nghiên cứu khả năng ứng dụng biện pháp kiểm tra kháng sinh đồ trực tiếp từ cơ quan bệnh phẩm mủ gan trên cá tra

25 Hình 4.3: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 108 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử dụng Ampicillin giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ .... 29 Hình 4.4: So sánh số lượng vi k

TRƯỜN G ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA TH ỦY SẢN

TRẦN THỊ ĐAN THANH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG BIỆN PHÁP KIỂM TRA KHÁNG SINH ĐỒ TRỰC TIẾP TỪ CƠ QUAN BỆNH PHẨM MỦ GAN

TRÊN CÁ TRA

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠ I HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY S ẢN CHUYÊN NGÀNH B ỆNH HỌC THỦY SẢN

20 09

TRÊN CÁ TRA

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠ I HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY S ẢN CHUYÊN NGÀNH B ỆNH HỌC THỦY SẢN

CÁN BỘ H ƯỚNG DẪN

Ts ĐẶ NG THỊ HOÀNG OANH ĐẶNG THỤY MAI THY

20 09

LỜI CẢM TẠ

Trong những năm tháng trên giảng đường đại học những kiến thức được tích lũy là hành trang quý báu cho tôi trên con đường phát triển nghề nghiệp tương lai Vì thế thực hiện luận văn tốt nghiệp chính là sự lựa chọn tốt nhất để tổng hợp kiến thức trong những năm học của rất nhiều sinh viên trong đó có cá nhân tôi Tuy nhiên để có thể hoàn thành luận văn ngoài phấn đấu bản thân còn được

sự ủng hộ từ gia đình và sự tận tâm hướng dẫn của quý thầy cô

Do vậy đầu tiên tôi muốn gửi những lời biết ơn sâu sắc nhất đến gia đình đã luôn động viên tôi trong suốt thời gian qua

Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô khoa Thủy sản trường Đại học Cần Thơ

đã truyền đạt những kiến thức quý báu trong khoảng thời gian học tập

Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Đặng Thị Hoàng Oanh và cô Đặng Thụy Mai Thy đã tận tình hướng dẫn trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn cô Bùi Thị Bích Hằng, cô Trần Thị Tuyết Hoa đã quan tâm và động viên trong những thời gian qua

Xin gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp Bệnh học thủy sản K31 đã giúp đỡ tôi trong thời gian học tập tại trường

TÓM TẮT

Sau khi được phục hồi từ nguồn vi khuẩn trong bộ sưu tập 10 chủng 3B3, E3, E8, CAF260, T8, A1, CAF255, STL303, CAF258, E223 được kiểm tra kháng sinh đồ trên 2 loại kháng sinh ampicillin và chloramphenicol Đồng thời vi khuẩn cũng được dùng cho thí nghiệm MTT Kết quả thu được ở cả phương pháp kháng sinh đồ và MTT đều cho thấy tất cả các chủng vi khuẩn nhạy với 2 kháng sinh ngoại trừ chủng CAF258, E223 kháng ampicillin và chủng T8 kháng chloramphenicol

Đề tài cũng tiến hành nghiên cứu thí nghiệm MTT trên mô thận tươi Kết quả thu được cho thấy sau khi sử dụng chloramphenicol mật độ tế bào tồn tại giảm

từ 1-10% so với sử dụng ampicillin Bên cạnh đó thực hiện thí nghiệm MTT trên mô đã giảm được thời gian (còn 1,5 ngày) và hạ giá thành từ 7-8 lần so với phương pháp kháng sinh đồ

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ i

TÓM TẮT ii

MỤC LỤC iii

DANH SÁCH BẢNG iv

DANH SÁCH HÌNH v

Chương I: GIỚI THIỆU 1

Chuơng II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Tình hình bệnh mủ gan trên cá tra 2

2.2 Bệnh mủ gan 2

2.2.1 Tác nhân gây bệnh 2

2.2.2 Đường lây truyền 3

2.2.3 Dấu hiệu bệnh lý 3

2.3 Thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản 3

2.3.1 Định nghĩa 4

2.3.2 Nguyên tắc phối hợp kháng sinh trong điều trị 4

2.3.3 Tình hình sử dụng thuốc kháng sinh 5

2.3.4 Cơ chế của sự kháng thuốc 7

2.3.5 Những nghiên cứu về kháng sinh trên E.ictaluri 7

2.4 Thí nghiệm MTT 8

2.4.1 Định nghĩa 8

2.4.2 Những điểm đặc trưng của thí nghiệm MTT 10

2.4.3 Các nghiên cứu về thí nghiệm MTT 10

CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 13

3.2 Nội dung nghiên cứu 13

3.3 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 14

3.3.1 Đối tượng thí nghiệm 14

3.3.2 Vật liệu 14

3.3.3 Thiết bị 14

3.3.4 Hóa chất 15

3.4 Phương pháp nghiên cứu 15

3.4.1 Chuẩn bị vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 15

3.4.2 Kháng sinh đồ 16

3.4.3 Thí nghiệm MTT 17

3.4.4 Xử lý số liệu 21

CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

4.1 Kết quả thí nghiệm trên vi khuẩn 22

4.1.1 Kết quả kháng sinh đồ 22

4.1.2 Kết quả thí nghiệm MTT trên vi khuẩn 24

4.1.3 So sánh số lượng vi khuẩn tồn tại sau sử dụng kháng sinh giữa phương pháp kháng sinh đồ và thí nghiệm MTT 29

4.1.4 So sánh thời gian xác định tính nhạy của kháng sinh giữa thí nghiệm

MTT và phương pháp kháng sinh đồ 33

4.2 Kết quả thí nghiệm trên mô tươi 34

4.2.1 Sự sai khác giữa mô bệnh và mô bệnh sử dụng kháng sinh 34

CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41

5.1 Kết luận 41

5.1.1 Sự mẫn cảm của kháng sinh trên vi khuẩn theo kháng sinh đồ 41

5.1.2 Sự mẫn cảm của kháng sinh trên vi khuẩn theo thí nghiệm MTT 41

5.1.3 Sự mẫn cảm của kháng sinh trên mô theo thí nghiệm MTT 41

5.2 Đề xuất 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

PHỤ LỤC 46

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 3.1: Nguồn gốc các chủng vi khuẩn sử dụng cho đề tài 15

Bảng 3.2: Đường kính vòng tròn vô trùng một số thuốc kháng sinh 16

Bảng 3.3: Sơ đồ bố trí mẫu vi khuẩn vào 7 hàng đầu của đĩa 96 giếng 17

Bảng 3.4: Sơ đồ bố trí mẫu mô vào đĩa 96 giếng 20

Bảng 4.1: Đường kính trung bình vòng vô trùng của 10 chủng vi khuẩn 22

Bảng 4.2: Số lượng vi khuẩn tồn tại sau sử dụng kháng sinh qua phương pháp kháng sinh đồ 23

Bảng 4.3: Sự sai khác của vi khuẩn và vi khuẩn sử dụng kháng sinh qua thí nghiệm MTT 26

Bảng 4.4: Số lượng vi khuẩn tồn tại sau sử dụng kháng sinh trong thí nghiệm MTT trên vi khuẩn 27

Bảng 4.5: Sự sai khác giữa mô bệnh và mô bệnh sử dụng kháng sinh qua thí nghiệm MTT 36

Bảng 4.6: Số lượng tế bào tồn tại sau sử dụng kháng sinh trong thí nghiệm MTT trên mô 37

DANH SÁCH HÌNH

Hình 4.1: Mẫu vi khuẩn & MTT 25

Hình 4.2: Mẫu vi khuẩn & MTT sau khi ủ 4 giờ 25

Hình 4.3: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 108 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử dụng Ampicillin giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ 29

Hình 4.4: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 108 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử dụng Chloramphenicol giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ 29

Hình 4.5: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 107 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử dụng Ampicillin giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ 30

Hình 4.6: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 107 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử dụng Chloramphenicol giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ 30

Hình 4.7: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 106 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử dụng Ampicillin giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ 31

Hình 4.8: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 106 cfu/ml còn tồn tại sau khi

sử dụng Chloramphenicol giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh

đồ 31

Hình 4.9: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 105 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử dụng Ampicillin giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ 32

Hình 4.10: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 105 cfu/ml còn tồn tại sau khi

sử dụng Chloramphenicol giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ 32

Hình 4.11: Thời gian xác định tính nhạy cảm kháng sinh trên vi khuẩn giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ 33

Hình 4.12: Mẫu mô &MTT 35

Hình 4.13: Mẫu mô & MTT sau khi ủ 4 giờ 35

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long

Nafiquaved Cục Quản lý chất lượng, An toàn vệ sinh và Thú y thủy sản MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards

ATCC American Type Culture Collection

E.ictaluri Edwardsiella ictaluri

MIC Minimum Inhibitory Concentration

MBC Minimum Bactericidal Concentration

IC50 The half maximal inhibitory concentration

CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU

Trong quá trình hội nhập WTO và đồng thời chịu ảnh hưởng do tình hình kinh

tế khó khăn chung của thế giới nhưng xuất khẩu thủy sản Việt Nam vẫn có những bước đi vững chắc và ổn định Tháng 7-2008, các doanh nghiệp chế biến xuất được trên 136.000 tấn thủy sản các loại, đạt kim ngạch gần 476 triệu USD Đây là tháng có mức tăng trưởng cao nhất trong 3 năm qua về sản lượng lẫn giá trị, tạo đà cho xuất khẩu thủy sản về đích (www.atpvietnam.com, 18.11.2008) Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thủy sản Việt Nam (VASEP), 7 tháng đầu năm 2008 xuất khẩu thủy sản cả nước đạt khoảng 2,388

tỷ USD, tăng 20% so cùng kỳ năm ngoái, trong đó, sản phẩm cá tra- ba sa chiếm 31,9% Riêng tháng 7- 2008, kim ngạch xuất khẩu cá tra, ba sa vào Nga tăng đến 64 lần so với tháng 7-2007

Song song với sự phát triển của nghề nuôi thì vấn đề dịch bệnh ngày càng trở nên trầm trọng, trong đó tỉ lệ xuất hiện bệnh mủ gan trên cá tra khá cao khoảng 61% (Trần Anh Dũng, 2005) và có xu hướng ngày càng tăng Thiệt hại

do bệnh rất lớn, tỷ lệ cá chết có thể lên đến 90% trên cá tra giống và 50% trên

cá nuôi thương phẩm (Nguyễn Hữu Thịnh, 2007) Khi bệnh xảy ra, người dân thường sử dụng sản phẩm thuốc thú y- thủy sản chứa kháng sinh hoặc kháng sinh nguyên liệu để điều trị cho cá Việc sử dụng kháng sinh bừa bãi, không đúng liều lượng, đôi khi sử dụng với liều lượng thấp để phòng bệnh dẫn đến dịch bệnh ngày càng diễn biến phức tạp, khó điều trị hơn, tỷ lệ sống của cá ngày càng thấp (Nguyễn Chính, 2005) Một phương pháp được sử dụng khá phổ biến hiện nay để xác định các loại kháng sinh và liều lượng thích hợp trong việc điều trị bệnh mủ gan trên cá tra là phương pháp lập kháng sinh đồ Tuy nhiên phương pháp lập kháng sinh đồ truyền thống đòi hỏi nhiều thời gian để phân lập, nuôi cấy Vì vậy đề tài “Nghiên cứu khả năng ứng dụng biện pháp kiểm tra kháng sinh đồ trực tiếp từ cơ quan bệnh phẩm mủ gan trên cá tra” nhằm đánh giá độ tin cậy của biện pháp kiểm tra kháng sinh đồ trực tiếp từ cơ quan bệnh phẩm mủ gan trên cá tra Nhờ vào đó

đề xuất việc sử dụng thuốc kháng sinh phù hợp, góp phần tăng năng suất và sản lượng, hướng đến nghề nuôi cá tra thâm canh bền vững

CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Tình hình bệnh mủ gan trên cá tra

Phong trào nuôi cá tra tại Việt Nam ngày càng được nhân rộng để phục vụ cho nhu cầu tiêu thụ trong nước và đặc biệt là xuất khẩu Từ năm 1996-2006, diện tích nuôi cá tra, basa tăng gấp 7 lần; sản lượng tăng 36,2 lần Tổng diện tích nuôi cá tra, cá ba sa trong toàn khu vực ĐBSCL hiện đã lên đến 5.000 ha Năm 2001 tổng sản lượng cá tra, cá ba sa của toàn vùng mới chỉ được 110.000 tấn thì đến năm 2006 là 825.000 tấn và dự báo năm 2007 sẽ vượt quá 1 triệu tấn, bằng sản lượng quy hoạch cho đến năm 2010 Tại TP Cần Thơ, theo dự báo năm 2007 sẽ tăng thêm khoảng 10% sản lượng sản phẩm cá tra xuất khẩu

(nguồn:www.nafiqaved.gov.vn,14/11/2008) Hiện nay, cá tra đã được xuất

khẩu sang 80 quốc gia và vùng lãnh thổ Để có sản lượng cao cung cấp cho xuất khẩu, bên cạnh tăng diện tích nuôi trồng thì còn nuôi thâm canh ở mật độ

cao làm xuất hiện nhiều loại bệnh như đốm trắng nội tạng do Edwardsiella

ictaluri, đốm đỏ do Pseudomonas , bệnh nhiễm huyết do Edwardsiella tarda,

một số bệnh do nấm, ký sinh trùng gây ra Theo Lý Thị Thanh Loan (2008) ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long tỉ lệ mủ gan là cao nhất so với các loại bệnh khác: 52,8% Tại An Giang bệnh chiếm tỉ lệ cao nhất đạt 66,7%, kế đến

là Cần Thơ: 54,89%; Vĩnh Long 53,8%; Đồng Tháp 36% (www.agriviet.com, 14/11/2008) Cao điểm dịch bệnh thường xảy ra từ tháng 9 đến tháng 12 hằng

năm vào thời kỳ thời tiết chuyển mát (Nguyễn Hữu Thịnh và ctv, 2007); đặc

biệt bệnh xuất hiện không phụ thuộc vào mùa vụ thả giống hay lứa tuổi cá

Theo Crumlish và ctv (2004) qua phân lập từ 181 mẫu cá tra bệnh thu được

108 dòng vi khuẩn gây bệnh mủ gan (Edwardsiella ictaluri) Càng nghiêm trọng hơn theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Hữu Thịnh và ctv (2007) trong

55 mẫu cá tra bệnh phân lập được 97 chủng vi khuẩn thì đã có 47 chủng vi khuẩn gây bệnh mủ gan

2.2 Bênh mủ gan 2.2.1 Tác nhân gây bệnh

Fugerson và ctv (2001) đã có công trình nghiên cứu đầu tiên mô tả về bệnh mủ

gan trên cá tra nuôi xuất hiện đầu tiên vào cuối năm 1998 ở đồng bằng sông Cửu Long, Việt Nam Nguyên nhân gây bệnh được xác định do vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri (Crumlish và ctv, 2002)

Vi khuẩn E ictaluri lần đầu tiên được phân lập và định danh vào năm 1976

(Hawke, 1979 được trích dẫn bởi Valerie, 1993) thuộc họ Enterbacteriaceae là

vi khuẩn gram âm, hình que, kích thước 1 x 2- 3μm, không sinh bào tử, phản

ứng catalase dương tính, oxidase âm tính, không oxy hoá, lên men trong môi

trường glucose Vi khuẩn E.ictaluri cho hầu hết các phản ứng âm tính chỉ có 2 phản ứng dương tính là Lysine và Glucose (Crumlish & ctv, 2004)

Edwardsiella ictaluri phát triển chậm trên môi trường BHI, cần 36-48 giờ để

hình thành các khuẩn lạc ở 28-30oC và kém phát triển hay hoàn toàn không ở

37oC (Valerie và ctv, 1993) Có 1 - 3 plasmid liên kết với E ictaluri (Speyerer

và Boyle, 1987; Newton và ctv, 1988 được trích dẫn bởi Valerie, 1993) Chức

năng của những plasmid vẫn chưa được xác định rõ nhưng có thể chúng đóng

vai trò quan trọng trong việc đề kháng với kháng sinh (Valerie và ctv, 1993)

2.2.2 Đường lây truyền

Bệnh thường xảy ra nhiều vào mùa mưa lũ kéo dài đến mùa khô Edwardsella

ictaluri có thể nhiễm cho cá bằng hai đường khác nhau Vi khuẩn trong nước

có thể qua đường mũi của cá xâm nhập vào cơ quan khứu giác và di chuyển vào dây thần kinh khứu giác, sau đó vào não, bệnh lan rộng từ màng não đến

sọ và da (Shotts và ctv, 1986)

E ictaluri cũng có thể xâm nhiễm qua đường tiêu hoá qua niêm mạc ruột vào

máu gây nhiễm trùng máu Bằng đường này thì vi khuẩn vào mao mạch trong

biểu bì gây hoại tử và mất sắc tố của da Cá còn nhiễm E ictaluri qua đường miệng gây nhiễm khuẩn ruột (Shott và ctv, 1986)

2.2.3 Dấu hiệu bệnh lý

Cá bệnh do nhiễm vi khuẩn E ictaluri thường thể hiện kém ăn hoặc bỏ ăn, gầy

yếu , bụng thường chướng to, xung quanh miệng có các đám xuất huyết, gốc vây xuất huyết, mắt lồi Giải phẫu bên trong, một số cơ quan nội tạng như gan,

lá lách, thận bị hoại tử tạo thành những đốm màu trắng đục đường kính

0,5-2,5mm (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004)

2.3 Thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản

Khi bệnh xảy ra trong ao, nông dân thường sử dụng các sản phẩm thuốc thú thủy sản chứa kháng sinh hoặc kháng sinh nguyên liệu để điều trị cho cá Tuy

y-nhiên theo Nguyễn Hữu Thịnh và ctv (2007) việc sử dụng kháng sinh còn tùy

tiện, không đúng về liều lượng và liệu trình điều trị Nông dân thường dùng kháng sinh liều thấp để phòng bệnh cho cá Vì vậy hiệu quả điều trị kháng sinh ngày càng giảm và hình thành khả năng kháng thuốc cho vi khuẩn

Theo Bùi Thị Tho (2003) trong điều trị các bệnh truyền nhiễm nên có chiến lược sử dụng kháng sinh phù hợp, bao giờ cũng chọn thuốc mà vi khuẩn mẫn cảm nhất và chỉ nên phối hợp kháng sinh khi bị nhiễm đồng thời nhiều vi khuẩn hay khi phối hợp sẽ diệt được vi khuẩn kháng thuốc

2.3.1 Định nghĩa

Kháng sinh là các chất hữu cơ có cấu tạo hóa học phức tạp, có nguồn gốc sinh học (do xạ khuẩn, vi khuẩn và nấm sản sinh ra) hay do con người tổng hợp nên, có tác động một cách chuyên biệt trên một giai đoạn chính yếu của sự biến dưỡng của các vi khuẩn (tác nhân kháng khuẩn), của các nấm (tác nhân kháng nấm), của các virus (tác nhân kháng virus) (Lê Thị Kim Liên và Nguyễn Thị Như Ngọc, 2002)

Sự kháng thuốc: tức vi khuẩn gây bệnh không bị ức chế bởi nồng độ thuốc trong các mô bào (nồng độ này cao hơn nồng độ tác dụng nhưng chưa gây hại

tế bào) Muốn ức chế các vi khuẩn gây bệnh này cần phải dùng nồng độ thuốc cao hơn (tức liều gây đôc hại tế bào) Trong lâm sàng tuyệt đối không được dùng các thuốc đã bị vi khuẩn kháng lại để điều trị, khi đó bệnh không những không khỏi mà động vật còn chết do độc lực của thuốc (Bùi Thị Tho, 2003)

2.3.2 Nguyên tắc phối hợp kháng sinh trong điều trị

Theo Bùi Thị Tho (2003) có những cơ sở khoa học để xem xét, phối hợp các thuốc kháng sinh:

a Dựa trên cơ sở chắc chắn của cơ chế tác dụng

- Sự diệt khuẩn

• Do các chất dinh dưỡng ra khỏi màng tế bào vi khuẩn trong khi vi khuẩn đang cần phải nhân lên với tốc độ nhanh để gây bệnh

• Do thay đổi tính thấm của màng tế bào

• Các thuốc có tác dụng diệt khuẩn: Ampicillin, vancomycin, Penicillin…

- Kìm khuẩn

• Do ức chế sinh tổng hợp protein, acid nucleic và chuyển hóa nội bào của vi khuẩn

• Do vi khuẩn mất cơ chế tự bảo vệ

• Các thuốc có tác dụng kìm khuẩn: Chloramphenicol, tetracycline, erythromycin, sulfonamid

b Sử dụng kháng sinh đúng nguyên tắc hay tuân theo các chỉ định khi phối hợp kháng sinh:

• Các thuốc ức chế và tiêu diệt vi khuẩn có thể có tác dụng đối kháng, tác dụng cộng hay tác dụng độc lập

• Đối kháng không phải nguyên nhân giữa các thành viên khi phối hợp (ức chế hay diệt khuẩn)

• Phối hợp những kháng sinh ức chế vi khuẩn chưa bao giờ có tác dụng hiệp đồng, cộng và độc lập

• Phối hợp các kháng sinh diệt khuẩn có thể có tác dụng hiệp đồng, cộng

và độc lập

• Phối hợp điều trị chỉ sử dụng theo chỉ định: nhiễm trùng hỗn hợp, vi khuẩn hoàn toàn kháng thuốc hay đề phòng sự xuất hiện các chủng vi khuẩn kháng thuốc

Các phối hợp đã được công nhận có tác dụng tốt trên lâm sàng (Bùi Thị

Có 5 loại thuốc được phép sử dụng trong nuôi trồng thủy sản tại Mĩ, trong đó

có 3 loại kháng sinh: oxytetracycline HCL (Terramycin 10), sulfamerazine và

sự kết hợp giữa sulfadimethozine và ormetoprim (Romet- 30) (Benbrook, 2002) Theo thống kê của NAHMS (1997) tổng lượng kháng sinh sử dụng trị bệnh ESC (Enteric Septicemia of Catfifh) hàng năm cho cá da trơn khoảng 126.000- 252.000 pound (57.000-115.000 kg); mặc dù đã sử dung thuốc đặc hiệu nhưng sản lượng cá vẫn thiệt hại ở mức cao 60%

Bên cạnh đó trong kết quả điều tra gần đây của Benbrook (2002) người nuôi

đã sử dụng kháng sinh 2 hoặc 3 lần trong thời gian nuôi và mỗi lần sử dụng vài pound cho các bệnh thường gặp trên cá da trơn, trong đó bệnh ESC chiếm 78,1% và các loại kháng sinh thường sử dụng: oxytetracycline HCL, Romet-

30 Mặc dù đã có một số trường hợp kháng thuốc xảy ra nhưng kháng sinh vẫn là phương pháp chữa trị hàng đầu cho những bệnh truyền nhiễm vi khuẩn

(McGeer, 1998 được trích dẫn bởi Gibbs et al, 2006)

Nhóm Macrolid: đây là những kháng sinh có tác động làm kìm khuẩn ở nồng

độ trong huyết tương Tuy nhiên ở mô nồng độ thường cao hơn và có hiệu lực diệt khuẩn Thuốc không có hiệu lực đối với phần lớn các vi khuẩn gram âm, tác động chủ yếu trên cầu khuẩn gram dương (Lê Thị Kim Liên và Nguyễn Thị Như Ngọc, 2002) Trong đó các chất thường được sử dụng phổ biến trong thủy sản: Erythromycin, Spiramycin, Traleandomycin

Nhóm Tetracycline: thuốc có phổ kháng khuẩn rất rộng cho cả vi khuẩn gram

âm và gram dương, có tác động kìm khuẩn ở nồng độ thấp và diệt khuẩn ở nồng độ cao Đại diện và thông dụng trong nuôi trồng thủy sản là Tetracyclin, Chlotetracyclin và Oxytetracyclin

Nhóm Quinolon: có tác dụng diệt khuẩn , làm mất hoạt tính enzyme DNA

gyrase vì thế gây ức chế tổng hợp DNA Đặc biệt với Fluoroquinolon hoạt tính kháng khuẩn vừa nhanh, vừa mạnh, đặc biệt phổ kháng khuẩn cũng đã được

mở rộng với cả vi khuẩn gram âm và gram dương (Edwardsiella, Aeromonas, Pseudomonas ngoại trừ norfloxacin (Lê Thị Kim Liên và Nguyễn Thị Như Ngọc, 2002)

Nhóm Aminosid: có phổ kháng khuẩn rộng đối với hầu hết vi khuẩn gram âm

và một số vi khuẩn gram dương hiếu khí, ít tác dụng đối với vi khuẩn kỵ khí vì aminoasid thấm qua màng tế bào vi khuẩn một phần nhờ hệ thống vận chuyển hoạt động phụ thuộc vào oxygen nên vi khuẩn kỵ khí tuyệt đối không chịu tác động của Aminosid (Trần Thị Thu Hằng, 2006)

Nhóm Phenicol: là những kháng sinh kìm khuẩn, phổ kháng khuẩn rộng và

khả năng phân tán tốt vào các mô cơ thể Cloramphenicol rất được ưa chuộng trong trị liệu Tuy nhiên từ 1950 sự phát triển độc tính đáng kể trên cơ quan tạo máu đã giới hạn việc sử dụng kháng sinh này (Lê Thị Kim Liên và Nguyễn Thị Như Ngọc, 2002) và hiện nay lại cấm sử dụng trong thú y do phát hiện được những tác hại của thuốc: gây suy tủy, tỷ lệ quái thai cao, gây dị ứng… Đặc biệt nếu dùng thường xuyên để điều trị bệnh cho động vật sẽ rất nguy hại

do chúng để lại tồn lưu các sản phẩm dùng làm thức ăn cho người từ động vật (Bùi Thị Tho, 2003)

2.3.4 Cơ chế của sự kháng thuốc

Theo Dixon (2007) cho rằng một dòng vi khuẩn đã kháng kháng sinh có thể truyền gen kháng thuốc là plasmid và hiện tượng kháng thuốc có nguy cơ xảy

ra ở hầu hết các loại kháng sinh đã dùng trong nuôi trồng thủy sản Hiện tượng kháng thuốc kháng sinh là khả năng mà một sinh vật có thể chịu được tác động của các loại kháng sinh Các gen kháng thuốc thường có sẵn trong các loài vi sinh vật tạo ra kháng sinh nhằm bảo vệ chúng khỏi tác động của thuốc kháng sinh này (Ricki, 1995)

2.3.5 Những nghiên cứu về kháng sinh trên E ictaluri

Một số phương pháp xác định mật độ vi khuẩn thông dụng

Theo Geert Huys, 2002 hiện nay có 2 phương pháp thường được sử dụng xác định mật độ vi khuẩn

Thứ nhất: Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ

Nuôi tăng sinh: vi khuẩn sau khi phục hồi và tách ròng cho đến thuần dùng que cấy tiệt trùng lấy 2-3 khuẩn lạc cho vào ống nghiệm chứa 30ml NB tiệt trùng, sau đó đặt lên máy lắc 200 vòng/phút 18-24h Sau 24h chuyển vi khuẩn sang ống falcol 50ml tiệt trùng và ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút Ly tâm xong loại bỏ phần dung dịch phía trên và rửa vi khuẩn bằng nước muối sinh lý, quá trình ly tâm được lặp lại 2-3 lần cho đến lần ly tâm cuối; loại bỏ dung dịch phía trên và cho 25ml dung dịch NB vào, trộn đều bằng máy vortex Xác định mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ bước sóng 590nm

Thứ hai: Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn dựa vào ống chuẩn McFarland số 3 (9x10 8 cfu/ml):

Vi khuẩn sau khi phục hồi tiến hành tách ròng cho đến thuần Dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc cho vào 10ml nước muối sinh lý đã tiệt trùng Trộn đều và so sánh độ đục với ống McFarlant số 3 (9,7ml H2SO4 1% & 0,3ml 1% BaCl2) Quan sát nếu độ đục thấp hơn ống chuẩn thì cho thêm khuẩn lạc vào ống nghiệm cho đến khi độ đục tương đương với ống chuẩn McFarlant Khi

đó mật số vi khuẩn trong ống nghiệm khoảng 9x108

cfu/ml

Một số kết quả nghiên cứu kháng sinh trên E ictaluri

Crumlish & ctv (2002) ghi nhận các chủng E ictaluri phân lập trên cá tra ở Việt Nam nhạy cảm hoàn toàn với amoxycillin, florfenicol E ictaluri được

phân lập từ cá nheo Mỹ cũng hoàn toàn nhạy cảm với florfenicol Ngoài ra vi

khuẩn E ictaluri trên cá tra còn kháng với một số loại thuốc kháng sinh oxytetracylin, oxolinic acid, sulphonamid (Từ Thanh Dung và ctv, 2004) Bên cạnh đó theo Nguyễn Thanh Phương và ctv (2005), 13 chủng E ictaluri

phân lập trên cá tra tại ĐBSCL đều kháng với oxytetracylin, oxolinic acid và

sulphonamid Vẫn trên đối tượng E ictaluri theo Cao Tuấn Anh và ctv

(2006) kết quả kiểm tra kháng sinh đồ của 17 loại kháng sinh trên 8 chủng vi khuẩn thì tất cả đều nhạy với doxycilin, ofloxacin và kháng với 15 loại kháng sinh còn lại norfloxacin, oxolonic acid, pefloxacin, colistin, streptomycin, cefipime, sulfamethoxazole/trimethroprime, cetriaxone, cefazolin, gentamycin, aztreonam, cefixime, cefotaxime, oxytetracylin và amoxicillin

Theo nghiên cứu của Nguyễn Hữu Thịnh và ctv (2007) 100% chủng E ictaluri

phân lập được đều đề kháng với sulfamethoxazole, gần như tuyệt đối với

Colistin (97,9%); và tác giả đã nhận xét Edwardsiella ictaluri còn kháng với

các lọai kháng sinh như sau: florphenicol (42,5%), amoxicilin (40,4%), tetracyclin (31,9%), doxycyclin (27,7%) Cùng với thời gian đó, Huỳnh Chí

Thanh (2007) đã tiến hành nghiên cứu sự mẫn cảm của E ictaluri phân lập từ

cá tra tại An Giang , nhận thấy rằng vi khuẩn mẫn cảm cao với kháng sinh cefazoline, doxycilin, cefalexin; kháng với amoxicillin, aztreonam, sulfamethoxazole/ trimethroprime, streptomycin, oxolinic acid, gentamycin và mẫn cảm trung bình với enrofloxacin, ofloxacin, norfloxacin, pefloxacin

Ngoài ra, theo kết quả kiểm tra kháng sinh đồ của vi khuẩn E ictaluri gây

bệnh trên cá tra (chủng E223) của Tiết Ngọc Trân (2007) cho rằng vi khuẩn nhạy với ofloxacin, cefazolin, doxycylin và ceferime (đường kính vòng tròn

vô trùng > 16mm) Riêng đối với sulfamethoxazole/ trimethroprime và streptomycine thì dòng 223 có dấu hiệu kháng thuốc (đường kính vòng tròn vô trùng là 10mm và 11mm) Tiếp theo những nghiên cứu về kháng sinh đồ trên chủng vi khuẩn E223, Nguyễn Thị Thúy Hằng (2008) nhận xét rằng vi khuẩn nhạy với hầu hết các loại kháng sinh: cefixime, doxycylin, cefalexin, ofloxacin, amoxicillin và pefloxacin

2.4 Thí nghiệm MTT 2.4.1 Định nghĩa

Theo Mosmann (1983), người đã nghiên cứu thành công kỹ thuật tạo màu thí nghiệm MTT dựa trên khả năng khử hidro trên ti thể của tế bào sống, nhằm tách tetrazolium đã làm xanh xám màu vàng của MTT và tạo nên tinh thể

formazan màu xanh đen Tinh thể này sẽ ngăn cản sự thấm nước của màng tế bào, vì thế các sự tích tụ vẫn còn bên trong các tế bào khỏe Sau đó chất tẩy được cho vào để có thể hòa tan các tinh thể tạo thành Số tế bào tồn tại tương ứng với lượng formazan sinh ra

Trong khi đó theo Wikipedia (www.en.wikipedia.org, 1/12/2008) thí nghiệm MTT là phương pháp kiểm tra và phân tích trong phòng thí nghiệm bằng một thiết bị đo màu chuẩn (phân tích phạm vi thay đổi màu sắc) làm tiêu chuẩn để đánh giá hoạt động của những enzim khử MTT tạo formazan màu tía Hiện tượng này chủ yếu xảy ra ở ty thể vì thế những thí nghiệm này là tiêu chuẩn để đánh giá hoạt động của ty thể trên quy mô lớn Cũng có thể được sử dụng để xác định độc tố tiềm tàng bên trong các tác nhân có đặc tính chữa bệnh và những vật liệu có độc tố khác Từ đó các tác nhân trên sẽ cho kết quả về các tế bào có đặc tính độc gây sự hoạt động bất thường của ty thể, làm giảm kết quả phân tích

Theo ATCC ( http://www.atcc.org, 1/12/2008) thí nghiệm MTT là phương pháp thuận lợi để ước lượng mật độ tế bào đồng thời là công cụ quan trọng cho nhiều lĩnh vực nghiên cứu rộng lớn Trong thí nghiệm MTT, muối tetrazolium vàng được biến đổi trong hoạt động chuyển hóa của tế bào hình thành tinh thể formazan không tan màu tía Sau đó tinh thể này sẽ được hòa tan khi cho chất tẩy vào Màu sắc sau đó sẽ được định lượng bởi máy đo phổ

Ở mỗi loại tế bào, sẽ thiết lập nên mối quan hệ tuyến tính giữa số tế bào và khả năng hấp thu, vì thế giúp xác định số lượng thay đổi trong tăng trưởng chính xác và trung thực Một trong số những ứng dụng cho phương pháp này

là xác định khả năng nhạy của thuốc, độc lực, phản ứng lại các yếu tố tăng trưởng và hoạt động tế bào

2.4.2 Những điểm đặc trưng của thí nghiệm MTT

Theo ATCC( http://www.atcc.org) thí nghiệm MTT có những ưu điểm sau:

- Tính ứng dụng cao: phương pháp này đã được áp dụng rông rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác nhau

- Sự đo lường chính xác: phép đo phổ có thể phát hiện những sự thay đổi rất nhỏ trong sự chuyển hóa của tế bào, nhạy hơn rất nhiều so với sự nhuộm màu bằng trypan blue

- Thuốc thử an toàn: không cần trữ và kích hoạt các chất phóng xạ bằng tay

- Dễ sử dụng: thao tác tương đối đơn giản và sử dụng những thiết bị có sẵn trong hầu hết các phòng thí nghiệm

- Thao tác nhanh: thí nghiệm hoạt động trên đĩa 96 giếng và đọc kết quả bằng máy microtitre plate reader, cho phép đưa một số lượng lớn mẫu vào trong quá trình thực hiện

- Lưu trữ thuận lợi: bộ kit ổn định trong 18 tháng khi trữ vào tủ lạnh trong tối

2.4.3 Các nghiên cứu về thí nghiệm MTT

Mshana (1998) đã sử dụng MTT để nghiên cứu khả năng kháng rifampin của

Mycobacterium tuberculosis Cho 40 µl dung dịch vi khuẩn vào mỗi giếng và

thí nghiệm được lặp lại 3 lần Sau đó cho 10µl dung dịch MTT vào mỗi giếng

và đem ủ 4 giờ ở 37oC Tiếp theo cho 50 µl dung dịch lysing buffer (20% sodium dodecyl sulfate trong 50%N1N- dimethylformamide; pH 4,7) vào mỗi giếng và ủ qua đêm Sự hấp thu được đo bằng máy đo tự động khả năng hấp thu miễn dịch liên kết enzim ở bước sóng 570nm Kết quả phát hiện được khả

năng kháng rifampin của Mycobacterium tuberculosis Trong đó thí nghiệm đã

thể hiện mối quan hệ tuyến tính giữa mật độ vi khuẩn đã có và sự giảm MTT, nếu vi khuẩn chết thì không có khả năng làm giảm MTT

Nhiều nghiên cứu về sau đã sử dụng MTT để xác định hàm lượng độc tố trên các tác nhân gây bệnh Tiêu biểu là thí nghiệm của Zorrilla (2001) đã sử dụng MTT để ước lượng độc tố ECPs (sản phẩm ngoại bào) của nhiều tác nhân gây

bệnh có kích thước nhỏ trên cá vền biển (Sparus aurata L) Kết quả thu được

phụ thuộc vào thời gian ủ nhưng khả năng tối ưu nhất để xác định độc tố gây

hủy hoại 5000 tế bào cá trên mỗi giếng là ủ ở 25oC trong 4-5 ngày, và thời gian ủ với MTT là 5h Kết quả khả năng gây độc ECP của các chủng vi khuẩn khác nhau đều được ước lượng bởi MTT

Bên cạnh đó Freimoser (1999) cho rằng phương pháp sử dụng thiết bị đo màu

để xác định mật số tế bào bằng cách dùng MTT chính xác và tiết kiệm thời gian hơn so với việc đếm mẫu máu truyền thống Một phương pháp khởi đầu cho việc phát triển một phép phân tích nhanh về sự sinh trưởng và tồn tại tế bào lympho của động vật hữu nhũ dựa trên sự biến đổi và sự xác định số lượng của MTT bằng thiết bị đo màu Tổng số tinh thể có thể được xác định bằng phép đo phổ từ đó dẫn đến xác định số lượng tế bào sống trong mẫu Những điểm đặc trưng này có thể mang đến thuân lợi trong việc phân tích độc

tố hay sự sinh sôi của tế bào, được sử dụng rộng rãi trong miễn dịch học, độc chất học, sinh học phân tử

Theo Freimoser (1999) thuận lợi của MTT là phương pháp chính xác, mức độ tin cậy cao và tiết kiệm được ít nhất 80% thời gian tiến hành thí nghiệm Đặc biệt phương pháp MTT có thể xác định mật số tế bào trong thể tích nuôi rất nhỏ Cũng cùng nhận xét về ưu điểm của MTT, Zorrilla (2001) cho rằng phương pháp này giúp việc xác định số lượng và so sánh khách quan về nồng

độ gây độc của các sản phẩm ngoại bào trên các vi sinh vật gây bệnh cho cá

Vì thế kết quả thu được chính xác hơn so với phương pháp đếm truyền thống với trypan blue

Ngoài những ưu điểm trên theo Caviedes (2002) sử dụng MTT để xác định sự mẫn cảm của kháng sinh còn giảm được giá thành trong quá trình tiến hành thí nghiệm; tác giả cho rằng kiểm tra khả năng đề kháng kháng sinh của mỗi chủng Mycobacterium tuberculosis cần 7,54$ nếu sử dụng Alamar Blue, nhưng với MTT giá thành giảm còn 5,04$

Ứng dụng những thành công trong các nghiên cứu trước đây về thí nghiệm MTT, Schrader (2006) cũng đã tiến hành thí nghiệm trên đĩa 96 giếng, tìm

hiểu về khả năng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên

cá da trơn và Flavobacterium columnare Tác giả nhận xét rằng trước đây các

lọai thức ăn thủy sản thường được tẩm các kháng sinh như oxytetracycline, sulfadimethoxine/ormetoprim; đến năm 2005 florfenicol lại được xem như một loại kháng sinh có hiệu quả trong việc điều trị bệnh ESC trên cá trơn Tuy nhiên do lạm dụng thuốc kháng sinh dẫn đến đã tồn lưu các chất độc hại ảnh hưởng đến môi trường nước và sức khỏe con người Vì vậy MTT đựơc xem như hóa chất có thể đánh giá hiệu quả sử dụng kháng sinh cá da trơn, khi đó

sự phát triển của vi khuẩn sẽ được đánh giá thông qua mật độ hấp thu Sau khi

cho MTT vào và ủ 24 giờ, Schrader đã dùng bước sóng 570nm để xác định mật độ tế bào tồn tại Qua việc tạo tinh thể formazan đã xác định được giá trị MIC, MBC, IC50 nhờ vào các số liệu về khả năng hấp thu Kết quả IC50 (24 giờ) từ thí nghiệm kết hợp kháng sinh được so sánh với đối chứng vi khuẩn chỉ sử dụng oxytetracycline , florfenicol Cùng nhận xét như các tác giả trước đây, Schrader cho rằng phương pháp này thực hiện nhanh, chính xác và mang lại giá trị kinh tế do có thể thực hiện thí nghiệm được nhiều mẫu

Cũng vẫn trên nghiên cứu về MTT, Mashhadian (2007) cho rằng môt trong số những phương pháp sinh hóa xác định mật số tế bào sống trong môi trường nuôi cấy thì phương pháp MTT được sử dụng rộng rãi nhằm xác định hàm luợng độc tố trong tế bào Trong nghiên cứu này, Mashhadian đã tiến hành trên kháng sinh rifampin được sử dụng trị bệnh lao phổi cho con người Khác với những thí nghiệm trước đây, HepG2 (tế bào gây ung thư gan) được nuôi trong đĩa 96 giếng với mật độ 1000 tế bào/ giếng, ủ với 5% CO2 ở 37oC Sau

24 giờ Rifampin được thêm vào cho đến khi đạt được nồng độ cuối cùng 5, 10,

2, 50 và 100µM; tiếp tục ủ 48 giờ Trong thí nghiệm này lượng MTT dùng cao hơn , 20 µl (5mg/ml) cho mỗi giếng Các giếng vẫn được ủ 4 giờ (37o C) Sau

đó cho tiếp vào 200 µl dung môi DMSO (dimethylsulfoxide) và 20 µl glycine,

ủ tiếp ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Kết quả rifampin không làm giảm nhiều

tế bào ở nồng độ 5µM nhưng lại làm giảm tế bào ở các nồng độ còn lại Khi

đó số lượng tế bào giảm 12,32%, 37,58%, 55,63% và 77,62% tương ứng ở các nồng độ 5, 10, 2, 50 và 100µM

Ngoài ra MTT còn được sử dụng khá phổ biến trong y học, theo nghiên cứu

Trần Quang Tuấn và ctv (www.cimsi.org.vn, 18/11/2008) về mô hình và chiều hướng đáp ứng miễn dịch ở bệnh nhân sẩy thai liên tiếp, các tác giả đã

sử dụng chứng nghiệm chuyển dạng lympho bào để đánh giá khả nǎng hoạt động của tế bào lympho cũng như khả nǎng và chiều hướng đáp ứng miễn dịch của bệnh nhân

Trong nghiên cứu của Trần Quang Tuấn đã sử dụng nguyên lý đánh giá kết quả chuyển dạng lympho bào máu ngoại vi theo phương pháp MTT, áp dụng

kỹ thuật tạo màu do Mosmann mô tả nǎm 1983 và cải tiến theo phương pháp của Denziot nǎm 1986 với nguyên lý: muối tetrazolium (MTT) màu vàng được chuyển hóa trong ti thể của tế bào sống tạo thành sản phẩm formazan, tạo ra tỉ lệ thuận giữa quá trình chuyển hóa tế bào và số lượng tế bào đang hoạt động Tế bào lympho trong máu của bệnh nhân được nuôi cấy với mật độ 105

tế bào lympho trong 100ml môi trường không có mặt PHA hoặc có mặt PHA với nồng độ 7,5m g/ml Sau 48 giờ thêm MTT để có nồng độ cuối cùng là

1mg/ml và ủ trong 3 giờ Cuối giai đoạn ủ, loại bỏ môi trường bằng ly tâm Sau đó cho vào mỗi giếng 50ml isopropanol, toàn bộ phiến được lắc mạnh để hòa tan toàn bộ chất màu formazan do tế bào tạo ra Kết quả thu được (tính theo chỉ số OD) đã so sánh khả nǎng hoạt động của tế bào lympho giữa các nhóm nghiên cứu

CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian: từ tháng 1- 5/2009

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học & Bệnh thủy sản

3.2 Nội dung thực hiện

- Phục hồi vi khuẩn từ nguồn vi khuẩn liệt kê ở Bảng 3.1

- Thực hiện kháng sinh đồ 10 chủng vi khuẩn Bảng 3.1 (so sánh mật độ

vi khuẩn với ống McFarland 1, mật độ vi khuẩn khoảng 3x108 cfu/ml)

- Dùng MTT ước lượng mật độ vi khuẩn trong dịch huyền phù từ khuẩn lạc

- Dùng MTT ước lượng mật độ vi khuẩntrong dịch mô bệnh phẩm (cá bệnh)

- So sánh hiệu quả sử dụng kháng sinh giữa phương pháp kháng sinh đồ

và thí nghiệm MTT trên vi khuẩn và mô tươi (cá bệnh)

3.3 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 3.3.1 Đối tượng thí nghiệm

- Cá tra từ các đề tài nghiên cứu gây cảm nhiễm bệnh mủ gan

3.3.2 Vật liệu

- Que cấy, bình xịt cồn, đèn cồn

- Ống nghiệm, ống đong, đĩa petri, lame, lamella

- Chai nấu môi trường, bình tam giác

- Cá từ, , hộp đầu col, cối nghiền mẫu, cân, bộ tiểu phẫu

- Que trãi thủy tinh

3.3.3 Thiết bị

- Kính hiển vi

- Tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh, tủ cấy

- Bếp nấu môi trường, nồi thanh trùng

- Micropipette, microplate, máy microplate reader

3.3.4 Hóa chất

- Cồn 70o, cồn 96o

- NaCl, nước cất, H2SO4, BaCl2

- Isopropanol, HCl, MTT diphenyltetrazolium bromide)

(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5 Môi trường phục hồi và nuôi cấy vi khuẩn: Nutrient agar (NA)

- Kháng sinh: ampicilin (AM), choramphenicol (CH)

- Đĩa kháng sinh: ampicillin, chloramphenicol

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Chuẩn bị vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri sử dụng nghiên cứu từ bộ sưu tập vi khuẩn

Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri sử dụng nghiên cứu từ bộ sưu tập vi khuẩn của

Bộ môn Sinh học & Bệnh thủy sản Vi khuẩn được cấy trên môi trường Nutrient Agar, ủ 48 giờ ở 28-300C Cho vi khuẩn vào 3 ml nước muối sinh lý (0.85% NaCl) So sánh mật độ vi khuẩn với ống chuẩn McFarland 1 (mật độ 3x108 cfu/ml) tiến hành pha loãng vi khuẩn ở các mật độ105, 106, 107và 108cfu/ml (thí nghiệm MTT) Tương tự, cho vi khuẩn vào 2 ml nước muối sinh

lý So sánh mật độ vi khuẩn với ống chuẩn McFarland 1 (mật độ 3x108 cfu/ml) (kháng sinh đồ)

Bảng 3.1: Nguồn gốc các chủng vi khuẩn sử dụng cho đề tài

- Cho 100 µl dung dịch vi khuẩn mật độ tương đương ống chuẩn McFland 1

- Dùng que trãi tiệt trùng trãi đều dung dịch trên mặt thạch, ủ khoảng 1-2 phút

- Dùng pel tiệt trùng dán các đĩa kháng sinh lên mặt thạch Khoảng cách giữa các đĩa kháng sinh 24mm, giữa vành đĩa Petri và đĩa kháng sinh 10-15mm (Lila và Eleonor, 2004)

- Ủ 24-48 giờ ở 28-300C

- Đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô trùng (mm)

- Đường kính vòng tròn vô trùng đuợc đo bằng mm, dòng vi khuẩn trên đĩa kháng sinh tương ứng sẽ đuợc xác định là kháng, nhạy hoặc trung bình dựa theo hướng dẫn của NCCLS (2002)

Nếu đường kính vòng tròn vô trùng

≤ 11mm: kháng 12-15mm: trung bình

≥16mm: nhạy

Bảng 3.2: Đường kính vòng tròn vô trùng một số loại thuốc kháng sinh

Công thức xác định số lượng vi khuẩn tồn tại theo phương pháp kháng sinh đồ:

Giả sử rằng sau khi trải dung dịch vi khuẩn lên đĩa thạch, khi đó số lượng vi khuẩn chứa trong đĩa là 100% Từ đây ta sẽ tính được % vi khuẩn tồn tại sau

sử dụng kháng sinh:

[(S đĩa thạch-S đường kính vòng tròn vô trùng)/S đĩa thạch]*100

3.4.3 Thí nghiệm MTT (Raut et al 2008)

Trên vi khuẩn:

- Cho 500 µl dung dịch kháng sinh vào 500 µl dung dịch vi khuẩn mật độ

105, 106 ,107 và 108 cfu/ml Ủ các dung dịch trong 24 giờ

- Bố trí 100 µl dung dịch vi khuẩn mật độ 105, 106 ,107 v 108 cfu/ml lần lượt vào mỗi giếng (mỗi mật độ lặp lại 3 lần)

- Tương tự bố trí 100 µl dung dịch vi khuẩn được ủ kháng sinh vào mỗi giếng (mỗi mật độ lặp lại 3 lần)

- Mẫu control: 100 µl NB

- Cho 10 µl dung dịch MTT vào các giếng, ngoại trừ giếng blank

- Lắc đều mẫu và đem ủ 4 giờ ở 370C

- Cho 0.1N HCl/isopropanol vào và mix các dung dịch bên trong giếng, tiếp tục ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng

- Đọc kết quả bằng máy microplate reader (OD = 570nm)

- Quá trình cho mẫu vào giếng 96 được thể hiện trong phụ lục bảng A

Bảng 3.3: Sơ đồ bố trí mẫu vi khuẩn vào 7 hàng đầu của đĩa 96 giếng

Sơ đồ được bố trí trên 2 chủng vi khuẩn trong đó:

NB: mẫu đối chứng không có vi khuẩn

5, 6, 7, 8 tương ứng với các mật độ vi khuẩn 105, 106, 107, 108 (cfu/ml)

AM: ampicillin CH: chloramphenicol Vk1: vi khuẩn 1 Vk2: vi khuẩn 2

NB NB NB NB

mtt

NB mtt

NB mtt

8 mtt vk1

8 mtt vk1

8 mtt vk1

6 mtt vk1

6 mtt vk1

6 mtt vk1

5 mtt vk1

5 mtt vk1

5 mtt vk1

7 mtt vk1

7 mtt vk1

7 mtt vk1

5

CH mtt vk1

5

CH mtt vk1

5

CH mtt vk1

6

CH mtt vk1

6

CH mtt vk1

6

CH mtt vk1

7

CH mtt vk1

7

CH mtt vk1

7

CH mtt vk1

8

CH mtt vk1

8

CH mtt vk1

8

CH mtt vk1

5

AM mtt vk1

5

AM mtt vk1

5

AM mtt vk1

6

AM mtt vk1

6

AM mtt vk1

6

AM mtt vk1

7

AM mtt vk1

7

AM mtt vk1

7

AM mtt vk1

8

AM mtt vk1

8

AM mtt vk1

8

AM mtt vk1

6 mtt vk2

6 mtt vk2

6 mtt vk2

8 mtt vk2

8 mtt vk2

8 mtt vk2

7 mtt vk2

7 mtt vk2

7 mtt vk2

5 mtt vk2

5 mtt vk2

5 mtt vk2

5

CH mtt vk2

5

CH mtt vk2

5

CH mtt vk2

6

CH mtt vk2

6

CH mtt vk2

6

CH mtt vk2

7

CH mtt vk2

7

CH vtt vk2

7

CH mtt vk2

8

CH mtt vk2

8

CH mtt vk2

8

CH mtt vk2

5

AM mtt vk2

5

AM mtt vk2

5

AM mtt vk2

6

AM mtt vk2

6

AM mtt vk2

6

AM mtt vk2

7

AM mtt vk2

7

AM vtt vk2

7

AM mtt vk2

8

AM mtt vk2

8

AM mtt vk2

8

AM mtt vk2