ảnh hưởng của thuốc kháng sinh lên các chỉ tiêu huyết học của cá tra (pangasianodon hypophthalmus) nhiễm edwardsiella ictaluri

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN LÊ NGỌC LAN VÂN ẢNH HƯỞNG CỦA THUỐC KHÁNG SINH LÊN CÁC CHỈ TIÊU HUYẾT HỌC CỦA CÁ TRA Pangasianodon hypophthalmus NHIỄM Edwardsiella ictaluri LUẬN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

LÊ NGỌC LAN VÂN

ẢNH HƯỞNG CỦA THUỐC KHÁNG SINH LÊN CÁC CHỈ TIÊU HUYẾT HỌC CỦA CÁ TRA

(Pangasianodon hypophthalmus) NHIỄM

Edwardsiella ictaluri

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2009

LỜI CẢM TẠ

Xin gởi lời cảm ơn đến cô Đặng Thụy Mai Thy, cô Đặng Thị Hoàng Oanh và chị Nguyễn Thị Thúy Liễu đã tận tình hướng dẫn em trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Mình xin chân thành cảm ơn những người bạn thân yêu của lớp Bệnh học thủy sản khóa 31 đã luôn gắn bó, quan tâm, giúp đỡ mình trong 4 năm đại học

Lời cảm ơn cuối cùng con xin gởi đến cha mẹ, cha mẹ là nguồn động viên lớn nhất giúp cho con vượt qua những lúc khó khăn , giúp con có đủ tự tin trong học tập và trong cuộc sống

Chân thành cảm ơn!

TÓM TẮT

Đề tài “ Ảnh hưởng của thuốc kháng sinh lên các chỉ tiêu huyết học của cá tra

(Pangasianodon hypophthalmus) nhiễm Edwardsiella ictaluri” nhằm mục tiêu

xác định ảnh hưởng của các loại thuốc kháng sinh thường dùng trong nuôi cá

tra lên các chỉ tiêu huyết học của cá tra nhiễm E ictaluri Cá tra giống mua về

có biểu hiện bệnh mủ gan, tiến hành bố trí thí nghiệm với 7 nghiệm thức trong

đó có 6 nghiệm thức sử dụng kháng sinh, nghiệm thức 1 – Amoxicilin, nghiệm thức 2 – Flofenicol, nghiệm thức 3 – Docycilin, nghiệm thức 4 – Flofenicol và Amoxicillin, nghiệm thức 5 – Flofenicol và Doxycilin và nghiệm thức 6 - Amoxicillin và Doxycilin, 1 nghiệm thức đối chứng không sử dụng kháng sinh Theo dõi tỉ lệ chết của cá, tiến hành phân lập vi khuẩn và lấy máu xác định các chỉ tiêu huyết học trên những cá có biểu hiện lờ đờ Kết quả thí nghiệm cho thấy tỉ lệ chết ở nghiệm thức 1 cao nhất (100% cá chết vào ngày thứ 3 thí nghiệm), kế đến là nghiệm thức đối chứng (93,3%), nghiệm thức 2 (93%), nghiệm thức 3 (47%), nghiệm thức 4 (43%), nghiệm thức 5 và 6

(30%) Kết quả phân lập vi khuẩn xác định cá nhiễm bệnh do E.ictaluri

Trong máu tìm được 5 loại tế bào: hồng cầu, lympho, tiểu cầu, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính Ngoài ra còn tìm thấy hồng cầu nhiều nhân và không nhân Hồng cầu được định loại bằng dung dịch Natt – Herick, bạch cầu bằng phương pháp nhuộm Wright & Giemsa

Số lượng hồng cầu của cá sau khi điều trị bằng kháng sinh là 1,6x106 tế bào/mm3 thấp hơn hồng cầu của cá nhiễm bệnh trước khi sử dụng kháng sinh

là 1,8x106 tế bào/mm3, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Lympho sau sử dụng kháng sinh thấp hơn trước khi sử dụng kháng sinh còn bạch cầu đơn nhân và bạch cầu trung tính sau sử dụng kháng sinh cao hơn trước khi sử dụng kháng sinh.

Đối với từng nghiệm thức, lympho và bạch cầu trung tính ở nghiệm thức không sử dụng kháng sinh có số lượng thấp nhất (13,3x103 tế bào/mm3 và 7,3x103 tế bào/mm3), số lượng lympho cao nhất ở nghiệm thức 6 (53,8x103 tế bào/mm3) và bạch cầu trung tính cao nhất ở nghiệm thức 2 (16,6x103 tế bào/mm3) Số lượng bạch cầu đơn nhân cao nhất ở nghiệm thức 2 với 12,8x103

tế bào/mm3 và tiểu cầu cao nhất với số lượng 24.6x103 tế bào/mm3 ở nghiệm thức 6 Nghiệm thức 5 có số bạch cầu đơn nhân thấp nhất (5,1x103 tế bào/mm3) và nghiệm thức 2 có số tiểu cầu thấp nhất (5,3x103 tế bào/mm3)

MỤC LỤC

Tóm tắt i

Mục lục ii

Danh sách bảng iv

Danh sách hình v

CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU 1

CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Tình hình dịch bệnh trên cá tra 2

2.2 Tình hình bệnh mủ gan trên cá tra 2

2.3 Bệnh mủ gan trên cá 2

2.4 Tình hình quản lý sử dụng kháng sinh trên thế giới và Việt Nam 3

2.5 Kháng sinh 4

2.5.1 Khái niệm 4

2.5.2 Cơ chế tác động của thuốc kháng sinh 4

2.5.3 Các loại thuốc kháng sinh thường dùng trong thủy sản 5

2.6 Những nghiên cứu về sự kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn E.ictaluri 6

2.7 Các chỉ tiêu huyết học 7

2.7.1 Hồng cầu ( Erythrocyte) 8

2.7.2 Bạch cầu đơn nhân 8

2.7.3 Bạch cầu trung tính ( Neutrophil) 9

2.7.4 Tiểu cầu ( Thrombocyte 9

2.7.5 Tế bào lympho ( lymphocyte) 10

3.1 Thời gian thực hiện 11

3.2 Địa điểm nghiên cứu 11

3.3 Vật liệu nghiên cứu 11

3.3.1 Đối tượng nghiên cứu 11

3.3.2 Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 11

3.3.3 Hóa chất 11

3.4 Phương pháp nghiên cứu 12

3.4.1 Chuẩn bị thí nghiệm 12

3.4.2 Bố trí thí nghiệm 12

3.4.3 Các chỉ tiêu thu thập 12

3.5 Định danh vi khuẩn 13

3.6 Phương pháp lấy mẫu máu quan sát các chỉ tiêu huyết học 13

3.6.1 Phương pháp lấy mẫu máu, nhuộm và đếm hống cầu 13

3.6.2 Phương pháp lấy mẫu máu, nhuộm và đếm bạch cầu 14

3.7 Xử lý số liệu 15

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ THẢO LUẬN 16

4.1 Dấu hiệu bệnh lý 16

4.2 Kết quả thí nghiệm 16

4.3 Kết quả phân lập vi khuẩn 17

4.4 Kết quả phân tích huyết học 18

4.4.1 Hồng cầu 18

4.4.2 Bạch cầu 20

CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 24

5.1 Kết luận 24

5.2 Đề xuất 24

TÀI LIỆU THAM KHẢO 25

Phụ lục 28

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 So sánh độ nhạy của các loại kháng sinh đối với vi khuẩn E.ictaluri phân lập trên cá tra bệnh gan thận mủ (nguồn: Nguyễn Đức Hiền) 8 Bảng 3.1 Các loại thuốc và liều lượng kháng sinh sử dụng cho các nghiệm thức thí nghiệm 12 Bảng 4.1 Sự biến đổi số lượng các loại bạch cầu trước và sau khi sử dụng kháng sinh 20 Bảng 4.2 Số lượng các loại bạch cầu ở các nghiệm thức sau khi sử dụng kháng sinh 21

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Cá tra bệnh xuất hiện nhiều đốm trắng trên gan (G),

thận (Th) và tỳ tạng (Tt)) 3

Hình 2.2 Tế bào hồng cầu 8

Hình 2.3 Bạch cầu đơn nhân 9

Hình 2.4 Bạch cầu trung tính 9

Hình 2.5 Tiểu cầu 10

Hình 2.6 Tế bào lympho 10

Hình 3.1 Buồng đếm hồng cầu 13

Hình 3.2 Thao tác lấy mẫu máu và trải mẫu 14

Hình 4.1 Biểu đồ thể hiện tỉ lệ chết của các nghiệm thức trogn quá trình thí nghiệm 16

Hình 4.2 Khuẩn lạc trên môi trường TSA 17

Hình 4.3 Kết quả nhuộm gram 18

Hình 4.4 Kết quả kiểm tra các loai đường 18

Hình 4.5 Hồng cầu nhiều nhân (100X) 18

Hình 4.6 Hồng cầu không nhân (100X) 18

Hình 4.7 Biểu đồ mật độ hồng cầu cá tra trước, sau khi sử dụng kháng sinh và không sử dụng kháng sinh 19

Hình 4.8 Tế bào lympho (100X) 20

Hình 4.9 Tiểu cầu (100X) 20

Hình 4.10 Bạch cầu trung tính (100X) 20

Hình 4.11 Bạch cầu đơn nhân (100X) 20

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU

Nghề nuôi trồng thuỷ sản đang ngày một phát triển và trở thành một ngành có đóng góp đáng kể trong kim ngạch xuất khẩu Hiện tại, nhu cầu cá tra cho xuất khẩu và tiêu thụ trong nước đều tăng cao Giải pháp quan trọng để tạo thêm nhiều sản phẩm là nuôi công nghiệp tập trung Song song với sự phát triển đó, vấn đề dịch bệnh trên cá tra nuôi ngày càng trở nên trầm trọng Tình hình dịch bệnh xuất hiện nhiều hơn khi vào mùa mưa, chủ yếu là bệnh gan thận có mủ, trắng gan, trắng mang Theo thống kê của Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn, diện tích nuôi cá tra ở ĐBSCL giảm hơn trước, tính đến ngày15/8/2008, diện tích thả nuôi của các tỉnh An Giang là 1.392 ha, Cần Thơ - 1.250 ha, Đồng Tháp - 630 ha, Bến Tre - 563 ha, Vĩnh Long - 221 ha, Sóc Trăng - 212

ha, Hậu Giang - 171 ha và Tiền Giang - 118 ha (Dương Long Trì, 2008)

Để hạn chế dịch bệnh người nuôi đã sử dụng một số loại kháng sinh Việc dùng kháng sinh trị bệnh thường tốn kém và hiệu quả không cao Theo điều tra của Nguyễn Tấn Duy Phong ( 2008) về tình hình sử dụng thuốc thú y thủy sản

ở 2 tỉnh Cần Thơ và An Giang cho thấy chi phí cho việc sử dụng thuốc thú y thủy sản là rất lớn, chiếm hơn 7% tổng chi phí sản xuất Hơn nữa lượng tồn dư kháng sinh không chỉ ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm, mà còn ảnh hưởng đến sức khoẻ người tiêu dùng

Việc dùng kháng sinh tùy tiện, không đúng loại, liều lượng và cách thức điều trị đã đưa đến hiệu quả điều trị của kháng sinh ngày càng giảm và tạo ra các dòng vi khuẩn kháng thuốc

Từ thực tế nêu trên, đề tài “ Ảnh hưởng của thuốc kháng sinh lên các chỉ

tiêu huyết học của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nhiễm

Edwardsiella ictaluri” được thực hiện với mục tiêu xác định ảnh hưởng của

các loại kháng sinh thường dùng trong nuôi cá tra lên các chỉ tiêu huyết học

của cá tra khỏe và cá bị nhiễm E ictaluri

Nội dung đề tài:

- Xác định ảnh hưởng của các loại thuốc kháng sinh thường dùng trong nuôi

cá tra lên các chỉ tiêu huyết học của cá tra nhiễm E ictaluri

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình dịch bệnh trên cá tra

Tình hình dịch bệnh trên cá tra của các tỉnh thuộc khu vực đồng bằng sông Cửu Long trong năm 2007 cho thấy các bệnh thường xảy ra và gây thiệt hại cho người nuôi đó là bệnh gan, thận có mủ (đốm trắng trên gan, thận) với tần suất xuất hiện cao (52,8%), kế đến là bệnh xuất huyết (42,5%), phù đầu, phù mắt (20,7%), vàng da và thân (21,6%) Riêng bệnh gan, thận có mủ (đốm trắng trên gan, thận) thì An Giang chiếm tỉ lệ cao nhất đạt 66,7%, kế đến là Cần Thơ: 54,89%, Vĩnh Long 53,8%, Đồng Tháp 36% Bệnh thường xảy ra từ tháng 5 đến tháng 9 vào mùa nước xoay ở đồng bằng sông Cửu Long, đỉnh điểm rơi vào tháng 9-10; đặc biệt bệnh xuất hiện không phụ thuộc vào mùa vụ thả giống hay lứa tuổi cá

2.2 Tình hình bệnh mủ gan trên cá tra

Bệnh mủ gan được phát hiện lần đầu tiên tại Việt Nam năm 1998 Đây là một bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng cho các hộ nuôi cá tra, basa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long Tỉ lệ xuất hiện bệnh mủ gan trên cá tra khoảng 61% không cao hơn nhiều so với các bệnh khác như bệnh đỏ mỏ đỏ kỳ 68,3%, bệnh phù đầu 51,2% Bệnh mủ gan là một trong các nguyên nhân chủ yếu dẫn đến tỷ lệ hao hụt cao, đặc biệt giai đoạn cá giống và cá nuôi thương phẩm dưới 3 tháng tuổi Những khu vực bị ảnh hưởng chủ yếu là những vùng có nghề nuôi cá tra phát triển mạnh mang tính chất công nghiệp như: An Giang, Đồng Tháp, Cần

Thơ (huyện Thốt Nốt, Phụng Hiệp) (Từ Thanh Dung và ctv, 2002)

2.3 Bệnh mủ gan trên cá tra

Theo Từ Thanh Dung và ctv (2002), giống như những bệnh khác, cá mắc bệnh

mủ gan có biểu hiện lờ đờ, không có hiện tượng xuất huyết trên da và hậu môn Ở giai đoạn mới chớm bệnh cá kém ăn, nhưng nếu không áp dụng các phương pháp điều trị và không giảm lượng thức ăn thì bệnh sẽ trở nên trầm trọng hơn và rất khó điều trị Phần nội quan có những đốm trắng, đường kính 1-3mm Trên gan, thận, tỳ tạng sưng to nhất là thận sẽ bị sưng và nhũng Tỉ lệ chết từ 10-90% tổng số cá nuôi trong bè Nguyên nhân của bệnh này là do vi

khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra

Hình 2.1 Cá tra bệnh xuất hiện nhiều đốm trắng trên gan (G),

thận (Th) và tỳ tạng (Tt) (Từ Thanh Dung và ctv, 2002)

E ictaluri là vi khuẩn hình que, gram âm, không di động, lên men, không oxy

hóa, oxidase âm tính, cho phản ứng catalase dương tính Các chỉ tiêu sinh hóa

của E ictaluri đều âm tính, riêng lysine và glucose cho phản ứng dương tính

Phản ứng indole và H2S âm tính (Từ Thanh Dung và ctv, 2002)

2.4 Tình hình quản lý sử dụng kháng sinh trên thế giới và Việt Nam Trên thế giới

Nhận rõ sự nguy hiểm của kháng sinh trong thủy sản gây ảnh hưởng trực tiếp đến người tiêu dùng do vậy thị trường bên ngoài đã có nhiều biện pháp nhằm kiểm soát dư lượng kháng sinh an toàn vệ sinh thực phẩm thủy sản Cụ thể ở một số thị trường bên ngoài mà Việt Nam hướng vào như Canada, Trung Quốc, Hàn Quốc, EU, Mỹ… đã ban hành những văn bản pháp lý làm rào cản trong việc kiểm soát dư lượng kháng sinh tồn tại trong sản phẩm thủy sản (Nguyễn Ngọc Hải, 2004)

Ở Việt Nam

Qua khảo sát của Nguyễn Ngọc Hải (2004) cho thấy người ương cá đều dùng thuốc hay hóa chất với nhiều chủng loại khác nhau Tỉ lệ thuốc kháng sinh nguyên liệu và thuốc có nguồn gốc kháng sinh chiếm đa số với 23 loại kháng sinh là nguyên liệu gốc và 27 loại có chứa thành phần phối chế chuyên dùng như kháng sinh, tỉ lệ thuốc kháng sinh chiếm số lượng lớn (40,65%) trong cơ cấu thuốc Ngoài ra, có nhiều loại thuốc được dùng có tên gọi không rõ ràng (12% số hộ), 6 loại đã được quy định giới hạn sử dụng tối đa: ampicillin, tetracillin, oxytetracillin, amoxicillin, cloxacillin, sulfonamide; 1 loại bị cấm

bệnh khá cao, đa phần các hộ đều không nhớ hết những loại đã sử dụng và số lần phải dùng để điều trị trong năm, ước lượng chiếm từ 8- 31% ( trung bình 15,7%) tổng chi phí vụ ương

Theo điều tra của Nguyễn Chính (2005) ở 2 tỉnh An Giang và Cần Thơ về tình hình sử dụng thuốc và hóa chất cho thấy các nhà sản xuất đã thay đổi cách phối trộn, liều lượng và đặt tên khác cho sản phẩm, cùng 1 sản phẩm nhưng có nhiều tên khác nhau như cùng sản phẩm với đơn chất là Colistin nhưng có đến

7 tên khác nhau: Coli 1000, HHN-Coli, Colimeiji, Vicoli, ST Colizon, ADP Colizon, Coli-tialincomplex Ngoài ra, nhiều loại kháng sinh điều trị cho người và gia súc cũng được người dân sử dụng trong thủy sản Liều lượng sử dụng rất khó xác định vì là thuốc phối chế

2.5 Kháng sinh 2.5.1 Khái niệm

Hiện tượng kháng sinh được Alexander Fleming phát hiện từ năm 1928 thông

qua việc phát hiện ra chất penicillin do một loại nấm có tên là Penicillin notatum sản sinh ra Đến năm 1940 người ta đã sản xuất thành công penicillin

thô thử nghiệm trên động vật có kết quả tốt, đến năm 1946 con người đã sản xuất ra được penicillin kết tinh, từ đó bắt đầu một thời kỳ mới, thời đại hoàng kim của y học: thời đại của chất kháng sinh

Theo Lê Thị Kim Liên và Nguyễn Thị Như Ngọc (2006), kháng sinh là các chất hữu cơ có cấu tạo hóa học phức tạp, có nguồn gốc sinh học (do xạ khuẩn,

vi khuẩn và nấm sinh ra), hay do con người tổng hợp nên, có tác dụng một cách chuyên biệt trên một giai đoạn chính yếu trong chu trình biến dưỡng của các vi khuẩn (tác nhân kháng khuẩn), của nấm (tác nhân kháng nấm), của virus (tác nhân kháng virus)

2.5.2 Cơ chế tác động của thuốc kháng sinh

Theo Bùi Quang Tề (2004) các thuốc kháng sinh có tác dụng độc lập với cấu trúc hóa học chính là do nó được gắn vào các điểm tác dụng, mà các điểm tác dụng này có thể xác định được một cách chắc chắn bằng các phương pháp hóa, lý khác nhau Khi thuốc kháng sinh tác động vào các điểm tác dụng, liền theo đó các quá trình sinh tổng hợp proyein, sinh tổng hợp màng, quá trình hoạt động màng, sự chuyển hóa ADN và ARN, sự tổng hợp purin và pirimidin, sự oxy hóa – khử sinh học, sự phosphoryl hóa trong cơ thể sinh vật

bị thay đổi, đảo lộn hoặc mất đi Bằng những con đường khác nhau, chất

kháng sinh làm thay đổi các yếu tố trao đổi chất của các quá trình trên và từ đó

nó thể hiện tác dụng diệt khuẩn, tác dụng kháng khuẩn hoặc các tác dụng khác trong đó có tác dụng gây nên khả năng kháng thuốc Các kết quả nghiên cứu hiện đại đã chỉ rõ hoạt động của các chất kháng sinh đều cho một hướng giống nhau ở trong cơ thể đơn bào cũng như cơ thể đa bào, nhưng những hiệu quả của các quá trình đó thể hiện bằng những đặc hiệu khác nhau cả về số lượng

Ngoài tác dụng diệt khuẩn nhóm này còn tác động kiềm hãm vi khuẩn Tuy nhiên, nhóm β-lactamin chỉ có tác dụng với vi khuẩn đang phát triển, còn vi khuẩn không phân bào thì không chịu tác dụng của thuốc do chúng có thể tổng hợp màng ngoài ( Nguyễn Khang, 2005.)

Một số loại thường dùng trong nhóm β-lactamin là amoxillin, ampicillin

thường dùng điều trị các bệnh do Stretococcosis, Edwardsiellosis, Furunculosis, Pasteurellosis.Nhóm Vibrio và Aeromonas thường kháng với

kháng sinh này ( Lê Thị Kim Liên và Nguyễn Thị Như Ngọc, 2006)

Y Nhóm Tetracyclin

Nhóm này có phổ kháng khuẩn rộng tác dụng trên vi khuẩn gram âm, gram dương, nguyên sinh động vật, là kháng sinh kìm khuẩn phổ rộng, ở nồng độ thấp có khả năng ức chế vi khuẩn nhưng ở nồng độ cao có tác dụng diệt khuẩn Các kháng sinh oxytetracyclin, chlotetracyclin và doxycyclin thuộc nhóm tetracycline được dùng phổ biến trong nuôi thủy sản Các kháng sinh này thường được dùng để trị bệnh đường ruột, bệnh nhiễm khuẩn máu, xuất huyết

ở các loài cá nước ngọt như cá tra, basa, trắm cỏ (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004)

Theo Lê Thị Kim Liên và Nguyễn Thị Như Ngọc (2006) thì các kháng sinh này được dùng để điều trị đỏ mỏ, đỏ kì, trắng da, lở loét, chướng hơi ngửa bụng trên cá, bệnh trầy da ở ếch, bệnh phồng cổ ở basa

Là nhóm kháng sinh có tác dụng diệt khuẩn, chúng tác dụng ức chế tổng hợp AND do ức chế enzyme DNA gyrase làm mất hoạt tính của enzyme này Do

có tính tạo chelat nên khi sử dụng không nên dùng chung với các chất có chứa cation hóa trị 2 vì nó sẽ làm giảm hấp thụ kháng sinh này

Các kháng sinh nhóm Quinolones được sử dụng phổ biến trong nuôi thủy sản như: enrofloxacin, norfloxacin, ciprofloxacin được sử dụng phổ biến trong

việc điều trị bệnh mủ gan do vi khuẩn E ictaluri (Từ Thanh Dung và ctv,

2005)

Theo Đỗ Thị Hòa và ctv (2004), kháng sinh norfloxacin, oxolinic acid có hoạt

phổ mạnh trên vi khuẩn gram âm, nhóm Vibrio sp gây bệnh trên tôm

Y Nhóm Sulfonamid

Là nhóm kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng trên vi khuẩn gram âm và một

số vi khuẩn gram dương Nhóm Sulfonamid chỉ có tác dụng kìm khuẩn do cấu trúc của nó tương tự như PABA ( para_aminobenzoic acid) do đó nó ức chế cạnh tranh với chất này trong một giai đoạn tổng hợp acid folic

Các kháng sinh thuộc nhóm Sulfonamid thường dùng trong thủy sản là sulfadiazine, sulfamethizole ở dạng kết hợp với trimethoprim điểu trị các bệnh như: đỏ mỏ, viêm ruột, xuất huyết, đốm trắng, đốm đỏ, trắng đuôi do vi khuẩn

gây ra trên cá, Vibrio

2.6 Những nghiên cứu về sự kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn

Edwadsiella ictaluri

- Theo kết quả khảo sát của Nguyễn Hữu Thịnh và Trương Thanh Loan (2007)

về tính đề kháng kháng sinh của 47 chủng E ictaluri cho thấy 47 chủng

E ictaluri phân lập được đều đề kháng với Sulfamethoxazole/Trimethoprim,

đối với Colostin thì có tới 46/47 chủng vi khuẩn (chiếm 97,9%) kháng với

kháng sinh này Đối với các loại kháng sinh còn lại E ictaluri đề kháng 1

phần với tỷ lệ thay đổi từ 27,7% đến 42,5%

- Qua kết quả kiểm tra kháng sinh đồ của Từ Thanh Dung và ctv (2002) trên vi khuẩn E ictaluri cho kết quả kháng với 3 loại thuốc kháng sinh là

oxytetracyllin, oxolinic acid và sulphonamid Nguyên nhân là do trong quá trình nuôi cá tra người dân thường sử dụng thuốc kháng sinh không hợp lý

- Kết quả nghiên cứu kháng sinh đồ của Nguyễn Đức Hiền (2008) tại các tỉnh Cần Thơ, An Giang, Vĩnh Long, Trà Vinh, Hậu Giang và Bến Tre cho thấy mức độ nhạy của thuốc trên vi khuẩn ngày càng giảm dần

Chú thích: Do: Doxycillin, Flo: Flofenicol, Norflox: Norfloxacin, Enro: Enrofloxacine, Amox: Amoxicilin, Sulfa+Trime: Sulfadiazin+Trimethoprim

Bộ thủy sản đã đưa ra quyết định số 07/2005/QĐ-BTS ban hành ngày 24 tháng

2 năm 2005 quy định danh mục 17 loại thuốc kháng sinh cấm sử dụng và danh mục 34 loại hạn chế sử dụng (phụ lục 1)

2.7 Các chỉ tiêu huyết học

Máu là một loại mô liên kết đặc biệt gồm các chất cơ bản là chất lỏng và phần

tế bào ( huyết cầu).Máu giữ chức năng hô hấp, vận chuyển các chất dinh dưỡng cung cấp cho cơ thể, đào thải những chất cặn bã, độc hại (trích dẫn bởi Phạm Thị Phương Tiến, 2008)

Theo Nguyễn Hoài Hương (2009) thì máu là loại mô liên kết bao gồm các tế bào lơ lửng trong khoảng gian bào là dịch lỏng Chúng có chức năng vận chuyển các chất giữa các tế bào trong cơ thể và môi trường bên ngoài, đồng thời làm nhiệm vụ bảo vệ cơ thể, điều hòa hoạt động của các cơ quan, điều hòa thân nhiệt, cân bằng nước và muối khoáng Ngoài ra máu còn tham gia vào việc duy trì ổn định áp suất thẩm thấu và độ pH của dịch thể Cùng với bạch huyết và các dịch thể khác, máu tạo thành môi trường bên trong (nội môi) Môi trường này luôn có chỉ tiêu sinh lý – sinh hóa ổn định đảm bảo cho sự tồn tại và phát triển của hệ thống sống trong cơ thể Nếu để máu vào ống nghiệm

để lắng hoặc ly tâm sẽ thấy máu phân thành 2 lớp: phía trên là huyết tương

3/08(n=120)

Bảng 2.1 So sánh độ nhạy của các loại kháng sinh đối với vi khuẩn E ictaluri phân

lập trên cá tra bệnh gan thận mủ (nguồn Nguyễn Đức Hiền, 2008)

tích Trong các tế bào máu hồng cầu có số lượng lớn nhất khoảng trên 99% tổng số, còn lại một phần rất ít là bạch cầu và tiểu cầu

2.7.1 Hồng cầu (Erythrocyte)

Hồng cầu là loại tế bào máu chiếm số lượng lớn nhất Hồng cầu trưởng thành

có dạng hình tròn hoặc oval, nhân bắt màu tím đậm đồng nhất có kích thước từ 10x11 µm-12x13µm, đường kính nhân 4-5µm (Chinabut, 1991) Tế bào chất bắt màu xanh nhạt, phân chia rõ ràng với nhân Hồng cầu chưa trưởng thành ít được tìm thấy

2.7.2 Bạch cầu đơn nhân (monocyte)

Bạch cầu đơn nhân có nhân lớn lệch tâm, hình dạng nhân biến đổi Ớ một số bạch cầu đơn nhân có thể quan sát được không bào trong tế bào chất Nhân bắt màu xanh, tế bào chất bắt màu xanh nhạt Bạch cầu đơn nhân là tế bào lớn nhất trong các dạng tế bào máu với đường kính 10-14µm

2.7.3 Bạch cầu trung tính (Neutrophil)

E: hồng cầu thành thục R: hồng cầu chưa thành thục

Hình 2.2 Tế bào hồng cầu của cá trê trắng

(Chinabut et al, 1991)

Hình 2.3 Bạch cầu đơn nhân của cá trê trắng

(Chinahut et al, 1991)

Bạch cầu trung tính có nhân nhỏ bắt màu xanh tối, thường nằm lệch về một góc tế bào, đôi khi gặp bạch cầu trung tính phân thùy rất rõ Tế bào chất có hạt dạng lưới, màu hồng nhạt, đôi khi rất khó thấy tế bào chất

2.7.4 Tiểu cầu (Thrombocyte)

Tiểu cầu có dạng dài hoặc hình thoi, nhân xanh đen chiếm hầu hết tế bào, tế

bào chất là một vành mỏng bao quanh nhân Theo Chinabut và ctv ( 1991),

tiểu cầu đảm nhận vai trò quan trọng trong quá trình đông máu khi bị tổn thương

Hình 2.4 Bạch cầu trung tính của cá trê trắng

(Chinabut et al, 1991)

Hình 2.5 Tiểu cầu của cá trê trắng

(Chinabut et al, 1991)

2.7.5 Tế bào lympho (Lymphocyte)

Tế bào lympho là dạng bạch cầu thường thấy nhất trong máu tuần hoàn, nhỏ hơn hồng cầu Tế bào lympho có nhân tròn, bắt màu tím đậm khi nhuộm với thuốc nhuộm Giemsa, tế bào chất nhỏ là một lớp mỏng bao quanh nhân Tế bào lympho chiếm 70-90% tổng bạch cầu của cá (Hibiya, 1982 Trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thúy Liễu, 2008)

Hình 2.6 Tế bào lympho của cá trê trắng

(Chinabut et al, 1991)

CHƯƠNG III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian thực hiện

Đề tài được thực hiện từ tháng 01/2009 đến tháng 05/2009

3.2 Địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm gây cảm nhiễm tại phòng gây cảm nhiễm của Khoa Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ

Phân tích mẫu tại phòng thí nghiệm bộ môn Sinh học và bệnh Thủy Sản, Khoa Thủy Sản , trường Đại Học Cần Thơ

3.3 Vật liệu nghiên cứu 3.3.1 Đối tượng nghiên cứu

Cá tra giống có trọng lượng khoảng 15–20g

3.3.2 Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu

- Kính hiển vi, cân điện tử, lame, lamelle, ống đong, ống nhỏ giọt, ống nghiệm, khẩu trang, găng tay, pipet, đầu col 1ml và 0.1ml, chai chịu nhiệt, bình tam giác, bình xịt cồn, cốc thủy tinh, bộ tiểu phẫu, que cấy, đĩa Petri, bể composite, máy sục khí, hệ thống sục khí, xô nhựa, vợt, kim tiêm, buồng đếm hồng cầu

3.3.3 Hóa chất

- NaCl, Na2SO4, Na2HPO4.2.H2O, NaH2PO4.2H2O, KH2PO4.

- Formaline (37%) , chlorine, Methyl violet, nước cất, cồn 96°, cồn 70°, methanol, glycerol, Wright, Giemsa, Acid citric, Tripticase soy agar (TSA), nutrient broth (NB)

- Dung dịch nhuộm gram, giấy test oxidase, H2O2

- Các loại kháng sinh flofenicol, docycillin, amoxcillin

3.4 Phương pháp nghiên cứu 3.4.1 Chuẩn bị thí nghiệm

- Bể composite được vệ sinh bằng xà phòng và chlorine 200 ppm, phơi khô

Bể sau đó được cấp đầy nước xử lý bằng chlorin 30ppm và sục khí liên tục trong vòng một tuần, kiểm tra lại nồng độ chlorin trong nước trước khi cho cá vào bể Nguồn nước là nước máy thành phố Bể 1m3 dùng để trữ cá được đặt ngoài trời nơi có mái che Bể 100L dùng để thí nghiệm nhưng chứa từ 70-80L nước thí nghiệm Bể được đặt trong phòng kín

3.4.2 Bố trí thí nghiệm

- Cá mua về tiến hành kiểm tra, phân lập vi khuẩn, kết quả cho thấy có 10/15 con nhiễm bệnh Thí nghiệm được bố trí trong 10 ngày với 7 nghiệm thức (3 lần lặp lại), mật độ là 10 con/bể

- Sử dụng phương pháp ngâm kháng sinh trong 7 ngày để điều trị (1 lần/ngày)

3.5 Định danh vi khuẩn

Sau khi lấy mẫu bệnh trên 3 cơ quan đem ủ vi khuẩn ở điều kiện nhiệt độ

28-300C

Ghi nhận các đặc điểm hình thái của khuẩn lạc sau 24-48 giờ:

- Hình dạng và kích thước khuẩn lạc trên môi trường TSA/NA, màu sắc khuẩn lạc, điều kiện nhiệt độ vi khuẩn phát triển

Các chỉ tiêu về sinh lý, sinh hóa (phụ lục 2):

- Nhuộm gram, kiểm tra tính di động, phản ứng oxidase, phản ứng catalase, khả năng lên men và oxi hóa đường glucose ( O-F test), khả năng sinh indole, khả năng sử dụng đường, sinh gar và H2S, phản ứng tạo nitrit từ nitrate

3.6 Phương pháp lấy mẫu máu quan sát các chỉ tiêu huyết học 3.6.1 Phương pháp lấy mẫu máu, nhuộm và đếm hồng cầu

Chuẩn bị 1990 µl dung dịch Natt & Herrick cho vào ống nghiệm, dùng ống tiêm tiệt trùng 1ml lấy máu cá (cuống đuôi) Nhỏ máu xuống 1 tấm lame rồi dùng pipet hút 10 µl máu cho vào ống nghiệm có chứa dung dịch Natt & Herrick, lắc nhẹ Trữ lạnh và đếm mẫu trong vòng 24 giờ bằng buồng đếm hồng cầu Quan sát dưới kính hiển vi quang học ( 40X) để xác định mật độ hồng cầu (2 lần lặp lại)

Cách tính mật độ hồng cầu: HC = C x 10 x 5 x 200 (tb/mm3) Trong đó C là tổng số hồng cầu trên 5 vùng đếm

Hình 3.1 Buồng đếm hồng cầu

3.6.2 Phương pháp lấy mẫu máu, nhuộm và đếm bạch cầu

Mẫu máu đếm bạch cầu được lấy cùng lúc với mẫu máu đếm hồng cầu Sau

khi cho giọt máu lên lame ( đếm hồng cầu) , tiếp tục nhỏ một giọt máu lên 1 lame khác ( lập lại 3 lần) và thực hiện thao tác trãi mẫu máu: cho lamelle chạm nhẹ vào giọt máu, đẩy lamelle ngược về phía trước Chờ cho mẫu máu khô sau

đó đem cố định trong dung dịch methanol 1-2 phút, để mẫu khô rồi trữ lạnh

+ Ngâm trong dung dịch pH 6,2 trong 15 – 30 phút

+ Rửa sạch lại bằng nước cất, để mẫu khô tự nhiên và đọc mẫu

Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100X Phân loại các tế bào máu theo

Tổng bạch cầu (TBC)

+ Đếm tổng số hồng cầu và bạch cầu trên 1.500 tế bào trên mẫu nhuộm TBC (tb/mm3) = (số bạch cầu x mật độ hồng cầu trên buồng đếm)/số hồng cầu trên mẫu

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ THẢO LUẬN

4.1 Dấu hiệu bệnh lý

Theo Từ Thanh Dung và ctv (2002) thì cá tra nhiễm E ictaluri có biểu hiện lờ

đờ, không có hiện tượng xuất huyết trên da và hậu môn, cá kém ăn ở giai đoạn mới chớm bệnh Ở cá thí nghiệm nhiễm bệnh có biểu hiện nổi đầu, bơi lờ đờ trên mặt nước Quan sát nội tạng thấy có những đốm nhỏ màu trắng xuất hiện

ở gan, thận và tỳ tạng đặc biệt là ở thận Một vài con nhiễm bệnh nặng thận bị

nhũng Từ Thanh Dung và ctv (2002) cũng tìm thấy các dấu hiệu tương tự

trong nội quan cá tra bệnh

4.2 Kết quả thí nghiệm

Qua phương pháp ngâm kháng sinh để điều trị cho cá tra nhiễm bệnh và qua

10 ngày theo dõi thí nghiệm để xác định ảnh hưởng của kháng sinh lên cá tra, kết quả cho thấy kháng sinh có ảnh hớn rất lớn đối với cá tra nhiễm bệnh

Ngày

Tỉ lệ chết (%)

Hình 4.1 Biểu đồ thể hiện tỉ lệ chết của các nghiệm thức trong quá trình

thí nghiệm Chú thích: NT1: Amoxicillin, NT2: Flofenicol, NT3: Docycillin, NT4: Flofenicol+Amoxicilin, NT5: Flofenicol+Docycillin, NT6: Amoxicillin+Docycillin, NT7: Đối chứng

Tỉ lệ chết ở nghiệm thức 1 (Amoxcilin) rất cao, 100% cá chết vào ngày thí nghiệm thứ 3 Vào ngày thứ 9 của thí nghiệm, nghiệm thức thứ 2 (Flofenicol)

và đối chứng có tỉ lệ chết lần lượt là 93% và 93,33%, trong khi 4 nghiệm thức còn lại tỉ lệ chết rất thấp, nghiệm thức 3 (Doxycilin) là 47%, nghiệm thức 4 (Flofenicol+ Amoxicillin) – 43%, nghiệm thức 5 (Flofenicol+ Doxycilin) – 30% và nghiệm thức 6(Amoxicillin + Doxycilin) là 30% Kết quả thí nghiệm cho thấy, sử dụng kháng sinh kết hợp cho hiệu quả điều trị cao hơn so với sử dụng kháng sinh đơn Tuy nhiên, ở nghiệm thức sử 3 (Doxycilin) tỉ lệ chết cũng rất thấp

4.3 Kết quả phân lập vi khuẩn

Kết quả cho thấy: khuẩn lạc của vi khuẩn phát triển chậm trên môi trường TSA (sau 48giờ), khuẩn lạc nhỏ, có màu trắng đục không đồng nhất

Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa bằng phương pháp truyền thống cho kết quả vi khuẩn gram âm, hình que, di động yếu, cho kết quả dương tính với catalase, âm tính với oxidase,lên men và oxi hóa đường glucose (O/F) Khả năng sinh indole, phản ứng VP, khả năng sinh H2S, phản ứng urea và phản ứng tạo nitrit từ nitrate đều cho kết quả âm tính, kết quả kiểm tra các loại đường chỉ có đường manose, glucose, glycerol, galactose cho kết quả dương tính, các loại còn lại cho kết quả âm tính

Hình 4.2 Khuẩn lạc trên môi trường TSA

Chú thích: các loại đường theo thứ tự từ trái qua : Manose, sucrose, xylose, glucose, mannit, glycerol, mantose, rhamnoso, inositol, galactose, sorbitol, crystal violet

Kết quả này cho thấy vi khuẩn gây bệnh là E ictaluri Từ Thanh Dung và ctv (2002), Hawke và ctv (1998) cũng phân lập được vi khuẩn E ictaluri trên cá

tra với các đặc điểm tương tự Kết quả phân lập vi khuẩn của Nguyễn Thị

Thúy Liễu (2008) trên 31 mẫu cá bệnh có 23 chủng thuộc vi khuẩn E ictaluri,

Huỳnh Chí Thanh (2007) phân lập được 9 chủng E ictaluri đều cho kết quả

tương tự với kết quả thí nghiệm

4.4 Kết quả phân tích huyết học 4.4.1 Hồng cầu

Hồng cầu ở cá bệnh có sự biến đổi về số lượng, xuất hiện nhiều hồng cầu nhiều nhân và không nhân Chúng có kích thước và bắt màu gần giống như hồng cầu thành thục nhưng nhân phân chia thành 2, 3 hoặc nhiều phần

Hình 4.6 Hồng cầu không nhân

Kết quả định lượng hồng cầu cho thấy mật độ hồng cầu trước khi trị bằng kháng sinh trung bình vào khoảng 1,8x106 tế bào/mm3, sau khi sử dụng kháng sinh mật độ hồng cầu trung bình của 6 nghiệm thức là 1,6 x106 tế bào/mm3 và nghiệm thức 7 là 0,77 x106 tế bào/mm3

Qua hình 4.4 cho thấy mật đồ hồng cầu ở nghiệm thức không sử dụng kháng sinh giảm rất nhiều so với trước khi sử dụng kháng sinh, sau khi sử dụng kháng sinh mật độ hồng còn tuy có giảm nhưng không đáng kể, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05)

Qua phân tích thống kê cho thấy, mật độ hồng cầu ở các nghiệm thức 3, 4, 5

và 7 khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) Nghiệm thức 1, 2 và 6 cho kết quả khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với trước khi sử dụng kháng sinh Mật độ hồng cầu ở nghiệm thức 1 và 2 là 19,6x106 tế bào/mm3 và 22,9x106 tế bào/mm3 cao hơn trước khi sử dụng kháng sinh trong khi các nghiệm thức còn lại thấp, đặc biệt là nghiệm thức 7 (không sử dụng kháng sinh) mật độ hồng cầu chỉ còn 0,77x106 tế bào/mm3

Phạm Thị Phương Tiến (2008) và Nguyễn Thị Thúy Liễu (2008) cũng tìm thấy được hồng cầu không nhân và hồng cầu nhiều nhân trên cá tra bệnh mủ gan Kết quả định lượng hồng cầu của Liễu (2008) ở cá tra bệnh 0,75x106 tế bào/ mm3giảm đến 2,74 lần so với cá khỏe(2,05x106 tế bào/ mm3) Còn Phan Thị Hừng (2004) cho kết quả hồng cầu cá tra bệnh giảm 50% so với cá tra

0

2

Hình 4.7 Biểu đồ mật độ hồng cầu trước khi sử dụng kháng sinh (KS), sau khi sử

sụng KS và không sử dụng KS

vế một góc, bắt màu tím Phạm Thị Phương Tiến (2008) và Nguyễn Thị Thúy Liễu (2008) cũng tìm thấy 4 loại bạch cầu này khi nghiên cứu về các chỉ tiêu huyết học trên cá tra

Bảng 4.1 Sự biến đổi số lượng các loại bạch cầu trước và sau sử dụng kháng sinh

Giá trị trên bảng thể hiện giá trị trung bình và độ lệch chuẩn Các giá trị trong cùng

1 hàng có các chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p>0.05), các chữ cái giống nhau thì khác biệ không có ý nghĩa thống kê (p<0.05)

Phân tích thống kê cho thấy, lympho và bạch cầu đơn nhân sau khi sử dụng kháng sinh và trước khi sử dụng kháng sinh khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05), trong khi đó tổng bạch cầu, tiểu cầu và bạch cầu trung tính cho kết quả khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05)

Số lượng các loại bạch cầu trước và sau khi sử dụng kháng sinh Tổng bạch cầu sau sử dụng kháng sinh là 68,4x103 tế bào/mm3 thấp hơn so với trước khi

sử dụng kháng sinh Lympho sau sử dụng kháng sinh là 33,2x103 tế bào/mm3giảm so với trước khi sử dụng kháng sinh (49,8x103 tế bào/mm3), bạch cầu đơn nhân và bạch cầu trung tính đều tăng, đặc biệt là bạch cầu đơn nhân tăng 2,8 lần so với trước khi sử dụng kháng sinh Tiểu cầu sau sử dụng kháng sinh

có giảm nhưng không đáng kể

Bảng 4.2 Số lượng các loại bạch cầu ở các nghiệm thức sau khi sử sụng kháng sinh

(x103 tế bào/mm3) Trước sử dụng KS Sau sử dụng KS

Bảng 4.2 thể hiện số lượng các loại bạch cầu ở từng nghiệm thức sau khi sử dụng kháng sinh Tổng bạch cầu ở nghiệm thức 7 là 43,7x103 tế bào/mm3, thấp nhất so với 6 nghiệm thức còn lại, tổng bạch cầu cao nhất ở nghiệm thức

6 với số lượng 99,5x103 tế bào/mm3 Các nghiệm thức còn lại có số lượng tổng bạch cầu dao động trong khoảng 49x103 tế bào/mm3 đến 92x103 tế bào/mm3

Tương tự như tổng bạch cầu, lympho và bạch cầu trung tính ở nghiệm thức 7 cũng thấp nhất với số lượng là 13,3x103 tế bào/mm3 và 7,3x103 tế bào/mm3 Trong khi đó số lượng lympho cao nhất ở nghiệm thức 6 với 53,8x103 tế bào/mm3 và bạch cầu trung tính cao nhất với số lượng 16,6x103 tế bào/mm3 ở nghiệm thức 2 Các nghiệm thức còn lại có số lượng lympho trong khoảng 24x103 ÷ 52x103 tế bào/mm3 và bạch cầu trung tính là 10x103 ÷ 16x103 tế bào/mm3

Đối với bạch cầu đơn nhân, số lượng cao nhất ở nghiệm thức 2 với 12,8x103

tế bào/mm3 và thấp nhất là 5,1x103 tế bào/mm3 ở nghiệm thức 5 Các nghiệm thức còn lại biến động trong khoảng 5,3x103 ÷ 9,6x103 tế bào/mm3

Nếu như bạch cầu trung tính và bạch cầu đơn nhân ở nghiệm thức 2 cao nhất thì tiểu cầu ở nghiệm thức 2 lại thấp nhất với số lượng là 5,3x103 tế bào/mm3

Số lượng tiểu cầu cao nhất ở nghiệm thức 6 (24,6x103 tế bào/mm3) và các nghiệm thức còn lại nằm trong khoảng 5,5x103 ÷ 12,8x103 tế bào/mm3

Theo Trần Hồng Ửng (2003), số lượng tổng bạch cầu tăng rất cao ở cá bệnh Theo Romão (2006), sự nhiễm khuẩn có thể là nguyên nhân làm tăng số lượng các bạch cầu Báo cáo của Nguyễn Thị Thúy Liễu (2008) thì cho rằng hồng cầu và tổng bạch cầu ở cá bệnh đều giảm Nguyên nhân tổng bạch cầu giảm là

do vi khuẩn xâm nhập quá nhiều gây ra tình trạng quá tải của các tế bào bạch cầu dẫn đến mất chức năng và thoái hóa Khi bị nhiễm khuẩn hệ miễn dịch không đặc hiệu của cá hoạt động làm cho số lượng các tế bào (bạch cầu trung tính và đại thực bào) tăng lên nhanh chóng Nếu vi khuẩn tồn tại lâu thì hệ

miễn dịch của cá sẽ bị tổn thương không thể chống lại mầm bệnh (Crumlish et

al, 2002)

Việc đưa kháng sinh vào điều trị có tác dụng diệt khuẩn ( hay kìm khuẩn), ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn bên trong cơ thể cá, giúp cho hệ miễn dịch của cá có thể chống lại vi khuẩn tạo sức đề kháng cho cá Tuy nhiên cũng tùy loại kháng sinh mà hiệu quả điều trị khác nhau Kết quả kháng sinh đồ của

Hawke (1979) trên 58 chủng E ictaluri với 10 loại kháng sinh thì vi khuẩn E.ictaluri nhạy cảm với Amoxcilin chiếm 84,5%, Flofenicol là 74,1% và

Docycilin là 68,9% Kết quả kháng sinh đồ do Huỳnh Chí Thanh (2007) thực

hiện cho thấy vi khuẩn E ictaluri mẫn cảm cao với Doxycilin và đề kháng với Amoxicilin Theo Trương Ngọc Loan và ctv (2007), trong 47 chủng vi khuẩn

E ictaluri thì có 20 chủng kháng với Florphenicol (42,5%), 19 chủng kháng

với Amoxicilin (40,4%) và 13 chủng với Doxycilin là 27,7%

CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận

Qua 10 ngày theo dõi thí nghiệm cho kết quả tỉ lệ chết ở nghiệm thức 1 (Amoxcilin) là 100% vào ngày thứ 3 Nghiệm thức 7 (không sử dụng kháng sinh) là 93,3%, nghiệm thức 2 (Flofenicol) là 93%, nghiệm thức 3 (Doxycillin)

là 47%, nghiệm thức 4 (Flofenicol+Amoxicillin) là 43%, nghiệm thức 5 (Flofenicol+Doxycillin) và nghiệm thức 6 (Amoxicillin+Doxycillin) là 30%

Số lượng hồng cầu cá tra nhiễm E ictaluri trước khi sử dụng kháng sinh là

1,8x106 tế bào/mm3, sau khi sử dụng kháng sinh hồng cầu trung bình của 6 nghiệm thức là 1,6x106 tế bào/mm3 và nghiệm thức không sử dụng kháng sinh

là 0,77x106 tế bào/mm3

Số lượng tổng bạch cầu trước khi sử dụng kháng sinh là 73,2x103 tế bào/mm3, sau sử dụng kháng sinh tổng bạch cầu giảm chỉ còn 68,4x103 tế bào/mm3, khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Đối với từng loại bạch cầu, lympho sau sử dụng kháng sinh là 33,2 x103 tế bào/mm3 thấp hơn trước khi sử dụng kháng sinh (49,8x103 tế bào/mm3), bạch cầu trung tính và bạch cầu đơn nhân sau sử dụng kháng sinh đều tăng Lympho và bạch cầu đơn nhân cho kết quả khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05)

Ở nghiệm thức 7 (không sử dụng kháng sinh), tổng bạch cầu là 43,7x103

tế bào/mm3 , lympho là 13,3x103 tế bào/mm3 và bạch cầu trung tính là 7,3x103 tế bào/mm3 thấp nhất so với các nghiệm thức sử dụng kháng sinh Tiểu cầu và bạch cầu đơn nhân tuy không thấp nhất trong 7 nghiệm thức nhưng với số lượng tiểu cầu là 11,7x103 tế bào/mm3 và bạch cầu đơn nhân là 6,5x103 tế bào/mm3 vẫn thấp hơn nhiều so với số lượng tiểu cầu cao nhất ở nghiệm thức

6 (24,6x103 tế bào/mm3 ) và bạch cầu đơn nhân cao nhất ở nghiệm thức 2 (12,8x103 tế bào/mm3 )

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Benli, C.K and H.Y Yildiz, 2004 Blood parameters in Nile tiapia

(Oreochromis niloticus L.) Spontaneously infected with Edwardsiella tarda Aquaculture Research, 35: 1888-1380

2 Chinabut S, P Kitsawat and C Limsuwan, 1991 Histology of the

walking catfish, Clarias batrachus International development research

centre, Canada 96 pages

3 Crumlish M, TT Dung, J F Turnbull, N T N Ngoc, H W Ferguson,

2002 Identification of Edwardsiella ictaluri from diseased freshwater catfish, Pangasius hypophthalmus ( Sauvage), culture in the Mekong

Delta , Vietnam Short communication Journal of Fish Diseases Volume 25 Issue 12 Page 733-736

4 Dương Long Trì, 2008 Báo cáo kết quả thực hiện kế hoạch tháng 8 năm 2008 ngành Nông nghiệp và PTNT Trung tâm tin học và thống

kê, Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn

5 Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội, 2004.Giáo trình bệnh học thủy sản, Khoa nuôi trồng thủy sản, Đại học Thủy sản Nha Trang

6 Hawke, J.P, R.M Durborow, R.L Thune and A.C Camus, 1998 ESC – Enteric Septicemia of Catfish SRAC Publication No.477

7 Hawke, J P 1979 A bacterium associated with disease of pond – cultured channel catfish J Fish Res Board Can

8 Huỳnh Chí Thanh, 2007 Xác định đặc điểm sinh hóa và bước đầu thử

nghiệm điều trị bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên

cá tra ( Pangasius hypophthalmus) bằng kháng sinh Luận văn tốt nghiệp Đại học, Khoa Thủy Sản, Đại học Cần Thơ 44 trang

9 Lê Thị Kim Liên và Nguyễn Thị Như Ngọc, 2006 Bài giảng thuốc, hóa chất dùng trong thủy sản Khoa Thủy Sản, Đại học Cần Thơ

10 Nguyễn Chính, 2005 Đánh giá tình hình sử dụng thuốc, hóa chất trong nuôi cá tra thâm canh tại An Giang và Cần Thơ Luận văn cao học Khoa Thủy Sản

11 Nguyễn Đức Hiền, 2008 Giải pháp tăng hiệu quả điều trị các bệnh

nhiễm khuẩn trên cá tra ( Pangasianodon hypophthalmus) Tạp chí

khoa học Thủy Sản, quyển 2, 2008

12 Nguyễn Hoài Hương, 2009 Bài giảng thực hành sinh lý động, thực vật Khoa môi trường và công nghệ Sinh học Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ TPHCM, 33 trang

13 Nguyễn Hữu Thịnh và Trương Thanh Loan, 2007 Phân lập và khảo sát

đặc điểm kháng kháng sinh của Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Pangasius hypophthalmus nuôi thâm canh Tạp chí

KHKT Nông Lâm nghiệp, Khoa Thủy Sản, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh Số 1&2, 2007

14 Nguyễn Ngọc Hải, 2004 Điều tra kỹ thuật và tình hình sử dụng thuốc

hóa chất trong ương cá tra giống (Pangasius hypophthalmus) Luận văn

tốt nghiệp Đại học, Khoa thủy sản

15 Nguyễn Khang, 2005 Kháng sinh học ứng dụng, nhà xuất bản y học,

Hà Nội

16 Nguyễn Tấn Duy Phong, 2008 Điều tra hiện trạng nuôi, bệnh và tình hình sử dụng thuốc hóa chất trong nuôi thâm canh cá tra ao Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khoa Thủy sản Trường Đại Học Cần Thơ.84 trang

17 Nguyễn Thị Thúy Liễu, 2008 Đánh giá các yếu tố miễn dịch không đặc hiệu trên cá tra nuôi trong ao bị bệnh mủ gan Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khoa Thủy sản Trường Đại Học Cần Thơ 49 trang

18 Phạm Thị Phương Tiến, 2008 Xác định một số yếu tố huyết học trên cá

tra (Pangasianodon hypophthalmus) trắng gan trắng mang ở một số

tỉnh nuôi cá tra tại Đồng Bằng Sông Cửu Long Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khoa Thủy sản Trường Đại Học Cần Thơ 73 trang

19 Phan Thị Hừng, 2004 Nghiên cứu cấu trúc mô và sự biến động số

lượng tế bào hồng cầu trên cá tra (Pangasius hypophthalmus) Luận văn

tốt nghiệp đại học Khoa Thủy Sản

20 Silva Romão, Lucélia Donatti, Matheus O Freitas, Josiane Teixeira and Josiana Kusma, 2006 Blood paremeter analysis and morphological

alterations as biomarkers on the health of Hoplias malabaricus and Geophagus brasiliensis Brazilian archives of biology and technology

21 Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Thị Tuyết Hoa, 2005 Giáo trình Bệnh học thủy sản, 131 trang

22 T T Dung, M Crumlish, H W Ferguson, N T N Ngoc, NQ Thịnh và D T

M Thy, 2002 Xác định vi khuẩn gây bệnh đốm trắng trên gan cá tra

(Pangasius hypophthalmus) nuôi thâm canh ở đồng bằng sông Cửu

Long Tạp chí khoa học thủy sản, 2002

PHỤ LỤC Phụ lục1: danh mục hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sản (Ban hành kèm theo Quyết định số 07/2005/QĐ-BTS ngày 24 tháng 2 năm 2005 của Bộ trưởng Bộ Thủy sản)

chúng

Thức ăn, thuốc thú y, hoá chất, chất xử lý môi trường, chất tẩy rửa khử trùng, chất bảo quản, kem bôi da tay trong tất cả các khâu sản xuất giống, nuôi trồng động thực vật dưới nước và lưỡng cư, dịch vụ nghề cá và bảo quản, chế biến

Phụ lục1: Danh mục hóa chất, kháng sinh hạn chế sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sản (Ban hành kèm theo Quyết định số 07/2005/QĐ-BTS ngày 24 tháng

2 năm 2005 của Bộ trưởng Bộ Thủy sản)

Thời gian dừng thuốc trước khi thu hoạch làm thực phẩm

Cơ sở SXKD phải có đủ bằng chứng khoa học và thực tiễn về thời gian thải loại dư lượng thuốc trong động, thực vật dưới nước và lưỡng cư xuống dưới mức giới hạn cho phép cho từng đối tượng nuôi và phải ghi thời gian ngừng sử dụng thuốc trước khi thu hoạch trên nhãn sản phẩm

Phụ lục 2: Phương pháp xác định đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn

Y Nhuộm gram

_ Sử dụng lame sạch, cho 1 ít nước muối sinh lý lên lame

_ Dùng que cấy tiệt trùng nhặt 1 ít vi khuẩn cho lên lame có nước muối sinh

lý và trải đều

_ Để lame khô tự nhiên

_ Hơ lame qua đèn cồn để cố định vi khuẩn, để lame nguội và tiến hành nhuộm:

+ Nhuộm crytal violet ( dd1) khoảng 1 phút, rửa lame bằng nước

+ Nhuộm iodine ( dd2) trong 1 phút, rửa lame bằng nước

+ Rửa bằng dung dịch alcohol/acetone ( dd3) từ 2-3 giây

+ Rửa lại bằng nước sạch

+ Nhuộm safranin ( dd4) khoảng 2 phút, rửa bằng nước sạch và để khô _ Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40X, vật kính 100X ( có giọt dầu)

Kết quả: Gram dương – màu xanh/ tím

Gram âm – màu đỏ/ hồng

Y Tính di động

Cho Vaseline lên 4 góc của lamelle và đặt ngửa lamelle trên bàn + Dùng pipet tiệt trùng nhỏ 1 giọt nước sinh lý ( 0.85%NaCl) lên lamelle + Tiệt trùng que cấy , lấy 1 ít vi khuẩn hòa vào nước muối sinh lý trên lamelle

+ Dùng lame đặt nhẹ lên lamelle sao cho lame không chạm vào giọt nước muối chúa vi khuẩn

+ Cẩn thận lật thật nhẹ lamelle lên để giọt nước được treo ngược trên lamelle

+ Đặt lame lên kính hiển vi và quan sát tính di động ở vật kính 40X

Y Phản ứng oxidase

_ Chạm nhẹ que thử oxidase vào 1 khuẩn lạc trên đĩa agar hoặc dùng que cấy nhặt 1 khuẩn lạc cho tiếp xúc trên que thử oxidase

_ Quan sát que thử trong 30 giây và ghi nhận sự thay đổi màu sắc

_ Kết quả: Que thử chuyển màu xanh đậm cho phản ứng oxidase dương tính

và không chuyển màu là âm tính

Y Phản ứng catalase

_ Nhỏ 1 giọt dung dịch 3% H2O2 lên lame

_ Dùng que cấy tiệt trùng lấy 1 ít vi khuẩn cho vào dung dịch 3% H2O2

_ Kết quả: Vi khuẩn cho phản ứng catalase dương tính (+) sẽ gây ra hiện tượng sủi bọt trong dung dịch 3% H 2 O 2 và ngược lại

Y Khả năng lên men và oxi hóa đường glucose (O-F test)

_ Đun và khuấy tan hoàn toàn môi trường O/F

_ Tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút, để nguội 45 phút

_ Thêm 1% glucose tiệt trùng Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm

_ Dùng đầu que cấy tiệt trùng lấy vi khuẩn trên đĩa agar

_ Cấy thẳng vào 2 ống nghiệm chứa môi trường O/F

_ Phủ 0,5-1ml dầu paraffin tiệt trùng vào 1 ống nghiệm tạo điều kiện yếm khí trong ống nghiệm ( khả năng lên men glucose:F)

_ Ống còn lại sẽ kiểm tra tính hiếu khí của vi khuẩn ( khả năng oxy hóa : O) _ Ủ trong tủ ấm 28-300C