nghiên cứu sự phát triển cơ quan lympho của cá tra pangasianodon hypophthalmus từ 1 đến 30 ngày tuổi

Mãi đến năm 2001, Lora et al ., đã nghiên cứu sự hình thành cơ quan lymphoid của cá nheo Mỹ cho thấy các tế bào có chức năng miễn dịch ở cơ quan tạo máu thuộc thận và thymus xuất hiện lú

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

ĐẶNG THANH PHONG

NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT TRIỂN CƠ QUAN LYMPHO

CỦA CÁ TRA Pangasianodon hypophthalmus

TỪ 1 ĐẾN 30 NGÀY TUỔI

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2009

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

ĐẶNG THANH PHONG

NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT TRIỂN CƠ QUAN LYMPHO

CỦA CÁ TRA Pangasianodon hypophthalmus

i

LỜI CẢM TẠ

Tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Từ Thanh Dung đã nhiệt tình giúp đỡ, hướng dẫn và đóng góp nhiều kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian thực hiện đề tài này

Xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô khoa Thủy Sản trường Đại Học Cần Thơ đã tạo môi trường tốt trong học tập, trao dồi đạo đức, truyền đạt kiến thức và nhiều kinh nghiệm thực tế trong suốt quá trình rèn luyện ở nhà trường

Tác giả xin chân thành cảm ơn gia đình Bác 2 Nắm (Hồng Mỹ) – Thị Trấn Hồng Ngự, tỉnh Đồng Tháp đã giúp đỡ tôi chỗ ăn, ở, phương tiện và điều kiện nghiên cứu thuận tiện trong suốt thời gian thu mẫu ở địa phương thuộc thị trấn Hồng Ngự Xin gởi lời cảm tạ đến anh Huỳnh Chí Thanh khuyến ngư huyện Hồng Ngự, tất cả các bạn lớp Bệnh học thủy sản K.31 và cùng các anh em P2C12, ký túc xá trường Đại Học Cần Thơ đã quan tâm, giúp đỡ và ủng hộ tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài

ii

TÓM TẮT

Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là đối tượng nuôi quan trọng ở Đồng Bằng

Sông Cửu Long (ĐBSCL) Tuy nhiên các thông tin khoa học về hệ miễn dịch chưa

có tác giả nào công bố để làm cơ sở cho việc phòng bệnh cho cá Việc nghiên cứu đề tài này nhằm mục tiêu là tìm hiểu sự phát triển cơ quan lympho của cá tra

Pangasianodon hypophthalmus từ 1 đến 30 ngày tuổi sau khi nở Thu mẫu cá từ 1

đến 30 ngày tuổi trực tiếp ở ao ương, mỗi ngày tuổi thu từ 6 – 30 con cá Bên cạnh

đó, cũng theo dõi quá trình hoạt động của cá, các chế độ quản lý và chăm sóc ao, hàng tuần kiểm tra các yếu tố môi trường và nhiệt độ đo mỗi ngày Nghiên cứu này

đã sử dụng phương pháp mô học (Haematoxylin & Eosin) trên cơ quan lympho thận,tuyến ức và tỳ tạng Kết quả nghiên cứu được tìm thấy thận xuất hiện đầu tiên ở

cá 6 ngày tuổi sau khi nở; tuyến ức được quan sát ở cá 9 ngày tuổi và cuối cùng là tỳ tạng được tìm thấy ở cá 21 ngày tuổi Trong suốt thời gian ương nuôi thì các yếu tố môi trường đều nằm trong khoảng cho phép và thích hợp cá phát triển Kết quả này góp phần làm cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu hệ thống miễn dịch trên cá tra nhằm tìm ra giải pháp phòng các bệnh truyền nhiễm một cách tích cực và có hiệu quả hơn

iii

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ i

TÓM TẮT ii

MỤC LỤC iii

DANH SÁCH HÌNH iv

Chương I: GIỚI THIỆU 1

Mục tiêu nghiên cứu 2

Nội dung nghiên cứu 2

Chương II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược đặc điểm về cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) 3

2.2 Lịch sử tiến hóa của các cơ quan lymphoid 3

2.3 Sự tiến hoá và phát triển của tế bào lympho 4

2.4 Các cơ quan lymphoid 5

2.4.1 Tỳ tạng (spleen) 5

2.4.2 Cơ quan thymus (tuyến ức) 6

2.4.3 Thận (kidney) 7

2.5 Sự hình thành cơ quan lymphoid 7

2.6 Một số thành tựu về phương pháp mô học 10

Chương III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 13

3.2 Vật liệu nghiên cứu 13

3.2.1 Dụng cụ 13

3.2.2 Hoá chất 13

3.3 Phương pháp nghiên cứu 13

3.3.1 Đối tượng nghiên cứu 13

3.3.2 Phương pháp cắt mẫu 13

3.3.3 Phương pháp cố định mẫu 14

3.3.4 Phương pháp làm tiêu bản mô 14

3.4 Đọc kết quả 17

Chương IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18

4.1 Thông tin chung về hộ nuôi 18

4.2 Các chỉ tiêu môi trường trong ao ương 19

4.3 Sự phát triển của các cơ quan Lympho 20

iv

4.3.1 Thận 20

4.3.2 Tuyến ức (thymus) 24

4.3.3 Tỳ tạng 26

Chương V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 28

5.1 Kết luận 28

5.2 Đề xuất 28

TÀI LIỆU THAM KHẢO 29

PHỤ LỤC I 32

PHỤ LỤC II 33

PHỤ LỤC III 34

v

DANH SÁCH HÌNH

Hình 3.1 Khối paraffin trước khi cắt 16

Hình 3.2 Vị trí của tuyến ức 18

Hình 4.1 Công tác cải tạo ao và các giai đoạn của cá hương 19

Hình 4.2 Thận của cá tra qua các giai đoạn 22

Hình 4.3 Cấu trúc của thận qua các giai đoạn của cá 23

Hình 4.4 Tuyến ức cá của tra qua các giai đoạn 25

Hình 4.5 Cấu trúc tỳ tạng cá 21 ngày tuổi 28

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU

Ngành nuôi trồng thuỷ sản (NTTS) Việt Nam (VN) nói chung và Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) nói riêng đã và đang phát triển mạnh mẽ Trong đó,

đối tượng nuôi nước ngọt được nuôi nhiều nhất là cá tra (Pangasianodon hypophthalmus), không chỉ cung cấp thực phẩm trong nước mà còn là mặt

hàng xuất khẩu ra nhiều nước trên thế giới Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (NN&PTNT), năm 2008 lượng cá tra xuất khẩu của VN đạt 657.000 tấn, đạt kim ngạch 1,48 tỉ USD, chiếm đến 32,1% tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản của cả nước Cá tra, ba sa là điểm sáng của bức tranh xuất khẩu thủy sản Việt Nam (htt://antg.cand.com.vn) Nhưng trong quá trình mở rộng diện tích nuôi do thiếu sự quy hoạch và không đồng bộ đã kéo theo nhiều vấn đề xảy ra đặc biệt là tình hình dịch bệnh Ở cá nuôi, nhiều loại bệnh truyền nhiễm xuất hiện và gây thiệt hại nghiêm trọng cho nghề nuôi cá tra Điển hình,

bệnh mủ gan do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra đã làm thiệt hại lớn cho

người nuôi ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, tỷ lệ cá chết khi bị bệnh này

có thể lên đến 90% (http://www.anova.com.vn) Theo nghiên cứu của

Ferguson et al., 2001 và Dung et al., 2004 cho rằng đây là loài vi khuẩn đặc

thù gây bệnh chủ yếu trên cá da trơn nuôi công nghiệp, còn theo Mitchell

(1997) xác định E ictaluri là tác nhân gây bệnh nhiễm trùng máu (Enteric septicaemia of catfish: ESC) ở cá nheo mỹ (Ictalurus punctatus), gây hao hụt

trên 60% và hằng năm thiệt hại trên 50 triệu USD

Việc dùng kháng sinh trị bệnh mang lại hiệu quả khi dùng thuốc đúng liều và chẩn đoán đúng tác nhân gây bệnh, nhưng trong thực tế do người nuôi sử dụng bừa bãi, không đúng liều lượng cũng như loại kháng sinh nên gây ra hiện trạng kháng thuốc và tình hình dịch bệnh trở nên trầm trọng hơn (Dung và ctv, 2008) Do đó, việc phòng bệnh như quản lý tốt môi trường nuôi, giống tốt, chế

độ dinh dưỡng hợp lý…, và đặc biệt hơn là việc nghiên cứu hệ miễn dịch Đây cũng là biện pháp phòng bệnh hữu hiệu nhất Việc nghiên cứu có hiệu quả hay không phụ thuộc vào sự sản xuất các tế bào tham gia đáp ứng miễn dịch và độ tuổi của cá Ở cá xương, các tế bào lympho (tế bào B, T) tạo ra các kháng thể (IgM, IgH,…) tham gia vào hệ thống đáp ứng miễn dịch được sản xuất ra từ

những cơ quan lympho như thymus, tỳ tạng, thận trước (Nadia et al., 2002; Magnadottir et al , 2005) Theo Merete et al., 1998, cho rằng các cơ quan

lympho ở cá phát triển hoàn chỉnh sau khi cá hoàn thành quá trình biến thái Các cơ quan lymphoid như thận trước, thymus và tỳ tạng phát triển trong suốt

ở giai đoạn ấu trùng (Padros et al., 1996) và sự hình thành cơ quan lympho của các loài cá nước ngọt sớm hơn so với các loài cá nước mặn (Doggett et al., 1987; Chantanachookhin et al., 1991) Mãi đến năm 2001, Lora et al , đã

nghiên cứu sự hình thành cơ quan lymphoid của cá nheo Mỹ cho thấy các tế bào có chức năng miễn dịch ở cơ quan tạo máu thuộc thận và thymus xuất

hiện lúc nở, còn tỳ tạng là 3 ngày sau khi nở Gần đây, Sonal et al., 2008 nghiên cứu sự hình thành cơ quan lympho ở cá bơn Đại Dương (Hippoglossus hippoglossus L.) cũng cho kết quả là thận xuất hiện ở cá 1 ngày tuổi, nhưng cơ

quan thymus là 33 ngày tuổi và tỳ tạng là 49 ngày tuổi Cho đến nay, vẫn chưa

có tác giả nào công bố những nghiên cứu về sự phát triển cơ quan lymphoid ở

cá tra Vì thế, đề tài “Nghiên cứu sự phát triển cơ quan lymphoid ở giai

đoạn giống của cá tra Pangasianodon hypophthalmus” được thực hiện

nhằm mục tiêu:

Tìm hiểu sự phát triển cơ quan lympho của cá tra từ 1 đến 30 ngày tuổi từ

đó làm cơ sở khoa học để nghiên cứu sự hình thành hệ miễn dịch góp phần

vào việc sử dụng hệ miễn dịch có hiệu quả hơn trong phòng bệnh cho cá Nội dung nghiên cứu

- Theo dõi, thu mẫu và ghi nhận sự phát triển và thay đổi về hình thái của

cá tra từ 1 đến 30 ngày tuổi ở Thị Trấn Hồng Ngự, tỉnh Đồng Tháp

- Xác định sự phát triển cơ quan lympho của cá tra bằng phương pháp nhuộm mô học (Haematoxylin & Eosin)

CHƯƠNG II

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược đặc điểm về cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)

Cá tra phân bố nhiều ở lưu vực sông Mê Kông ở cả 4 nước Lào, Campuchia, Việt Nam và Thái Lan Ở nước ta những năm trước đây khi chưa có cá sinh sản nhân tạo, cá bột được vớt trên sông Tiền và sông Hậu Khảo sát chu kỳ di

cư của cá tra ở địa phận Campuchia cho thấy cá ngược dòng từ tháng 10 đến tháng 5 và di cư vào hạ lưu tháng 5 đến tháng 9 hàng năm (Phạm Văn Khánh, 2006) Cá tra sống chủ yếu trong nước ngọt, có thể sống được ở vùng nước nhạt lợ (nồng độ muối từ 0,7 đến 1%), có thể chịu đựng được nước phèn có

pH >5, dễ chết ở nhiệt độ 150C nhưng chịu nóng tới 390C (Phạm Văn Khánh, 1996)

Cá tra khi hết noãn hoàng thích ăn mồi tươi sống, chúng có thể ăn lẫn nhau

Dạ dày to và ngắn là đặc điểm của cá có tập tính ăn tạp nhưng thiêng về động vật Khi cá lớn, trong điều kiện thiếu thức ăn cá bắt buộc ăn thức ăn khác như mùn bã hữu cơ, thức ăn có nguồn gốc động vật Cá tra có tốc độ tăng trưởng tương đối nhanh, cá còn nhỏ tăng nhanh về chiều dài Cá ương trong ao sau 2 tháng đã đạt chiều dài từ 10-12 cm (trọng lượng 14-15 g) Cá khi lớn đạt cỡ 2,5 kg trở lên, mức tăng trọng lượng nhanh hơn so với chiều dài cơ thể Cá tra trong tự nhiên có thể sống trên 20 năm (trích dẫn từ Trần Thanh Xuân, 1994)

2.2 Lịch sử tiến hóa của cơ quan lymphoid

Vài ngàn năm trở về trước đây cơ quan lymphoid đã được các nhà giải phẩu học khám phá Bước ngoặc khám phá đầu tiên là tỳ tạng tìm thấy trong Edwin Smith Papyrus, từ khoa y ở nước Ai Cập; thymus được mô tả đầu tiên bởi the Italian Jacopo Berengario da Carpi vào thế kỷ 15; và hệ bạch huyết được phát hiện bởi Dane Thomas Bartholin và the Swede Olaus Rudbeck vào thế kỷ 17 Nhưng giải thích chức năng của các cơ quan lymphoid trong hệ thống miễn dịch chỉ mới nghiên cứu gần đây và thymus được công nhận là cơ quan quan trọng trong hệ miễn dịch cho đến nay (trích dẫn từ George Iwama, 1996)

Ở lớp chim, tế bào B được sinh ra ở cơ quan lymphoid sơ cấp là túi Fabricius (là nơi tạo ra các tế bào biểu mô của ruột sau); sự hình thành tế bào B cũng có liên quan đến tổ chức lymphoid sơ cấp ở ruột của động vật có vú và đặc biệt là

ở nhóm động vật nhai lại (như cừu, thỏ và bò) Ngược lại, những cơ quan thứ cấp (và tam cấp) hoặc những cơ quan lymphoid ngoại biên như hạch lympho,

cơ bản là không cần thiết trong miễn dịch Trong khi đó, ở nhóm cá xương nói chung cơ quan lymphoid sơ cấp gồm có tuỷ xương và thymus (tuyến ức), cơ quan lymphoid thứ cấp gồm có tỳ tạng và một tổ chức lymphoid có liên quan đến ruột và hệ thống màng nhầy Bên cạnh đó thì ở động vật hữu nhũ, cơ quan thymus là nơi tế bào T phát triển, trong khi đó tế bào B được sinh ra ở tuỷ xương Những cơ quan Lymphoid chẳng hạn như thymus, tỳ tạng và những bạch huyết ở đốt mắt là trung tâm cấu thành hệ thống miễn dịch ở động vật hữu nhũ (George Iwama, 1996)

Cơ quan lymphoid nguyên thuỷ (cũng được gọi là cơ quan lymphoid trung tâm), như thymus và tuỷ xương ở hầu hết các động vật hữu nhũ, phụ thuộc vào

sự phát triển và sinh sôi của những tế bào lympho sơ cấp Vì vậy nó giữ 1 chức năng khá quan trọng trong hệ miễn dịch Cơ quan Lymphoid quan trọng trong điều chỉnh của sự phát triển tế bào lympho và những đáp ứng miễn dịch Trong suốt quá trình tiến hóa của động vật có xương sống, những cơ quan lymphoid sơ cấp xuất hiện sớm hơn những cơ quan lymphoid thứ cấp (George Iwama, 1996)

Từ vài điểm tiến hoá trên cho thấy, những cơ quan lymphoid sơ cấp có tầm quan trọng đặc biệt vì nó có liên quan đến việc tạo ra các thụ thể của kháng nguyên thông qua các tế bào lympho

2.3 Sự tiến hoá và phát triển của tế bào lympho

Ở tất cả các động vật có xương sống, các thụ thể kháng nguyên được sản xuất

từ các tế bào lympho Tất cả các tế bào tạo máu, tế bào lympho bắt nguồn từ chính cơ quan tạo máu của tế bào tuỷ xương Ở chuột, tế bào B bắt đầu phát triển trong bào thai sống (xuyên suốt sự phát sinh phôi) hoặc ở tuỷ xương (thời

kỳ sau khi sinh) và thành thục trong tỳ tạng Trái lại, tế bào T chỉ phát triển ở thymus Hầu hết những sinh vật đại diện tổ tiên thuộc động vật có xương sống

có thể nhận biết rõ ràng tế bào T và tế bào B ở cá sụn như cá mập và cá đuối

Ở cá, tế bào B phát triển đầu tiên ở gan, sau đó đến thận và cuối cùng là tỳ tạng Ở cá xương như cá chép và cá ngựa, thận trước là vị trí chiếm lĩnh của tế bào B Ở động vật lưỡng thê và bò sát, tế bào B phát triển đầu tiên ở gan và tỳ tạng, sau đó thì gián đoạn ở gan nhưng ở tỳ tạng vẫn được duy trì và cuối cùng

nó xuất hiện ở tuỷ xương Ở chim, tế bào B phát triển trong túi của Fabricius (là nơi tạo ra các tế bào biểu mô của ruột sau) Và ở động vật hữu nhũ, tế bào

B phát triển chủ yếu ở tuỷ xương Tuy nhiên, ở 1 vài loài động vật hữu nhũ, như thỏ và bò, tổ chức lymphoid ở ruột là nơi quan trọng để tạo ra các tế bào

B nguyên thuỷ Vì vậy, có thể cho rằng tế bào B có thể được sinh ra ở nhiều vị

trí khác nhau của động vật xương sống có hàm Trái ngược lại, tế bào T chỉ

phát triển ở một số vị trí nhất định (Trích dẫn từ Thomas et al., 2007)

2.4 Các cơ quan lymphoid 2.4.1 Tỳ tạng (Spleen)

Tỳ tạng của cá da trơn là một cơ quan lymphoid thuộc vùng ruột được bao quanh bằng màng treo ruột Nó có màu đỏ thẩm, hình thoi dài hoặc hình trứng

có bề mặt phẳng Nó được bao bọc bởi 1 lớp biểu bì và lớp mô liên kết Nhiều

tế bào nằm ở dưới mô liên kết Thành phần chính của tỳ tạng gồm dạng thể bầu dục, phần tủy trắng, phần tủy đỏ và trung tâm đại thực bào Thận của cá chưa trưởng thành không có phần cơ mở rộng đến nhu mô như ở trường hợp của cá trưởng thành Mặc dù ở tỳ tạng của cá trưởng thành có phần cơ mở rộng đến nhu mô nhưng không rõ ràng như ở động vật hữu nhủ Tủy trắng và tủy đỏ của cá bột không tách ra riêng biệt như ở cá trưởng thành Phần tủy đỏ bao gồm nhiều tế bào máu hình sine với những hồng cầu trưởng thành, một số nguyên hồng cầu, đại thực bào, những tế bào lưới và trung tâm đại thực bào sắc tố (melanin) Những sợi mạng lưới được tìm thấy ở vách dạng đường sine, được sắp xếp ở dạng vòng bao quanh vi thể tỳ tạng Phần tủy trắng có nhiều tế bào bạch cầu kiềm tính hơn phần tủy đỏ, ngoài ra ở tủy trắng còn có tế bào lympho, ít tế bào hồng cầu, đại thực bào và một số trung tâm đại thực bào Những tế bào hồng cầu chưa trưởng thành hoặc trưởng thành, đại thực bào, với một số ít tế bào hồng cầu trong tế bào chất đã được tìm thấy ở tỳ tạng, bắt màu đậm với dung dịch Wright và Giemsa Nhìn chung ở tỳ tạng có nhiều đại thực bào hơn ở tiền thận, đều này cho thấy tỳ tạng là cơ quan chính loại bỏ những tế bào hồng cầu già và tạo ra nhiều tế bào mới (Trích dẫn từ Supranee

et al., 1991)

Theo Nguyễn Quốc Thịnh, 2002 ở cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) tỳ

tạng có màu đỏ thẩm, dạng dẹp, vị trí của tỳ tạng nằm ở màng treo ruột Chức năng của tỳ tạng là tiêu hủy những tế bào hồng cầu già, tái hấp thu sắt, Hemoglobin và các thành phần cấu tạo hồng cầu khác để sản xuất hồng cầu mới Ngoài ra tỳ tạng còn có nhiệm vụ sản xuất ra các loại tế bào limpho giúp

cơ thể chống lại các tác nhân gây bệnh

2.4.2 Cơ quan thymus (tuyến ức)

Thymus là 1 đôi cơ quan được tìm thấy giữa lớp biểu bì và vỏ ở rìa trên của nắp mang thuộc hốc mang cá Nó là 1 cơ quan nhỏ Thymus được bao quanh bởi những sợi mô liên kết Nó không được tách biệt trong 1 vùng để nhận biết giữa vỏ và lỗi, vì vậy có sự khác nhau với thymus của động vật hữu nhũ Thymus có thể thay đổi hình dạng và phát triển tốt ở cá hương và cá giống

Nó nằm gần thận trước ở cá hương và cá giống nhưng vị trí đó lại khác so với

cá trưởng thành bởi vì là cơ quan rất nhỏ và kích thước tương tự như thymus

ở cá giống Các tế bào thymus bắt màu xanh đen với thuốc nhuộm haematoxylin & eosin đó là loại tế bào chiếm ưu thế được tìm thấy trong Thymus Thymus là cơ quan quan trọng của cá con và có một nhận định nó là

cơ quan nội tiết nhưng chức năng quan trọng phổ biến được nhận biết là nó

giữ vai trò trong tạo miễn dịch (Trích dẫn từ Supranee et al., 1991)

Ở cá nheo mỹ (channel catfish), thymus nằm ở phía trong mặt lưng của hốc mang Nó thường được bao bọc bằng lớp biểu bì mỏng Ở một số loài, lớp võ của thymus chủ yếu là các tế bào thymus và phần lõi là các tế bào biểu mô chiếm đa số Các tế bào biểu mô giống với các huyết cầu của 1 số cá có vú Ở một vài loài cá, thymus có thể được phát hiện ở 1 vài ngày đầu sau khi nở, ngược lại ở 1 vài loài cá bơn sao, dường như chỉ tìm thấy ở cá sau giai đoạn biến thái của ấu trùng Sự thành thục của thymus ở tất cả các loài cá không phát sinh giống như ở động vật hữu nhủ Thymus có khả năng thay đổi về kích thước với sự thay đổi của mùa hoặc theo chu kỳ của hormone được nhận dạng nhờ phương pháp mô học Chức năng thymus của cá cũng giống như ở động vật hữu nhũ, tạo ra các tế bào lympho trong miễn dịch qua trung gian tế bào, trước khi di dời ra cơ quan lymphoid ngoại biên Ở cá nhỏ, khi vi khuẩn tiếp xúc với hốc mang, phủ lên thymus gây hoại tử biểu bì là phổ biến, sau đó xâm nhập và phá huỷ nhu mô của thymus Sự thay đổi về hình dạng ngoài của thymus đặc biệt là sự xuất huyết của thymus ở một số loài cá được cho là có

liên quan đến điều kiện gây sốc của môi trường (Trích dẫn từ Grizzle et al.,

1976)

tiền thận đã tiêu biến ra phía sau của thận (Trích dẫn từ Grizzle et al., 1976)

Ở cá tra thận có màu nâu đỏ nằm dọc theo cột sống Chức năng chính của thận

là bài tiết các sản phẩm của quá trình biến dưỡng như NH3, Ure, các muối hóa trị 2; ổn định môi trường pH; điều hòa áp suất thẩm thấu,… Đồng thời thận còn có chức năng tạo máu và tham gia vào hệ thống miễn dịch bằng mô kẽ Ngoài ra, thận còn tham gia vào hệ thống nội tiết (tiết kích thích tố và điều hòa quá trình sinh lý của cơ thể bằng hormone Adrenalin và Noradrenalin) (Bùi Châu Trúc Đan, 2003)

2.5 Sự hình thành cơ quan lympho

Ở người hệ miễn dịch bao gồm nhiều cơ quan như tuyến ức (thymus), các hoạch bạch huyết, tuỷ xương, tuỵ tạng và ruột thừa Tất cả các tế bào miễn dịch xuất phát từ các nguyên bào trong phôi, sau đó di chuyển đến các mô và

cơ quan chuyên biệt, tại đây chúng sản sinh ra các hồng cầu và bạch cầu Những tế bào bạch cầu nhất là các đại thực bào, tế bào B, T, NK và tế bào mast giữ vai trò quan trọng trong đáp ứng niễm dịch Có 2 hệ thống đáp ứng miễn dịch là miễn dịch qua thể dịch và miễn dịch qua trung gian tế bào Cả 2

hệ thống này hoạt động chung để phá huỷ các kháng nguyên Hệ thống miễn dịch thể dịch bảo vệ cơ thể chống lại các kháng nguyên thông qua sự tiết các prôtêin chuyên biệt là kháng thể, làm bất hoạt hoặc phá huỷ kháng nguyên trên

bề mặt của vi khuẩn, nấm, virus nằm bên ngoài tế bào cũng như các chất độc

tự do trong máu và huyết tương Còn hệ miễn dịch qua trung gian tế bào trực tiếp phá huỷ các vi khuẩn qua việc sản xuất những tế bào chuyên biệt tấn công vào các chất xâm nhập (Bùi Tấn Anh và ctv, 2004)

Theo Breuil.G, et al., 1997 nghiên cứu sự phát sinh kháng thể IgM trong tế

bào và sự thay đổi trong miễn dịch golobulin (IgM) xuyên suốt ở giai đoạn ấu trùng của cá chẽm bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (FITC) và phép phân

tích FACS để phát hiện những tế bào dương tính với IgM bằng mẫu dò kháng kháng thể Còn sự phát triển của cơ quan lympho được nghiên cứu bằng phương pháp mô học Kết quả nghiên cứu cho thấy, một lượng nhỏ IgM được phát hiện bằng phương pháp ELISA ở trứng cá, nhưng giảm dần cho đến ngày thứ 5 sau khi nở, từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 15 không tìm thấy IgM trong tế bào Sau đó IgM được phát hiện lại từ ngày 15 đến ngày thứ 30 Xuyên suốt giai đoạn này cơ quan thymus và thận trước được hình thành Từ ngày 30 đến ngày 95, mật độ IgM tăng lên tương quan với trọng lượng cơ thể của ấu trùng Kết quả này cho thấy rằng IgM được phát hiện từ ngày thứ 0 đến ngày thứ 5 xuất phát từ cá mẹ, trong khi đó IgM được phát hiện từ ngày 15 là các IgM mới được tổng hợp Hơn thế nửa, tế bào B thành thục và sự tổng hơp IgM tương đối hoàn chỉnh ở ấu trùng cá chẽm 50 ngày tuổi khi cơ quan lympho

phát triển đầy đủ

Trong khi đó, Merete et al., 1998 nghiên cứu về sự hình thành cơ lympho và

sự sản xuất miễn dịch globulin ở cá tuyết đại dương (Gadus morhua L.), thuộc loài cá nước mặn Kết quả cho thấy, ở cá tuyết (Gadus morhua L) thận trước

và lá lách là cơ quan lympho xuất hiện trước tiên trong khoảng thời gian lúc

nở, còn thymus được quan sát ở ấu trùng có kích thước 9 mm Tế bào IgH mRNA được phát hiện trong lát cắt paraffin của ấu trùng cá, còn cá ở giai đoạn tiền trưởng thành dùng phương pháp lai phân tử Những tế bào dương tính không phát hiện được ở cá nhỏ hơn 33 mm (58 ngày sau khi nở) IgH mRNA có sự giống nhau với các động vật khác và sự xuất hiện đầu tiên của các tế bào miễn dịch globulin dương tính được tìm thấy bằng phương pháp hoá mô miễn dịch

Tiếp theo đó, vào năm 2001, Lora et al., nghiên cứu sự hình thành cơ quan

lympho của cá nheo mỹ, để đánh giá sự thay đổi có liên quan đến sự phát triển

về chức năng đáp ứng miễn dịch dịch thể, nghiên cứu đánh giá về thời gian và không gian phân bố của tế bào miễn dịch phát triển ở cá da trơn Kết quả cho thấy những tế bào có chức năng trong miễn dịch không đặc hiệu nó hiện diện

ở cơ quan tạo máu thuộc thận và thymus lúc nở và ở tỳ tạng là 3 ngày tuổi Tế bào lympho dương tính với IgM được phát hiện đầu tiên ở ngày thứ 7, 10 và thứ 14 tương ứng với các cơ quan tạo máu thuộc thận, thymus và tỳ tạng Sự thành thục của cơ quan thymus được phát hiện đầu tiên ở cá 10 ngày tuổi Cơ quan thymus xuất hiện rõ ràng và tổ chức lympho thuộc tỳ tạng không quan sát được cho đến ngày thứ 21 sau khi nở Nghiên cứu còn cho thấy, tổ chức lympho thứ cấp nghèo nàn là do kháng thể được sản xuất ra ít cho đến khi ấu trùng cá được 21 ngày tuổi

Một năm sau, Nadia et al., 2002 đã nghiên cứu sự phát triển của tế bào B trong

tỳ tạng của cá ngựa Ở cá ngựa trước đây được cho rằng tế bào T có thể phân biệt được ở thymus của cá 4 ngày tuổi nhưng tế bào B chỉ phân biệt được ở cá

3 tuần tuổi Nhưng ở cá 4 ngày tuổi, phát hiện gen thụ thể của tế bào B trong ADN ly trích từ toàn bộ con cá Cũng thời gian 4 ngày, bản sao Rag-1 được thấy ở tỳ tạng (là cơ quan trước đây cho rằng không liên quan đến tổ chức lymphoid của cá ngựa); ở cá 10 ngày tuổi, bản sao Ig cũng được phát hiện ở tỳ tạng Vì vậy, ở cá ngựa tỳ tạng cũng được thừa nhận là cơ quan có chức năng

quan trọng trong hệ thống miễn dịch Và cũng năm này, Lora et al., 2002, nghiên cứu hệ thống đáp ứng miễn dịch thể dịch của cá nheo mỹ (Ictalurus punctatus) ở giai đoạn cá bột và cá giống khi tiếp xúc với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Nghiên cứu thực hiện với cá không có mầm bệnh được

thuần hoá phù hơp với điều kiện môi trường Cá ở tuổi 1, 2, 3 và 4 tuần và 2,

3, 4, 5, và 6 tháng sau khi nở, Cá được tiêm liều sơ cấp với vi khuẩn E ictaluri

(ở liều 6,4×104 cfu/ mlcho 1 bể) và sau đó 4 tuần tiêm tiếp liều thứ 2 còn nhóm đối chứng thì được tiếp xúc với môi trường nuôi cấy đã tiệt trùng Kết quả cho thấy kháng thể đặc hiệu được phát hiện đầu tiên ở cá 4 tuần tuổi sau khi nở có trọng lượng trung bình 85 mg Đáp ứng thứ cấp được chứng minh ở

cá hương 4 tuần tuổi khi nhúng liều sơ cấp và 8 tuần tuổi khi nhúng liều thứ cấp Tuy nhiên, hiệu quả tăng khả năng đáp ứng là đúng được chứng minh ở

cá 2 tháng tuổi nhận liều sơ cấp Cá nhận liều sơ cấp ở trước 4 tuần tuổi và 1 liều thứ cấp nhẹ kết quả đáp ứng kháng thể có ý nghĩa, thậm chí chúng đồng tuổi nhau ở liều tiếp xúc thứ 2 việc tạo ra đáp ứng kháng thể tốt được kéo dài nhờ vào liều tiếp xúc ban đầu Từ kết quả trên người ta cho rằng cá nheo không có khả năng tạo ra đáp ứng miễn dịch thể dịch trước 4 tuần tuổi

Tiếp tục, nghiên cứu mô học về cơ quan lympho của cá đĩa Xiphophorus maculatus L ở giai đoạn ấu trùng cho thấy thymus là cơ quan lớn và chứa đầy

các tế bào lympho Trong khi tổ chức lympho có ở lá lách và ống thận phát triển chậm hơn (Leknes, 2003)

Cho đến hai năm sau, Zapata et al, 2005, nghiên cứu sự phát sinh hệ miễn dịch

ở một số loài cá có giá trị từ cách nguồn báo cáo đã có trước đây Kết quả cho thấy rằng ở một vài loài cá xương (chẳng hạn như cá angelfish) tế bào máu đầu tiên được hình thành từ khối noãn hoàng Ở vài loài cá khác như cá ngựa,

vị trí cơ quan tạo máu đầu tiên là ở trong phôi, đa số là các tế bào trung gian (ICM), trong khi đó ở cả cá mùi và cá hồi các tế bào máu đầu tiên chỉ xuất hiện 1 thời gian ngắn ở noãn hoàng nhưng sau đó ICM phát triển chủ yếu ở cơ quan tạo máu Hồng cầu và các đại thực bào là những tế bào máu đầu tiên

được nhận định ở phôi của cá ngựa Những tế bào này sinh ra từ tế bào ICM, ống Cuvier và những tế bào ngoại biên Trong khoảng 24 - 30 giờ sau khi thụ tinh ở nhiệt độ 28°C một ít nguyên bào tuỷ và tế bào tuỷ xuất hiện giữa khối noãn hoàng và vách cơ thể, ở vùng bụng gần phần đuôi ở cá ngựa 1 - 2 ngày tuổi cũng có các tế bào máu phát triển Cơ quan thymus, thận và lá lách là những cơ quan lympho thiết yếu của lớp cá xương Thymus là cơ quan lympho được hình thành đầu tiên, mặc dù thận trước có thể xuất hiện trước nhưng chưa xuất hiện các tế bào lympho Ở cá nước ngọt, lá lách của cá xương là cơ quan lympho phát triển sau cùng Bên cạnh đó, sự xuất hiện sớm của Rag-1 ở Thymus của cá ngựa có mối tương quan với hình thái của tế bào lympho Chức năng và hình dạng của tế bào lympho rõ ràng hơn khi cá có được hệ miễn dịch hoàn chỉnh

Gần đây, Sonal et al., 2008 nghiên cứu sự hình thành cơ quan lympho và phát triển của tế bào sinh kháng thể IgM ở cá bơn Đại Dương (Hippoglossus hippoglossus L.) Kết quả mô học cho thấy thận xuất hiện ở cá 1 ngày tuổi sau

khi nở, cơ quan thymus xuất hiện ở cá 33 ngày sau khi nở, trong khi đó lá lách

là cơ quan sau cùng xuất hiện ở 49 ngày tuổi sau khi nở Tất cả các cơ quan lympho này có hình thái tương đối hoàn chỉnh sau giai đoạn biến thái Với phương pháp RT - PCR cho thấy IgM mRCT xuất hiện ở cá 66 ngày tuổi sau khi nở và có thể chậm hơn, tương ứng với thời gian này ở kỹ thuật lai phân tử cũng cho thấy có 1 ít tế bào dương tính với IgM có thể được phát hiện ở giai đoạn đầu của thận và lá lách Còn phương pháp hoá mô miễn dịch dùng kháng thể đơn dòng phát hiện được IgM ở thận trước và lá lách của cá 94 ngày tuổi, nhưng IgM mRCT được phát hiện chậm hơn Nhiều tế bào xuất hiện rõ ràng

cả IgM mRCT và prôtein có thể được phát hiện ở tỳ tạng, thận trước, và thymus cũng có xuất hiện nhưng ở giai đoạn cá bơn lớn

2.6 Một số thành tựu về phương pháp mô học

Nghiên cứu mô học bắt đầu từ cuối thế kỉ 17 nhưng mãi đến cuối thế kỉ 19 mô học mới được coi là ngành khoa học (trích dẫn bởi Nguyễn Quốc Thịnh, 2002) Mô học bắt đầu từ khi kính hiển vi đầu tiên được chế tạo bởi Antoni Van Leuwenhoek (1632-1723) người Hà Lan, đến cuối thế kỉ 18 Robert Hooke (1635-1703) nhà khoa học người Anh đã xác định tế bào là đơn vị cấu tạo cơ thể sinh vật Quan sát miếng nút chai dưới kính hiển vi đã đưa ra kết luận “miếng nút chai được tạo thành từ những túi nhỏ hay tế bào độc lập với nhau và chứa đầy không khí” (R.Hooke, 1665, trích dẫn bởi Nguyễn Quốc Thịnh, 2002)

Sau khi thuyết tế bào ra đời (1893), đặc biệt là lĩnh vực mô học mô tả ra đời thì những thành phần cấu tạo khác nhau của cơ quan và các mô được nghiên cứu cẩn thận, tỉ mỉ hơn Thành tựu lớn nhất của giai đoạn này là chế tạo ra máy cắt lát mỏng (microtom) cho phép nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc hiển vi thể của tế bào và mô (Phạm Phan Địch, 1998), từ đó đến nay mô học ngày càng được chú ý phát triển mạnh mẽ và chuyên sâu hơn

Robert (1989) đã hệ thống lại tất cả các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cá, các giống loài kí sinh trùng, vi khuẩn, virut gây bệnh trên cá, dấu hiệu bệnh lý đặc trưng của cá đối với từng tác nhân gây bệnh khác nhau Ông cũng đã mô tả về phản ứng sinh lý của cá, quá trình biến đổi chung của cơ quan trong cơ thể cá khi bị tác nhân xâm nhập và gây bệnh Bên cạnh đó, ông cũng trình bày cơ bản về những đáp ứng miễn dịch chung của cá trước tác động của các yếu tố vô sinh và hữu sinh

Suprance et al., (1991) nghiên cứu về mô học trên cá trê trắng Tác giả không

nghiên cứu trên cá bệnh mà chỉ nghiên cứu trên cá khỏe và khảo sát 1 số cơ quan như hệ bài tiết, hệ tuần hoàn,… nhằm so sánh khi nghiên cứu mô và

cung cấp sự hiểu biết về mô học Grizzle et al., (1976) giải phẩu và nghiên cứu

mô học trên cá nheo Tác giả đã mô tả đặc điểm về mô trên một số cơ quan của cá nheo như hệ thần kinh, hệ cơ, hệ tiêu hoá nhằm nhận dạng đặc điểm của các cơ quan để nghiên cứu sau này

Groman (1982) nghiên cứu mô học trên cá chẽm Tác giả đã quan sát cấu trúc

mô khỏe ở nhiều giai đoạn của cá từ giống đến trưởng thành ở một số cơ quan:

hệ hô hấp, hệ thần kinh, hệ tuần hoàn, hệ tiêu hoá, hệ sinh dục, hệ bài

tiết…Tiếp đó, Herrera (1996) nghiên cứu trên cá rô phi (Oreochromis niloticus) Tác giả dùng phương pháp mô học để nghiên cứu trên một số cơ

quan như da, cơ, xương, hệ tiêu hóa, hệ hô hấp, hệ tuần hoàn, hệ bài tiết, hệ sinh dục, hệ thần kinh…

Ở nước ta ngày nay, mô học đã được nghiên cứu nhiều trong lĩnh vực thủy sản như: Nguyễn Quốc Thịnh (2002) bước đầu nghiên cứu về mô bệnh đốm trắng trong nội tạng cá tra Tác giả đã đưa ra sự so sánh về những biến đổi cấu trúc của mô cá bệnh như hiện tượng xuất huyết, hoại tử, xung huyết so với cá khỏe Đến năm 2003, Bùi Châu Trúc Đan nghiên cứu đặc điểm mô bệnh học bệnh phù mắt trên cá tra, quan sát trên các cơ quan như gan, nội tạng… nhằm so sánh những cấu trúc vi thể của cá và tiếp theo là Phan Thị Hừng, 2004 nghiên cứu cấu trúc mô và sự biến động số lượng hồng cầu trên cá tra bị bệnh vàng

da Tác giả cũng quan sát cơ quan gan, thận và tỳ tạng trong cấu trúc của mô

cá bệnh để so sánh với cá khỏe Gần đây, Võ Quốc Hào (2008), nghiên cứu cấu trúc mô của một số hệ cơ quan trên cá tra Tác giả đã xác định được đặc điểm, cấu trúc mô của cá khỏe từ đó làm cơ sở cho việc chẩn đoán

Ở nước ta, nghiên cứu về mô học trên cá được thực hiện khá phổ biến nhưng chủ yếu thiêng về chẩn đoán và xác định mầm bệnh Hiện nay, vaccine là biện pháp phòng bệnh hữu hiệu cho cá tra nuôi nhưng việc sử dụng vaccine chưa đem lại hiệu quả do chưa nghiên cứu Việc sử dụng vaccine có hiệu quả hay không là phụ thuộc vào khả năng đáp ứng miễn dịch của cá Do đó, nghiên cứu về sự hình thành cơ quan lymphoid trên cá tra là điều cần thiết

Địa điểm phân tích mẫu: Phòng mô của Bộ môn Sinh học và Bệnh thuỷ sản -

Khoa Thuỷ Sản - Đại Học Cần Thơ

3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Dụng cụ:

Bộ tiểu phẩu, ống universal, khay nhựa, lọ thuỷ tinh, cốc đốt 500ml, máy cắt lát mỏng (microtom), máy xử lý mô, khuôn đúc mẫu, máy ảnh, kính hiển vi, lame, lamelle…

Cắt tỉa và định hướng

Mẫu trước khi đưa vào qui trình xử lý mẫu phải cắt tỉa và định hướng cho mẫu đạt kích cỡ phù hợp, cắt mẫu với độ dày từ 3-5µm Đưa mẫu vào catsset và tiến hành xử lý

Quy trình xử lý mẫu Loại nước

Việc loại nước phải đảm bảo nguyên tắc là phải loại hết nước trong mẫu mô

mà không làm tế bào bị biến dạng hoặc không làm vị trí thành phần cấu tạo tế bào trong mẫu mô không bị thay đổi Quá trình loại nước được thực hiện bằng cách nhúng mẫu qua nhiều dung dịch cồn với nồng độ gia tăng từ 80-100% Thời gian thử nước phụ thuộc vào độ dày của mẫu mô

Phương pháp làm trong mẫu (tẩm dung môi trung gian)

Vì cồn không thể hòa lẫn với paraffin nên sau khi hoàn thành quá trình khử nước, cồn cần phải loại khỏi mẫu mô để tránh tình trạng mô có thể bi co rút khi tẩm paraffin Dung môi trung gian vừa hòa tan được cồn và paraffin thường dùng là xylen, xylen ít độc và có tính thấm nhanh Phương pháp này được thực hiện bằng cách ngâm mẫu mô trong xylen qua hai lọ.Thời gian ngâm mẫu mô trong mỗi lọ dao động từ 2h-2h30’ Ngoài ra để tăng khả năng nhấm paraffin và để loại hoàn toàn cồn ra khỏi mẫu mô, trước khi chuyển sang bước ngấm paraffin, mẫu mô được ngâm trong lọ paraffin hòa tan trong xylen