ĐӖ án kӻ THUҰT các QUÁ TRÌNH SINH hӑc sҧn XUҨT ENZYME PECTIN METHYLESTERASE tӯ nҩm mӕc ASPERGILLUS NIGER vӟi CÔNG SUҨT 50 TҨNNĂM

() B CỌNGăTH NG TR NGăĐ I H C CÔNG NGHI P TH C PH M TP HCM KHOA CÔNG NGH SINH H C VÀ K THU TăMỌIăTR NG  Đ ÁN K THU T CÁC QUÁ TRÌNH SINH H C S N XU T ENZYME PECTIN METHYLESTERASE T N M M C ASPERGILLUS NIGER V I CÔNG SU T 50 T NNĔM Giảng viên hướng dẫn Nhóm sinh viên thực hiện Th S ĐẨOăTH M LINH NGUY N TH THANH TUYÊN H TH THU SINH PH M TH THÙY TRANG ĐẨOăLểăPH NGăUYểN TR N HOÀI NAM TP H Chí Minh, tháng 12 năm 2016 Đ ÁN K THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH H C Nhóm 01 GVHD Trang i DANH SÁCH NHÓM STT.

B CỌNGăTH NG



Đ ÁN K THU T CÁC QUÁ TRÌNH SINH H C

S N XU T ENZYME PECTIN METHYLESTERASE

T N M M C ASPERGILLUS NIGER

em trong sút quá trình tḥc hi n đề tài

Các anh ch khóa 03DHSH, các b n khóa 04DHSH đư luôn bên c nh động viên, chia sẻ, giúp đ̃ chúng em trong th i gian tḥc hi n đề tài

Do ṣ gíi h n về mặt th i gian và ki n th c, đề tài ch c ch n còn nhiều thi u sót Mong nḥn ṣ góp ý c a Quý Th y Cô để đề tƠi đ ̣c hoàn thi n nh t

Nhóm sinh viên tḥc hi n

M C L C

DANH SÁCH NHÓM i

L I C M N ii

DANH M C B NG vi

DANH M C HÌNH vii

L I M Đ U 1

CH NG 1: T NG QUAN TÀI LI U 3

1.1 T ng quan về Enzyme Pectin Methylesterase 3

1.1.1 T ng quan 3

1.1.2 Đặc điểm 3

1.1.3 C ch tác d ng 4

1.1.4 ng d ng 5

1.1.5 Ngu n thu nḥn 6

1.2 T ng quan về n m Aspergillus niger 7

1.2.1 Gíi thi u 7

1.2.2 Phân lo i 8

1.2.3 Đặc điểm hình thái 8

1.2.4 Hình th c sinh s n 9

1.2.5 Đặc điểm sinh hóa 9

1.2.6 Phân b́ 10

1.3 Các y u t́ nh h ng đ n quá trình s n xu t 10

1.3.1 nh h ng c a thành ph n môi tr ng 10

1.3.2 nh h ng c a nhi t độ 11

1.3.4 Th i gian nuôi c y 11

1.4 Ćc ph ng th c nuôi c y 12

1.4.1 Ph ng ph́p nuôi c y bề sâu SmF 12

1.4.2 Ph ng ph́p nuôi c y bề mặt SSF 12

CH NG 2: QUY TRỊNH S N XU T 16

2.1 Quy trình s n xu t 16

2.2 Thuy t minh quy trình 17

2.2.1 Nguyên li u 17

2.2.2 Ph́i trộn 18

2.2.3 Thanh trùng 18

2.2.4 Làm nguội 18

2.2.5 Nhân gíng s n xu t 18

2.2.6 Gieo gíng 19

2.2.7 Nuôi c y 19

2.2.8 Nghiền 19

2.2.9 Trích ly 20

2.2.10 K t t a 20

2.2.11 Ly tâm 21

2.2.12 Ḷc màng 21

2.2.13 S y thăng hoa (s y đông khô) 21

2.2.14 Bao gói 22

CH NG 3: TệNH TOÁN CÂN B NG VẬT CH T 23

3.1 K ho ch s n xu t 23

3.2 Tính toán cân b ng ṿt ch t cho từng giai đo n 23

3.2.1 Bao gói 24

3.2.2 Quá trình s y 24

3.2.3 Quá trình ḷc 25

3.2.4 Quá trình ly tâm 25

3.2.5 Qú tr̀nh k t t a 26

3.2.6 Quá trình trích ly 26

3.2.7 Qú tr̀nh nghiền 26

3.2.8 Quá trình lên men 27

3.2.9 Quá trình thanh trùng và làm nguội 27

3.2.10 Quá trình ph́i trộn 27

3.2.11 Quá trình chuẩn b nguyên li u 27

CH NG 4: TệNH TOÁN THI T B 29

4.1 Thi t b nghiền nguyên li u 29

4.2 Thi t b ph́i trộn 30

4.3 Thi t b thanh trùng 31

4.4 Thi t b lên men 32

4.5 Thi t b nhân gíng 34

4.6 Thi t b nghiền 36

4.7 Thi t b trích ly 38

4.8 Thi t b k t t a 40

4.9 Thi t b ly tâm 41

4.10 Thi t b ḷc 43

4.11 Thi t b s y 45

4.12 Thi t b đóng gói 48

CH NG 5: TệNH TOÁN KINH T 50

5.1 V́n ć đ nh 50

5.1.1 Chi phí thi t b 50

5.1.2 Chí phí nhƠ đ t, xây ḍng 51

5.2 Chi phí s n xu t tṛc ti p 53

5.2.1 Chi phí nguyên li u s n xu t 53

5.2.2 Chi phí nhân công 54

5.2.3 Chi phí năng l ̣ng tiêu th 55

5.3 Chi phí s n xu t gián ti p 55

5.3.1 Phí b o trì thi t b và công trình 55

5.3.2 Phí xử lỦ n ́c th i 55

5.3.3 Phí phát sinh 55

5.3.4 Chi phí b o hiểm nhân công 56

5.3.5 Lãi vay v́n ngân hàng 56

5.3.6 T ng kh u hao 57

5.4 V́n l u động 57

5.5 T ng v́n đ u t 57

5.6 Giá thành s n phẩm 57

5.7 Ḷi nhụn h ng năm 58

5.8 Th i gian hoàn v́n c a ḍ án 58

CH NG 6: TệNH TOÁN R I RO 59

5.4 Đ́nh gí tính kh thi c a ḍ án Error! Bookmark not defined. 5.4.1 Giá tr hi n t i thu n (NPV) 59

5.4.2 T su t hoàn v́n nội bộ (IRR) 61

CH NG 7: TệNH TOÁN R I RO 62

K T LUẬN 63

TÀI LI U THAM KH O 64

DANH M C B NG

B ng 2.1: Thành ph n dinh d ̃ng c a cám 17

B ng 2.2: Thành ph n môi tr ng Czapek 18

B ng 3.1: T l hao h t trong từng công đo n 23

B ng 3.2: Kh́i l ̣ng từng thành ph n 28

B ng 4.1: B ng thông ś thi t b nghiền nguyên li u 29

B ng 4.2 :B ng thông ś thi t b ph́i trộn 30

B ng 4.3: :B ng thông ś thi t b thanh trùng 31

B ng 4.4: Thông ś giá lên men 33

B ng 4.5: B ng thông ś thi t b nghiền 37

B ng 4.6: B ng thông ś thi t b trích ly 39

B ng 4.7: Thông ś thi t b k t t a 41

B ng 4.8: B ng thông ś thi t b ly tâm 42

B ng 4.9: Thông ś thi t b ḷc khung b n 44

B ng 4.10: B ng thông ś thi t b s y 45

B ng 4.11: Các thông ś k thụt c a ḿy đóng gói 49

B ng 5.1: Tính toán chi phí thi t b 50

B ng 5.2: Danh m c ph ng ti n ṿn t i 51

B ng 5.3: Chi phí xây ḍng các công trình 51

B ng 5.4: Chi phí nguyên li u và hóa ch t cho 1 mẻ s n xu t 53

B ng 5.5: Chi phí nhân công chi ti t 54

B ng 5.6: Chi phí năng l ̣ng tiêu th trong một năm 55

B ng 6.1: Giá tr dòng tiền c a ḍ án 59

DANH M C HÌNH

Hình 1.1: C u trúc không gian ba chiều c a PME 4

Hình 1.3: Aspergillus niger 5

Hình 1.4: Bào tử c a A.niger 8

Hình 1.5: Ṣ phát triển c a n m ṣi khi nuôi c y bề mặt 15

Hình 4.1: Thi t b nghiền 2012GM 29

Hình 4.2: Thi t b trộn Coulter Mixer LDH-2 30

Hình 4.3: Thi t b thanh trùng n m ngang 31

Hình 4.4: Khay lên men môi tr ng bán r n trong phòng lên men 33

Hình 4.5: Máy nghiền DP28 37

Hình 4.6: Thi t b trích ly Ruian Xuanli Machinery Co., Ltd 39

Hình 4.7: S đ c u t o thi t b k t t a enzyme 40

Hình 4.8: Thi t b ly tâm DHC400 42

Hình 4.9: Thi t b ḷc khung b n XmaZ 20/800U 44

Hình 4.10: Thi t b s y FD300 Freeze Dryer 45

Hình 4.11: Thi t b đóng gói SV-L 48

L I M Đ U

Trong nhiều th k qua, enzyme đư đ ̣c sử d ng nhiều trong các lo i tḥc

phẩm cũng nh ćc ngƠnh công nghi p khác (Kashyap et al, 2001; Aehle, 2004)

Vi c sử d ng enzyme trong s n xu t tḥc phẩm giúp t o ra các s n phẩm có năng

su t và ch t l ̣ng cao v́i giá thành th p, đ m b o s c khỏe c a ng i tiêu dùng

h n so v́i vi c sử d ng các ph gia mà l i thân thi n v́i môi tr ng Vi c ng

d ng enzyme trong tḥc phẩm đặc bi t là ch bi n n ́c qu và nhiều lĩnh ṿc khác

đư vƠ đang lƠ một trong những v n đề mang tính c p thi t vƠ có Ủ nghĩa tḥc ti n Trong lĩnh ṿc ch bi n n ́c qu : Các nghiên c u th tr ng ḿi nh t cho

th y n ́c úng tŕi cơy ngƠy cƠng đ ̣c a chuộng T́c độ tiêu dùng n ́c ép trái cơy b̀nh quơn đ u ng i tăng nhanh so v́i n ́c úng có gas Theo ś li u Công ty

C ph n n ́c gi i kh́t Tribeco năm 2004 th̀ th tr ng n ́c không gas tăng 10%/năm trong khi th tr ng n ́c ng̣t có gas ti p t c s t gi m 5%/năm Theo đó,

cho th y xu h ́ng chuyển d ch tiêu dùng sang n ́c úng gi i khát không gas có ḷi

cho s c khỏe Theo ś li u th́ng kê năm 2007 th̀ th ph n n ́c trái cây toàn c u

ch y u tâp trung Châu Âu (45,8%), M (37,7%) trong khi đó Chơu Á còn r t

khiêm t́n V́i tiềm năng về ngu n nguyên li u thì Vi t Nam hoàn toàn có thể s n

xu t các lo i n ́c úng trái cây Vi c sử d ng enzyme để tăng hi u su t ép d ch

qu cũng nh tăng độ trong c a d ch qu là h t s c c n thi t

Pectin methylesterase (PME) một enzyme thuộc nhóm pectinase đư đ ̣c quan

tâm sử d ng và phát triển nhiều qúc gia (Saurel et al., 2003; Suutarinen và Autio,

2004) v́i các m c đích h n ch ṣ phá h y c u trúc c a t bào tḥc ṿt, tăng hi u

su t ly trích n ́c qu vƠ thúc đẩy nhanh quá trình s y rau qu (Van, 1979;

Sajjaanantakul và Pitifer, 1991) NgoƠi ra enzyme nƠy còn đ ̣c sử d ng trong một

ś ngành công nghi p khác nh m xử lý ngu n nguyên li u giàu pectin, ví d ngành

công nghi p d t, xử lỦ n ́c th i, công nghi p gi y, bột gi y, khai thác d u (Jayani

et al, 2005; Kashyap et al, 2001)

Bên c nh PME từ tḥc ṿt, ngu n giƠu PME vƠ đ ̣c sử d ng nhiều nh t trong

các ch phẩm pectinase th ng m i là các PME từ vi sinh ṿt (Solis – Pereira et

al.,1993) Khi so sánh kh năng sinh pectinase c a Aspergillus niger và các n m

ḿc khác, Aspergillus niger đ ̣c xác nḥn là nhóm có kh năng sinh enzyme

pectinase ho t tính cao và là ngu n ph bi n nh t cho s n xu t enzyme này (Taragano et al.,1997)

Trên th gíi đư có nhiều nghiên c u cũng nh vi c nuôi c y, thu nḥn

enzyme PME từ Aspergillus niger Tuy nhiên, Vi t Nam hoàn toàn không có

x ng s n xu t ch phẩm enzyme, hƠng năm n ́c ta ṽn ph i nḥp ngo i một kh́i

l ̣ng ĺn các lo i enzyme (Đặng Th Thu và Nguy n Th Xuân Sâm, 2009) Do

đó vi c xây ḍng một quy tr̀nh cũng nh nhƠ ḿy s n xu t enzyme pectin

methylesterase từ n m ḿc Aspergillus niger v́i quy mô công nghi p là h t s c

c n thi t Đó lƠ lỦ do chúng em tḥc hi n đề tƠi ắS n xu t enzyme pectin

methylesterase t n m m c Aspergillus niger v i công su t 50 t n/nĕmẰ

CH NGă1: T NG QUAN TÀI LI U

1.1 T ng quan về Enzyme Pectin Methylesterase

1.1.1 T ng quan

Enzyme pectinase là nhóm enzyme th y phân ch t pectic có trong tḥc ṿt

Chúng bao g m: polygalacturonases, pectinlyase, và pectin methylesterase (Pooja Kohli và cộng ṣ, 2015) Những enzyme này có vai trò h t s c quan tṛng trong quá

trình b o qu n trái cây và hoa qu Enzyme pectinase đ ̣c ng d ng nhiều trong

ch bi n tḥc phẩm, đặc bi t là kh năng lƠm trong n ́c qu Vi c kiểm soát ho t động c a enzyme cũng có thể điều ch nh đ ̣c độ nh́t c a s n phẩm (Nguy n Đ c

L ̣ng và cộng ṣ, 2010) Đơy lƠ nhóm enzyme đ ̣c ng d ng rộng rãi trong công

nghi p ch đ ng sau enzyme amylase và protease

Enzyme pectin methylesterase (PME, EC 3.1.1.11) còn có tên g̣i khác là

pectinesterase (PE) là enzyme thuộc nhóm pectinase xúc tác ph n ng th y phân

liên k t methyl ester c a pectin, gi i phóng methanol và hình thƠnh pectin có độ

methoxyl th p là các acid peptinic hoặc các acid peptic Đơy lƠ enzyme đặc hi u,

hi u su t phân gi i pectin có thể đ t 98% (Nguy n Đ c L ̣ng và cộng ṣ, 2010)

Pectinase đ ̣c tìm th y trong tḥc ṿt, vi khuẩn và n m Các PME trong tḥc

ṿt và vi khuẩn có pH t́i u lƠ 6 - 8, trong khi PME s n xu t b i n m độ pH t́i u

là 4 – 6 Các enzyme pectinase th ng m i đ ̣c s n xu t b i các ch ng vi sinh an

toàn từ Aspergillus sp Chúng đ ̣c sử d ng rộng rãi trong ngành ch bi n đ úng

n ́c trái cây (Samantha Lemke Gonzalez, Neiva Deliberali Rosso, 2011)

1.1.2 Đặcăđi m

PME có kích th ́c trung bình hay phân tử kh́i vào kho ng 25 ÷ 54 kDa

PME thu nḥn từ những ngu n kh́c nhau có điểm đẳng đi n (pI) không gíng nhau Điểm đẳng đi n c a PME thay đ i từ 3,1 đ́i v́i một ś enzyme đ ̣c sinh

t ng ḥp từ n m ḿc đ n giá tr pI lƠ 11 trong tr ng ḥp PME ly trích từ cà chua

H u h t PME chi t xu t từ tḥc ṿt có pI trung tính đ n kiềm, ch một vƠi tr ng

ḥp PME có pI mang tính acid (Marianne Bordenave, 1996)

Hình 1.1: C ấu trúc không gian ba chiều của PME (Fabienne Micheli, 2001)

Đặc điểm c a pectineaterase tḥc ṿt: cà chua ch a ít nh t hai lo i PE C PE1

vƠ PE2 đều tăng trong giai đo n đ u c a qú tr̀nh chín Khi b ́c vƠo giai đo n

chín, nông độ enzyme PE1 gi m xúng nh ng PE2 tích lũy d n đ n khi qu có màu đặc tr ng c a trái chín PE2 có kh́i l ̣ng phân tử 23kD, pH t́i u 7,6 Enzyme

này b b t ho t 50% sau 5 phút đun 67oC Ćc ion Ca2+ vƠ Na+ lƠm tăng ho t độ

c a enzyme lên t́i đa các n ng độ 0,005M và 0,05M theo th ṭ

PE trong qu cam có hai lo i: đó lƠ isoenzyme PE1 vƠ PE2 có kh́i l ̣ng

phân tử 36kD nh ng có điểm đẳng đi n khác nhau là 10,05 và >= 11,0 theo th ṭ

pH t́i u c a PE1 là 7,6 còn c a PE2 là 8,0

Enzyme từ vi sinh ṿt: t t c các enzyme vi sinh ṿt không ph i là protein

kiềm PE c a Aspergillus có điểm đẳng đi n và pH t́i u n m trong kho ng acid

Ho t động c a enzyme PE sinh ra b i A niger đ t t́i đa pH 4,5 40o

C Các PE acid và kiềm có thể đề methyl hóa có ch t pectin theo cùng một kiểu PE kiềm làm

hình thành các pectin đ ̣c đề ester hóa và pectin này có thể t o gel y u v́i ion

calcium; PE acid t o ra pectin b đề ester hóa có kh năng t o gel m nh v́i ion

calcium (Nguy n Đ c L ̣ng và cộng ṣ, 2010)

1.1.3 C ăch tác d ng

Vách t bào tḥc ṿt có c u trúc r t ph c t p quy t đ nh kích th ́c, hình

d ng, liên quan đ n ṣ tăng tr ng và phát triển c a t bào Thành ph n ch y u c a

vách t bào là các polysaccharides: cellulose, hemicelluloses và pectin, pectin chi m kho ng 35% tṛng l ̣ng khô c a thành t bào (Fabienne Micheli, 2001) Ĺp pectin

có vai trò là liên k t các t bào v́i nhau, do đó khi s n xu t n ́c d ch qu hàm

l ̣ng pectin cao s lƠm n ́c d ch qu b đ c và r t nh́t gây nh h ng ĺn đ n

quá trình s n xu t B sung enzyme vào kh́i th t qu nghiền lƠm tăng hi u su t thu

h i d ch qu Thêm vƠo đó, ṣ phân h y một phẩn t bào b i enzyme t o thụn ḷi

cho vi c tách chi t các ch t màu, ch t th m vƠ góp ph n c ithi n ch t l ̣ng c m

quan c a d ch qu (Đặng Th Thu và cộng ṣ, 2012)

Enzyme pectin methylesterase xúc tác ṣ th y phân c a các nhóm methyl ester Enzyme th ng t n công vào các nhóm ester methyl c a đ n v galacturonate

n m kề đ n v không b ester hóa, phân c t các nhóm methoxy (COOCH3) đ ng

c nh các nhóm –COOH ṭ do, t o thành acid pectinic hoặc acid pectic và methanol Pectinesterase th ng đ ̣c ho t hóa b i các ion Ca2+ và Mg2+ (Nguy n Đ c L ̣ng

và cộng ṣ, 2010)

Hình 1.2: Ph ản ứng thủy phân của PME (Fabienne Micheli, 2001)

Các nghiên c u đ́i v́i PME cũng cho th y ph n ng PME thuộc tr ng ḥp

PME đ ̣c sử d ng trong lĩnh ṿc s n xu t công nghi p r ̣u vang và n ́c

trái cây kể từ năm 1930 Ćc ch phẩm pectinase th ng m i, chi m kho ng 25%

l ̣ng enzyme ng d ng trong tḥc phẩm c a th gíi PME đ ̣c s n xu t nhiều

nh t từ các ngu n n m (Aspergillus niger) vƠ đ ̣c ng d ng nhiều trong công

nghi p tḥc phẩm (Pooja Kohli và cộng ṣ, 2015)

Trong s n xu t r ̣u vang, n ́c qu LƠm tăng hi u su t trích ly b ng cách

phá ṽ c u trúc c a pectin làm gi m độ nh́t c a các lo i n ́c ép trái cây giúp tăng

hi u qu ḷc và ly tâm Để gi m pectin, PME đ ̣c sử d ng k t ḥp v́i pectinase kh́c nh polygalacturonases và pectinlyase Trong một ś tr ng ḥp, pectinase

đ ̣c k t ḥp v́i cellulase và hemicellulases để phá ṽ hoàn toàn thành t bào tḥc

ṿt

C i thi n c u trúc rau qu : Trong công nghi p, h u h t ćc qú tr̀nh nh ch n,

làm l nh, khử n ́c, thanh trùng và ti t trùng đ ̣c áp d ng để b o qu n trái cây và

rau qu Tuy nhiên, cách này t́c động tiêu c̣c đ n ch t l ̣ng rau qu , có thể kh c

ph c đ ̣c tình tr ng này b ng cách sử d ng PME và CaCl2 lƠm săn ch c rau qu

C ch này ḍa trên ṣ đề methyl hóa c a pectin trong mô tḥc ṿt do t́c động c a

PME và canxi Khi có mặt c a ion Ca2+ ćc pectin đư b khử ester s t o gel giúp

thành t bào tr nên c ng ch c h n Khi không có Ca2+

k t ḥp vào m ch pectin thì

enzyme polygalacturonases và pectinlyase s ho t động và th y phân ng̃u nhiên

m ch polymer c a pectin làm cho rau qu tr nên mềm h n (Tr n Thanh Trúc,

2013)

Trong s n xu t cà phê Ng i ta dùng pectinase để tách ĺp keo trên bề mặt

c a h t cƠ phê, tr ́c đơy dùng vi sinh ṿt để tḥc hi n nh ng quá trình x y ra không đ ng đều và khó kiểm soát nên hi n nay th ng dùng các ch phẩm từ

enzyme pectinase để thay th Ngoài ra vỏ cà phê là một ph phẩm không thể tránh

khỏi trong quá trình s n xu t cà phê Trong thành ph n c a nó ch a nhiều ḥp ch t

khó phân h y ṭ nhiên B ng vi c sử d ng 2 ch ng n m ḿc Trichoderma viride và Aspergillus niger để sinh t ng ḥp cellulase và pectinase làm cho quá trình phân

h y di n ra nhanh h n, góp ph n làm gi m ô nhiềm môi tr ng (Tr n Th Thanh

Thu n, Nguy n Đ c L ̣ng, 2009)

1.1.5 Ngu n thu nh n

Vi c sử d ng vi sinh ṿt làm ngu n nguyên li u để s n xu t enzyme đang r t

đ ̣c quan tâm Hi n có h n 50% t ng l ̣ng enzyme công nghi p đ ̣c s n xu t từ

n m men và n m ḿc, một ph n ba đ ̣c t ng ḥp từ ngu n vi khuẩn và ph n còn

l i từ tḥc ṿt, động ṿt

Các vi sinh ṿt có kh năng t ng ḥp pectinase ch y u là vi sinh ṿt hi u khí,

tiêu biểu là các dòng sau:

- N m men: Saccharomyces fragilis

- N m ḿc: Aspergillus sp., Penicillium glaucum, Botrytis cinerea, Fusarium moniliforme, Rhizoctonia solani, Rhizopus stolonifer, Trichoderma sp., Neurospora

crassa,…

- Vi khuẩn: Bacillus polymyxa, Bacillus felineus, Flavobacterium pectinovorum, Klebsiella aerogenes, Erwinia carotovora,

V́i u điểm là d nuôi c y, sinh tr ng và phát triển nhanh cho nhiều enzyme

trong một th i gian ng n, vi sinh ṿt đặc bi t là n m ḿc đ ̣c sử d ng ph bi n để

nuôi c y thu enzyme pectinase th ng m i, trong đó, A niger là ch ng sinh enzyme

pectinase nhiều (Lê Th thu Trang, 2011)

Enzyme pectin methylesterase đ ̣c tìm th y một ś loài tḥc ṿt: cà chua,

cam, đu đ , táo, kiwi, vỏ b i, cam quýt Các lo i n m và vi khuẩn (Aspergillus niger, Erwinia chrysanthemi, Pseudomonas solanacearum ) đ ̣c ng d ng nhiều

trong s n xu t các lo i r ̣u, n ́c trái cây và các ngành công nghi p tḥc phẩm

khác (Pooja Kohli và cộng ṣ, 2015)

PME lƠ enzyme đ ̣c sinh t ng ḥp ch y u trong nhóm pectinase từ A niger

Các nghiên c u về vai trò c a dòng n m ḿc đ n kh năng sinh enzyme cũng đư

xác nḥn ho t tính c a enzyme pectin methylesterase đ ̣c thu nḥn từ n m ḿc

Aspergillus niger cao h n hẳn so v́i các loài n m ḿc kh́c H n th nữa A niger

còn đ ̣c công nḥn là dòng n m có đặc tính an toàn d phát triển và phân ḷp (Tr n

Thanh Trúc, 2013)

1.2. T ng quan về n m Aspergillus niger

1.2.1 Gi i thi u

Aspergillus niger là một trong những loài vi sinh ṿy quan tṛng đ ̣c sử d ng

trong công ngh sinh ḥc Là loài ph bi n nh t trong chi Aspergillus, phân b́ rộng

rưi trên ćc c ch t ṭ nhiên, trong các s n phẩm nông công nghi p và nhiều vùng

đ a lý khác nhau trên th gíi Hi n nay, Aspergillus niger đ ̣c sử d ng ch y u

trong công nghi p s n xu t enzyme (điển h̀nh nh α -amylase, glucoamylase,

pectinase, protease, cellulase ) trong công nghi p ch bi n tḥc phẩm, công nghi p

s n xu t một ś acid hữu c nh acid citric, acid gluconic,ầ

1.2.2 Phân lo i

1.2.3 Đặcăđi m hình thái

C u trúc vi thể: bào tử dính dƠi tr n không mƠu hay nơu, thể b̀nh 2 đ́y, túi

n m tròn đ u xòe A.niger sinh s n b ng hình th c bào tử dính không có túi bao

ḅc

C thể d ng ṣi, g̣i là khuẩn ty hay ṣi n m (hypha), nhiều ṣi (lypha), ḥp

l i thành h ṣi n m (mycelium).Khuẩn ty c a n m ch tăng tr ng ng̣n và có v́ch ngăn, g m hai lo i:

 Khuẩn ty dinh d ̃ng: khuẩn ty phát triển trong c ch t, có kích th ́c nhỏ,

màu tr ng Các khuẩn ty b n chặt thành một kh́i r t dai, ăn sơu vƠo môi

tr ng nuôi c y để hút d ̃ng ch t Khi già h ṣi ngã sang màu vàng

 Khuẩn ty sinh s n: khuẩn ty phát triển trong không khí, có kích th ́c ĺn h n

khuẩn ty dinh d ̃ng r t nhiều, trong sút Khuẩn ty sinh s n h ́ng vào không khí để l y oxy, có kh năng t o bào tử khi già

Tóm l i, khi già h ṣi có nhiều bi n đ i: một ś khuẩn ty dinh d ̃ng t o

thành các h ch n m làm h ṣi ngã sang mƠu vƠng Trong khi đó, khuẩn ty sinh s n

hình thành các bào tử đính lƠm cho bề mặt khuẩn l c có mƠu đen (Tr n Thanh Trúc,

2013) Thành c a khuẩn ty n m có c u t o ṣi, thành ph n hóa ḥc chính là chitin

và glucan

C quan sinh s n có d ng nh hoa cúc Cúng bào tử tr n nhẵn, trong sút

hoặc nâu nh t, cúng bào tử có ph n phình to đ u t o thành ḅng ĺn d ng hình

c u đ ̣c g̣i là ḅng đ nh giá hình c u (vesicle), trên có ṃc lên những thể bình là

Chi (Genus): Aspergillus

Loài (Species): Aspergillus niger

c quan t o bào tử đính (conidi) vƠ từ ng̣n thể bình sinh ra các chuỗi bào tử đính (conidia) LoƠi A.niger đ ̣c phân bi t v́i các loài khác trong chi Aspergillus b i

kh́i bào tử đính mƠu đen

1.2.4 Hình th c sinh s n

A.niger có thể sinh s n theo hai hình th c chính:

 Sinh s n sinh d ̃ng: từ một đo n khuẩn ty riêng lẻ có thể phát triển thành

một h ṣi n m Khuẩn ty c a n m ḿc có thể l̃n vào b i, không khí bay đi kh p

n i, gặp điều ki n thụn ḷi s nhanh chóng phát tri n thành khuẩn l c ḿi

 Sinh s n vô tính: A.niger sinh s n vô tính b ng bào tử tr n (conidium) H u

nh ćc bƠo tử tr n là các bào tử ngo i sinh, nghĩa lƠ đ ̣c hình thành bên ngoài t

bào sinh bào tử tr n (conidiogenóu cell) Các bào tử này sinh ra tṛc ti p trên khuẩn

ty hoặc đặc bi t là cúng bào tử tr n (conidiophone)

1.2.5 Đặcăđi m sinh hóa

 Kh năng đ ng hóa các lo i đ ng khác nhau

A.niger đ ng hóa t́t các lo i đ ng nh glucose, fructose, saccharose,

mannose Đ́i v́i đ ng sorbose, galactose, A.niger đ ng hóa m c khá t́t, còn

đ ng lactose th̀ đ ng hóa m c trung bình

 Ngu n dinh d ̃ng nit

A.niger có kh năng sử d ng ure làm ngu n N và ch t điều ch nh pH, dúi tác

d ng c a enzyme urease, ure phân h y thành CO2 và NH3 A.niger đ ng hóa các

múi amon Vi c sử d ng ngu n N hữu c , urease vƠ ćc múi amon đều g n liền

v́i vi c tách NH3 ra r i h p thu vƠo c thể Nh ṿy NH3 lƠ trung tơm con đ ng dinh d ̃ng nit c a vi sinh ṿt

Hình 1.4: Bào t ử của A.niger

 Ngu n dinh d ̃ng khoáng phospho

Ṣ có mặt c a các ḥp ch t phospho và n ng độ c a chúng trong môi tr ng

có nh h ng r t ĺn đ n qú tr̀nh trao đ i ch t trong t bào vi sinh ṿt Thay đ i

n ng độ các ḥp ch t phospho trong môi tr ng s d̃n đ n thay đ i các quá trình

t ng ḥp hàng lo t các ch t ḥp ph n c a t bào có ch a phospho, t bào và ch t

nhân NgoƠi ra, phospho có trong môi tr ng còn có tác d ng điều ch nh ho t tính

h enzyme đ ng hóa các lo i th c ăn cacbon

 Kh năng sinh t ng ḥp enzyme

A.niger có kh năng sinh ćc enzyme nh amylase, protease, peptinase, α

-amylase, glucoamylase

1.2.6 Phân b

Aspergillus niger phân b́ nhiều trong ṭ nhiên, đ t, xác bã tḥc ṿt, hoa qu

vƠ đặc bi t có nhiều vùng khí ḥu m áp Chúng là những c thể hi u khí śng

ho i sinh hoặc ký sinh, không có kh năng quang ḥp t o ch t hữu c mà śng nh

kh năng h p th các lo i ch t hữu có sẵn qua bề mặt khuẩn ty

1.3 Các y u t nhăh ngăđ n quá trình s n xu t

1.3.1 nhăh ng c a thành ph nămôiătr ng

 Ngu n carbon

Ngu n carbon là thành ph n đóng vai trò đặc bi t trong ṣ phát triển c a vi

sinh ṿt Đ́i v́i quá trình sinh t ng ḥp PME, cũng nh ćc enzyme kh́c trong

nhóm pectinase, ngu n carbon giƠu pectin có độ methoxyl hóa cao vƠ đ n phơn tử

nh acid pectic, D-galacturonate và một ś ngu n carbohydrate kh́c th ng đ ̣c

sử d ng (Sajjaanantakul và Pitifer, 1991) Các thành ph n này không ch đóng vai trò đ n thu n là ngu n carbon cho ṣ phát triển c a vi sinh ṿt, mà còn là một c

ch t c m ng, xúc tác cho quá trình sinh t ng ḥp PME (Sajjaanantakul và Pitifer,

1991; Nguy n Đ c L ̣ng, 2004; Vinod Kumar Joshi et al., 2006)

 Ngu n nito

Nito tham gia vào quá trình t o protein, acid nucleic và nhiều ch t có đặc tính

sinh ḥc khác c a t bào sinh ṿt Môi tr ng có đ l ̣ng carbon và nito c n thi t

s tích lũy l ̣ng enzyme ĺn nh t Ngoài ra, do acid amin là những c u tử ḥp

thành phân tử enzyme, acid amin có nh h ng t́t đ n sinh lý c a vi sinh ṿt cũng

nh quá trình sinh t ng ḥp enzyme Acid amin có thể đ ng th i vừa là ngu n

carbon, ngu n nitrogen và là ngu n năng l ̣ng (Nguy n Đ c L ̣ng, 2004)

 Ngu năc ch t

Đặc điểm chung c a môi tr ng nuôi c y vi sinh ṿt thu enzyme pectinase cũng nh PME là ṣ có mặt ch t c m ng (Nguy n Đ c L ̣ng, 2004)

 Ngu năkhoángădinhăd ỡng

Các nguyên t́ đa vi l ̣ng có nh h ng ĺn đ n ṣ sinh tr ng và t ng ḥp

enzyme c a vi sinh ṿt Phospho c n để t ng ḥp các thành ph n quan tṛng c a t

bào và nhiều coenzyme Phospho nh h ng tṛc ti p đ n ṣ sinh s n c a n m ṣi

và các vi sinh ṿt khác Cation Mg2+

có nh h ng đ n độ bền nhi t c a enzyme

L u huỳnh có mặt trong các acid amin quan tṛng nh methionine, cysteine, có vai

trò tích c̣c trong vi c kích thích ṣ hình thành enzyme Ngoài ra, calcium, mangan, corban,ầ cũng nh h ng đ n ṣ t ng ḥp enzyme (Nguy n Đ c L ̣ng, 2004)

1.3.2 nhăh ng c a nhi tăđ

Nhi t độ quá cao hoặc quá th p s nh h ng đều nh h ng đ n ṣ sinh

tr ng và phát triển c a n m ḿc và làm gi m ho t ḷc c a enzyme Nhi t độ t́t

nh t cho A.niger phát triển và lên men là 30-40oC

1.3.3 nhăh ng c a pH

Khi nuôi c y b ng ph ng ph́p bề mặt, do môi tr ng có dung d ch đ m cao

và hàm ẩm th p nên giá tr pH c a d ch trích sau lên men th ng ít thay đ i trong

kho ng th i gian nuôi c y Tuy nhiên, giá tr pH ban đ u c a môi tr ng có nh

h ng không nhỏ đ n ṣ phát triển c u n m ḿc và ṣ t o thành enzyme Khi pH môi tr ng chuyển d ch về phía acid hoặc kiềm, ṣ t o thành sinh kh́i không b

nh h ng nh ng ṣ t o thành enzyme l i b kìm hãm Giá tr pH t́i u trong quá

trình lên men là 4,0 (Vinod Kumar Joshi et al., 2006)

1.3.4 Th i gian nuôi c y

Th i gian lên men nh h ng đ́ng kể đ n kh năng sinh t ng ḥp enzyme và

ho t tính c a enzyme Vi sinh ṿt c n th i gian để phát triển và s n sinh enzyme

N u th i gian qú dƠi môi tr ng s c n d n dinh d ̃ng vi sinh ṿt phát triển kém vƠ do đó ho t tính enzyme s b gi m, ngoài ra vi c t o bào tử cũng s làm

gi m ho t tính c a enzyme Đ́i v́i A niger quá trình sinh t ng ḥp enzyme nhiều

nh t th ng k t thúc khi n m b t đ u sinh bào tử (Nguy n Đ c L ̣ng, 2004) PME

đ ̣c t ng ḥp từ A niger đ ̣c nuôi c y trong th i gian 96 gi (Vinod Kumar Joshi

et al., 2006)

1.4 Cácăph ngăth c nuôi c y

Quá trình nuôi c y A niger để thu nḥn PME có thể đ ̣c tḥc hi n b ng hai

ph ng ph́p lên men kh́c nhau: lên men bề mặt trên môi tr ng r n (SSF) và lên

men bề mặt trên môi tr ng lỏng (SmF)

Các nghiên c u tr ́c đư cho th y enzyme thu đ ̣c từ ph ng ph́p SSF có

ho t tính cao h n so v́i ph ng ph́p SmF khi nuôi c y trên cùng lo i vi sinh ṿt

vƠ c ch t lên men, ho t tính c a PME trong ph ng ph́p SSF cao h n 2,3 l n so

v́i SmF (Vinod Kumar Joshi et al., 2006)

1.4.1 Ph ngăphápănuôiăc y bề sâu SmF

Nuôi c y chìm hay nuôi c y bề sâu dùng d ch thể Ch ng vi sinh ṿt c y vào môi tr ng đ ̣c phân tán kh p ṃi điểm và chung quanh bề mặt t bƠo đ ̣c ti p

xúc v́i d ch dinh d ̃ng Đặc điểm nƠy đòi hỏi trong sút quá trình nuôi c y ph i

khu y và cung c p oxy b ng cách s c khí liên t c Do h th́ng khu y trộn t́t nên

toàn bộ môi tr ng nuôi c y là một h th́ng nh t

 Đòi hỏi trang b k thụt cao, d nhi n trùng toàn bộ

 D hỏng c quá trình lên men, gây t́n kém ĺn

 Ph li u ph i kèm theo công ngh xử lý ch́ng ô nhi m môi tr ng

1.4.2 Ph ngăphápănuôiăc y bề mặt SSF

Ph ng ph́p t o điều ki n cho vi sinh ṿt phát triển trên bề mặt môi tr ng

hay trên bề mặt ṿt li u r n, x́p, ẩm Thông th ng, môi tr ng d ng r n v́i

nguyên li u chính là bột cám mì, bã c c i, bột b p nghiền, h t thóc nẩy m m, tr u

và b sung thêm một ś ch t dinh d ̃ng khác (amonium sulfate, amonium chloride,

amonium phosphate)

 uăđi m

 Môi tr ng nuôi c y đ n gi n;

 Một ś c ch t có thể đ ̣c sử d ng tṛc ti p lƠm môi tr ng r n hoặc b

sung thêm một ś ch t dinh d ̃ng;

 S n phẩm thu nḥn có n ng độ cao, d dàng tinh s ch;

 Sử d ng k t ḥp ćc c ch t ṭ nhiên có ngu n ǵc tḥc ṿt, bào tử hoặc t

bào;

 Độ ẩm th p và ṃt độ n m ḿc ĺn nên h n ch đ ̣c ṣ lây nhi m c a

nhiều lo i vi sinh ṿt khác;

 L ̣ng t p ch t sinh ra th p h n trong SmF;

 Enzyme ít nh y c m v́i các ch t c ch d hóa hoặc c m ng;

 Trong điều ki n thi t b đ n gi n, không có thi t b ph n ng sinh ḥc, vi c

lên men SSF lƠ ph ng th c hi u qu , d tḥc hi n, có tính kh thi cao

 Vi c cung c p oxy cho vi sinh ṿt thụn ti n h n, do hƠm l ̣ng oxy trong không khí cao h n nhiều so v́i hƠm l ̣ng oxy hòa tan trong d ch lên men, di n

tích ti p xúc c a vi sinh ṿt v́i không khí trong môi tr ng r n cũng cao h n ṣ

ti p xúc c a vi sinh ṿt v́i ḅt khí trong môi tr ng lỏng

 Có thể t o đ ̣c s n phẩm d ng r n

 Chi phí năng l ̣ng th p h n

 Ṿn hƠnh quy tr̀nh lên men cũng đ n gi n h n, không đòi hỏi tr̀nh độ

chuyên môn cao

 Nh căđi m

 Các vi sinh ṿt nuôi c y b i ph ng ph́p SSF b h n ch b i rào c n về độ

ẩm c a môi tr ng;

 Vi c x́c đ nh các thông ś nh độ ẩm, pH, oxy ṭ do, CO2 khó theo dõi và

kh́ng ch h n V̀ th vi c duy trì ch độ lên men t́i u trong sút th i gian lên

men là khó tḥc hi n

 Ṣ đ o trộn khó, d̃n đ n vi c lên men khó đ ̣c đ ng nh t

 Trong nhiều tr ng ḥp, vi c thu s n phẩm khó khăn h n so v́i lên men trong môi tr ng lỏng

Trong kĩ thụt nuôi c y bề mặt có hai lo i môi tr ng nuôi c y, đó lƠ môi

tr ng bán r n vƠ môi tr ng lỏng môi tr ng lỏng thì vi sinh ṿt s phát triển

trên bề mặt dung d ch lỏng n i phơn c t giữa pha lỏng vƠ pha khí Khi đó ćc t bào

vi sinh ṿt s t o thành những ván ph kín bề mặt dung d ch lỏng Enzyme s đ ̣c

t ng ḥp trong t bào và thoát khỏi t bào vào trong dung d ch nuôi c y Do đó vi c

thu nḥn enzyme thô trong d ch nuôi c y cũng r t đ n gi n Tuy nhiên ph ng ph́p

nuôi c y này tỏ ra không hi u qu vì ho t ḷc c a enzyme thu nḥn đ ̣c c a

ph ng ph́p nƠy không cao b ng nuôi c y trên môi tr ng bán r n Một mặt

ph ng ph́p nƠy vi sinh ṿt phát triển ch y u trên bề mặt nên h ś sử d ng môi

tr ng nuôi c y không cao Vì ṿy ph ng ph́p nƠy ít đ ̣c dùng

Chính vì những lý do trên mà nhóm quy t đ nh cḥn ph ng ph́p nuôi c y bề

mặt trên môi tr ng bán r n Quá trình nuôi c y trong môi tr ng bán r n nuôi b ng

ph ng ph́p bề mặt tr i qua ćc giai đo n sau:

 Giaiăđo n 1: Giai đo n nƠy th ng kéo dài 10 ÷ 14 gi kể từ th i gian b t

đ u nuôi c y Trong giai đo n này có những thay đ i sau:

C vì th i kỳ này gíng r t m̃n c m v́i nhi t độ

 Giaiăđo n 2: Giai đo n này kéo dài 14 ÷ 18 gi ti p theo Trong giai đo n

này có những thay đ i c b n sau:

Toàn bộ bào tử đư ph́t triển thành ṣi n m và ṣi n m b t đ u phát triển r t

m nh Các ṣi n m này t o ra những m ng ṣi ch ng ch t kh p trong các h t môi

tr ng, trong lòng môi tr ng

Môi tr ng đ ̣c k t l i khá chặt

Độ ẩm c a môi tr ng gi m d n

Nhi t độ c a môi tr ng tăng nhanh có thể lên đ n 400C ÷ 450C

Các ch t dinh d ̃ng b t đ u gi m nhanh do ṣ đ ng hoá c a n m ṣi

Các lo i enzyme đ ̣c hình thành

L ̣ng oxy trong môi tr ng gi m và CO2tăng d n, do đó trong giai đo n này

c n thông khí m nh vƠ điều ch nh nhi t độ kho ng 290C ÷ 300C

Giaiăđo n 3: Giai đo n này kéo dài 10 ÷ 20 gi Lúc này nhi t độ kh́i môi

tr ng s gi m d n kéo theo c ng độ hô h p gi m một cách rõ r t Màu s c c a

n m ṣi b t đ u thay đ i và thể hi n mƠu đặc tr ng Trong giai đo n này bào tử

đ ̣c hình thành nhiều và làm gi m ho t ḷc c a enzyme Do đó c n dừng quá trình

nuôi c y và thu nḥn enzyme trong giai đo n này

Đ́i v́i A niger quá trình sinh t ng ḥp enzyme nhiều nh t th ng k t thúc

khi n m b t đ u sinh bào tử (Nguy n Đ c L ̣ng, 2004) Theo Vinod Kumar Joshi

et al (2006) và k t qu nghiên c u c a Tr n Thanh Trúc và Nguy n Văn M i

(2014) t̀m ra đ ̣c điều ki n lên men sinh t ng ḥp PME t́t nh t là 96 gi

Hình 1.5: S ự phát triển của nấm sợi khi nuôi cấy bề mặt

(Ngu n: Nguy n Đ c L ̣ng, 2002)

Lên men 37oC trong 96 gi

2.2 Thuy t minh quy trình

S t Vitamin B1

12,2 22,7 40,3 6,3 6,5 30,0 4,6 14,0 0,96

- Cách ti n hành: Bột cám g o đ ̣c nghiền đ t kích th ́c c n thi t sau đó đ ̣c

đ nh l ̣ng vào thi t b ph́i trộn

 Nguyên liệu trấu

- Ch c năng: B sung tr u v́i m c đích t o độ t i x́p và tránh nguyên li u b k t dính

- Cách ti n hành: Tr u đ ̣c đ a đi lƠm s ch, sau đó đ ̣c chuyển đi đ nh

l ̣ng, và x xúng thi t b trộn

 Nguyên liệu bã táo

- Ch c năng: LƠ c ch t c m ng t o t ng ḥp enzyme pectin methylesterase

Bã táo là ngu n c ch t r t thích ḥp cho quá trình lên men sinh t ng ḥp enzyme

PME ho t tính enzyme thô thu đ ̣c là 4,83 U/g (Tr n Thanh Trúc, 2013)

- Cách ti n hƠnh: Bư t́o đ ̣c nghiền đ t kích th ́c c n thi t sau đó đ ̣c đ nh

l ̣ng vào thi t b ph́i trộn

55% pH=5,0

2.2.3 Thanh trùng

 M c đích: LƠm cho môi tr ng đ ̣c tinh khi t về ph ng di n vi sinh ṿt

 Cách ti n hành: Thanh trùng b ng h i n ́c nóng 121oC trong vòng 15 phút

2.2.4 Làm ngu i

 Làm nguội g n đ n nhi t độ nuôi c y nh m t o điều ki n thích ḥp về mặt

nhi t độ cho vi sinh ṿt phát triển Đơy cũng lƠ giai đo n kiểm tra và lo i bỏ những

thành ph n quá nhão hoặc khô so v́i yêu c u

 Cách ti n hành: Sau khi thanh trùng, môi tr ng đ ̣c làm nguội đ n nhi t

độ kho ng 330C ÷ 340C Yêu c u th i gian tḥc hi n quá trình này ph i ng n để

tránh b nhi m vi sinh ṿt t p

2.2.5 Nhân gi ng s n xu t

Để phù ḥp v́i môi tr ng đ ̣c cḥn ta cḥn gíng Aspergillus niger để nuôi

c y có kh năng sinh t ng ḥp PME cao

Gíng trong ́ng nghi m đ ̣c giữ tr ng thái ho t động b ng cách c y

chuyền mỗi tháng một l n trong ćc môi tr ng th ch Czapek

B ng 2.2: Thành ph ần môi trường Czapek

+ Kích ho t gíng ǵc và cho gíng vi sinh ṿt làm quen v́i môi tr ng lên

men s s n xu t trên quy mô công nghi p

+ T o đ l ̣ng gíng để s n xu t trên quy mô công nghi p

 Cách ti n hành:

Nhân gíng trên máy l c

Môi tr ng trong giai đo n nƠy cũng lƠ môi tr ng trên ḿc gíng đ ̣c nuôi trong b̀nh tam gíc 1 lít vƠ đ ̣c đặt trên máy l c

Từ môi tr ng s n xu t sau khi làm nguội k t thúc, trích ra 10% chuyển qua

phòng nhân gíng để nhân gíng s n xu t Quá trình nhân gíng s n xu t cũng đ ̣c

tḥc hi n trên khay vƠ đ ̣c tḥc hi n trong phòng nhân gíng

2.2.6 Gieo gi ng

 M c đích: Phơn b́ gíng đều trên môi tr ng nuôi c y nh m t o điều ki n

thụn ḷi cho gíng phát triển t́t

 Cách ti n hành: Sau khi làm nguội môi tr ng đ n nhi t độ 330

C ÷ 340C ta

ti n hành gieo gíng, t l gieo gíng là 16,5% v/w (Tr n Thanh Trúc, Nguy n Văn

M i, 2014)

2.2.7 Nuôi c y

Đơy lƠ giai đo n quan tṛng nh t trong toàn bộ qú tr̀nh, giai đo n này c n

đ ̣c giám sát chặt ch Những thay đ i c a các thông ś sinh lỦ trong giai đo n này

s nh h ng tṛc ti p đ n năng su t và ch t l ̣ng enzyme thành phẩm

- Cách ti n hành: Sau khi k t thúc quá trình gieo gíng, canh tr ng n m ḿc

đ ̣c chuyển canh tr ng qua cơn đ nh l ̣ng vƠ đ ̣c đ a vƠo khay, khay chuyển

vào phòng nuôi c y đ ̣c đặt trong phòng nuôi c y và ti n hành nuôi Th i gian

nuôi c y n m ḿc 96 gi

2.2.8 Nghiền

M c đích: vừa phá ṽ t bào vừa làm nhỏ các thành ph n c a t bào Khi

thành t bào b phá ṽ, các enzyme nội bƠo ch a thót khỏi t bào s d dàng thoát

khỏi t bào

Trong khi nghiền ng i ta th ng b sung những ch t tṛ nghiền trong tr ng

ḥp nƠy đ ̣c dùng là cát th ch anh và bột th y tinh Các ch t này là những ch t vô

c không tham gia vƠo ph n ng và kh năng tăng m c độ ma śt Tr ́c khi đ ̣c

sử d ng ph i đ ̣c rửa s ch, s y khô nhi t độ ĺn h n 100oC để lo i bỏ n ́c và

tiêu di t vi sinh ṿt

2.2.9 Trích ly

M c đích: trích ly giúp PME có thể liên k t và khu ch tán ra ngoài dung môi

m c t́i đa, gi m m t ho t tính c a enzyme Vi ḷc dùng để lo i bỏ vi khuẩn, xác vi

sinh ṿt, và các t p ch t trong dung d ch enzyme

Sử d ng dung d ch đ m citrate (pH= 3,6) v́i t l dung d ch đ m : c ch t 2:1

v/w Nhi t độ trích ly 35o

C, th i gian 50 phút Sau khi trích ly sử d ng vi ḷc 0,2

micromet để ḷc vƠ thu đ ̣c ch phẩm enzyme thô

2.2.10 K t t a

K t t a b ng múi là một trong các cách th c ph bi n nh t để tách protein

Kh năng hòa tan c a protein tùy thuộc vào nhiều y u t́: đặc tính lý hóa ṭ nhiên

c a protein, pH, nhi t độ, n ng độ c a múiầ Ph ng ph́p k t t a b ng múi ḍa trên c s ṣ khác nhau về kh năng k t t a c a các protein một n ng độ múi

(tính theo ph n trăm n ng độ bưo hòa) x́c đ nh để lo i bỏ một ph n protein t p c a

dung d ch enzyme (Scopes, 1994) Hi u qu t a protein c a các anion múi khác

nhau thì khác nhau, có thể x p theo th ṭ gi m d n nh sau:

citrate > phosphate > sulphate > acetate/chloride > nitrate > thiocyanate

Đ́i v́i các cation múi hi u qu k t t a tăng d n theo th ṭ: Na+

< K+

<NH4+

Trong ś các lo i múi đ ̣c sử d ng, ng i ta nḥn th y múi (NH4)2SO4 là

t́t nh t Vì múi (NH4)2SO4 có độ hòa tan cao, rẻ tiền, đ ng th i múi (NH4)2SO4

có độ ion hóa cao Thêm vƠo đó, k t t a thu đ ̣c b ng ph ng ph́p nƠy n đ nh, ít

b bi n tính nh ng ph i ti n hành quá trình lo i múi tr ng th́i b̀nh th ng, các

nhóm mang đi n tích trên bề mặt enzyme s liên k t v́i các phân tử n ́c bao

quanh qua liên k t hydro t o ĺp ́o n ́c quanh phân tử Khi thêm múi ammonium

sulfate vào v́i n ng độ cao, các phân tử múi s phân ly thành các ion, các ion này

liên k t v́i các phân tử n ́c làm cho enzyme m t ĺp ́o n ́c, liên k t l i v́i nhau

và t a xúng (Mukherjee and Banerjee, 2006)

Theo nghiên c u c a Tr n Thanh Trúc (2013) thì t l (NH4)2SO4 : PME thô

từ 55 : 65 (w/v) khi đó đ t 6,87 U/mg protein độ tinh s ch 5,45 l n và hi u su t thu

h i là 62,23%

2.2.11 Ly tâm

Trong quá trình ly tâm tách t a enzyme ra khỏi hỗn ḥp dung môi dung d ch

ch c n t́c độ ly tâm th p để thu cặn nên ta dùng máy ly tâm d ng đĩa để ti n hành

thu cặn vì thể tích ch a c a ḿy ly tơm đĩa cao h n so v́i quá trình ly tâm ́ng nên

sử d ng ḿy ly tơm đĩa lƠ phù ḥp trong quá trình thu cặn Thể tích thùng c a máy

ly tâm d ng đĩa ĺn phù ḥp v́i quy mô công nghi p

Để tránh hi n t ̣ng bi n tính enzyme th ng ly tâm 4oC v́i ṿn t́c 6500

vòng/phút trong 15 phút Sau đó thu k t t a

2.2.12 L c màng

 M c đích: Lo i bỏ múi amonisulfat

 M̃u enzyme đ ̣c hòa tan trong dung d ch đ m citrate pH 4 sau đó đ ̣c

b m qua h th́ng màng phơn đo n 20 kDa và ti n hành quá trình ḷc kh́i l ̣ng

phân tử c a PME kho ng 43 kDa do đó ph n d ch ḷc ch a múi amonisulfat đư tan

trong dch đ m bã ḷc ch a enzyme d ng s t đ ̣c thu nḥn và chuyển sang giai

đo n s y t o thành phẩm

2.2.13 S y thĕngăhoaă(s yăđôngăkhô)

S y đông khô sử d ng chân không và k t đông để lo i bỏ n ́c S y đông khô

chân không là một k thụt s y s n phẩm u vi t Tr ́c h t nguyên li u đ ̣c đông

l nh đột ngột, làm n ́c trong s n phẩm đóng thƠnh thể r n, r i qua xử lý chân không thăng hoa (sublimes) thƠnh d ng h i r i ng ng t thành n ́c và th i ra

ngoài, s n phẩm tr thành d ng khô S y thăng hoa có u điểm r t ĺn so v́i các

ph ng ph́p s y kh́c đó lƠ: s n phẩm có ch t l ̣ng cao giữ nguyên đ ̣c màu s c,

c u trúc, ho t tính sinh ḥc Tiêu hao năng l ̣ng để bay h i hƠm ẩm th p

Quá trình s y thăng hoa th ng g m 3 giai đo n:

 Giai đo n 1: l nh đông nguyên li u để chuyển một ph n n ́c trong nguyên

li u sang d ng r n

 Giai đo n 2: t o áp su t chân không r i gia nhi t nguyên li u đư l nh đông

trong bu ng s y để n ́c thăng hoa

 Giai đo n 3: do trong giai đo n l nh đông không thể chuyển toàn bộ l ̣ng

n ́c trong nguyên li u sang d ng r n nên sau giai đo n s y thăng hoa lƠ giai

đo n s y chơn không để tách thêm một ph n ẩm d ng lỏng trong nguyên

li u, đ m b o độ ẩm trong nguyên li u sau quá trình s y đ t yêu c u

 Ph ng ph́p gia nhi t: cḥn ph ng ph́p gia nhi t b ng b c x (vì nguyên

li u đ ̣c gia nhi t đ ng đều h n vƠ vi c thót h i n ́c ra môi tr ng xung

quanh di n ra d dƠng h n)

 Áp su t trong bu ng s y: 27-133 Pa

 Độ ẩm nguyên li u sau khi s y: <5%

Năng su t c a thi t b thăng hoa t́c động liên t c tính theo độ ẩm b́c h i ĺn

h n 200 kg/h Th i gian có mặt c a s n phẩm trong máy s y từ 40 đ n 110 phút,

nhi t độ cao nh t c a s n phẩm cúi quá trình s y nhỏ h n 270

C

2.2.14 Bao gói

Sau khi thu đ ̣c ch phẩm enzyme d ng bột ta đem đi đóng gói b ng thi t b

bao gói ṭ động kh́i l ̣ng đ nh sẵn thu nḥn thành phẩm enzyme k thụt

CH NGă3:ăTệNHăTOỄN CÂN B NG V T CH T

3.1 K ho ch s n xu t

Gi sử một năm lƠm vi c 330 ngày

Th i gian lên men một mẻ là 96 gi , 5 mẻ v sinh 1 l n trong 24 gi

Th i gian lên men và v sinh trong 5 mẻ là: 96 x 5 + 24 = 504 gi

Ṿy ś mẻ lên men trong một năm lƠ:

B ảng 3.1: Tỷ lệ hao hụt trong từng công đoạn

Quá trình

T l

t n th t

Hi u su t quá trình Tài li u tham kh o

Chuẩn b nguyên li u 5%

Ph́i trộn 0,3%

Thanh trùng và làm nguội 1,5%

2013

 Ṿy nên ta s sử d ng l ̣ng múi để k t t a enzyme lƠ: 997,1 lit

T ng thể tích ṿt ch t trong qú tr̀nh ḷc lƠ:

VL = VMúi t a + VEnzyme = 997,1 + 1705,9 = 2703 (lit)

T ng thể tích ṿt ch t trong qú tr̀nh ly tơm lƠ:

VLT = VMúi + VEnzyme = 1602,102 + 2043,743 = 3645,845 (lit)

3.2.5 Q uáătrìnhăk tăt a

T l t n th t 2% và hi u su t qú tr̀nh đ t H = 62,23%

L ̣ng s n phẩm tr ́c khi k t t a:

P = , × − × , = , kg/mẻ

Gi sử sau qú tr̀nh trích ly toƠn bộ dung d ch đ m đư đ ̣c lo i bỏ hoƠn toƠn,

do đó trong qú tr̀nh k t t a có b sung thêm múi để thu nḥn enzyme mƠ t l

(NH4)2SO4: PME thô từ 55 : 65 (w/v) [Tr n Thanh Trúc, 2013]

Kh́i l ̣ng riêng c a enzyme lƠ: 1,05 kg/l, thể tích c a enzyme lƠ:

VE e = , , = , lit Ṿy kh́i l ̣ng múi c n sử d ng lƠ:

NH SOEnzyme = =

NH SO

,

=> M(NH4)2SO4 = 2835,72 (kg)

V́i hi u suơt k t t a enzyme lƠ 62,23% trong 2835,72 kg múi th̀ có 62,23%

l ̣ng múi k t t a đ ̣c enzyme Ṿy l ̣ng múi đư k t t a enzyme lƠ:

d ch đ m : c ch t lƠ 2 : 1 v/w [Lê Th Thu Trang, 2011]

Thể tích c a dung d ch đ m citrate c n dùng lƠ: 4534,54 x 2 = 9069,08 (lít)

3.2.7 Q uáătrìnhănghiền

T l t n th t 0,5% và hi u su t qú tr̀nh đ t H = 85%

L ̣ng s n phẩm tr ́c khi nghiền

Bao g m các quá trình nghiền nguyên li u thô t́i kích th ́c c n thi t

T l t n th t là 5%

Ta có kh́i l ̣ng môi tr ng tr ́c khi nghiển là:

M = , × − = , kg/mẻ

Từ kh́i l ̣ng t ng c a các nguyên li u và t l từng thành ph n ta có kh́i

CH NGă4:ăTệNHăTOỄNăTHI T B

Cḥn thi t b nghiền 2012GM S n phẩm c a công ty CPĐT Tu n Tú

Tṛng l ̣ng ḿy không động c 1500 kg

Thành ph n nguyên li u tr ́c khi nghiền bao g m: bột cám 5194,04 kg, cám

mì 418,847 kg, bã táo 418,874 kg T ng kh́i l ̣ng nguyên li u nghiền là:

M = 5194,04 + 418,847 + 418,847 = 6031,734 (kg)