ứng dụng phương pháp pcr phát hiện edwardsiella ictaluri trực tiếp từ mô cá bệnh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN MAI THỊ LOAN ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN Edwardsiella ictaluri TRỰC TIẾP TỪ MÔ CÁ BỆNH LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

MAI THỊ LOAN

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN

Edwardsiella ictaluri TRỰC TIẾP TỪ MÔ CÁ BỆNH

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2009

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN

MAI THỊ LOAN

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN

Edwardsiella ictaluri TRỰC TIẾP TỪ MÔ CÁ BỆNH

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

TS ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH

KS NGUYỄN TRÚC PHƯƠNG

2009

Chân thành cảm ơn cô Đặng Thụy Mai Thy và cô Trần Thị Tuyết Hoa cũng như toàn thể quý thầy cô Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy Sản đã giúp đỡ tôi

và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Chân thành cảm ơn chị Trần Việt Tiên, anh Lê Hữu Thôi và các anh chị Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy Sản đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài

Cảm ơn những người bạn thân của tôi cũng như tất cả các bạn lớp Bệnh Học Thủy Sản 31 đã luôn bên cạnh động viên giúp đỡ tôi trong suốt quãng thời gian học tập tại Giảng đường Đại học cũng như trong quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng là lời cảm ơn sâu sắc đến Cha, Mẹ và Em trai tôi đã luôn là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi trong học tập cũng như trong cuộc sống

Mai Thị Loan

TÓM TẮT

Đề tài thực hiện nhằm chuẩn hóa phương pháp ly trích ADN từ mô thận của cá

tra theo phương pháp của Taggart et al (1992) và tối ưu hóa phương pháp PCR phát hiện E ictaluri

Qui trình ly trích ADN được chuẩn hóa có thời gian thực hiện bằng 1/8 lần qui

trình gốc (Taggart et al, 1992) với hàm lượng Proteinase K sử dụng là 2.5µl (40mg/ml), thời gian ủ ở bước 1 là 15 phút; hàm lượng RNase là 2.5µl (2mg/ml), thời gian ủ bước 2 là 30 phút

Qua thí nghiệm xác định được độ nhạy đối với ADN chiết tách trực tiếp từ thận có hàm lượng là 50ng, với ADN chiết tách từ vi khuẩn có hàm lượng 0.2

ng Hai đoạn mồi EiFd-1 và EiRs-1 được xác định là đặc hiệu với vi khuẩn E

ictaluri Ngoài ra trong quá trình chuẩn hóa thay đổi hàm lượng Tag DNA

polymerase từ 5U/µl xuống còn 3U/µl

Thực hiện phản ứng PCR với ADN được chiết tách trực tiếp từ thận với qui

trình đã được tối ưu, phương pháp PCR đã chuẩn hóa phát hiện E ictaluri ở vị

trí 407bp

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM TẠ i

TÓM TẮT ii

MỤC LỤC iii

DANH SÁCH BẢNG vi

DANH SÁCH HÌNH vii

PHẦN I: GIỚI THIỆU 1

PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược tình hình nuôi và bệnh trên cá tra ở ĐBSCL 3

2.2 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 4

2.2.1 Tình hình bệnh do vi khuẩn E ictaluri trên thế giới và Việt Nam 4

2.2.1.1 Trên thế giới 4

2.2.1.2 Ở Việt Nam 4

2.2.2 Đặc điểm sinh hóa của loài vi khuẩn E ictaluri 5

2.2.3 Độc lực và một số thí nghiệm gây cảm nhiễm 6

2.3 Chiết tách acid nucleic 6

2.4 Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) 7

PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

3.1 Thời gian và địa điểm 13

3.2 Dụng cụ và hoa chất 13

3.2.1 Dụng cụ 13

3.2.1.1 Dụng cụ phân tích mẫu vi khuẩn 13

3.2.1.2 Dụng cụ dùng trong phản ứng PCR 13

3.2.2 Hóa chất 14

3.2.2.1 Hóa chất dùng phân tích mẫu vi khuẩn 14

3.2.2.2 Hóa chất dùng trong phản ứng PCR 14

3.3 Phương pháp nghiên cứu 15

3.3.1 Thí nghiệm gây cảm nhiễm 15

3.3.1.1 Chuẩn bị hệ thống bể 15

3.3.1.2 Cá thí nghiệm 15

3.3.1.3 Vi khuẩn gây cảm nhiễm 15

3.3.1.4 Bố trí thí nghiệm 16

3.3.2 Phương pháp phân tích mẫu vi khuẩn 17

3.3.3 Phương pháp PCR 19

3.3.3.1 Vật liệu cho phản ứng PCR 19

3.3.3.2 Chiết tách acid nucleic: phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992) 19

3.3.3.3 Thí nghiệm xác định độ nhạy 20

3.3.3.2.1 Chiết tách acid nuleic (Bartie và ctv, 2006) 20

3.3.3.2.2 Khuếch đại ADN: (Panangala và ctv (2007) có chỉnh sửa) 21

3.3.3.2.3 Điện di 22

3.3.3.4 Thí nghiệm xác định tính đặc hiệu 22

PHẦN IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24

4.1 Kết quả phân tích vi sinh 24

4.1.1 Dấu hiệu bệnh lý 24

4.1.2 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa 24

4.2 Kết quả chuẩn hóa qui trình chiết tách acid nucleic – phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992) (chỉnh sửa bởi Đặng Thị Hoàng Oanh)25 4.2.1 Thực hiện qui trình chiết tách acid nucleic bằng phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992) 25

4.2.2 Tăng hàm lượng Proteinase K, giảm thời gian ủ bước 1 26

4.2.3 Điều chỉnh hàm lượng Proteinase K, thời gian ủ và hàm lượng RNase 27

4.2.4 Tối ưu qui trình chiết tách với hàm lượng Proteinase K 2.5µl, thời gian ủ bước 1 là 15 phút; hàm lượng RNase 2.5µl, thời gian ủ bước 2 là 30 phút 27

4.3 Kết quả chuẩn hóa phương pháp PCR 28

4.3.1 Kết quả thí nghiệm xác định độ nhạy 28

4.3.2 Kết quả xác định tính đặc hiệu 30

4.3.3 Kết quả chuẩn hóa qui trình khuếch đại phát hiện E ictaluri (Panangala và ctv, 2007) 31

4.4 Kết quả phản ứng PCR 33

4.4.1 Kết quả phản ứng PCR với ADN mẫu thực hiện qui trình chiết tách acid nucleic bằng phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992) 33

4.4.2 Kết quả phản ứng PCR với ADN mẫu thực hiện bằng qui trình chiết tách được tối ưu 35

PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 36

5.1 Kết luận 36

5.2 Đề xuất 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO 37

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 3.1 Thành phần tham gia phản ứng PCR 20 Bảng 4.1 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa 25

Bảng 4.2 Hàm lượng DNA chiết tách (theo Taggart et al., 1992) 25

Bảng 4.3 Hàm lượng DNA chiết tách theo phương pháp Phenol chloroform

(Taggart et al, 1992), tăng hàm lượng Proteinase K, giảm thời gian ủ bước 1

26 Bảng 4.4 Hàm lượng ADN chiết tách theo phương pháp Phenol chloroform

(Taggart et al, 1992), chỉnh hàm lượng Proteinase K, thời gian ủ và hàm lượng

RNase 27 Bảng 4.5 Hàm lượng ADN chiết tách theo phương pháp Phenol chloroform

(Taggart et al, 1992), hàm lượng Proteinase K 2.5µl, thời gian ủ bước 1 là 15 phút; hàm lượng RNase 2.5µl, thời gian ủ bước 2 là 30 phút 28 Bảng 4.6 Thành phần tham gia phản ứng PCR (hàm lượng Tag DNA polymerase 5U/µl) 31 Bảng 4.7 Thành phần tham gia phản ứng PCR (hàm lượng Tag DNA polymerase 4U/µl) 31 Bảng 4.8 Thành phần tham gia phản ứng PCR (hàm lượng Tag DNA polymerase 3U/µl) 32

DANH SÁCH HÌNH

Hình 4.1 Cá bệnh mủ gan 24 Hình 4.2 Kết quả điện di thí nghiệm xác định độ nhạy với ADN chiết tách từ thận 29 Hình 4.3 Kết quả điện di thí nghiệm xác định độ nhạy với ADN chiết tách từ

vi khuẩn 29 Hình 4.4 Kết quả điện di thí nghiệm xác định tính đặc hiệu 30 Hình 4.5 Kết quả điện di kiểm tra hiệu quả của các hàm lượng Tag DNA polymerase khác nhau 32

Hình 4.6 Kết quả chạy PCR phát hiện E ictaluri, qui trình chiết tách acid nucleic theo phương pháp Phenol-chloroform (Taggart et al, 1992) 33

Hình 4.7 Kết quả chạy PCR, chuẩn hóa qui trình chiết tách lần 1 34 Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm PCR với qui trình tối ưu 35

PHẦN I GIỚI THIỆU

Trong những năm gần đây, nghề nuôi trồng thủy sản ở nước ta nói chung và Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) nói riêng đang phát triển không ngừng mang lại hiệu quả kinh tế cao cho nước nhà đặc biệt là cá tra do đây là đối tượng dễ nuôi, mau lớn, chất lượng thịt ngon Cá tra được nuôi nhiều ở An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ với nhiều mô hình khác nhau cả trong lồng bè,

ao đất

Mặc dù năm 2008 ngành thủy sản nước ta gặp nhiều khó khăn nhưng giá trị xuất khẩu vẫn không ngừng gia tăng Theo số liệu của Hải quan, tính đến ngày 14/11/2008, tổng kim ngạch xuất khẩu thuỷ sản của cả nước đã đạt 4 tỷ USD 10 tháng đầu năm, xuất khẩu thuỷ sản đạt 1.054.600 tấn, trị giá 3,828 tỷ USD, tăng 39,4% về lượng và 24,4% về giá trị so với cùng kỳ năm ngoái Xuất khẩu trong tháng 10 đạt 124.328 tấn, trị giá 478,23 triệu USD, tăng 30%

về khối lượng và giá trị so với tháng 10/2007 Trong đó, cá tra, basa chiếm 32,4%, với 550.070 tấn, đạt mức tăng trưởng cao nhất, tăng 74,5% về lượng

và 53,3% về giá trị so với cùng kỳ (http://www.fistenet.gov.vn/)

Để có sản lượng cao như thế, bên cạnh việc tăng diện tích nuôi trồng người nuôi còn tăng cả mật độ làm xuất hiện nhiều loại bệnh như mủ gan, bệnh đốm

đỏ, bệnh nhiễm huyết và một số bệnh do nấm, ký sinh trùng gây ra.v.v Theo thống kê của Lý Thị Thanh Loan (2008) thì tần suất xuất hiện bệnh năm 2007

ở các tỉnh ĐBSCL gồm đốm trắng trên gan, thận (52,80%), xuất huyết (42,50%), phù mắt (20,70%) và vàng da (21,60%) Như vậy tần số xuất hiện của bệnh đốm trắng nội tạng là cao nhất (Nguyễn Trọng Bình, 2008)

Bệnh này xuất hiện lần đầu tiên trên cá tra nuôi ở ĐBSCL vào cuối năm 1998

(Ferguson và ctv, 2001) và trở nên trầm trọng vào 1999 Bệnh xuất hiện suốt

chu kỳ nuôi, thường vào mùa lũ và cao điểm là vào tháng 7 và 8 Cá bị bệnh

có biểu hiện bơi lờ đờ, tuy nhiên đa số cá bệnh không có những biểu hiện bất thường bên ngoài Ở giai đoạn mới chớm bệnh cá vẫn còn bắt mồi, trong giai đoạn này nếu không áp dụng các phương pháp điều trị và môi trường nuôi quá bẩn bệnh sẽ trở nên trầm trọng và rất khó khăn trong việc điều trị Khi cá nhiễm bệnh, tỷ lệ chết tăng cao 10-90% có thể lên tới 100% tùy thuộc vào cách quản lý và cỡ cá nuôi (Từ Thanh Dung, 2004)

Từ thực tế tình hình dịch bệnh đòi hỏi phải có một phương pháp giúp sớm tìm

ra tác nhân gây bệnh từ đó có hướng xử lý và điều trị kịp thời Hiện nay

phương pháp xác định vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra phổ

biến là phương pháp sinh hóa truyền thống hoặc sử dụng bộ kit API20E Tuy nhiên cả 2 phương pháp này cho kết quả chậm, mất nhiều thời gian nên chưa đáp ứng được nhu cầu chẩn đoán bệnh trong tình hình hiện nay Gần đây Nguyễn Trúc Phương (2009) đã ứng dụng phương pháp PCR để chẩn đoán

nhanh vi khuẩn E.ictaluri, thời gian được rút ngắn ¼ lần so với phương pháp

định danh truyền thống Tuy nhiên phương pháp này vẫn phải trải qua một bước nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường tổng hợp để được chủng vi khuẩn thuần Nếu phương pháp này được thực hiện trực tiếp từ mô cá bệnh thì thời gian chẩn đoán sẽ được rút ngắn hơn nữa (chỉ mất khoảng 1 ngày) Do đó đề

tài “Phát triển phương pháp PCR phát hiện Edwardsiella ictaluri trực

tiếp từ mô cá bệnh” được thực hiện nhằm chuẩn hóa phương pháp PCR phát

hiện E ictaluri nhanh, nhạy làm cơ sở cho việc điều trị có hiệu quả sau này

Mục tiêu

Thực hiện và chuẩn hóa phương pháp PCR phát hiện E ictaluri từ mô cá

bệnh

Nội dung

1 Thực hiện và chuẩn hóa phương pháp ly trích ADN từ mô cá bệnh

2 Tối ưu phương pháp PCR phát hiện E ictaluri

3 Xác định độ nhạy và tính đặc hiệu của phương pháp PCR phát hiện E

ictaluri

PHẦN II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược tình hình nuôi và bệnh trên cá tra ở ĐBSCL

Đồng Bằng Sông Cửu Long gồm 12 tỉnh và 1 thành phố trực thuộc Trung ương với tổng diện tích chiếm 3.960.000 ha chiếm 12% tổng diện tích tự nhiên của cả nước Tiềm năng diện tích mặt nước nuôi trồng thủy sản của vùng được xác định là khoảng 963.700 ha chiếm 57,61% tổng diện tích tiềm năng của cả nước Năm 2002, đã có khoảng 73,9% diện tích tiềm năng này được sử dụng cho nuôi trồng thủy sản (Lê Xuân Sinh, 2005)

Theo báo cáo của ngành Thủy sản năm 2006, cá tra basa đạt sản lượng 800.000 tấn và kim ngạch xuất khẩu đạt 773 triệu USD (tăng 50% so với năm 2005), và đến năm 2007 với sản lượng hơn 1,5 triệu tấn kim ngạch xuất khẩu

cá tra đạt 974 triệu USD, chiếm 26% kim ngạch xuất khẩu toàn ngành thủy sản (kim ngạch xuất khẩu toàn ngành ước đạt 3,75 tỷ USD) (Trần Thanh Hoan

2008, trích dẫn bởi Nguyễn Tấn Duy Phong, 2008)

Theo Nguyễn Phú Son (2007), năm 2002 diện tích nuôi cá tra ao là 2.720 ha, đến năm 2005 tăng lên 3.548 ha, tăng bình quân hằng năm 18,6% trong 3 năm

tố quyết định thắng thua trong một đợt sản xuất (Bùi Quang Tề, 2004)

Ngoài ra, theo Lê Xuân Sinh và Lê Lệ Hiền (2008), trong tổng chi phí nuôi cá tra, thức ăn chiếm khoảng ¾, điều này có tác động lớn tới môi trường nước - một trong những nguyên nhân quan trọng nhất đối với việc bệnh xuất hiện ngày càng nhiều trên cá tra nuôi

Có nhiều loại tác nhân gây bệnh trên cá tra nuôi, tuy nhiên vi khuẩn là một tác nhân gây bệnh quan trọng, là trở lực chủ yếu kìm hãm phát triển và gây hạn chế mở rộng sản xuất trong nuôi trồng thủy sản (Từ Thanh Dung, 2008)

Theo Trần Anh Dũng (2005), khi nghiên cứu khảo sát tác nhân gây bệnh trên

cá tra nuôi thâm canh ở An Giang cho thấy, bệnh trên cá tra nuôi sự xuất hiện

có tính mùa vụ rõ rệt, bệnh do ký sinh trùng hầu như xuất hiện quanh năm nhưng nhiều nhất là vào mùa mưa và mùa lũ rút, mùa khô thường ít hơn mùa

lũ Bệnh do vi khuẩn xuất hiện quanh năm, bệnh mủ gan xuất hiện nhiều vào mùa lũ, bệnh xuất huyết xuất hiện nhiều vào mùa lũ rút Theo đó, tỉ lệ nhiễm các bệnh do vi khuẩn như bệnh đỏ mỏ đỏ kỳ chiếm 68,3%, mủ gan chiếm 61,0%, phù đầu 51,2% và bệnh vàng da chiếm 24,4%

Kết quả điều tra tại An Giang và Cần Thơ cho thấy các loại bệnh phổ biến trong nuôi cá tra thâm canh ở hai địa phương này là bệnh gan thận mủ, bệnh đốm đỏ, bệnh phù đầu, bệnh lở loét, trắng mang – trắng đuôi, lồi mắt-nổ mắt, nấm thủy mi, xuất huyết đường ruột, ký sinh trùng Trong đó bệnh thường gặp

và gây thiệt hại lớn là bệnh gan thận mủ với tỷ lệ chết là 80 – 90% nếu không

có biện pháp điều trị kịp thời (Nguyễn Chính, 2005; Nguyễn Tấn Duy Phong, 2008)

2.2 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 2.2.1 Tình hình bệnh do vi khuẩn E ictaluri trên thế giới và Việt Nam

2.2.1.1 Trên thế giới

Hawke (1979) lần đầu tiên phân lập được vi khuẩn gây bệnh nhiễm trùng máu

trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus), với tên gọi là ESC (Enteric septicaemia

of catfish) Bệnh gây thiệt hại lớn cho ngành công nghiệp nuôi cá nheo

(Hawke và ctv,1998) Bên cạnh xuất hiện ở miền Nam nước Mỹ bệnh còn

được tìm thấy ở Indiana, Idaho, California, Arizona, và New Mexico

Ngoài cá nheo, các loài blue catfish (Ictalurus furcatus), white catfish (Ictalurus melas) cũng nhạy cảm với E ictaluri (Plumb và Sanchez, 1983) và theo ghi nhận của Kasornchandra và ctv (1987) thì vi khuẩn này cũng được tìm thấy trên cá trê trắng (Clarias batrachus) ở Thái Lan

Plumb, 1999 cho biết bệnh do vi khuẩn E ictaluri xảy ra trên cá trơn vào mùa

có nhiệt độ thấp Trên cá nheo, bệnh ESC thường xảy ra vào cuối mùa xuân đến đầu mùa hè và trong suốt mùa thu khi nhiệt độ nước khoảng 18 - 28°C

2.2.1.2 Ở Việt Nam

Bệnh mủ gan được ghi nhận xuất hiện đầu tiên trên cá tra nuôi ở ĐBSCL vào cuối năm 1998 với tên gọi là bệnh BNP (bacillary necrosis of Pangasius)

(Ferguson và ctv 2001) Khi cá nhiễm bệnh, tỷ lệ chết tăng cao từ 10 – 90%

tùy thuộc vào cách quản lý và cỡ cá nuôi Cá bị bệnh trên gan, thận và tỳ tạng

xuất hiện nhiều đốm trắng đường kính 1 – 3mm, bên trong chứa dịch màu

trắng đục nên thường gọi là bệnh mủ gan Qua nghiên cứu E ictaluri chính là

tác nhân gây ra bệnh này (Từ Thanh Dung, 2004)

Theo thống kê của Lý Thị Thanh Loan (2008) thì trong hai năm 2005 và 2006, tại các khu vực nuôi cá tra tập trung như An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ và Vĩnh Long, cá tra thường nhiễm bệnh vào tháng 5 và 7 Thời điểm này, môi trường nước trong ao nuôi rất xấu do ảnh hưởng của lũ đổ về mang nhiều chất thải lẫn mầm bệnh Cá thường bị nhiễm các bệnh vàng da, mủ gan, bệnh xuất huyết, và đốm đỏ Kết quả điều tra 65 hộ nuôi cá tra thì có 100% số hộ ở Đồng Tháp, Vĩnh Long, Cần Thơ và 80% số hộ ở An Giang bị nhiễm bệnh (Thạch Thảo, 2008)

Theo Từ Thanh Dung (2005) bệnh xuất hiện từ cuối 1998 và trở nên trầm trọng vào 1999 Ở ĐBSCL, bệnh thường xuất hiện trong suốt mùa lũ Tuy nhiên bệnh bộc phát cao điểm vào tháng 7 và 8 Bệnh đốm trắng trên gan xuất hiện và gây thiệt hại chủ yếu ở giai đoạn cá giống và cá thịt, ở cả cá nuôi ao và nuôi bè

2.2.2 Đặc điểm sinh hóa của loài vi khuẩn E ictaluri

Vi khuẩn E ictaluri là loài thuộc họ Enterobacteriaceace, vi khuẩn gram âm,

hình que, kích thước thay đổi, di động yếu ở 25-30°C, ở nhiệt độ cao hơn không di động, H2S và indole âm tính, có khả năng lên men O/F Cho phản

ứng catalase dương tính, âm tính trong phản ứng oxydase E ictaluri phát

triển tốt ở 28oC trên môi trường TSA trong 48h tạo thành những khuẩn lạc màu trắng đục kích thước rất nhỏ, không có nhân, rìa có dạng không đồng

nhất (Từ Thanh Dung và ctv, 2004)

Tuy nhiên Plumb (1993) cũng có một số mô tả khác như có dạng hình que và

kích thước biến đổi So với E tarda phát triển tốt ở 37oC trong khi E ictaluri

phát triển tốt ở 28oC, điều này lý giải vì sao vi khuẩn E tarda ngoài gây bệnh

trên cá còn gây bệnh trên nhiều loài động vật máu nóng khác như chim, gia

súc, heo, động vật có vú ở biển E ictaluri cho tới nay chỉ phát hiện trên cá

Dấu hiệu bệnh lý

Theo Lê Thị Bé Năm (2002), cá bị bệnh thường giảm hoặc bỏ ăn, cá nổi trên mặt nước, bơi lội chậm chạp, không phản ứng hoặc phản ứng rất chậm với tiếng động, màu sắc nhợt nhạt Một số cá bụng sưng và có những điểm xuất huyết trên đuôi, hậu môn, các tia vi Bên trong cá bụng trương to, có những đốm trắng đường kính 1-3mm dưới bề mặt lớp biểu bì và khắp vùng gan, thận

và tỳ tạng Ngô Minh Dung (2007) cũng có những mô tả tương tự khi thí

nghiệm gây cảm nhiễm E ictaluri trên cá tra Tuy nhiên đa số cá không có

biểu hiện bất thường bên ngoài (Từ Thanh Dung, 2004)

2.2.3 Độc lực và một số thí nghiệm gây cảm nhiễm

Theo Wolter và Johnson (1994) khi gây cảm nhiễm trên cá nheo Mỹ (từ

15-20cm) với mật độ vi khuẩn E ictaluri 1,2 x 106tb/0,1ml ở 250C, tốc độ nước chảy 1lít/phút, cho ăn 3% trọng lượng thân/ ngày Tỉ lệ cá chết dao động từ 38

– 95.3% Trong thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri của Phan Thị Mỹ

Hạnh (2004), với mật độ vi khuẩn tương đương 1,5x106 tb/ml nhưng tỉ lệ chết trên cá tra cao hơn so với cá nheo Mỹ ở cùng thời gian thí nghiệm 7 ngày

Lương Trần Thục Đoan (2006) tiến hành gây cảm nhiễm E ictaluri trên cá tra

bằng hai phương pháp ngâm và tiêm với các mật độ vi khuẩn khác nhau, thời gian theo dõi trong 10 ngày Kết quả cho thấy ở phương pháp ngâm cá bắt đầu chết vào ngày thứ 3, tỷ lệ chết 75% với mật độ vi khuẩn là 1x 107 CFU/ml Với phương pháp tiêm, thời gian xuất hiện cá chết là ngày thứ 2, tỷ lệ chết 100% trong 6 ngày với mật độ vi khuẩn 1x106 CFU/ml

Với thí nghiệm gây cảm nhiễm của Huỳnh Chí Thanh (2007), kết quả cho thấy

cá biểu hiện bệnh lý sớm nhất ở mật độ vi khuẩn 1,02x108 CFU/ml với tỷ lệ 91,66% Với các mật độ 1,02x107 CFU/ml, 1,02x106 CFU/ml, 1,02x105CFU/ml có tỷ lệ chết tương ứng là 66,66%, 33,33 % và 25% Qua đó xác định được LD50 là 3,16x106 CFU/ml

Theo nghiên cứu của Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II kết hợp với công ty thuốc Thú Y TW (Navetco) (2008) sau khi phân lập và định danh vi khuẩn cho thấy 97% mẫu cá bệnh đều có dấu hiệu điển hình của bệnh đốm

trắng với sự hiện diện của vi khuẩn E ictaluri Tiến hành thí nghiệm cảm nhiễm ngược, vi khuẩn gây bệnh thực nghiệm là vi khuẩn E ictaluri được phân lập từ các mẫu cá bệnh Kết quả nghiên cứu đã xác định, vi khuẩn E

ictaluri là tác nhân gây bệnh đốm trắng trên gan, thận và lách cá tra Kết quả

thí nghiệm cũng xác định được liều gây chết 50% cá thí nghiệm (LD50) là 2,5

x 104 tế bào/0,2 ml/ cá có trọng lượng trung bình khoảng 30 gram (Nguyễn Thị Hiền, 2008)

2.3 Chiết tách acid nucleic

Mỗi thí nghiệm thao tác gen đều đòi hỏi phải có nguồn acid nucleic đủ lớn và

đủ tinh sạch Mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết acid nucleic

là thu nhận được các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học (phân tử bị gãy do nghiền, lắc mạnh) hay hóa học (phân tử bị thủy giải bởi các enzym nội bào giải phóng ra môi trường khi tế

bào bị phá vỡ) Các acid nucleic cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzym nội bào (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998)

Theo Hồ Huỳnh Thùy Dương (1998), phương pháp tách chiết cơ bản gồm có

Bước 3: Tủa acid nucleic Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận acid nucleic ở dạng cô đặc, một mặt nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzym, mặt khác để có thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn Có hai cách tủa thông dụng:

- Tủa trong ethanol (ethylic alcohol), việc tủa này được thực hiện trong môi trường có nồng độ muối cao và nồng độ ethanol cao (2,5 dung tích ethanol/1 dung tích mẫu), nhiệt độ thấp tạo thuận lợi cho việc tủa Hầu như toàn bộ acid nucleic đều tủa trong các điều kiện nêu trên

- Tủa trong isopropanol, điểm khác biệt so với phương pháp trên là không cần sự hiện diện của muối , thể tích isopropanol/thể tích mẫu là 1/1 Các DNA có trọng lượng phân tử thấp không bị tủa, do đó có thể loại chúng ra khi dùng cách tủa trong isopropanol

Trong cả hai phương pháp, acid nucleic sẽ được thu nhận lại bằng cách ly tâm Sau đó cặn tủa phải được rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc các dấu vết của isopropanol còn dính lại trên mẫu

2.4 Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR)

Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp được phát minh từ năm 1985 và được thừa nhận chính thức từ năm 1993 qua giải thưởng Nobel cho Kary Mullis - người phát minh ra nó, PCR hiện đang được ứng dụng rộng khắp tại Việt Nam

Nguyên tắc (Đặng Thị Hoàng Oanh 2007)

Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn,

và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới Nếu hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA thì chỉ đoạn DNA nằm giữa hai mồi được tổng hợp Hai mồi này gồm một mồi xuôi và một mồi ngược so với chiều phiên mã của gen

Phản ứng PCR là một chuỗi phản ứng gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn sau:

Giai đoạn biến tính: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần

cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của chúng, thường là 94-95oC trong vòng 30 giây đến 1 phút

Giai đoạn lai: nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của các mồi cho phép mồi bắt

cặp với khuôn Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng

40-70oC, tùy thuộc vào Tm của các mồi sử dụng mà thời gian bắt cặp khác nhau

và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút

Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ được tăng lên 72oC, đó là điều kiện tốt nhất để cho Taq polymerase hoạt động tổng hợp kéo dài mạch theo nguyên tắc bổ sung từ hai đầu sợi khuôn ban đầu giúp cho DNA polymerase hoạt động Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút

Sau một chu kỳ gồm ba giai đoạn như trên, một phân tử ADN khuôn được nhân lên thành hai, các đoạn ADN vừa được nhân trong chu kỳ lại làm khuôn cho chu kỳ nhân bản tiếp theo Do đó sau mỗi chu kỳ số lượng ADN được tổng hợp sẽ tăng lên gấp đôi và như vậy sau n chu kỳ nhân bản sẽ tạo ra 2n bản ADN từ một khuôn ban đầu

Đối chứng

Một xét nghiệm PCR tiêu chuẩn cần có những đối chứng sau:

- Không có DNA/RNA: phản ứng PCR không có mạch khuôn DNA để kiểm soát trường hợp trường hợp bị tạp nhiễm

- DNA/mRNA của vật chủ: để chắc chắn acid nucleic mẫu cũng được khuếch đại và mồi không đặc hiệu với hệ gen của vật chủ

Các nhân tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR

Theo Trần Thị Xô và Nguyễn Thị Lan (2005), phản ứng PCR có các nhân tố ảnh hưởng sau:

- ADN mẫu: Phản ứng PCR tối ưu xảy ra khi mẫu ADN không được dài quá, thường khuếch đại tốt nhất đối với đoạn ADN dài khoảng 1 – 1.5kb Mẫu ADN tinh sạch sẽ cho kết quả tốt , tuy nhiên kỹ thuật chẩn đoán bằng phương pháp này vẫn đạt kết quả tốt trong trường hợp mẫu ADN không cần có độ tinh sạch cao

- Enzyme ADN-polymerase: Chất lượng của phương pháp phụ thuộc vào khả năng chịu nhiệt của enzyme polymerase do phản ứng luôn phải thực hiện ở nhiệt độ khác nhau Enzyme thường được dùng là Taq-

polymerase có nguồn gốc vi khuẩn (Thermus aquaticus) tách từ suối

nước nóng nên chịu được nhiệt độ cao Nhược điểm của enzyme này là không tổng hợp được trình tự ADN dài quá 3kb, hơn nữa enzyme này không có khả năng sửa sai trong quá trình sao chép

- Mồi và nhiệt độ nóng chảy của mồi: Mồi là một chỉ tiêu quan trọng để đạt được sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao Chọn mồi phải tuân theo nguyên tắc sau đây:

• Trình tự của mồi được chọn không có sự bắt cặp giữa mồi xuôi và mồi ngược, và cũng không tạo những cấu trúc kẹp tóc

• Mồi phải chọn đặc trưng cho ADN cần khuếch đại và không trùng với các trình tự lặp lại trên gen

• Trình tự nằm giữa mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn (1kb)

• Độ dài mồi cần chọn khoảng 18 đến 30 nucleotide, nếu mồi nhỏ hơn 10 nucleotide, mồi bám không đặc hiệu Còn mồi dài hơn 30 nucleotide sẽ ảnh hưởng đến cơ chế tổng hợp

• Tm mồi xuôi và mồi ngược không cách nhau quá xa, thông thường trong khoảng từ 4-50C, và nhiệt độ nóng chảy của mồi khoảng

720C

- Ảnh hưởng của các nucleotide: Cần phải có bốn loại nucleotide dạng triphosphat như: dATP, dTTP, dGTP, dCTP Nồng độ mỗi loại nucleotide phải ở dạng cân bằng, ứng với khoảng 20 - 200µM cho mỗi loại nucleotide Nếu mất trạng thái cân bằng sẽ gây ra lỗi khi sao chép, nếu nồng độ các nucleotide cao hay thấp hơn sẽ dẫn đến hiện tượng sao chép giả

- Môi trường phản ứng

• Ion Mg2+ là thành phần không thể thiếu được của phản ứng PCR, nồng độ Mg2+ tối ưu để thực hiện PCR từ 150-200µM Nồng độ chuẩn cho từng khoản tương ứng, phải được xác định trong điều kiện thí nghiệm nhất định

• Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải là nước tinh khiết, không chứa bất kỳ ion lạ nào Không được chứa các enzyme cắt hạn chế và các enzyme phân hủy acid nucleic

• Môi trường dung dịch đệm phải ổn định

- Thời gian và số lượng chu kỳ: Tổng thời gian cho mỗi bước của một chu kỳ và của chu kỳ đầu với các chu kỳ tiếp theo là khác nhau Ngoài

ra thời gian cho mỗi phản ứng còn phụ thuộc vào độ dài đoạn ADN cần nhân dòng Số lượng chu kỳ cho một phản ứng PCR thông thường trong khoảng từ 30 đến 40 chu kỳ

- Thiết bị và dụng cụ: Thiết bị cần đáp ứng yêu cầu thay đổi được nhiệt

độ nhanh và chính xác Tránh tối đa sự bốc hơi nước trong quá trình phản ứng Tuy nhiên, với mỗi phản ứng cụ thể có các thiết bị và dụng

cụ khuếch đại riêng

Ứng dụng của phương pháp PCR

Ở các lĩnh vực khác kể cả thủy sản, PCR là một công cụ hữu hiệu trong việc phát hiện mầm bệnh vi khuẩn, virus, ký sinh trùng và nấm Một số mầm bệnh thủy sản quan trọng ở tôm nuôi hiện nay được chẩn đoán bằng PCR gồm: virus đốm trắng (WSSV), virus đầu vàng (YHV), virus gây hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV), virus gây hội chứng Taura (TSV) (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007)

Theo Lê Đình Lương (2004) kỹ thuật PCR có nhiều ứng dụng rộng rãi trong khoa học công nghệ và trong đời sống xã hội

- Trong nghiên cứu khoa học kỹ thuật PCR giúp phát hiện đột biến, cho phép phân tích liên kết gen từ những tế bào riêng lẻ, giúp nghiên cứu quá trình tiến hóa ở mức phân tử Thậm chí giúp phục hồi những gen

đã tồn tại cách đây hàng chục triệu năm

- Trong chọn giống vật nuôi và cây trồng, kỹ thuật PCR cho phép lựa chọn cặp cha mẹ làm giống chỉ trong vài ngày, thậm chí vài giờ

- Trong y học PCR có thể chẩn đoán chính xác các bệnh truyền nhiễm do virus, vi khuẩn, HIV-AIDS…

Các hạn chế của phương pháp PCR

Theo Đặng Thị Hoàng Oanh (2007), phương pháp PCR có các hạn chế sau:

- Phương pháp PCR thông thường không hoạt động được với những đoạn DNA lớn hơn 3kb

- Sự ngoại nhiễm do sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước

- Các sai sót gây ra do taq polymerase (khoảng 10.000 nucleotic thì enzym gắn sai 1 nucleotic)

Một số nghiên cứu về PCR

Yang và ctv (2006) đã phát triển phương pháp m-PCR phát hiện đồng thời hai

loại virus IHHNV và WSSV trên tôm he Với đoạn mồi I 2814, I 3516 và W1, W2 lần lượt cho hai loại bệnh trên với trọng lượng phân tử của sản phẩm PCR lần lượt là 703 và 824bp (trích dẫn bởi Nguyễn Trúc Phương, 2008)

Trần Thị Mỹ Duyên (2006) đã ứng dụng và tối ưu hóa qui trình genotyping với các thay đổi về thành phần hóa chất tham gia phản ứng, chu kỳ nhiệt của phản ứng thu được qui trình tối ưu phát hiện tác nhân gây bệnh đốm trắng trên tôm sú

PCR-Lê Hữu Thôi (2008) thực hiện qui trình mRT-PCR phát hiện đồng thời YHV, GAV và β-actin YHV và GAV là hai bệnh do virus trên tôm sú gây thiệt hại nặng đến nghề nuôi tôm của nước ta Phương pháp giúp phát hiện đồng thời hai loại bệnh này trên tôm đồng thời kiểm soát chất lượng ARN của tôm trong qui trình thông qua gen nội sinh β-actin Kết quả sản phẩm PCR cho hai vạch

750 bp (YHV) và 216 bp (β-actin) ở bước 1 và 317 bp (GAV) ở bước 2 Trần Nguyễn Diễm Tú (2008) thực hiện qui trình phát hiện WSSV, HPV và β-actin trên tôm sú Cũng như YHV và GAV, WSSV và HPV là hai bệnh gây thiệt hại nặng nề đến nghề nuôi tôm sú của nước ta Kết quả sản phẩm PCR cho hiện vạch ở vị trí 1441 bp (WSSV) và 216 bp (β-actin) ở bước 1 và 941

bp (WSSV), 441 bp (HPV), 216 bp (β-actin) ở bước 2

Victor và ctv (2007) phát triển phương pháp m-PCR phát hiện cùng lúc ba loài

vi khuẩn gây bệnh trên cá : Flavobacterium Columnare (504bp), E Ictaluri (407bp), Aeromonas Hydrophyla (209bp)

Gần đây nhất, Nguyễn Trúc Phương (2008) đã định danh E ictaluri bằng

phương pháp truyền thống và bằng bộ kit API20E, sau đó tiến hành kiểm tra lại bằng phương pháp PCR Kết quả cho thấy 5 trong 7 chủng đã được định

danh là E ictaluri với trọng lượng phân tử của sản phẩm PCR là 407bp

Nguyễn Văn Hòa (2008), dùng qui trình chiết tách acid nucleic theo phương

pháp Phenol-Chloroform (Taggart et al, 1992) ly trích ADN từ cơ thịt cá lóc,

sản phẩm thu được sau khi điện di trên agarose 1% cho sản phẩm có kích thước phân tử lớn hơn 1kb Dùng ADN ly trích được thực hiện phản ứng PCR, sản phẩm thu được có kích thước khoảng 300-400 bp

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm

3.2.1.1 Dụng cụ phân tích mẫu vi khuẩn

- Que cấy, đèn cồn, hộp quẹt

- Ống nghiệm, đĩa petri thủy tinh

- Bàn đọc UV và máy chụp hình gel

- Lò viba

- Tủ hút, tủ lạnh

3.2.2 Hóa chất 3.2.2.1 Hóa chất dùng phân tích mẫu vi khuẩn

- Cồn tuyệt đối, NaCl, H2O2

- Vaselin, nước cất

- Hóa chất nhuộm gram

- Amyl alcohol, ethanol, axit sulphanilic, axit acetic

- Dầu paraffin

- Glucose

- Oxidase thương mại

Môi trường

- Môi trường thạch: Tryptic soy agar (TSA), Nutrient agar (NA)

- Môi trường lỏng: Nutrient broth (NB)

- TE buffer (10mM Tris, 1mM EDTA, pH=7)

- Buffer 10X, MgCl2, dNTPs (10mM), Taq polymerase (5u), mồi

- Bể Composite được vệ sinh kỹ bằng xà phòng và chlorine 200ppm, phơi khô

- Cấp nước vào bể, có sục khí liên tục vài ngày để loại hết chlorine

- Đối với bể lớn 2m3 để trữ cá thì cấp nước khoảng 2/3 bể, có sục khí trước 1-2 ngày khi thí nghiệm Bể được đặt ngoài trời nơi có mái che (tránh mưa)

- Đối với bể thí nghiệm 100L thì cấp khoảng 60L nước, sục khí Bể được đặt trong phòng kín nhiệt độ phòng 26-280

C

- Nước sử dụng là nguồn nước máy

- Các dụng cụ thí nghiệm như: xô, vợt, ống sục khí, đá bọt…cũng được

3.3.1.3 Vi khuẩn để gây cảm nhiễm

Sử dụng nguồn vi khuẩn trữ trong tủ -800C của bộ môn sinh học và bệnh học thủy sản, khoa thủy sản, trường Đại Học Cần Thơ

Phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn

Vi khuẩn được phục hồi trên môi trường NA/TSA ở 280C Sau 24-48 giờ quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, nhuộm gram kiểm tra tính thuần của vi khuẩn

Chuẩn bị vi khuẩn thí nghiệm

Nuôi tăng sinh vi khuẩn: sau khi có được đĩa vi khuẩn thuần, dùng que cấy tiệt trùng lấy khoảng 2 đến 3 khuẩn lạc cho vào chai chứa khoảng 30ml NB đã tiệt trùng, đặt lên máy lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ

Sau 24 giờ chuyển vi khuẩn sang ống falcol 50ml tiệt trùng, đem ly tâm 4000 vòng/phút ở 40C trong 15 phút Sau khi ly tâm loại bỏ dung dịch phía trên và dùng nước muối sinh lý tiệt trùng để rửa vi khuẩn (lặp lại 2-3 lần)

Lần ly tâm cuối, loại bỏ phần dung dịch phía trên và cho vào khoảng 25ml dung dịch nước muối sinh lý tiệt trùng, sau đó trộn đều mẫu bằng máy vortex Tiến hành xác định mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ với bước sóng 590nm và điều chỉnh OD tương ướng để xác định mật độ vi khuẩn

OD=0.1±0.02 tương ướng mật độ vi khuẩn là 108 cfu/ml

3.3.1.4 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 6 nghiệm thức và nghiệm thức đối chứng không tiêm và tiêm nước muối sinh lý, mỗi nghiệm thức lặp lại

3 lần với mật độ 10 con/bể

Ø Nghiệm thức không tiêm

Ø Nghiệm thức đối chứng: Tiêm nước muối sinh lý

Ø Nghiệm thức 1: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 102

Cá mua về được thuần hóa 1 tuần thì tiến hành tiêm vi khuẩn cho cá ở các mật

độ vi khuẩn và tiêm ở gốc vi ngực của cá

Cá được kiểm tra kí sinh trùng và vi sinh trước khi tiến hành thí nghiệm Tiêm 0,1ml cho mỗi con và không cho ăn trong suốt quá trình thí nghiệm Thời gian theo dõi sau khi gây cảm nhiễm là 12 ngày

3.3.2 Phương pháp phân tích mẫu vi khuẩn

Trước khi giải phẫu đặt cá lên khay sạch Quan sát cá bằng mắt thường, ghi nhận tất cả các biểu hiện bên ngoài: vết thương, điểm xuất huyết, mùi và các triệu chứng của bệnh Phân lập vi khuẩn từ gan, thận, tỳ tạng Khi giải phẩu để tránh các tạp khuẩn từ bên ngoài, cần áp dụng các nguyên tắc vô trùng trong quá trình phân lập vi khuẩn Dụng cụ lấy mẫu được đốt trên đèn cồn và để nguội trước khi lấy mẫu ở các cơ quan Dùng cồn 70% sát trùng mặt ngoài của

cá và dùng giấy lau sạch các chất nhầy trên cơ thể cá để diệt các tạp khuẩn ký sinh ở phần da cá

Phương pháp xác định đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn

Quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc

Quan sát khuẩn lạc trên môi trường thạch TSA và ghi nhận các đặc điểm: hình dạng khuẩn lạc, kích cỡ, màu sắc

Nhuộm Gram

Nhuộm Gram để quan sát hình dạng, kích thước, xác định vi khuẩn thuần và là Gram âm hay Gram dương

Các bước thực hiện

- Sử dụng lame sạch, cho một ít nước muối sinh lý lên lame

- Dùng que cấy tiệt trùng nhặt một ít vi khuẩn cho lên giọt nước muối sinh lý trên lame và trải đều

- Để lame khô tự nhiên

- Hơ lame qua đèn cồn để cố định vi khuẩn, để nguội và tiến hành nhuộm

- Nhuộm crystal violet (dd1) khoảng 1 phút sau đó rửa lame bằng nước

- Nhuộm iodine (dd2) trong 1 phút, rửa lame bằng nước Sau đó rửa bằng dung dịch alcohol/acetone (dd3) từ 2-3 giây