khảo sát tác nhân gây bệnh hpv (hepatopancreatic parvovirus) trên tôm sú (penaeus monodon) nuôi ở khu vực đồng bằng sông cửu long

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN TRẦN QUỐC TRUNG TUẤN KHẢO SÁT TÁC NHÂN GÂY BỆNH HPV Hepatopancreatic parvovirus TRÊN TÔM SÚ Penaeus monodon

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN

TRẦN QUỐC TRUNG TUẤN

KHẢO SÁT TÁC NHÂN GÂY BỆNH HPV

(Hepatopancreatic parvovirus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) NUÔI Ở KHU VỰC

ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH PHẠM TRẦN NGUYÊN THẢO

2007

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

LỜI CẢM TẠ

Tác giả xin cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ về vật chất và tinh thần trong quá trình phân tích mẫu và hoàn thành đề tài tốt nghiệp của Ban Chủ Nhiệm Khoa,

Bộ Môn Sinh Học và Bệnh Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ

Tác giả xin chân thành cảm ơn cô Đặng Thị Hoàng Oanh đã giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất để hoàn thành luận văn

Xin cảm ơn chị Phạm Trần Nguyên Thảo đã giúp đỡ và hướng dẫn tận tình trong suốt thời gian thu mẫu và phân tích mẫu

Xin cảm ơn thầy cô trong Khoa đã giảng dạy trong suốt thời gian học ở Trường Đại học Cần Thơ

Xin cảm ơn các bạn lớp Bệnh Học Thủy Sản K29 đã hỗ trợ và động viên trong suốt thời gian học cũng như làm đề tài

Và thật thiếu sót khi không kể đến công ơn cha mẹ, gia đình và bạn Trần Thị Huỳnh Trang đã lo lắng, động viên và tạo điều kiện cho tác giả học tập

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

TÓM TẮT

Kết quả của quá trình nghiên cứu là xác định sự hiện diện của HPV trên tôm giống và tôm thịt nuôi ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long Trong 265 mẫu tôm giống thu ngẫu nhiên ở 3 tỉnh (Trà Vinh, Sóc Trăng và Bạc Liêu) có 25,3% nhiễm HPV, 60% nhiễm MBV và 22,26% nhiễm kép MBV-HPV Không giống như tỉ lệ cảm nhiễm tự nhiên của HPV trên tôm giống, thì trên tôm thịt nuôi ở Trà Vinh và Sóc Trăng có tỉ lệ cảm nhiễm thấp, khoảng 4,43% tôm thịt nhiễm HPV trong tổng số mẫu là 316 Nghiên cứu được thực hiện bằng hai phương pháp: phết mẫu tươi-nhuộm Malachite Green và phương pháp mô học truyền thống nhuộm H&E Bằng phương pháp phết mẫu tươi - nhuộm Malachite Green có thể chẩn đoán được 2 bệnh MBV và HPV trong thời gian 5 phút nhưng đối với phương pháp mô học truyền thống cần 3-4 ngày mới có kết quả Bên cạnh đó chi phí của phương pháp phết mẫu tươi rẻ tiền hơn, độ chính xác không chênh lệch nhiều (16,67%) so với phương pháp

mô học truyền thống Vì vậy có thể sử dụng phương pháp phết mẫu tươi - nhuộm Malachite Green trong việc chẩn đoán HPV trên tôm giống trước khi thả nuôi

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ i

TÓM TẮT ii

MỤC LỤC………iii

DANH SÁCH BẢNG v

DANH SÁCH HÌNH……… vi

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về tình hình nuôi tôm biển 3

2.1.1 Tình hình nuôi tôm biển trên thế giới 3

2.1.2 Tình hình nuôi tôm biển ở Việt Nam 3

2.1.3 Tình hình nuôi tôm sú ở Sóc Trăng 3

2.2 Tình hình dịch bệnh và tác hại do vi-rút gây ra trên tôm 4

2.3 Một số bệnh vi-rút thường xảy trong nuôi tôm sú ở ĐBSCL 6

2.3.1 Bệnh đốm trắng 6

2.3.2 Bệnh Còi 6

2.3.3 Bệnh đầu vàng 7

2.3.4 Bệnh phân trắng 7

2.3.5 Bệnh nhiễm trùng vi-rút dưới da và hoại tử 7

2.4 Tôm nhiễm HPV 8

2.4.1 Đặc điểm tôm nhiễm HPV 8

2.4.2 Phân loại HPV 8

2.4.3 Hình thái học của HPV 8

2.4.4 Đặc tính sinh học của HPV 9

2.4.5 Phân bố của bệnh HPV 9

2.4.6 Con đường lây nhiễm, biện pháp phòng ngừa và kiểm soát sự lây nhiễm của HPV 9

2.4.7 Tác hại của HPV đối với tôm nuôi 10

2.5 Lịch sử mô học 11

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚU……….13

3.1 Thời gian và địa điểm………13

3.2 Vật Liệu nghiên cứu……… 13

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 13

3.2.2 Dụng cụ dùng trong nghiên cứu 13

3.2.3 Hóa chất dùng trong nghiên cứu 13

3.3 Phương pháp nghiên cứu……… 13

3.3.1 Phương pháp thu mẫu 13

3.3.2 Phương pháp phân tích mẫu 14

3.4 Phương pháp phân tích số liệu……… 17

3.4.1 Xác định tỉ lệ cảm nhiễm 17

3.4.2 Xác định cường độ cảm nhiễm/cá thể 17

3.4.3 Phương pháp xử lý số liệu 17

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………18

4.1 Cường độ cảm nhiễm và tỉ lệ cảm nhiễm tự nhiên của vi-rút trên tôm sú giống thả nuôi ở ĐBSCL……….18 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

4.1.1 Cường độ cảm nhiễm HPV trên tôm giống thả nuôi ở ĐBSCL 18

4.1.2 Tỉ lệ cảm nhiễm HPV và MBV trên 3 tỉnh ĐBSCL 20

4.1.3 Tỉ lệ cảm nhiễm kép giữa HPV và MBV trên tôm giốngở ĐBSCL 21

4.1.4 So sánh tỉ lệ cảm nhiễm HPV và MBV ở 3 tỉnh khác nhau: Trà Vinh, Bạc Liêu và Sóc Trăng .22

4.1.5 Tỉ lệ cảm nhiễm HPV trên tôm giống qua 3 tháng thu mẫu ở ĐBSCL 23

4.1.6 Tỉ lệ cảm nhiễm HPV trên tôm thịt ở 2 tỉnh Trà Vinh và Sóc Trăng 24

4.2 Một số biến đổi mô học trên tôm nhiễm HPV……… 25

4.2.1 Cấu tạo gan tụy ở tôm 25

4.2.2 Biến đổi mô học trên gan tụy tôm giống và tôm thịt nhiễm HPV .25

4.3 So sánh kết quả kiểm tra HPV giữa 2 phương pháp: phết mẫu tươi gan tụy Malachite Green và mô học truyền thống………28

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT……… 31

5.1 Kết Luận………31

5.2 Đề Xuất……….31

TÀI LIỆU THAM KHẢO………32

PHỤ LỤC………35

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 4.1: Kết quả cường độ cảm nhiễm trên tôm giống thu ở ĐBSCL 18 Bảng 4.2: Bảng tổng kết qui ước xác định cường độ cảm nhiễm HPV trên

tôm giống 19 Bảng 4.3: Số lượng và tỉ lệ nhiễm kép HPV và MBV trong tổng số mẫu

phân tích 21 Bảng 4.4: Tỉ lệ cảm nhiễm HPV và MBV ở 3 tỉnh Sóc Trăng, Trà Vinh

và Bạc Liêu 23 Bảng 4.5: Khối lượng và chiều dài của tôm nuôi nhiễm HPV và tôm nuôi

không nhiễm HPV 25 Bảng 4.6: Đường kính thể vùi HPV trên tôm giống 27

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

DANH SÁCH HÌNH

Hình 4.1: Tỉ lệ cảm nhiễm HPV trên tôm giống ở 3 tỉnh ĐBSCL 20 Hình 4.2: Tỉ lệ cảm nhiễm MBV trên tôm giống ở 3 tỉnh ĐBSCL 20 Hình 4.3: Tỉ lệ cảm nhiễm HPV qua các tháng thu mẫu ở ĐBSCL 24 Hình 4.4: Cấu tạo vi thể của gan tụy bình thường và gan tụy nhiễm HPV

trên tôm thịt ở độ phóng đại 10X (H&E) 27 Hình 4.5: Cấu tạo vi thể của gan tụy bình thường và gan tụy nhiễm HPV

trên tôm giống ở độ phóng đại 40X (H&E) 27 Hình 4.6: Gan tụy tôm giống nhiễm cả hai bệnh MBV và HPV ở độ

phóng đại 100X (H&E) 28 Hình 4.7: Gan tụy tôm giống nhiễm HPV 30

Hình 4.8: Gan tụy tôm giống nhiễm kép HPV và MBV 31

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

Thủy sản là một trong những ngành mũi nhọn của nước ta, mang lại thu nhập cao cho người nuôi và làm giàu cho đất nước Nghề nuôi tôm ở nước ta có từ nhiều năm trước với hình thức nuôi chủ yếu là quảng canh, quảng canh cải tiến nhưng với sự phát triển của khoa học kĩ thuật thúc đẩy nghề nuôi tôm theo hướng thâm canh hóa, diện tích nuôi tôm bán thâm canh, thâm canh ngày càng được mở rộng Bên cạnh việc nuôi tôm thâm canh có nảy sinh những vấn đề liên quan đến môi trường, dịch bệnh và sức khỏe tôm nuôi

Với hình thức nuôi mật độ thấp tôm mau lớn và ít xảy ra bệnh nhưng nuôi ở mật độ cao khả năng xảy ra bệnh nhiều hơn và tôm nuôi chậm lớn hơn Hiện nay tôm nuôi chậm lớn và thời gian nuôi kéo dài hơn so với những năm trước

do chất lượng con giống ngày một giảm xuống, ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng của tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, vi-rút Một số loài vi-rút có thể

gây chết hàng loạt tôm nuôi trong ao như vi-rút đốm trắng WSSV (White spot syndrome virus), vi-rút đầu vàng YHV (Yellow head virus) Một số loài vi-rút

không gây chết tôm hàng loạt nhưng lại ảnh hưởng đến chất lượng tôm giống

và thời gian sinh trưởng của tôm nuôi: vi-rút gây bệnh còi MBV (Monodon baculovirus), vi-rút gây bệnh trên gan tụy HPV (Hepatopancreatic parvovirus)

Hiện nay nghề nuôi tôm của một số nước trên thế giới gặp trở ngại do tôm

giống nhiễm HPV Nhưng các chỉ tiêu kiểm tra chất lượng tôm giống trước

khi thả nuôi của một số tỉnh thuộc khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) chỉ gồm: MBV, WSSV, YHV

Năm 1987-1988 MBV cùng với HPV gây chết hàng loạt tôm nuôi ở Đài Loan, (Nguyễn Văn Hảo, 2000)

Theo Catap et al (2003), tôm giống ở Philippin nhiễm HPV chiếm tỉ lệ cao

khoảng 20-100 % và cũng ảnh hưởng đến tỉ lệ sống và tăng trưởng của tôm, nhưng người nuôi tôm ở đây vẫn thiếu thông tin về những mối nguy hại này

Ở Thái Lan, HPV gây thiệt hại đáng kể về kinh tế cho người nuôi do tôm nhiễm HPV gây tỉ lệ chết cao ở giai đoạn tôm nhỏ, sinh trưởng chậm và ngừng

sinh trưởng ở chiều dài 6 cm (Flegel et al., 2004)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Còn ở Việt Nam có rất ít nghiên cứu và chưa có số liệu thống kê cụ thể về

mức độ thiệt hại đối với tôm nuôi nhiễm HPV Chính vì thế, đề tài “ Khảo sát

tác nhân gây bệnh HPV (Hepatopanreas Parvovirus) trên tôm sú nuôi ở

Đồng Bằng Sông Cửu Long” được tiến hành:

Mục tiêu của đề tài:

Xác định sự hiện diện của HPV trên tôm sú nuôi ở khu vực ĐBSCL, từ đó làm

cơ sở cho việc quản lý giống đạt hiệu quả và nâng cao hiệu quả kinh tế cho người nuôi

Nội dung của đề tài:

− Khảo sát cường độ cảm nhiễm, tỉ lệ cảm nhiễm HPV và tỉ lệ đa nhiễm với MBV trên tôm giống thả nuôi ở các tỉnh giống ở Trà Vinh, Sóc Trăng và Bạc Liêu

− Khảo sát cường độ cảm nhiễm và tỉ lệ cảm nhiễm HPV trên tôm thịt ở Trà Vinh, Sóc Trăng

− So sánh kết quả kiểm tra HPV giữa 2 phương pháp phết mẫu tươi - nhuộm bằng Malachite Green và mô học truyền thống

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về tình hình nuôi tôm biển

2.1.1 Tình hình nuôi tôm biển trên thế giới

Trên thế giới nghề nuôi tôm biển hiện đang phát triển mạnh và mang lại hiệu quả kinh tế cao, là nguồn thu ngoại tệ cho nhiều nước Sản lượng nuôi trồng thủy sản thế giới tăng nhanh trong những năm gần đây Sản lượng nuôi trồng thủy sản năm 2000 là 1.087.900 tấn, đến năm 2001 đạt khoảng 37,5 triệu tấn Trong đó, sản lượng tôm biển trên thế giới gia tăng rất nhanh, năm 1990 sản lượng tôm biển trên thế giới là 632.400 tấn, đến năm 2000 thì sản lượng này tăng lên là 1.087.900 tấn (Lê Xuân Sinh, 2005)

2.1.2 Tình hình nuôi tôm biển ở Việt Nam

Nghề nuôi tôm ở Việt Nam có từ rất lâu nhưng chuyên nuôi tôm từ năm 1997 (Nguyễn Trọng Nho, 1995) Trong những năm gần đây có nhiều tiến bộ kỹ thuật về nuôi tôm được đưa vào thực tiễn: sản xuất giống tôm nhân tạo, nghiên cứu quản lý sức khỏe tôm nuôi, nâng cao chất lượng thức ăn, chế phẩm sinh học được dùng để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh, ứng dụng của

kĩ thuật PCR trong việc phát hiện mầm bệnh vi-rút, đã thúc đẩy nghề nuôi tôm theo xu hướng thâm canh hóa Theo báo cáo của Bộ Thủy Sản năm 2004 Việt Nam đứng hàng thứ ba về nuôi tôm trên thế giới với sản lượng 250.000 tấn Năm 2005 diện tích nuôi tôm nước nước lợ là 604.479 ha với sản lượng khoảng 324.680 tấn, giá trị kim ngạch xuất khẩu đạt 1,6 tỷ USD (Bộ Thủy Sản, 2007)

2.1.3 Tình hình nuôi tôm sú ở Sóc Trăng

Nghề nuôi tôm ở Sóc Trăng chỉ mới phát triển trong những năm gần đây nhưng diện tích nuôi tôm tăng rất nhanh và mật độ thâm canh hóa rất cao Theo thống kê của Hoàng Trọng Tứ (2004), năm 1998 toàn tỉnh chỉ có 22.599

ha diện tích nuôi tôm, đạt sản lượng 5.794 tấn nhưng đến năm 2002, diện tích nuôi tôm sú là 34.160 ha đạt sản lượng 16.000 tấn Đến năm 2003, tổng diện tích nuôi tôm của tỉnh là 41.280 ha, sản lượng đạt 22.301 tấn (Nguyễn Minh Niên, 2004 Trích dẫn bởi Trần Thanh Tuấn, 2006) Đến năm 2005 là 43.211

ha, đạt sản lượng 42.817 tấn (Sở thủy sản Sóc Trăng, 2005) Năm 2003, diện tích nuôi tôm bán thâm canh và thâm canh là 5.214 ha nhưng đến năm 2005, Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

thì diện tích nuôi tôm bán thâm canh và thâm canh là 7.481 ha, tăng lên 3 lần

so với năm 2003 Năng suất bình quân của mô hình cải tiến là 580 kg/ha/vụ; bán thâm canh là 1,63 tấn/ha/vụ và thâm canh là 3,24 tấn/ha/vụ Bên cạnh việc nuôi tôm thâm canh thì vấn đề dịch bệnh xảy ra làm ảnh hưởng đến sản lượng nuôi một cách đáng kể, làm thiệt hại kinh tế cho người nuôi tôm Năm 2002, Sóc Trăng thả nuôi 30.000 ha thì có đến 740 ha tôm bị chết từ 60-90% Đến giữa tháng 4/2003 tỉnh thả nuôi tôm sú trên 35.000 ha, trong đó 4.000 ha tôm

bị bệnh, riêng huyện Mỹ Xuyên bị thiệt hại tới 3.280 ha (Tin tức - thông báo,, 2007)

2.2 Tình hình dịch bệnh và tác hại do vi-rút gây ra trên tôm

Có nhiều tác nhân gây bệnh cho tôm nuôi: nấm, kí sinh trùng, vi khuẩn, vi-rút,

do dinh dưỡng hay do môi trường, trong đó vi-rút có tác hại lớn và nghiêm trọng cho nghề nuôi tôm Vi-rút là phần tử có mang acid nucleic (ADN hoặc ARN) nằm trong vỏ bọc protein, có khả năng sao chép trong tế bào chủ và lan truyền từ tế bào này sang tế bào khác, chỉ có thể quan sát được vi-rút dưới kính hiển vi điện tử (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004)

Hiện nay có hơn 22 loài virut được ghi nhận và mô tả trên tôm biển Một trong

số chúng gây thiệt hại nặng cho tôm nuôi: WSSV, YHV, TSV (Taura

syndrome virus), vi-rút gây hoại tử cơ quan tạo máu (IHHNV) (Nadala et al.,

1999 Trích dẫn bởi Phạm Trần Nguyên Thảo, 2003)

Theo Sindermann, năm 1960 là năm đầu tiên công bố vi-rút gây bệnh trên giáp xác và năm 1990 xác định bệnh do vi-rút là trở ngại lớn cho nghề nuôi tôm Việc chữa trị bệnh do vi-rút không có hiệu quả vì hiện nay chưa có một loại thuốc hay hóa chất nào có thể chữa bệnh vi-rút Vi-rút gây tỉ lệ chết cao cho ấu

trùng và đối với tôm trưởng thành sự nhiễm ít nghiêm trọng hơn (Liao et al.,

1992 Trích dẫn bởi Nguyễn Văn Hảo, 2000)

Hiện tượng tôm nuôi chết hàng loạt ở Đài Loan năm 1986 được xác định là do MBV gây ra Dịch bệnh đã gây thiệt hại cho nghề nuôi tôm biển ở Đài Loan vào năm 1987-1988 làm thất thoát 80% sản lượng tôm nuôi ở quốc gia này (Lin, 1989)

Năm 1989, lần đầu tiên ở Thái Lan tìm thấy một số lượng lớn các thể ẩn Polyhedral của MBV trên cơ quan gan tụy của tôm sú (Nguyễn Văn Hảo, 2000)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Bệnh do vi-rút đặc biệt là WSSV bệnh nguy hiểm nhất cho nghề nuôi tôm sú ở nhiều nước trên thế giới Bệnh đốm trắng được báo cáo đầu tiên ở Nhật Bản

năm 1993 trên tôm thẻ Penaeus japonicus do nhập tôm ở Trung Quốc về nuôi

Bệnh bộc phát khắp Châu Á – năm 1992 - 1993 tôm nuôi ở Thái Lan bị bệnh đốm trắng và đầu vàng thiệt hại hơn 40 triệu USD Tiếp theo sự bùng nổ dịch bệnh đầu vàng ở Thái Lan là bệnh đốm trắng Bệnh làm giảm sản lượng tôm nuôi từ 225.000 tấn xuống 160.000 tấn năm 1996 làm thiệt hại trên dưới 500 triệu USD Ở các nước Châu Á bệnh gây thiệt hại khoảng 3 tỷ USD mỗi năm (Nguyễn Văn Hảo, 2000)

Năm 1989 đã có báo cáo về bệnh đỏ thân trên tôm sú ở các trại tôm của Thái Lan Năm 1999 bệnh đốm trắng gây thiệt hại cho tôm nuôi công nghiệp ở Trung và Nam Mỹ (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004)

Năm 1994 ở Trung Quốc bệnh WSSV đã gây thiệt hại 400 triệu USD, năm

1996 ở Thái Lan là 500 triệu USD, và thiệt hại 580 triệu USD ở Ecuador năm

1999 (Toshiaki, 2003 Trích dẫn bởi Triệu Thanh Tuấn, 2006)

Theo báo cáo của Nguyễn Văn Hảo (1999), hiện trạng tôm bị chết trên diện tích rộng ở huyện Duyên Hải, tỉnh Trà Vinh là do WSSV và có đến 58-62 % tôm giống đến tay người nuôi bị nhiễm WSSV

Đầu năm 2001 bệnh đốm trắng đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất tôm nuôi ở các tỉnh ven biển thuộc ĐBSCL như Bến Tre, Trà Vinh, Sóc Trăng, Cà Mau, Kiên Giang Một số vùng nuôi của các tỉnh này tỉ lệ tôm chết sau 30-45 ngày tuổi có thể lên đến 50-80 % và bệnh đốm trắng trở thành rủi ro lớn nhất trong nghề nuôi tôm (Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv, 2004)

Theo báo cáo của Bùi Quang Tề (2003), khi phân tích mô bệnh học gan tụy của tôm sú ở Sóc Trăng thấy xuất hiện các thể vùi của IHHNV nhưng tỉ lệ cảm nhiễm còn thấp

Bệnh đỏ đuôi cũng xuất hiện ở các vùng nuôi tôm của Hải Phòng và gây chết tôm vào năm 2002-2003 Khi phân tích mô học có biểu hiện nhiễm TSV (Bùi Quang Tề, 2003)

Trong thời gian gần đây ở Việt Nam xuất hiện một loại bệnh mới nhưng tác hại không kém được gọi là bệnh phân trắng Bệnh phân trắng gây ra thiệt hại không nhỏ cho bà con nuôi tôm ở một số tỉnh miền Trung như Ninh Thuận, Phú Yên, Bình Thuận, Bình Định, Khánh Hòa và một số tỉnh thuộc miền Tây Nam Bộ như Bến Tre, Tiền Giang, Sóc Trăng, Bạc Liêu Bệnh phân trắng Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

không xảy ra thường, chỉ xuất hiện ở những ao nuôi thâm canh, qui trình ít thay nước Bệnh tùy thuộc vào mùa vụ, có thể xảy ra trên cả vùng tương đối rộng Năm 2002 ở huyện Tuy Hòa có khoảng 450 ha ao nuôi có xuất hiện bệnh, Khánh Hòa là 300 ha, Bình Định là 600 ha Năm 2003 bệnh tiếp tục phát triển lan rộng cho nhiều tỉnh như Quảng Trị, Bình Thuận Riêng đối với Ninh Thuận trong năm 2003 diện tích bị phân trắng trong 2 vụ lên đến 600 ha Theo những nghiên cứu gần đây bệnh phân trắng có thể liên quan đến HPV Ở Ninh Thuận phát hiện sự có mặt của vi-rút HPV trên tôm nuôi với tỉ lệ nhiễm

Whispovirus và họ Nimaviridae Tôm bị nhiễm WSSV thường có những biểu

hiện đặc trưng như kém ăn, lờ đờ, bơi dọc theo bờ ao và đặc trưng nhất là có những đốm trắng xuất hiện trong lớp biểu bì dưới vỏ Các đốm trắng xuất hiện

ở một số tôm ngay sau khi có những dấu hiệu đầu tiên về sức khỏe kém và tỉ

lệ tôm chết có thể lên tới 100% trong vòng 7 ngày (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004) Bệnh lan truyền theo chiều ngang, bị nhiễm từ môi trường ngoài vào ao nuôi Bệnh thường xuất hiện vào mùa xuân và đầu mùa hè khi thời tiết khi thời tiết biến đổi nhiều như biên độ trong ngày biến thiên quá lớn (>5ºC) Bệnh thường xuất hiện 1-2 tháng tuổi sau khi nuôi Bệnh đốm trắng không trị được, chủ yếu

là phòng bệnh Bệnh đốm trắng chỉ lan truyền theo phương chiều ngang nên hạn chế lây nhiễm từ bên ngoài là biện pháp có hiệu quả cao (Bùi Quang Tề, 2003)

2.3.2 Bệnh còi

Bệnh do MBV gây ra Theo Bùi Quang Tề (2004), vi-rút tấn công vào tế bào hình ống gan tụy (Hepatopancreas) và tế bào phía trước ruột giữa, vi-rút tái sản xuất bên trong tế bào vật chủ

Tôm nhiễm MBV thường có màu tối hoặc màu xanh tái hoặc xanh đậm Tôm kém ăn, hoạt động yếu và sinh trưởng chậm Các phần phụ của tôm có hiện tượng hoại tử, có nhiều sinh vật bám Gan tụy teo lại, có màu trắng hơi vàng, thối rất nhanh Tỷ lệ chết dồn tích rất cao tới 70% hoặc có thể tôm chết cả ao MBV chỉ lan truyền theo chiều ngang, không theo chiều dọc Bệnh MBV Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

truyền từ cá thể này sang cá thể khác thông qua đường miệng Bệnh MBV không trị được, chủ yếu là phòng bệnh Bệnh MBV lan truyền theo chiều ngang nên hạn chế lây nhiễm từ bên ngoài là biện pháp có hiệu quả cao (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004)

2.3.3 Bệnh đầu vàng

Bệnh do vi-rút gây ra Khi tôm mới nhiễm bệnh, biểu hiện đầu tiên là tôm ăn rất nhiều so với bình thường Sau đó, tôm đột ngột ngừng ăn, một vài ngày sau tôm dạt vào bờ và chết (Bùi Quang Tề, 2004)

Bệnh đã gây tỷ lệ chết nghiêm trọng đến 100% trong vòng 3-5 ngày sau khi xuất hiện dấu hiện bệnh lý đầu tiên và có thể xảy ra sau khi thả giống từ 20 ngày trở đi Đặc trưng của bệnh là cơ thể tôm có màu nhạt ở mang và gan tụy

có màu vàng nhạt Bệnh đầu vàng bùng phát thường đi đôi với điều kiện môi trường nuôi xấu, vì vậy sẽ rất khó xác định nguyên nhân gây chết tôm là do

môi trường nuôi xấu hay do vi-rút (Chanratchakool et al., 2002 Trích dẫn bởi

Trần Thanh Tuấn, 2006)

2.3.4 Bệnh phân trắng

Bệnh phân trắng đầu tiên do trùng hai tế bào làm tổn thương thành ruột, dạ

dày của tôm kết hợp với môi trường ô nhiễm lượng Vibrio phát triển gia tăng, tôm ăn thức ăn nhiễm Vibrio vào dạ dày ruột, vi khuẩn nhân cơ hội hoại tử

thành ruột làm phân có màu vàng hoặc màu trắng (Bùi Quang Tề, 2003)

Tuy nhiên theo một số nghiên cứu gần đây thì bệnh phân trắng có liên quan

đến HPV (Nguyễn Khắc Lâm, 2007)

2.3.5 Bệnh nhiễm trùng vi-rút dưới da và hoại tử

Bệnh do loài vi-rút thuộc giống Parvovirus gây ra Vi-rút ký sinh trong tế bào

tuyến anten, tế bào hệ bạch huyết, tế bào mang, tế bào dây thần kinh, không có thể ẩn chỉ có thể vùi, chúng làm hoại tử và sưng to nhân vật chủ Tôm nhiễm

IHHNV thường hôn mê, hoạt động yếu, chũy biến dạng Tôm sú (Penaeus monodon) bị bệnh sắp chết thường chuyển màu xanh, cơ phần bụng có màu

đục Kiểm tra mô bệnh học tế bào tuyến ăng-ten, tế bào dây thần kinh và tế bào mang của tôm nhiễm IHHNV có thể vùi trong nhân tế bào Thời kỳ đầu thể vùi thường nhỏ nằm ở trung tâm của nhân, sau đó lớn nằm gần kín nhân Trong thể vùi có chứa nhiều vi-rút (Bùi Quang Tề, 2003)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

2.4 Tôm nhiễm HPV

2.4.1 Đặc điểm tôm nhiễm HPV

Tôm bị nhiễm HPV thường bỏ ăn, chán ăn, chậm lớn, giảm nhiều hoạt động (Lightner & Redman, 1985)

HPV có nhiều biểu hiện đặc thù trên động vật chân đốt (Bonami et al., 1995)

Tôm nhiễm HPV hoạt động yếu dễ bị nhiễm các sinh vật bám trên mang, vỏ

và các phần phụ, hiện tượng chết thường xảy ra ở tôm ấu trùng, tỉ lệ chết từ 50-100 % HPV làm hoại tử và teo gan tụy của tôm (Sindermann & Lightner, 1988)

Chẩn đoán tôm nhiễm HPV dựa vào sự biểu hiện của các thể vùi phì đại trong nhân của tế bào biểu mô gan tụy và thỉnh thoảng xảy ra ở tế bào ruột giữa (Lightner, 1996)

2.4.2 Phân loại HPV

HPV thuộc họ Parvoviridae, giống Parvovirus Ở Châu Á có 2 loại HPV đặc trưng, một là HPV nhiễm trên tôm Penaeus chinensis ở Hàn Quốc và loài thứ hai là HPV nhiễm trên tôm Penaeus monodon ở Thái Lan (Rukpratanporn et al., 2005)

2.4.3 Hình thái học của HPV

HPV là loại vi-rút không có vỏ bao có 20 mặt, đường kính trung bình của virion là 22-25 nm và thuộc loại ADN mạch đơn cuộn tròn (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004)

Thể virion của vi-rút thuộc giống Parvovirus, là loài vi-rút đơn giản nhất

Chromosom của nó được tạo thành từ 1 mạch ADN có trọng lượng phân tử 1,5

- 2,2×106 Kích thước trung bình của Parvirion là 20 nm và capsid của nó

được tạo thành từ 3 polypeptid khác nhau Trọng lượng phân tử lớn nhất của

polypeptid lớn nhất là 90.000 Có hai dạng Parvovirus, dạng bình thường và

dạng hoạt động ADN của vi-rút trong tế bào vật chủ là luôn luôn có cấu trúc 2 sợi sắn (ADN ±) ADN của vi-rút nằm ở giữa và được bao quanh bởi các protein capsid và có 1 mạch ADN đi đến virion Protein của capsid bao quanh ADN mạch dương và cả ADN mạch âm (Nguyễn Thị Chính và ctv, 2001) Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

2.4.4 Đặc tính sinh học của HPV

HPV lây nhiễm trên các loài tôm nuôi và tôm tự nhiên thuộc họ Penaeus bao gồm Penaueus merguiensis, Penaueus monodon, Penaueus chinensis, Penaueus japonicus, Penaueus penicillatus, Penaueus vannamei (Nguyễn Văn Hảo, 2000) và tôm càng xanh Microbrachium rosenbergii (Lightner et al.,

1994) HPV có thể được che giấu do nhiễm cùng nhiều mầm bệnh khác

Thường chỉ có một thể vùi trong nhân đôi khi có hai thể vùi trong nhân phì đại của tế bào biểu mô gan tụy Vi-rút HPV tấn công chủ yếu vào tế bào E, đoạn đầu của ống tiểu quản Thời kỳ đầu thể vùi nhỏ nằm ở trung tâm của nhân, sau lớn dần chiếm gần hết nhân Trong thể vùi có nhiều có chứa nhiều vi-rút (Sindermann & Lightner, 1988)

2.4.5 Phân bố của bệnh HPV

HPV được mô tả đầu tiên từ nông dân nuôi tôm biển ở Singapore (Chong &

Loh, 1984 Trích dẫn bởi Flegel et al., 2004) Sau đó Lightner và Redman (1985) trích dẫn bởi Flegel et al (2004), dựa trên phân tích mô bệnh học báo cáo HPV nhiễm trên 4 loài tôm: Penaeus chinensis nuôi ở Trung Quốc, Penaeus merguiensis nuôi ở Singapore, Penaeus monodon nuôi ở Phillipin và Penaeus semisulcatus nuôi ở Kuwait

Loài vi-rút này lây nhiễm trên nhiều loài tôm khác nhau và lan rộng ở nhiều nơi trên thế giới: Châu Á, Châu Phi, Châu Úc , Bắc Mĩ và Nam Mĩ (Fulks & Main, 1992; Lightner & Redman, 1992)

Bệnh HPV lần đầu tiên được phát hiện ở Mỹ trong đàn tôm nhập nội Tiếp theo đó là tôm nuôi ở Malaysia đã nhiễm vi-rút HPV (Lightner & Redman,

Sự lây truyền của HPV có thể xảy ra theo chiều dọc và chiều ngang (Lightner

& Redman, 1992) Còn theo Bùi Quang Tề (2000), HPV chỉ lây truyền theo chiều ngang, không lan truyền theo chiều dọc Nhưng ở Ấn Độ thì tỉ lệ nhiễm kép HPV trên tôm giống cùng với sự xuất hiện của MBV và WSSV dẫn đến tỉ

lệ chết cao trên tôm giống được báo cáo bởi Umesha et al (2003), có thể

chứng minh HPV có thể lây nhiễm theo chiều dọc

Biện pháp làm giảm tỉ lệ nhiễm HPV là nên kiểm tra tôm bố mẹ trước khi sản

xuất giống và kiểm tra tôm giống trước khi thả nuôi được đề nghị bởi Flegel et

al (1999)

2.4.7 Tác hại của HPV đối với tôm nuôi

Bệnh HPV cùng với MBV gây tác hại trong đợt dịch tôm chết ở Đài Loan năm 1987-1988 (Nguyễn Văn Hảo, 2000)

Vi-rút HPV được tìm thấy ở Thái Lan trong nhiều năm nhưng chưa có nhiều thông tin phổ biến HPV gây chết tôm trong suốt tháng đầu tiên sau khi thả

nuôi (Flegel et al., 1995) Tuy nhiên, nhiều kết quả nghiên cứu thống kê gần

đây cho thấy tôm nhiễm HPV có kích cỡ nhỏ hơn so với tôm bình thường Hầu hết tôm nhiễm HPV sinh trưởng rất chậm và ngừng lớn ở chiều dài 6 cm

chỉ nặng khoảng 5 gam và làm thiệt hại rất nhiều về mặt kinh tế (Flegel et al.,

2004)

Năm 1996 ở tỉnh Songkhla, Thái Lan kiểm tra 80 mẫu từ 4 ao tôm sú Penaeus Monodon, chỉ có HPV và MBV nhiễm trên tôm nhỏ hơn bình thường HPV có

liên quan đến sự phát triền chiều dài của tôm Tôm nhiễm HPV và nhiễm kép

có chiều dài ngắn hơn tôm bình thường và tôm chỉ nhiễm MBV Báo cáo của tỉnh Songkhla chiều dài của tôm nhiễm MBV không khác với chiều dài của tôm không nhiễm MBV và không có sự liên quan giữa MBV và chiều dài của tôm Năm 1997 trong 80 mẫu kiểm tra ở hai ao nuôi tôm thuộc tỉnh Ratchaburi chỉ có HPV và MBV được phát hiện giống như kết quả ban đầu của tỉnh Songkhla, nhóm tôm nhiễm HPV và nhiễm kép HPV và MBV giống nhau về chiều dài và ngắn nhất trong số mẫu kiểm tra Báo cáo ở tỉnh Songkhla không

có mối liên quan giữa MBV và chiều dài của tôm Tuy nhiên kết quả của tỉnh Ratchaburi không giống với kết quả của tỉnh Songkhla: có sự liên quan giữa MBV và chiều dài của tôm, tôm nhiễm MBV có chiều dài khác với tôm không nhiễm Năm 1998 trong 240 mẫu ở 6 ao từ tỉnh Chumpol chỉ có MBV duy nhất được phát hiện Kết quả có sự liên quan giữa MBV và kích cỡ của tôm và

có sự khác biệt giữa chiều dài giữa nhóm tôm nhiễm MBV và tôm không Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

nhiễm Kết quả của sự nghiên cứu là MBV có ảnh hưởng đến sinh trưởng của tôm ít hơn HPV và sự khác nhau về kích cỡ giữa tôm nhiễm HPV và không nhiễm là một chứng cứ rõ ràng dẫn đến thời gian nuôi bị kéo dài thêm Nhiễm kép HPV-MBV thì chỉ có một số ít trường hợp làm tôm chết, còn đa số chỉ

gây chậm lớn cho tôm nuôi (Flegel et al., 2004)

Trước đây tỉ lệ cảm nhiễm HPV trên tôm giống là 60 % thì khi thả nuôi tỉ lệ chết cũng là 60 % đối với tôm thịt trong ao nuôi Tuy nhiên theo nghiên cứu những năm gần đây nếu nhiễm HPV thì không làm chết tôm, mà chỉ làm tôm

tăng trưởng rất chậm (Catap et al., 2003)

Ở Việt Nam tôm sú nuôi nhiễm HPV rất chậm lớn trong một số ao nuôi ở Nghệ An (2002) Tháng 7 năm 2002 kiểm tra một lô tôm post 25-30 ngày ở Quảng Ngãi kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm 100 % bệnh HPV, tôm có hiện tượng đen thân và chết rất nhiều (Bùi Quang Tề, 2003)

2.5 Lịch sử mô học

Mô học có từ khi chiếc kính hiển vi đầu tiên được chế tao bởi Antoni Van Leuenhock (1632-1723) Cuối thế kỷ XVIII Robert Hooke (1635-1703) nhà khoa học người Anh đã xác định tế bào là đơn vị cấu tạo cơ thể sinh vật Cuối thế kỷ XIX năm 1856 Rupolph Virehow (1821-1902) nhà giải phẩu học người Đức đã khẳng định: “bệnh tật là do tổn thương rối loạn của tế bào” Với kết luận trên mà con người hiểu rằng bệnh tật không chỉ là tổn thương, rối loạn ở các cơ quan, nội tạng mà còn ở mức độ mô và tế bào Sang thế kỷ XIX, các nhà khoa học xác định có 4 loại mô cơ bản: biểu mô, mô cơ, mô liên kết, mô thần kinh

Ứng dụng mô học trong nghiên cứu thủy sản

Các chuyên gia bệnh học sử dụng kính hiển vi quang học, điện tử để quan sát biến đổi bệnh lý của những tế bào, mô, cơ quan bị vi-rút tấn công (Fulks và Main, 1992) Young (1959), Johnson (1980) đã ứng dụng giải phẩu học và mô học trong việc hệ thống bệnh thường gặp trên tôm nuôi ở Châu Mỹ, Châu Á

Wang et al (1997), chứng minh sự hiện diện của vi-rút đốm trắng trên tôm Giant tiger shrimp, Penaeus monodon, Kuruma shrimp, Penaeus japonicus

bằng việc quan sát dưới kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử Sudha

et al (1998), bằng phương pháp mô học đã xác định mối quan hệ giữa các loài

vi-rút gây nhiễm trên các loài tôm biển ở Ấn Độ Năm 1999 Nguyễn Văn Hảo nghiên cứu bệnh đỏ mang tôm trên tôm sú nuôi tại Trà Vinh bằng phương pháp mô học để nhận biết bệnh lý và tác nhân thông qua sự thay đổi tổ chức tế Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

bào trong một số cơ quan của tôm như mang, dạ dày, gan tụy, biểu bì dưới vỏ,

cơ quan tạo máu và các các tổ chức khác Kết quả nhận biết được những con tôm bệnh nặng thường có một số biến đổi trong tổ chức cơ thể so với tôm khỏe như mô mang, biểu mô dưới vỏ, gan tụy thể hiện sự hoại tử, xuất hiện một dạng thể vùi nhỏ hình cầu hay hình bầu dục, nằm ngoài nhân bắt màu tím hồng trong biểu mô dưới vỏ, dạ dày, gan tụy Trong cơ quan lympho và mô tạo máu cũng có thể vùi lớn, hình cầu và bắt màu hồng của Eosin rất rõ Và phương pháp PCR hai bước của Lo và ctv (1996), để kiểm tra sự nhiễm vi-rút gây bệnh đốm trắng (WSSV) từ các mẫu tôm mẹ và mẫu ấu trùng Năm 2003 Phạm Trần Nguyên Thảo ứng dụng phương pháp mô học trong chẩn đoán

bệnh đốm trắng trên tôm sú (Penaeus monodon) có thể phát hiện được biểu

hiện đặc trưng của bệnh đốm trắng dưới vỏ, đặc biệt là giáp đầu ngực, dưới mức độ vi thể là thể vùi trong nhân phì đại của các tế bào biểu mô dạ dày, dưói da, mang, tế bào mô liên kết của các cơ quan khác nhau và một số tổn thương khác như phá vỡ cấu trúc của tổ chức, tạo nhiều không bào trên mô, mất liên kết giữa các mô Trong đó những thể vùi có tính kiềm trong nhân phì đại là biểu hiện bệnh lý đặc trưng dùng để chẩn đoán bệnh đốm trắng So sánh kết quả của phương pháp PCR và mô học truyền thống trong chẩn đoán bệnh tôm giống và tôm thịt cho thấy sự khác biệt không đáng kể Năm 2004 Phan Thị Hừng sử dụng phương pháp mô học truyền thống nghiên cứu cấu trúc mô

và biến động số lượng hồng cầu trên cá tra (Pangasius hypophthalmus) bị

bệnh vàng da có thể thấy được cấu trúc mô học của các cơ quan nội tạng của

cá bị vàng da như gan, thận, tỳ tạng không thay đổi so với cá khỏe Khi cá tra

bị bệnh vàng da thì số lượng tế bào hồng cầu giảm đi hơn 50% so với cá khỏe Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian thực hiện: từ tháng 03/2007-06/2007

Địa điểm: Phòng thí nghiệm Bệnh Học Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Cần Thơ

3.2 Vật Liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Tôm giống dùng cho nghiên cứu được thu từ các trại giống ở Sóc Trăng, Bạc Liêu và Trà Vinh

Tôm thịt dùng cho nghiên cứu được thu từ các ao nuôi tôm ở Sóc Trăng và Trà Vinh

3.2.2 Dụng cụ dùng trong nghiên cứu

Dụng cụ giải phẩu, ống tiêm, kính hiển vi, máy cắt lát mỏng (microtom), lame, lamelle, khuôn đúc, máy nhuộm, khai nhuộm, máy ảnh, bút chì, sổ ghi chép, cân điện từ, thước đo

3.2.3 Hóa chất dùng trong nghiên cứu

Nước cất, cồn tuyệt đối, xylen, formalin, Parafin + sáp ong, thuốc nhuộm Hematoxylin và Eosin (H & E), keo Canada Palsam, dung dịch Davidson’s AFA, thuốc nhuộm Malachite Green

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp thu mẫu

Mẫu tôm giống:

Thu ở các trại giống tại Bạc Liêu, Sóc Trăng, Trà Vinh và trung tâm xét nghiệm giống tại khoa Thủy Sản-Đại Học Cần Thơ Ghi nhận nguồn gốc khác nhau của tôm mẹ, giai đoạn tôm giống Mỗi tỉnh thu 10 trại, mỗi trại thu 2 mẫu trong 1 tháng, thu liên tục trong vòng 3 tháng Thu thêm tại trung tâm xét nghiệm giống 66 mẫu có nguồn gốc từ Sóc Trăng, 29 mẫu có nguồn gốc từ Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Bạc Liêu Tôm giống được chẩn đoán bằng phương pháp nhuộm Malachite Green Chọn 30 mẫu nhiễm HPV kiểm tra lại bằng phương pháp bằng phương pháp mô học

Mẫu tôm thịt:

Thu tại 2 địa điểm Sóc Trăng và Trà Vinh Tỉnh Sóc Trăng thu 15 ao, mỗi ao thu ngẫu nhiên 15 con, còn ở Trà Vinh thu 15 ao, mỗi ao thu 6 con Do mật độ tôm nuôi ở Trà Vinh thấp và tôm có cỡ lớn nên chỉ thu được trung bình 6 con/ao, còn ở Sóc Trăng đa số nông dân nuôi tôm thâm canh nên số lượng mẫu nhiều 15 con/ao Trong quá trình thu mẫu ghi nhận một số thông tin về kỹ thuật quản lý ao nuôi, chế độ cho ăn, loại thức ăn sử dụng trong quá trình nuôi, nguồn gốc giống thả nuôi Tôm được chẩn đoán sơ bộ với phương pháp nhuộm Malachite Green Sau đó dùng phương pháp mô học truyền thống để xác định sự hiện mầm bệnh trên tôm thịt

3.3.2 Phương pháp phân tích mẫu

3.3.2.1 Phân tích tôm giống và tôm thịt bằng phương pháp nhuộm tươi Malachite Green

Dùng dao mổ giáp đầu ngực của tôm (tôm thịt và tôm giống) lấy gan tụy đưa lên lame Nhuộm tươi bằng dung dịch cồn 0.05-0.1% Malachite green để phát hiện thể vùi trong tế bào gan tụy do vi-rút HPV gây ra Quan sát dưới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 400 lần có thể phát hiện thể vùi của HPV trong nhân tế bào gan tụy bắt màu xanh của thuốc nhuộm Malachite Green Quan sát các thể vùi HPV dưới kính hiển vi ngay trong vòng 5 phút

3.3.2.2 Đo chiều dài và trọng lượng tôm trước khi phân tích mẫu

3.3.2.3 Phương pháp mô bệnh học truyền thống theo Lightner (1996)

Cố định mẫu

Tôm giống được cố định trong dung dịch Davidson’s AFA trong thời gian từ 12-24 giờ, sau đó chuyển sang dung dịch cồn 70% và trữ ở nhiệt độ phòng đến khi phân tích Tỉ lệ giữa dung dịch cố định và mẫu tôm giống là 10:1

Tôm lớn thì thu cả con và cố định trong dung dịch Davidson’s AFA trong thời gian là 48 giờ, sau đó chuyển sang cố định trong dung dịch cồn 70% và trữ ở nhiệt độ phòng đến khi phân tích Tỉ lệ giữa dung dịch cố định và mẫu tôm thịt Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

là 10:1 Tôm lớn (trên 3 gam) được tiêm bằng dung dịch cố định vào phần đầu ngực xung quanh khu vực gan tụy Liều lượng tiêm phụ thuộc vào từng kích

cỡ và khối lượng của tôm nhưng phải đảm bảo toàn bộ phần cơ thể và quan trọng nhất là phần đầu ngực của tôm Sau đó dùng kéo và lưỡi dao cắt tỉa mẫu

để chuẩn bị xử lý, phân tích mẫu

Xử lý mẫu

Sau khi cố định tôm giống và tôm thịt (phải cắt tôm thành phần nhỏ trước khi vùi trong parafin) Cắt tôm thịt chiều phân đôi cơ thể, sau đó cắt lấy phần đầu

có chứa gan tụy Cho mẫu vào catsset và cho vào máy xử lý mẫu

Các bước trong quá trình xử lý mẫu như sau (Phòng thí nghiệm mô học, khoa Thủy Sản)

Mẫu sau khi được xử lý cần được cố định và đúc ngay thành khối với parafin

để tránh làm giòn và hư mẫu Định hướng mẫu cho ngay vị trí, sau đó cho parafin nóng chảy vào khuôn Để giữ mẫu được cố định đúng vị trí, quá trình làm lạnh có thể được thực hiện trong quá trình đúc khối Sau khi mẫu được vùi Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

vào trong parafin, làm rắn parafin bằng cách đặt khuôn đúc khối trên máy làm lạnh, sau khi parafin đã rắn tốt thì tiến hành tách khối parafin ra khỏi khuôn

Cắt mẫu

Trước khi tiến hành cắt lát mẫu thì phải gọt tỉa mẫu cho gọn, phải điều chỉnh

độ dày của lát cắt Những lát cắt đầu có thể cắt ở độ dày từ 10-12 µm Sau khi

đã cắt bằng mặt khối và đến vị trí cần, điều chỉnh độ dày về 4-6 µm Giữ lạnh khối parafin trong quá trình cắt mẫu Để qua đêm cho parafin tan ra và mẫu được khô

Dán lát cắt vào lame

Sau khi đã chọn được lát cắt phù hợp thì tiến hành dán lát cắt vào lame Cho nước ấm khoảng 55oC trải đều trên lame, sau đó dùng pen gấp thật khéo lát cắt đặt vào ngay giữa miếng lame, trong quá trình đặt lát cắt vào cần cẩn thận cho lát cắt thật thẳng để đảm bảo mẫu mô đẹp Cho miếng lame lên bàn sấy với nhiệt độ từ 45-50oC

Xylen 5 5 phút Làm khô mẫu

3.4 Phương pháp phân tích số liệu

cảm nhiễm cao (+++)

3.4.3 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được kiểm tra và phân tích bằng phầm mềm thống kê Excel

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

CHƯƠNG 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Cường độ cảm nhiễm và tỉ lệ cảm nhiễm tự nhiên của vi-rút trên tôm

sú giống thả nuôi ở ĐBSCL

4.1.1 Cường độ cảm nhiễm HPV trên tôm giống thả nuôi ở ĐBSCL

Trong số 265 mẫu tôm giống được thu ở 3 tỉnh Trà Vinh, Sóc Trăng, Bạc Liêu

và được phân tích bằng phương pháp nhộm tươi bằng Malachite Green có 67 mẫu nhiễm HPV dương tính có cường độ cảm nhiễm khác nhau và được trình bày trong bảng 1

Bảng 1: Kết quả cường độ cảm nhiễm trên tôm giống thu ở ĐBSCL (40X)

(Ghi chú: Ic cường độ cảm nhiễm)

Bảng 2: Bảng tổng kết qui ước xác định cường độ cảm nhiễm HPV trên tôm giống

≤ 30% tế bào gan tụy nhiễm MBV được ký hiệu +, mức nhiễm trung bình < 30-60% tế bào gan tụy nhiễm MBV được ký hiệu ++, mức nhiễm nặng ≥ 60%

tế bào gan tụy nhiễm MBV được ký hiệu +++ Như vậy khi kiểm tra HPV trên Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

tôm giống có thể sử dụng kết quả của bảng 2 làm cơ sở ban đầu để đánh giá cường độ cảm nhiễm

4.1.2 Tỉ lệ cảm nhiễm HPV và MBV trên 3 tỉnh ĐBSCL

Trong 265 mẫu tôm post thu ở 3 tỉnh Trà Vinh, Sóc Trăng, Bạc Liêu được kiểm tra có 67 mẫu nhiễm HPV dương tính chiếm tỷ lệ 25,3% (67/265), 159 mẫu nhiễm MBV chiếm tỉ lệ 60% (159/265) Trong 67 mẫu nhiễm HPV dương tính có 59 mẫu cảm nhiễm thấp (22,3%), 4 mẫu cảm nhiễm trung bình (1,5%), 4 mẫu cảm nhiễm nặng (1,5%) Trong 159 mẫu nhiễm MBV dương tính có 29% nhiễm nhẹ, 12% nhiễm trung bình, và 19% nhiễm nặng Tỉ lệ cảm nhiễm HPV và MBV được thể hiện qua hình 1&2

74,7%

22,3%

1,5% 1,5%

- HPV + HPV ++ HPV +++ HPV

Hình 1: Tỉ lệ cảm nhiễm HPV trên tôm giống ở 3 tỉnh ĐBSCL

Hình 2: Tỉ lệ cảm nhiễm MBV trên tôm giống ở 3 tỉnh ĐBSCL

Qua hình 1 cho thấy tỉ lệ cảm nhiễm HPV trên của 3 tỉnh Sóc Trăng, Trà Vinh

và Bạc Liêu hiện tại thấp hơn so với tỉ lệ cảm nhiễm trên tôm giống ở các trại giống trên hai đảo IIoilo và Samar (Philippin) lần lượt là: 70-99% và 20-100%

(Catap et al., 2003), nhưng cao hơn so với philippin trong những năm 1993 và

1994 cụ thể là 1,5% và 9,4% (Gomez, 1998)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu