha, gồm 35.000 ha rừng - tôm, 40.000 ha lúa - tôm, 1.000 ha tôm - vườn, 900 ha tôm công nghiệp, còn lại là diện tích chuyên tôm dạng sinh thái (Nguyễn Tiến Hưng, 2008)

2.2 Tình hình dịch bệnh trong nuôi tôm

nước châu Á tuy phát triển mạnh nhưng phải đối phó với vấn đề dịch bệnh và sự suy thoái của môi trường, đã gây ra nhiều thiệt hại cho người nuôi Ở Trung Quốc sản lượng tôm nuôi giảm mạnh khoảng 120.000 tấn trong năm 1993, trong khi đó

ở Đài Loan sản lượng liên tục giảm từ đỉnh cao 88.000 tấn vào năm 1987 xuống còn 12.000 tấn ở năm 1993 Trong khoảng thời gian từ 1993 - 1995 sản lượng tôm

ở Indonesia và philippines giảm tương ứng 48% và 58% (Nguyễn Văn Hảo, 2003)

Ở nhiều quốc gia do phát triển quá mức nghề nuôi nên phải chịu những hậu quả: tài nguyên môi trường bị cạn kiệt, sử dụng nhiều nông dược, hóa chất, phá rừng, lấn đất nông nghiệp làm cho đất bị nhiễm mặn, nguồn nước bị ô nhiễm Việc thâm canh hóa ngày càng cao làm bệnh bùng phát khắp nơi như Trung Quốc, Ecuador, Indonesia (1992), Việt Nam, Thái Lan (1994 - 1996), Đài Loan, Philippines (1993), Với các tác nhân gây bệnh chủ yếu là vi khuẩn, virus, ký sinh trùng,

nấm Nhưng bệnh do virus gây tác hại nghiêm trọng nhất như MBV (Monodon Baculovirus ), WSSV (White Spot Syndrome Virus), YHV (Yellow Head Virus)…Dịch bệnh đã làm giảm sản lượng tôm trên thế giới từ 733.000 tấn năm

1994 còn 712.000 tấn năm 1995, còn 693.000 tấn 1996 đến năm 1997 còn 660.000 tấn (Nguyễn Văn Hảo, 2003) Như vậy dịch bệnh là một trở ngại rất lớn cho sự phát triển nuôi trồng thủy sản trên Thế giới

2.2.2 Trong nước và khu vực Đồng bằng sông Cửu Long

Theo thống kê của Bộ Thủy sản năm 1995, từ năm 1993 - 1995 dịch bệnh đã báo động trên toàn quốc nó đã gây thiệt hại hàng ngàn tỷ đồng Trong năm 1994, có 84.558 ha bị dịch bệnh, sản lượng bị thiệt hại 5.225 tấn trị giá 294 tỷ đồng (Nguyễn Văn Hảo, 2003) Đến năm 2001 dịch bệnh bùng phát ở miền Nam gồm các tỉnh Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Tiền Giang… Trong đó Bạc Liêu có diện tích thiệt hại cao nhất là 47.333 ha, Sóc Trăng là 10.000 ha (Nguyễn Văn Hảo, 2004) Năm 2002 Cà Mau có 137.000 ha, Sóc Trăng Có 16.702 ha, Bạc Liêu có 89.841 ha bị thiệt hại do bệnh, trong đó có 18.890 ha bị thiệt hại hoàn toàn (Nguyễn Minh Niên, 2004) Ở Sóc Trăng đến tháng 10/2007 thì trong năm số hộ

nuôi lỗ là 3.908 chiếm 14.68%, diện tích thiệt hại 4.110 ha do bệnh phân trắng (

Sở Thủy sản Sóc Trăng, 2007)

Từ đầu năm 2008 đến nay, Cà Mau có hơn 39.000 ha diện tích tôm nuôi bị chết, với mức độ thiệt hại bình quân từ 25 đến 30% Trong tháng 6/2008, hiện tượng tôm chết xảy ra trên diện rộng ở các huyện như Ngọc Hiển: hơn 10.000 ha, Đầm Dơi: 4.300 ha và Năm Căn trên 800 ha Nguyên nhân là do thời tiết diễn biến bất thường, nhiệt độ dao động ngày đêm chênh lệch nhau, các đầm nuôi bị khô cạn

do nắng nóng kéo dài làm tôm suy yếu, phát sinh dịch bệnh (Tuyết Anh, 2008)

2.3 Ảnh hưởng của bệnh đốm trắng đến nghề nuôi tôm

Năm 1960 đã phát hiện virus gây bệnh trên trên giáp xác, đến năm 1990 xác định bệnh do virut là trở ngại lớn cho nghề nuôi tôm, đặc biệt là bệnh do virut đốm trắng Năm 1992, các ao nuôi thâm canh đã gặp trở ngại về bệnh đốm trắng có hơn 80% số trại bị thất bại tại Indonesia Năm 1994, bệnh đốm trắng gây tỷ lệ chết cao

và làm tổn thất lớn đến nghề nuôi tôm công nghiệp ở Trung Quốc, Nhật Bản, Indonesia, Ấn Độ, Đài Loan Năm 1996 ở Thái Lan dịch bệnh đốm trắng bùng phát làm thiệt hại khoảng 40% tổng sản lượng, thiệt hại khoảng 500 triệu USD Virus gây bệnh đốm trắng WSSV lần đầu tiên được báo cáo ở Nhật vào năm 1993, nhưng trước đó năm 1989 ở đã có báo cáo sự xuất hiện bệnh đỏ thân trên tôm sú đây là dấu hiệu đi kèm với đốm trắng Bệnh này đã làm giảm sản lượng tôm trên thế giới từ 733.000 tấn năm 1994 còn 712.000 tấn năm 1995, còn 693.000 tấn

1996 đến năm 1997 còn 660.000 tấn (Nguyễn Văn Hảo, 2003) Theo thống kê của

Bộ Thủy Sản mỗi năm có hàng ngàn hecta ao nuôi tôm thương phẩm phải thu hoạch sớm do bệnh trong đó 80% là bệnh đốm trắng Năm 2003 Sóc Trăng có 16.346 ha bị thiệt hại hoàn toàn chiếm 40% diện tích, cuối năm 2004 diện tích tôm nuôi bị mất trắng là 18.231 ha

2.4 Đặc điểm của tác nhân gây bệnh đốm trắng

2.4.1 Tác nhân gây bệnh

Bệnh đốm trắng do virus gây hội chứng đốm trắng WSSV gây ra trên tôm he

(Penaeid) WSSV được tìm thấy ở nhóm tôm he và các loài giáp xác khác: tôm

nước ngọt, cua, tôm hùm, chân chèo và ấu trùng côn trùng Bệnh được báo cáo đầu tiên ở Nhật Bản vào năm 1993 trên tôm nhập từ Trung Quốc về nuôi (Trần

Thị Tuyết Hoa, 2004) Trước năm 2002, có 3 chủng Baculovirus gây bệnh đốm

trắng hoặc còn gọi là virus Trung Quốc Tuỳ từng nước nghiên cứu chúng có tên gọi và kích thước khác nhau Đến hội nghị virus học quốc tế lần thứ 12 (Paris, 2002) các tác giả: Just M Vlak, Jean-Robert Bonami, Tim W Flegel, Guang-Hsiung Kou, Donald V Lightner, Chu-Fang Lo, Philip C Loh, Peter J Walker đã

phân loại virus gây hội chứng đốm trắng là một giống mới Whispovirus thuộc họ mới Nimaviridae (Vlak et al., 2002) Virus được tìm thấy ở nhiều cơ quan khác

nhau như: chân bơi, mang, dạ dày, cơ bụng, huyết tương, ruột giữa, tim, chân bò, lympho, màng bao bọc, mô thần kinh, gan, tinh hoàn, buồng trứng, tinh dịch,

cuống mắt (Lo et al, 1997)

2.4.2 Triệu chứng

Đặc trưng của bệnh này là tôm bơi lội lờ đờ, yếu ớt, bỏ ăn, di chuyển chậm chạp,

cơ thể có thể chuyển sang màu hồng hoặc hơi đỏ, phía dưới giáp đầu ngực có những đốm trắng từ 1mm đến vài mm Bệnh thường xuất hiện ở thời điểm 1 – 2 tháng sau khi nuôi, khi môi trường nuôi bắt đầu xấu đi (Bùi Quang Tề, 2003) Khi tôm bị bệnh đốm trắng có thể chết 100% trong 3 – 10 ngày (Lightner, 1996)

2.4.3 Phương thức lây nhiễm và loài cảm nhiễm

Theo Trần Thị Tuyết Hoa, 2004 hiện nay bệnh đốm trắng ảnh hưởng lớn đến các

loài tôm có giá trị kinh tế thuộc họ Penaeid Một số loài tôm bị nhiễm WSSV như

P monodon, P japonicus, P chinens, P indicus… Bên cạnh đó WSSV được phát

hiện cảm nhiễm trên 40 loài giáp xác: tôm, cua, còng, copepod, thậm chí là ấu

trùng côn trùng Theo Bùi Quang Tề, (2003) thì bệnh đốm trắng lây theo chiều ngang là chính Virus lây từ các giáp xác khác (tôm, cua, chân chèo) nhiễm bệnh đốm trắng từ môi trường bên ngoài ao hay ngay trong ao nuôi tôm Khi các loài tôm nhiễm đốm trắng trong ao sức khoẻ của chúng yếu hoặc chết các con khoẻ ăn chúng dẫn đến bệnh lây lan càng nhanh hơn Có thể một số loài chim nước đã ăn tôm bị bệnh đốm trắng từ ao khác và bay đến ao nuôi đã mang theo các mẫu thừa

và rơi vào ao

2.4.4 Chẩn đoán

Lightner, (1996) đã đưa ra phương pháp mô học để chẩn đoán bệnh đốm trắng Với phương pháp này ta có thể quan sát được thể vùi WSSV phì đại trong nhân của tế bào bị nhiễm nó bắt màu của thuốc nhuộm Hematoxylin và Eosin

Dựa trên dấu hiệu đặc trưng là xuất hiện các đốm trắng dưới vỏ Kết hợp với chẩn đoán bằng phương pháp mô học: Quan sát nhân của tế bào biểu bì dưới vỏ, tế bào biểu bì tuyến anten, tế bào cơ quan Lympho, tổ chức liên kết của vỏ, mang, tế bào biểu bì dạ dày,…Khi nhuộm Hematoxylin và eosin các nhân tế bào có thể vùi lớn bắt màu đỏ đồng đều Và sử dụng kỹ thuật PCR và enzyme miễn dịch (Bùi Quang

Tề, 2003)

2.4.5 Phòng ngừa và xử lý bệnh

Hiện nay bệnh đốm trắng chưa có phương pháp nào chữa trị có hiệu quả, do đó để nuôi tôm có hiệu quả thì việc phòng bệnh phải được quan tâm hàng đầu Để phòng bệnh đốm trắng có hiệu quả thì chúng ta phải phòng bệnh tổng hợp (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004), tức là phải làm tốt các khâu từ việc vệ sinh trại, lựa chọn tôm

bố mẹ, chọn giống tốt, cải tạo ao nuôi, xử lý nước, nuôi với mật độ vừa phải, cho

ăn thức ăn có chất lượng tốt, chăm sóc và quản lý sức khoẻ ao nuôi…

2.5 Một số nghiên cứu bệnh đốm trắng

Bệnh đốm trắng được báo cáo đầu tiên ở Nhật Bản vào năm 1993 trên tôm nhập từ Trung Quốc về nuôi (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004), cho đến nay bệnh đã xuất hiện trên khắp thế giới và gây thiệt hại hàng trăm triệu USD/năm chỉ tính riêng ở Châu

Á (Wongteerasupaya et al 2003) Vì thế có nhiều nghiên cứu được tiến hành

nhằm xác định sự hiện diện của WSSV nhằm đưa ra phương pháp chẩn đoán chính xác để có cách phòng ngừa hiệu quả như các nghiên cứu của: Lightner, (1996) đã đưa ra phương pháp mô học để chẩn đoán bệnh đốm trắng Với phương pháp này

ta có thể quan sát được thể vùi WSSV phì đại trong nhân của tế bào bị nhiễm nó bắt màu của thuốc nhuộm Hematoxylin và Eosin Nguyễn Minh Hậu, (2002) sử dụng phương pháp PCR để xác định tỷ lệ cảm nhiễm đốm trắng Kết quả có 23% tôm giống đến tay người nuôi bị nhiễm WSSV Phạm Trần Nguyên Thảo, (2003)

đã ứng dụng phương pháp mô học để chẩn đoán bệnh đốm trắng và so sánh với kết quả PCR Kết quả cho thấy phương pháp mô học chỉ có thể phát hiện virus khi đã xâm nhập và gây tổn thương tế bào, do đó không thể phát hiên giai đoạn sớm

Vaseeharan et al., (2003) sử dụng phương pháp PCR đã nghiên cứu về sự xuất

hiện và phân bố WSSV ở tôm nuôi, tôm tự nhiên và giáp xác Phương pháp thực hiện với 630 mẫu tôm trong đó có 280 mẫu tôm post thu từ 9 trại giống và 350 mẫu tôm nuôi ( 40 - 60 ngày tuổi) từ 18 ao khác nhau Kết quả 53% mẫu dương

tính với WSSV khi thực hiện PCR một bước Okumura et al., (2004) đã dùng kỹ

thuật RPLA (Reversed passive latex agglutination) để phát hiện WSSV từ mô dạ

dày trên tôm he Nhật bản (Penaeus japonicus) Kỹ thuật này sử dụng hạt tổng hợp

có tỷ trọng cao và kháng thể đa dòng đặc hiệu, WSSV được phát hiện sau 12 giờ ủ

độ chính xác tương đương PCR

Những nghiên cứu về dịch tể học nhằm tìm hiểu đặc điểm gen của virus gây bệnh đốm trắng để ứng dụng trong việc xác định con đường lây truyền của WSSV như:

Wongteerasupaya et al., (2003) đã nghiên cứu về dịch bệnh đốm trắng trên 65 mẫu

tôm bệnh từ 55 ao tôm nuôi đã bùng phát bệnh đốm trắng ở Thái Lan bằng phương

pháp PCR-genotyping sử dụng đoạn mồi khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94

để tìm số vùng lặp lại có kích thước 54 bp Kết quả cho thấy số lần lặp lại từ 6 đến

20 lần, trong đó 8 lần lặp lại chiếm nhiều nhất 32% Bui Thi Minh Dieu et al.,

(2004) phân tích mẫu tôm sú nhiễm WSSV từ 8 ao khác nhau ở 7 tỉnh thuộc khu vực Miền Trung và Miền Nam Việt Nam để so sánh các dòng WSSV ở Việt Nam với dòng WSSV ở Thái Lan (WSSV – TH), Đài Loan (WSSV – TW) và Trung Quốc (WSSV – CN) Sử dụng các cặp mồi được thiết kế dựa trên đoạn gen của WSSV thuộc ORF14/15, ORF24/25, ORF75, ORF94, ORF125 Kết quả chứng minh các dòng WSSV ở việt Nam có cùng nguồn gốc với WSSV – TW (Đài Loan) và WSSV – TH (Thái Lan) khi sử dụng 2 cặp mồi ORF23/24 và ORF14/15,

và kết quả này cho thấy ORF75 và ORF125 có ý nghĩa quan trọng trong việc nghiên cứu dịch tể học của bệnh đốm trắng sau này ở Việt Nam Tran Thi Tuyet

Hoa et al., (2005) sử dụng phương pháp PCR-genotyping khuyếch đại vùng lặp lại

thuộc ORF94 trên các mẫu tôm nuôi và tôm giống ở Việt Nam Kết quả nghiên cứu đã xác định được số vùng lặp lại thuộc ORF94 của WSSV trên tôm giống từ 4 đến 8 và trên tôm nuôi là 4 đến 9 trong đó kiểu gen của WSSV có 7 vùng lặp lại chiếm tỷ lệ cao nhất Lê Vân Hải Yến, (2006) sử dụng phương pháp PCR-genotyping khuếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 để xác định số vùng lặp lại của virus gây bệnh đốm trắng trên 130 mẫu tôm sú thu tại Sóc Trăng, Trà Vinh Kết quả nghiên cứu cho thấy WSSV có 5, 7, 8, 9, 12 vùng lặp lại thuộc ORF94 trong

đó kiểu gen có 8 vùng lặp lại chiếm tỷ lệ cao nhất trên 50% Triệu Thanh Tuấn, (2006) cũng sử dụng phương pháp PCR-genotyping khuếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 để xác định số vùng lặp lại của virus gây bệnh đốm trắng trên 169 mẫu tôm sú có dấu hiệu đốm trắng thu ở Cà Mau, Bạc Liêu Kết quả nghiên cứu đã nghi nhận được vùng lặp lại thuộc ORF94 của WSSV có từ 4 đến 16 vùng lặp lại, trong đó kiểu gen có 5 vùng lặp lại chiếm tỷ lệ cao nhất (48,8% ở Bạc liêu, 68,4%

ở Cà Mau) Pradeep et al., (2007), đã sử dụng ADN ly trích từ tôm hậu ấu trùng, tôm nuôi có nhiễm WSSV, đồng thời sử dụng cả tôm tự nhiên và cua của Ấn Độ Nghiên cứu tìm hiểu sự thay đổi trên các vùng lặp lại của WSSV đã tìm ra trước

đây, bao gồm ORF94, ORF125 và ORF75 Đối với ORF94, có 13 kiểu gen được tìm thấy với số lần lặp lại từ 2 đến 16 Trong đó lặp lại 7 lần chiếm 11,3%, không

có mẫu nào có số lần lặp lại 11 lần hoặc 15 lần được tìm thấy Đối với ORF125,

có 11 kiểu gen khác nhau được tìm thấy với số lần lặp lại từ 2 đến 14 Số lần lặp lại được tìm thấy nhiều nhất là 7 lần chiếm 47,1%, không tìm thấy mẫu nào có số lần lặp lại 6 lần hoặc 13 lần Đối với ORF75 tìm thấy 6 kiểu gen khác nhau của vùng lặp lại Trong đó các mẫu có cùng số lần lặp lại trên một ORF thì có số lần lặp lại không giống nhau trên một hoặc cả hai ORF khác Từ những kết quả trên cho thấy cả 3 ORF có thể sử dụng để phân tích sự khác nhau và các dòng đặc trưng của WSSV Về dịch tể học, ORF94 có vai trò lớn nhất, sau đó đến ORF125

và ORF75

Để xác định sự ảnh hưởng của bệnh đốm trắng, và tác hại của WSSV đối với tôm

nuôi thì độc lực của WSSV là điều cần quan tâm Marks et al., (2005) đã sử dụng

kỹ thuật PCR dựa trên các mồi ORF 14/15 và ORF 23/24 để tiến hành phân lập định danh các dòng WSSV ở Thái Lan Kết quả cho thấy dòng WSSV được phân lập vào năm 2005 (WSSV – TH) giống với dòng WSSV được phân lập từ năm

1996 (TH – 96 – II) Đồng thời, khi tiến hành gây cảm nhiễm trên tôm sú để so sánh độc lực của hai dòng virút này, cho thấy rằng đối với dòng TH – 96 – II gây chết 50% khoảng 14 ngày còn đối với dòng WSSV – TH chỉ mất 3,5 ngày Và nghiên cứu đã khẳng định rằng độc lực của dòng WSSV – TH cao hơn độc lực của dòng WSSV TH – 96 – II thông qua thí nghiệm LD50

Khi xác định được tác nhân gây bệnh, phương thức lây truyền, và những ảnh hưởng của WSSV thì có nhiều nghiên cứu nhằm khống chế sự phát triển và khả

năng gây hại của WSSV như: Witteveldt et al., (2003) đã sử dụng vacxin chứa vỏ

của WSSV để phòng WSSV Thí nghiệm đã chỉ ra rằng những tôm sống sót sau khi bị nhiễm WSSV sẽ có tỉ lệ sống cao hơn khi tái cảm nhiễm Chúng tôi nghiên cứu khả năng của vacxin cho tôm thông phương pháp cho ăn, vacxin này chứa protein vỏ của WSSV Tôm sú (Penaeus monodon) được cho ăn thức ăn viên áo

bên ngòai 1 lớp vi khuẩn không họat động biểu hiện 2 lọai protein vỏ của WSSV

là VP19 và VP28 Vacxin chứa VP28 cho thấy tỉ lệ chết của tôm thấp hơn có ý nghĩa khi so sánh với lô đối chứng (vi khuẩn chỉ chứa vector rổng) thông qua phương pháp ngâm (tỉ lệ sống 61%), trong khi đó vacxin chứa VP19 không thể hiện sự bảo vệ nào Để xác định sự tấn công và thời gian bảo vệ của vacxin, thí nghiệm cảm nhiễm được thực hiện sau khi sử dụng vacxin 3, 7 và 21 ngày Tỉ lệ sống cao hơn có ý nghĩa được quan sát sau khi tôm sử dụng vacxin 3, 7 ngày (64%

và 77%), nhưng sự bảo vệ đã giảm sau 21 ngày (tỉ lệ sống 29%) Trái với những hiểu biết hiện tại, động vật không xương sống không có hệ thống đáp ứng miễn dịch nhưng kết quả này cho thấy đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và khả năng bảo vệ

có thể tạo ra ở P monodon Các thí nghiệm trên mở ra con đường mới phòng WSSV mang lợi ích cho công nghiệp nuôi tôm Hứa Quyết Chiến, (2004) đã nghiên cứu và sử dụng thành công việc sử dụng chế phẩm SH'99 trong việc phòng bệnh virut đốm trắng trên tôm sú Khi cho tôm ăn liên tiếp chế phẩm SH'99 ngay

sau khi thả có thể giúp tôm phòng bệnh đốm trắng Sarathi et al., (2007) đã sử

dụng vi khuẩn có chứa VP28dsRNA vào trong thức ăn viên cho tôm ăn để làm giảm khả năng gây hại của WSSV Có hai phương pháp được thử nghiệm Phương pháp thứ nhất là trộn vi khuẩn có chứa VP28dsRNA vào trong thức ăn viên cho tôm ăn Phương pháp hai trộn phức hợp mảnh nhỏ VP28dsRNA-chitosan vào trong thức ăn viên cho tôm ăn Tôm khoẻ được gây cảm nhiễm bệnh đốm trắng bằng cách cho ăn tôm bị bệnh đốm trắng Thí nghiệm được thực hiện trong 30 ngày Kết quả cho thấy ở những lô tôm nhiễm WSSV có cho ăn dsRNA thì tỉ lệ sống cao hơn tôm ở lô đối chứng (vi khuẩn chứa véc tơ LITMUS38i không mang đoạn gen VP28) Tỉ lệ sống của tôm ở nghiệm thức sử dụnh vi khuẩn bất hoạt có chứa WSSV VP28dsRNA là 68% Trong khi chỉ có 37% tôm sống sót ở nghiệm thức sử dụng phức hợp mảnh nhỏ VP28dsRNA-chitosan và 100% tôm chết được ghi nhận ở nghiệm thức đối chứng Tôm còn sống cho kết quả xét nghiệm cho âm tính với WSSV bằng phương pháp PCR và Westnern Blot Dựa trên kết quả đạt

được và những lợi thế của dsRNA cho thấy có thể ngăn chặn sự nhiễm WSSV ở tôm sú bằng cách cho tôm ăn vi khuẩn bất hoạt có chứa VP28dsRNA

2.6 Kỹ thuật PCR và các ứng dụng

Kỹ thuật nhân DNA đặc hiệu PCR (Polymerase Chain Reaction) do Kary Mullis phát minh 1985 đã mở ra cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử Kỹ thuật này là kỹ thuật hoàn toàn mới trong nghiên cứu và phân tích gen, PCR cho phép tạo ra một số lượng lớn đoạn DNA cần lựa chọn mà không cần tách và nhân dòng (http://vi.wikipedia.org/wiki/PCR)

2.6.1 Quy trình

Quy trình PCR gồm 20 đến 30 chu kỳ Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:

Bước 1: Nhiệt độ tăng lên 94-96°C để tách hai sợi DNA ra Bước này gọi là biến tính, nó phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA Trước chu kỳ 1, DNA thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn Thời gian: 1-2 phút

Bước 2: Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn Bước này gọi là gắn mồi Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt độ biến tính 50°C (45-60°C) Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện Thời gian: 1-2 phút

Bước 3: DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống Nó bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo sợi DNA Bước này gọi là kéo dài Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc DNA-polymerase Thời gian của bước này phụ thuộc vào cả DNA-polymerase và chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại (http://vi.wikipedia.org/wiki/PCR)

Trong các lĩnh vực khác: (i) Nghiên cứu khoa học: xác định trình tự đoạn ADN cần nghiên cứu, phát hiện đột biến, nghiên cứu quá trình tiến hóa phân tử, phục hồi gen tồn tại hàng triệu năm; (ii) Chọn giống vật nuôi và cây trồng từ đó lựa chọn được những cá thể bố mẹ thuần chủng, sạch bệnh trong thời gian ngắn; (iii)

Y học và khoa học hình sự: áp dụng để chẩn đoán chính xác các bệnh nhiễm trùng

từ vi rút, vi khuẩn, nấm, chẩn đoán sớm ung thư và các bệnh do di truyền, xác định huyết thống, truy tìm dấu vết tội phạm

2.6.3 Hạn chế

Theo Đặng Thị Hoàng Oanh (2007) phương pháp PCR có những hạn chế sau Phương pháp PCR thừơng không hoạt động với những đoạn DNA lớn hơn 3 kb, điều kiện tối ưu cho phản ứng phải qua thực nghiệm

Sự ngoại nhiễm là vấn đề cực kỳ quan trọng, nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường

là các sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước

Sự sai sót do Taq polymerase, cứ 10.000 nucleic thì enzyme gắn sai 1 nucleic

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 01 đến tháng 07 năm 2008

Các mẫu tôm có dấu hiệu đốm trắng đã được thu từ các huyện Đầm Dơi (2 ao), Phú Tân (1 ao), Thới Bình (2 ao), Trần Văn Thời (3 ao), và Thành Phố Cà Mau (14 ao), tỉnh Cà Mau

Quá trình phân tích mẫu được thực hiện tại phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn sinh học và bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại Học Cần Thơ

Bảng đồ hành chính tỉnh Cà Mau

3.2 Vật liệu nghiên cứu

Mẫu được trữ trong nitơ lỏng hay trữ lạnh (vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm) và được trữ trong tủ âm 800C

3.4 Phương pháp Nested-PCR (Theo tài liệu hướng dẫn sử dụng của bộ kit

IQ-2000 WSSV của công ty Farming Intelligene Technology Coperation, Đài Loan) gồm các bước: ly trích DNA, khuyếch đại DNA, điện di, đọc kết quả