TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN CAO CHÍ THUẬN PHÁT HIỆN WHITE SPOT SYNDROME VIRUS (WSSV) TRONG MẪU THỨC ĂN DÙNG NUÔI VỖ TÔM SÚ BỐ MẸ (Penaeus monodon) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN CAO CHÍ THUẬN PHÁT HIỆN WHITE SPOT SYNDROME VIRUS (WSSV) TRONG MẪU THỨC ĂN DÙNG NUÔI VỖ TÔM SÚ BỐ MẸ (Penaeus monodon) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TRẦN THỊ TUYẾT HOA ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm tạ Quý Thầy - Cô giảng viên Khoa Thủy Sản, trường Đại học Cần Thơ đã tận tâm giảng dạy, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian em học tập tại trường. Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn cô Trần Thị Tuyết Hoa giảng viên Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy Sản thuộc khoa Thủy Sản - trường đại học Cần Thơ đã tận tâm dìu dắt, hướng dẫn em hoàn thành luận văn tốt nghiệp, tạo điều kiện để em có cơ hội học tập thêm những kiến thức thực tế. Chân thành cảm ơn anh Đào Bá Cường và anh Mai Nam Hưng (lớp cao học khoá 14) đã nhiệt tình hỗ trợ cung cấp mẫu thu ở Bạc Liêu và Cà Mau năm 2009. Xin cám ơn tập thể các bạn lớp Bệnh học thủy sản khóa 31 đã động viên, giúp đỡ, và trao đổi kiến thức trong suốt thời gian học tập, làm luận văn tốt nghiệp tại Khoa Thủy Sản. Chân thành cảm ơn các anh, chị ở bộ môn Sinh học và Bệnh thủy sản đặc biệt là chị Trần Việt Tiên và anh Hoàng Tuấn rất đã nhiệt tình hỗ trợ, giúp đỡ tận tình trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Chân thành cảm ơn Ba, Mẹ và hai chị đã động viên trong suốt thời gian học Đại học cũng như trong khoảng thời gian làm luận văn. Xin chân thành cảm ơn và chúc Quý thầy cô và các anh, chị, bạn bè lời chúc sức khỏe và thành công trong cuộc sống. i PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com TÓM TẮT Kể từ khi xuất hiện từ đầu những năm chín mươi thì bệnh đốm trắng đã trở thành một trong những bệnh nguy hiểm hàng đầu trong nghề nuôi tôm trên toàn thế giới. Tính chất nguy hiểm của bệnh là không chỉ gây chết trên diện rộng trong thới gian ngắn với phổ loài cảm nhiễm rất rộng vì vậy việc phát hiện WSSV trên các loài mới là rất có ý nghĩa trong việc phòng chống sự lan truyền mầm bệnh. Vì thế đề tài: “Phát hiện white spot syndrome virus (WSSV) trong mẫu thức ăn dùng nuôi vỗ tôm sú bố mẹ” được thực hiện nhằm phát hiện thêm các loài vật mẫn cảm mới và đánh giá sự nhiễm WSSV trên các loài có khả năng đưa mầm bệnh vào hệ thống nuôi này. Việc phát hiện WSSV trên các mẫu thức ăn tươi sống được thực hiện với qui trình PCR của Kimura et al.1996 (Trần Thị Phương Trang tối ưu tháng 5 năm 2009) và bộ kít IQ2000 của công ty Farming Intelligene Technology Corporation, Đài Loan. Việc khẳng định những ảnh hưởng của WSSV trên các mẫu thứ ăn này ở cấp đô mô, tế bào được thực hiện bằng phương pháp mô học. Thành phần các loại thức ăn thu được ở Bạc Liêu là nhiều hơn Cà Mau nhưng tỉ lệ nhiễm trong các mẫu ở Cà Mau (59 %) là cao hơn ở Bạc Liêu (54 %). Kết quả PCR của kít IQ2000 cho thấy các mẫu nhiễm WSSV chỉ ở mức độ nhẹ. Kết quả mô học trên một số ốc mượn hồn cho thấy sự ảnh hưởng của WSSV trên tế bào của mô liên kết dạ dày. Từ đó hoàn toàn có thể khẳng định sự nhiễm WSSV trên các mẫu thức ăn tươi sống trong các trại sản xuất giống thu từ Bạc Liêu và Cà Mau. ii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com MỤC LỤC Trang LỜI CẢM TẠ ……………………………………………………………… i TÓM TẮT………………………………………………………………… …ii DANH SÁCH BẢNG……………………………………………………… v DANH SÁCH HÌNH………………………………………………………… vi PHẦN I: GIỚI THIỆU……………………………………………………… 1 PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU…………………………………… 2 2.1.1 Sơ lược về tình hình nuôi tôm trên thế giới…………………… …… …2 2.1.2 Ở Việt Nam……………………………… ………………………… ….2 2.2 Sơ lược về bệnh đốm trắng……………………………………… …….….3 2.2.1 Dấu hiệu bệnh lý……………… …………………………………………3 2.2.2 Phổ loài cảm nhiễm………………………… ……………………………4 2.2.3 Phương thức lan truyền…………………………… ……………………5 2.2.4 Phương pháp chẩn đoán – phát hiện bệnh 6 2.2.5 Cách phòng bệnh 6 2.2.6 Một số các nghiên cứu phát hiện WSSV ………………………………….7 PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…… ……… ….9 3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện……………………………………….…….9 3.2 Vật liệu nghiên cứu…………………………………………………… ….9 3.2.1 Mẫu vật……………………………………………………………… … 9 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 3.2.2 Dụng cụ hóa chất………………………………………………… …….9 3.3 Phương pháp nghiên cứu……………………………………………… .……9 3.3.1 Phương pháp chiết tách ADN dựa theo kit IQ2000 – WSSV của công ty Farming Intelligene Technology Corporation, Đài Loan……………………………………………………………………… ……10 3.3.2 Phương pháp PCR phát hiện WSSV (Kimura et al. 1996)……………….11 3.3.3 Phương pháp PCR phát hiện WSSV theo kit IQ2000–WSSV (công ty Farming Intelligene Technology Corporation, Đài Loan)…………………… 14 3.3.5 Phương pháp mô học…… ……………………………………… …… 15 3.3.6 Phương pháp phân tích và xử lý thống kê ………………………… ……17 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Tình hình sử dụng thức ăn tươi sống nuôi vỗ tôm sú bố mẹ tại hai tỉnh Bạc Liêu và Cà Mau……………………………………………………… ……18 4.2 Xác định sự nhiễm WSSV ở các mẫu thức ăn…………………… 19 4.2.1 Sự nhiễm WSSV ở mẫu ốc mượn hồn………… ………………………19 4.2.2 Sự nhiễm WSSV ở mẫu mực…………………………………………….21 4.2.3 Sự nhiễm WSSV trên tôm tít………………… ………….…………… 22 4.2.4 Xác định sự nhiễm WSSV trong các mẫu thức ăn tươi sống với kít WSSV- IQ2000 ……………………………………………………………………… 23 4.2.5 Xác định sự nhiễm WSSV trong mẫu thức ăn với phương pháp mô học 24 4.3.1 Xác định tỉ lệ nhiễm WSSV ở các mẫu thức ăn tại Bạc Liêu……………25 4.2.3 Xác định tỉ lệ nhiễm WSSV ở các mẫu thức ăn tại Cà Mau…………… 27 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT……………………………………………………28 5.1 Kết luận…………………………………………………………… …… 28 5.2 Đề xuất…………………………………………………………………… 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………… 29 iv PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1 Trình tự đoạn mồi của Kimura et al. 1996 Bảng 3.2 Trình tự đoạn mồi của gen nội chuẩn (Csiro, 2008) Bảng 3.3 Thành phần hóa chất tham gia phản ứng bước 1 Bảng 3.4 Thành phần hóa chất sử dụng cho phản ứng bước 2 Bảng 4.1 Kết quả về các loại thức ăn tươi sống được sử dụng trong các trại sản xuất tôm sú giống tại Bạc Liêu và Cà Mau Bảng phụ lục A: Câu hỏi điều tra thông tin trại giống Bảng B.1 Thành phần hóa chất sử dụng trong qui trình PCR của Kimura et al (1996) được tối ưu bởi Trần Thị Phương Trang (2009). Bảng C.1 Dung dịch cố định Davidson/AFA Bảng C.2 Dung dịch nhuộm Haematoxylin Bảng C.3 Dung dịch Eosin/Phloxine PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com DANH SÁCH HÌNH Hình 4.1 Các mẫu ốc thu được từ các trại sản xuất giống tôm sú ở Bạc Liêu và Cà Mau Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR ốc mượn hồn, mực và tôm tít Hình 4.3 Các mẫu mực dùng trong các trại sản xuất giống tại Bạc Liêu Hình 4.4 Mẫu tôm tít dùng cho tôm mẹ tại Bạc Liêu Hình 4.5 Kết quả điện di các mẫu chạy PCR với bộ kit IQ2000 Hình 4.6 Tế bào liên kết dạ dày của ốc mượn hồn nhiễm WSSV (H&E, 100X) Hình 4.7 Cơ quan ống gan tụy của ốc mượn hồn (H&E, 40X) Hình 4.8 Tỉ lệ nhiễm WSSV trong các mẫu thu từ Bạc Liêu vi PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 1 PHẦN I GIỚI THIỆU Nghề nuôi trồng thủy sản của Việt Nam nói chung và Đồng Bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) nói riêng đã và đang phát triển mạnh, là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của cả nước. Trong đó cá tra, cá ba sa và tôm sú là một trong những đối tượng nuôi chính và chiếm ưu thế trong ngành nuôi thủy sản của cả nước. Tuy nhiên trong những năm qua cùng với sự phát triển quá ồ ạt, tự phát, thiếu quy hoạch nhất là sự thiếu nhận thức đúng về môi trường và dịch bệnh của người dân nên tình hình dịch bệnh diễn biến phức tạp, gây thiệt hại không nhỏ cho người nuôi. Đây là nguyên nhân chính làm cho nghề nuôi trồng thủy sản không ổn định và thiếu bền vững. Có nhiều bệnh gây tổn thất lớn cho nghề nuôi tôm nói chung và cho tôm sú nói riêng được biết đến như bệnh đầu vàng (Yellow Head Virus-YHV), bệnh còi (Monodon Baculovirus- MBV) đặc biệt là bệnh đốm trắng (White Spot Syndrome Virus-WSSV) là một bệnh rất nguy hiểm do gây tỉ lệ chết cao, lây lan nhanh và đặc biệt phổ loài cảm nhiễm rộng. Tất cả các loài tôm he đều có thể bị cảm nhiễm loại virut này, các loài cua, còng trong ao nuôi hay thậm chí ấu trùng của côn trùng thủy sinh cũng có thể mang mầm bệnh và là nguồn lây bệnh nguy hiểm. Do vậy việc nghiên cứu về phổ loài cảm nhiễm nhằm giúp kiểm soát và khống chế bệnh này là rất cần thiết khi mà công tác chữa trị hầu như không mang lại hiệu quả. Vì vậy đề tài “Phát hiện white spot syndrome virus (WSSV) trong mẫu thức ăn dùng nuôi vỗ tôm sú bố mẹ” được thực hiện. Mục tiêu của đề tài Tìm hiểu về khả năng nhiễm WSSV trong các mẫu thức ăn tươi sống dùng trong các trại sản xuất giống tôm sú ở khu vực Cà Mau và Bạc Liêu. Nội dung của đề tài - Xác định sự nhiễm WSSV ở các mẫu thức ăn tươi sống. - Xác định tỉ lệ nhiễm WSSV ở các mẫu thức ăn tại Cà Mau. - Xác định tỉ lệ nhiễm WSSV ở các mẫu thức ăn tại Bạc Liêu. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com [...]... có dấu hiệu bên ngoài khỏe như: tôm giống là 3/3 mẫu, các mẫu tôm lứa đang nuôi thì không bị nhiễm (0/2 mẫu) trong khi mẫu tôm hoang dại từ tự nhiên nhiễm 1/1 mẫu; các mẫu tôm mẹ là 3/3 mẫu và mẫu artemia là 1/1 mẫu, mẫu cua (Scylla serrata) nhiễm 3/20 mẫu, mẫu cua Sesarma oceanica nhiễm 1/10 mẫu, Charybdis lucifera là 2/5 mẫu và Matuta planipes là 2/2 mẫu, còn lại các mẫu cua có dấu hiệu bình thường... trung bình, dùng phần mềm excel và xử lý và vẽ biểu đồ 17 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Tình hình sử dụng thức ăn tươi sống nuôi vỗ tôm sú bố mẹ tại hai tỉnh Bạc Liêu và Cà Mau Hiện nay tình hình sử dụng thức ăn tươi sống trong các trại sản xuất giống tôm sú ở Bạc Liêu là rất đa dạng với nhiều loại thức ăn tươi sống... bì S K Otta et al 1999 đã dùng kỹ thuật PCR để phát hiện WSSV trên các loài giáp xác nuôi và hoang dại ở Ấn Độ Trong nghiên cứu này thì tôm hậu ấu trùng và tôm bố mẹ được kiểm tra với hai đoạn mồi là WSSV PJ dành cho tôm he Nhật (P japonicus) và WSSV PM dành cho tôm sú (P monodon) Kết quả dương tính với WSSV bằng phương pháp nested PCR trên các mẫu tôm hậu ấu trùng là 28/58 mẫu: (i) Trên nhóm có dấu... tại của WSSV trong mực là hoàn toàn có khả năng Hình 4.2 (giếng 5) cho thấy, WSSV hiện diện trong mẫu mực, được phát hiện bằng phương pháp PCR (đây là mẫu mực thu tại một trại sản xuất giống tại Bạc Liêu) 21 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 4.2.3 Sự nhiễm WSSV trên tôm tít Các loài tôm tít cũng là một trong những thức ăn ưa thích của tôm bố mẹ tuy nhiên... phương pháp này họ đã thành công trong việc phát hiện WSSV trên tôm nuôi, tôm đánh bắt từ tự nhiên, các loài cua và cả các một số loài động vật chân đốt khác Với mỗi nhóm đối tượng trên họ có phương pháp phát hiện WSSV khác nhau Đối với các loài trong nhóm mười chân đươc nuôi như tôm sú (P monodon), tôm he Nhật (P japonicus), tôm thẻ đuôi đỏ (P penicillatus), tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii)... Tôm tít 0 1/15 Trong các trại thu tại Bạc Liêu thì 9/15 trại là có sử dụng mực cho tôm ăn trong quá trình nuôi vỗ tôm sú bố mẹ Ngoài chín trại này, một số trại có sử dụng mực nhưng không thu được tại thời điểm thu mẫu Loại thức ăn được sử dụng nhiều nhất là ốc mượn hồn 14/15 trại, chỉ có duy nhất một trại ở Bạc Liêu là không sử dụng vì nghi ngờ khả năng mang WSSV vào hệ thống sản xuất Tôm tít chỉ có... lý mẫu Xử lý mẫu: qui trình xử lý mẫu mô (>= 5mm) được cài đặt trong máy xử lý mô (Program 4) theo các bước: - Cồn 80o trong 60 phút - Cồn 95o trong 60 phút - Cồn 95o trong 60 phút - Cồn 100o trong 1giờ 30 phút - Cồn 100o trong 1giờ 30 phút - Cồn 100o trong 1giờ 30 phút - Xylen trong 2 giờ - Xylen trong 2giờ - Xylen trong 2giờ - Paraffin + xylen (1:1) trong 2 giờ 30 phút - Paraffin + sáp ong (1:1) trong. .. tôm bố mẹ tuy nhiên các trại ít sử dụng loại tôm này vì nghi khả năng nhiễm WSSV của chúng Hình 4.4 Mẫu tôm tít dùng cho tôm mẹ tại Bạc Liêu Cả mẫu tôm tít thu về từ một trại sản xuất giống thuộc khu vực Bạc Liêu thì tất cả đều dương tính với WSSV Kết quả ở hình 4.2 (giếng 6, 7, 8) cho thấy WSSV hiện diện trong 3 mẫu tôm tít thu được ở Bạc Liêu, được phát hiện với phương pháp PCR 2 bước Kết quả này... ao hoặc ngay trong ao nuôi tôm Hiện tượng ăn lẫn nhau dẫn đến bệnh lây lan càng nhanh hơn trong ao có tôm bị bệnh Có thể một số loài chim nước đã ăn tôm bị bệnh đốm trắng từ ao khác và bay đến ao nuôi đã mang theo các mẩu thức ăn 5 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com thừa rơi vào ao nuôi (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004) Bệnh đốm trắng không có khả năng lây truyền... mực và tôm tít Giếng M là thang DNA 1kb Giếng 1, 2, 3, 4 là những mẫu ốc mượn hồn dương tính Giếng 5 là mẫu mực dương tính Giếng 6, 7, 8 là những mẫu tôm tít dương tính Giếng 9 là đối chứng dương Giếng 10 là đối chứng âm Hình 4.2 cho thấy, WSSV hiện diện trong các mẫu ốc mượn hồn được phát hiện bằng phương pháp PCR Trong đó có cả mẫu của Bạc Liêu (giếng 1, 2) và mẫu của Cà Mau (giếng 3,4) Những mẫu này . PHÁT HIỆN WHITE SPOT SYNDROME VIRUS (WSSV) TRONG MẪU THỨC ĂN DÙNG NUÔI VỖ TÔM SÚ BỐ MẸ (Penaeus monodon) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP. PHÁT HIỆN WHITE SPOT SYNDROME VIRUS (WSSV) TRONG MẪU THỨC ĂN DÙNG NUÔI VỖ TÔM SÚ BỐ MẸ (Penaeus monodon) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP