phát triển quy trình mpcr phát hiện mbv ( monodon baculovirus), wssv (white spot syndrome virus) và gen beta-actin trên tôm sú (penaeus monodon)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN VIẾT TOÀN PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH mPCR PHÁT HIỆN MBV Monodon baculovirus, WSSV White spot syndrome virus VÀ GEN BETA-ACTIN TRÊN TÔM SÚ Penaeu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

TRẦN VIẾT TOÀN

PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH mPCR PHÁT HIỆN MBV

( Monodon baculovirus), WSSV (White spot syndrome virus)

VÀ GEN BETA-ACTIN TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGHÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2009

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

TRẦN VIẾT TOÀN

PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH mPCR PHÁT HIỆN MBV

( Monodon baculovirus), WSSV (White spot syndrome virus)

VÀ GEN BETA-ACTIN TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGHÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN BÙI THỊ BÍCH HẰNG

2009

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với cô Bùi Thị Bích Hằng đã tận tâm hướng dẫn, chỉ bảo, cung cấp tài liệu cũng như những kinh nghiệm giúp tôi hoàn thành được đề tài

Tôi xin chân thành cám ơn toàn thể quý thầy cô, anh chị Bộ môn Sinh Học và Bệnh Thủy Sản – Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Cần Thơ đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành tốt đề tài luận văn tốt nghiệp Chân thành cám ơn các bạn lớp Bệnh học thủy sản K31 đã động viên và ủng

hộ tôi thực hiện được đề tài này

TÓM TẮT

Đề tài được thực hiện nhằm phát triển và ứng dụng quy trình mPCR phát hiện

đồng thời MBV và WSSV trên tôm sú (Penaeus monodon) Sau khi thực hiện quy trình mPCR của (Karlo et al., 2006) với mẫu dương tính với MBV cho

kết quả ở vị trí 361bp Sau đó tiếp tục phát triển quy trình mPCR phát hiện đồng thời MBV và gen β-actin cho kết quả hiện hai vạch ở vị trí 361bp (MBV)

và 216 (β-actin) Trên cơ sở kết quả đạt được, thực hiện quy trình mPCR phát hiện MBV và WSSV kết quả cho thấy hiện vạch 1441bp (WSSV) ở bước 1, hiện đồng thời hai vạch 941bp (WSSV) và 361bp (MBV) ở bước 2 Thực hiện tiếp quy trình phát hiện MBV, WSSV và gen β-actin nhưng kết quả ở hai bước chỉ hiện vạch của WSSV (1441bp, 941bp)

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ i

TÓM TẮT ii

MỤC LỤC iii

DANH SÁCH BẢNG v

DANH SÁCH HÌNH vii

CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU 1

CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Tình hình chung về tôm 3

2.1.1 Tình hình nuôi tôm trên thới giới 3

2.1.2 Tình hình ở Việt Nam 4

2.2 Tổng quang về tình hình dịch bệnh trên tôm 5

2.2.1 Trên thới giới 5

2.2.2 Ở Việt Nam 7

2.3 Bệnh Monodon Baculovirus (MBV) 8

2.3.1 Tác nhân gây bệnh 8

2.3.2 Vật chủ cảm nhiễm 8

2.3.3 Dấu hiệu bệnh lý 8

2.3.4 Kiểu lan truyền 9

2.3.5 Phương pháp chuẩn đoán 9

2.3.6 Các biện pháp kiểm soát bệnh 10

2.4 Bệnh đốm trắng WSSV 11

2.4.1 Tác nhân gây bệnh 11

2.4.2 Vật chủ cảm nhiễm 11

2.4.3 Dấu hiệu bệnh lý 12

2.4.4 Kiểu lan truyền 12

2.4.5 Phương pháp chuẩn đoán 13

2.4.6 Các biện pháp kiểm soát bệnh 14

2.5.Sơ lược về gen β-actin 14

2.6 Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR) 14

2.6.1 Một số nhân tố chính ảnh hưởng đến phản ứng PCR 16

2.6.2 Ứng dụng của phương pháp PCR Thủy sản 17

CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

3.1 Thời gian và địa điễm nghiên cứu 19

3.2 Dụng cụ và hóa chất 19

3.3 Phương pháp nghiên cứu 20

3.3.1 Vật liệu nghiên cứu 20

3.3.2 Ly trích DNA 20

3.3.3 Đo hàm lượng DNA 21

3.3.4 Quy trình PCR phát hiện MBV (Karlo et al.,2006) 21

3.3.5 Phương pháp mPCR phát hiện MBV và gen β – actin 22

3.3.6 Phương pháp mPCR phát hiện MBV và WSSV 23

3.3.7 Phương pháp mPCR phát hiện MBV, WSSV và gen β – actin 25

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

4.1. Thực hiện quy trình PCR phát hiện MBV (Karlo et al.,2006) 27

4.2 Thực hiện quy trình mPCR phát hiện MBV và gen β – actin 29

4.3 Thực hiện quy trình mPCR phát hiện MBV và WSSV 31

4.4 Thực hiện quy trình mPCR phát hiệnMBV,WSSVvà β–actin 34

4.5.Ứng dụng quy trình mPCR phát hiện MBV và β –actin 36

4.6.Ứng dụng quy trình mPCR phát hiện MBV và WSSV 39

CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40

5.1. Kết luận 40

5.2.Đề xuất 41

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1: Sản lượng tôm nuôi trên thế giới qua một số năm (nghìn tấn) (Bộ Thủy Sản số 4 năm 2003) 3 Bảng 2.2: Tình hình nuôi tôm sú ở VN qua một số năm (Bộ Thủy Sản số 4 năm 2003) 5 Bảng 3.3 Trình tự mồi sử dụng trong qui trình PCR phát hiện MBV (Belcher

and Young, 1998) , β-actin (Oanh, 2007), WSSV (OIE, 2006) 20

Bảng 3.4 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình PCR phát hiện MBV 21 Bảng 3.5 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV và β – actin 22 Bảng 3.6 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV (bước 1) 23 Bảng 3.7 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV (bước 2) 24 Bảng 3.8 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV và β – actin (bước 1) 25 Bảng 3.9 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV và β – actin (bước 2) 25 Bảng 4.10 Hàm lượng ADN của mẫu tôm sú 27 Bảng 4.11 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình PCR phát hiện MBV 28 Bảng 4.12 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV và β – actin 30 Bảng 4.13 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV (bước 1) 31 Bảng 4.14 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV (bước 2) 31 Bảng 4.15 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV (bước 2) đã được điều chỉnh 33 Bảng 4.16 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV và β – actin (bước 1) 35

Bảng 4 17 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV và β – actin (bước 2) 35

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Sản lượng tôm sú thế giới năm 2001 (Bộ Thủy Sản số 4 năm 2003) 4 Hình 2.2 Sản lượng tôm nuôi tính theo khu vực ( Nguồn tổng cục thống kê, 2008) 5 Hình 2.3: Tôm sú nhiễm bệnh MBV chậm lớn, màu xanh xẫm (Bùi Quang Tề, 2004) 9 Hình 2.4: Tiêu bản ép mô gan tụy của hậu ấu trùng tôm P monodon bị nhiễm MBV nhuôm malachite green (700X) (Bondad-Reantaso, M.G et al., 2001)…… 10 Hình 2.5 Gan tụy tôm sú bị nhiễm MBV, nhuộm H&E (Bùi Quang Tề, 2004) 10 Hình 2.6 Tôm sú bị bệnh đốm trắng WSSV, có các đốm trắng dưới vỏ (Bùi Quang Tề, 2004) 12 Hình 2.7 Tôm sú bị nhiễm đốm trắng, nhân tế bào biểu bị dạ dày trương to có thể vùi màu hồng, mẫu nhuộm H&E (Bùi Quang Tề, 2004) 13 Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV 27 Hình 4.9 Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV 29

Hình 4.10 Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và β – actin 30

Hình 4.11 Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và WSSV 32 Hình 4.12 Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và WSSV sao khi chuẩn hóa 34

Hình 4.13 Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV, WSSV và β –

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU

Việt Nam có diện tích mặt nước lớn, kể cả nước ngọt, lợ và mặn, đây là một lợi thế cho việc phát triển nuôi trồng thủy sản và cũng là một trong những

lý do dẫn tới sự thành công của ngành trong thời gian qua Việt Nam đã trở thành nước nuôi trồng thủy sản lớn thứ 3 và là một trong 10 nước xuất khẩu thủy sản lớn nhất thế giới Theo bộ thủy sản 2006, sản lượng thủy sản nuôi trồng của Việt Nam đạt 1,67 triệu tấn với giá trị xuất khẩu đạt 1,7 tỷ USD, tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản toàn ngành đạt 3,35 tỷ USD Đồng bằng Sông Cửu Long có diện tích tự nhiên khoảng 39.747 km2, chiếm 12% diện tích cả nước Trên thực tế, nuôi trồng thủy sản (NTTS) ở ĐBSCL đã trở thành một nghề truyền thống và không ngừng thay đổi Theo tính toán, tổng diện tích có khả năng NTTS ở ĐBSCL hơn 1.200.000 ha, bằng gần 60% của cả nước Trong đó, diện tích có khả năng NTTS vùng triều khoảng 750.300 ha, chiếm trên 26% tổng diện tích đất tự nhiên của 8 tỉnh ven biển của vùng và chiếm 74% tổng diện tích có khả năng NTTS trên vùng triều toàn quốc Năm

2006, sản lượng NTTS vùng ĐBSCL đạt khoảng 1.200.000 tấn, bằng trên 70% sản lượng NTTS toàn quốc

Trong đó Tôm sú (Penaeus monodon) là đối tượng thuỷ sản có giá trị thương

phẩm cao là đối tượng nuôi quan trọng ở Việt Nam cũng như một số nước đang phát triển ở Châu Á như Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Philippines, Việt Nam và Nam Mỹ (Ecuador) Nghề nuôi tôm không chỉ góp phần lớn làm tăng kim ngạch xuất khẩu thủy sản cho các nước nêu trên mà còn có tác động tích cực đến quá trình phát triển kinh tế xã hội, cải thiện đời sống cho người nuôi thủy sản Tuy nhiên, khi nghề nuôi tôm được thâm canh hóa nhất là nuôi với mật độ cao thì phải đương đầu với tình trạng dịch bệnh bùng nổ ngày càng thường xuyên và nghiêm trọng do sự suy thoái về môi trường và sự lây lan mầm bệnh Đặt biệt là bệnh do virus trên tôm sú như: bệnh đốm trắng (white spot syndrome virus – WSSV), bệnh MBV (monodon baculovirus), bệnh đầu vàng (yellow head virus – YHV),…đã và đang gây thiệt hại nặng nề cho người nuôi Do đó, việc phát hiện phát hiện sớm bệnh để giảm thiệt hại cho người nuôi, đồng thời nâng cao chất lượng và sản lượng tôm nuôi là vấn đề quan tâm hàng đầu của ngành thủy sản và của người nuôi tôm

Có nhiều phương pháp chẩn đoán bệnh như: phương pháp chẩn đoán truyền thống bằng cách quan sát dấu hiệu bệnh hay phương pháp mô bệnh học nhưng

nó lại không cho phép phát hiện sớm và chính xác tác nhân gây bệnh Nhiều phương pháp phân tử như lai in situ, western blot, PCR, RT-PCR được phát

triển nhằm khắc phục những nhược điểm trên Phương pháp PCR hiện đang được sử dụng rất rộng rải và hiệu quả trong việc xét nghiệm tôm giống Trong

đó phương pháp được xem là hiệu quả nhất là phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) nên nó được cải tiến không ngừng để có thể phát hiện sớm,

phát hiện đồng thời và chính xác tác nhân gây bệnh Từ đó, đề tài: “ Phát

triển qui trình mPCR (multiplex Polymerase Chain Reaction) phát hiện đồng thời MBV (M onodon baculovirus), WSSV (White spot syndrome virus) và gen beta – actin của tôm sú (Penaeus monodon)” được thực hiện

Mục tiêu của đề tài

Phát triển và ứng dụng quy trình mPCR phát hiện đồng thời MBV, WSSV trên

tôm sú (Penaeus monodon) và kiểm soát kết quả âm tính giả

Nội dung đề tài

Thực hiện quy trình PCR phát hiện MBV (Karlo et al., 2006)

Thực hiện quy trình mPCR phát hiện MBV và nội chuẩn β – actin Thực hiện quy trình mPCR phát hiện WSSV, MBV và nội chuẩn β – actin

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình chung về tôm

2.1.1 Tình hình nuôi tôm trên thới giới

Tổng sản lượng tôm của thế giới là 1,6 triệu tấn năm 2003 và có giá trị tương đương 9000 triệu đôla Khoảng 75% là từ các nước châu Á, như Trung Quốc, Thái Lan, Ấn Độ , 25% còn lại là từ nước Nam Mỹ Trung Quốc hiện là nhà xuất khẩu lớn nhất (FAO, 2004)

Các loài tôm được nuôi nhiều nhất là tôm sú (P monodon), tôm thẻ Trung quốc (P chinensis) và tôm chân trắng (P vannamei) Riêng 3 loài tôm này

chiếm trên 86% sản lượng tôm nuôi của thế giới Nếu tính về sản lượng thì tôm sú chỉ xếp thứ 20 trong số các loài thuỷ sản nuôi nhưng về giá trị thì chúng đứng đầu với 4.046 tỷ USD trong năm 2000 (Bộ Thủy Sản số 4 năm 2003)

Bảng 2.1: Sản lượng tôm nuôi trên thế giới qua một số năm (nghìn tấn) (Bộ Thủy Sản số 4 năm 2003)

Trung Quốc

Hình 2.1: Sản lượng tôm sú thế giới năm 2001 (Bộ Thủy Sản số 4 năm 2003)

2.1.2 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam

Bờ biển Việt Nam trãi dài 3.260 km suốt từ Bắc vào Nam là tiềm năng to lớn cho nuôi trồng thủy sản nước mặn và nước lợ Diện tích nuôi tôm gia tăng nhanh chóng từ 250.000ha năm 2000 lên đến 959.000 ha năm 2005 (Tạp chí thủy sản, 2006) Tính đến hết năm 2005 cả nước có 4.281 trại giống sản xuất được 28,8 tỷ con tôm giống tăng 151,64% so với năm 2000 Theo số liệu hiện

có, Việt Nam là nước có diện tích nuôi tôm vào loại lớn trên thế giới, vượt xa Indonesia, nước có diện tích nuôi tôm lớn nhất vào năm 1996, khoảng 360.000

ha Phần lớn diện tích nuôi tôm ở Việt Nam tập trung ở ĐBSCL, rải rác dọc các cửa sông, kênh, rạch ven biển miền Trung và ở đồng bằng sông Hồng, sông Thái Bình ở miền Bắc (http://www.vietlinh.com.vn/html/tintue)

Hình 2.2: Sản lượng tôm nuôi tính theo khu vực (Nguồn: tổng cục thống kê,

2008 )

Các loài tôm nuôi chính ở Việt Nam gồm tôm sú (P monodon), tôm he (P

merguiensis), tôm nương (P orientalis), tôm đất/rảo (metapenaeus ensis),

trong đó tôm sú là loài nuôi chủ đạo, đóng góp sản lượng cao nhất Việt Nam tồn tại 3 hình thức nuôi tôm là quãng canh (cải tiến), bán thâm canh và nuôi thâm canh

Bảng 2.2: Tình hình nuôi tôm sú ở VN qua một số năm (Bộ Thủy Sản số 4 năm 2003)

Năm Diện Tích (ha) Sản lượng ( 1000

tấn)

Năng Suất(kg/ha/năm)

1 10 100 1000 10000 100000 1000000

hóa chất nào có thể chữa bệnh virus Một số bệnh do virus gây ra làm bùng nổ dịch bệnh ở các trại nuôi tôm trên thế giới như: bệnh đốm trắng (WSSV), bệnh Monodon Type baculovirus (MBV), bệnh đầu vàng (YHV), .Năm 1989 lần đầu tiên ở Thái Lan tìm thấy một số lượng lớn thể ẩn polyhedral của MBV trong cơ quan gan tụy của postlarvae ở tôm sú (đây là loài tôm nuôi chủ yếu ở Thái Lan và các nước châu Á) Loài virus này được công bố là loài gây bệnh trên tôm nuôi công nghiệp ở Đài Loan năm 1987 - 1988 MBV cũng được xem

là tác nhân gây bệnh làm ảnh hưởng đến năng suất thu hoạch ở Úc MBV hiện diện phổ biến ở các Châu lục, gây bệnh cho tôm nuôi và tôm tự nhiên Virus gây tỷ lệ chết cao cho ấu trùng và đối với tôm trưởng thành sự nhiễm ít nghiêm trọng hơn Tuy nhiên khả năng gây bệnh của MBV còn tùy thuộc vào độc lực của từng chủng virus ở từng vùng địa lý khác nhau (Lightner và Redman, 1981)

Bệnh đốm trắng (WSSV) là một trong những bệnh nguy hiểm nhất đối với tôm nuôi hiện nay Bệnh xảy ra khắp nơi trên thế giới và ảnh hưởng phần lớn đến nghề nuôi tôm công nghiệp Bệnh đốm trắng gây tỉ lệ chết cao và gây thiệt hại rất lớn cho nghề nuôi tôm công nghiệp ở Trung Quốc, Nhật Bản, Indonesia và

Ấn Độ Trong khoảng thời gian 1994 – 1995, bệnh đốm trắng đã gây chết hầu hết tôm nuôi dọc theo bờ biển phía Đông Ấn Độ và phía Tây Ấn Độ (Thông tin KH & CNTS, số 4/2004) Bênh cạnh đó nghề nuôi tôm ở Ecuador hầu như

bị phá sản do dịch bệnh đốm trắng, sản lượng tôm nuôi giảm sút nghiêm trọng,

từ tháng 4/1999 đến 4/2000 thiệt hại do bệnh đốm trắng đã lên đến 600 triệu USD Cũng như Ecuador, bệnh đốm trắng đã gây thiệt hại 80% sản lượng nuôi tôm của Peru, tổng lượng tôm xuất khẩu từ 57 triệu USD năm 1997 và 71 triệu USD năm 1998 đến năm 1999 chỉ còn 32,66 triệu USD Ngoài ra, nghề nuôi tôm ở Ấn Độ cũng bị thiệt hại đến 95% do dịch bệnh đốm trắng gây ra Sự thiệt hại do bệnh đốm trắng gây ra rất nghiêm trọng, nhiều trại tôm bị thiệt hại đến 60% hoặc mất trắng (Thông tin KH & CNTS, số 10/2001) Ở Thái Lan bệnh WSSV làm giảm sản lượng tôm nuôi từ 225.000 tấn năm1995 xuống 160.000 tấn năm 1996 làm thiệt hại trên dưới 500 triệu USD Ở các nước châu

Á bệnh gây thiệt hại khoảng 3 tỷ USD mỗi năm (Nguyễn Văn Hảo, 2003)

Theo Chanratchakool et all (1999) YHV là virus gây thảm khốc và làm suy

giảm nền kinh tế châu Á Bệnh được phát hiện đầu tiên ở Thái Lan vào năm

1990 Làm thất thoát hơn 30,6 triệu USD năm 1992 và 650 triệu USD vào năm

1994

2.2.2.Tình hình bệnh tôm ở Việt Nam

Ở Việt Nam ngay từ những năm đầu thập niên 90, cùng với sự phát triển của nghề nuôi tôm công nghiệp thì dịch bệnh bắt đầu xuất hiện Từ năm 1993 –

1995 dịch bệnh tôm đã báo động trên toàn quốc, làm thiệt hại hàng ngàn tỷ đồng Trong năm 1994 tổng diện tích nuôi tôm có dịch bệnh là 84.558 ha với sản lượng thiệt hại ước tính là 5.225 tấn (Bộ thủy sản, 1995) Theo Nguyễn Văn Hảo (2003) đợt dịch bệnh thứ nhất năm 2001 xảy ra vào tháng 2 và tháng

3 rộng khắp trên tôm nuôi ở các tỉnh Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Tiềng Giang, riêng ở Bạc Liêu thiệt hại khoảng 10.212 ha Dịch bệnh đợt hai xảy ra vào tháng 7 cùng năm cũng làm tỉnh thiệt hại 47.333 ha

Theo điều tra của Nguyễn Văn Hậu năm 2006 thì tôm giống tới tay người nuôi

ở Đồng bằng sông Cửu Long có tới 23% tôm giống bị nhiễm WSSV và 43,8% nhiễm MBV Tính đến 9/2003, cả nước có 546.757 ha nuôi tôm nước lợ thương phẩm, trong đó diện tích có tôm nuôi bị bệnh và chết là 30.083 ha Các tỉnh, thành ven biển từ Đà Nẵng đến Kiên Giang có tới 29.200 ha nuôi tôm bị chết nhiều, chiếm 97% diện tích có tôm bị chết trong cả nước, Cà Mau bị hơn

232 ha (Theo báo lao động, 2003)

Ở Bạc Liêu, thiệt hại do dịch bệnh ở các mô hình nuôi tôm quãng canh cải tiến kết hợp với đối tượng khác, quãng canh cải tiến chuyên tôm, bán thâm canh và thâm canh lần lượt chiếm 9,6%, 28,8% và 53,1% (Sở thủy sản Bạc Liêu, 2006) Theo báo cáo của sở thủy sản Bình Định và Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản I, 6/2006 toàn tỉnh Bình Định có diện tích nuôi tôm là 3666,3

ha Tổng thiệt hại do bệnh đốm trắng làm tôm chết trên toàn tỉnh là 306 ha (165 ha mất trắng)

(http://www.ria1.org/modules/news/article.php?storyid=150)

Theo báo cáo của ngành thủy sản Bến Tre, 2006 toàn tỉnh đã thả nuôi trên 3.600 ha tôm sú thâm canh, bán thâm canh, đạt 57% diện tích Diện tích nuôi thâm canh, bán thâm canh thả nuôi bị thiệt hại do dịch bệnh là 436 ha, chiếm 12,07% diện tích thả nuôi, trong đó thiệt hại nặng nhất là huyện Bình Đại 367,75 ha Nếu so với năm 2005, tình hình dịch bệnh xảy ra nghiêm trọng hơn (http://www.vietlinh.com.vn/dbase/VLTTShowContent.asp?ID=3108)

Theo số liệu thống kê của Sở NN-PTNT Kiên Giang 5/2008, đã có 43.058 ha trong tổng số 80.563 ha tôm nuôi của tỉnh bị thiệt hại do dịch bệnh Tập trung chủ yếu ở các huyện vùng U Minh Thượng và Gò Quao, trong đó riêng hai huyện An Minh và Vĩnh Thuận đã có trên 35.000 ha tôm bị chết

Không riêng gì Kiên Giang mà các tỉnh khác như Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Trà Vinh, Long An nhiều nông dân cũng đang phải đối mặt với tình trạng tôm chết hàng loạt một cách bất thường như vậy Hiện tỉnh Cà Mau cũng

đã có trên 38.800 ha tôm sú nuôi bị chết với các triệu chứng như: đốm đỏ, đầu vàng, đốm trắng (http://www.thiennhien.net/news/160/ARTICLE/5611/2008-05-21.html)

2.3 Bệnh Monodon Baculovirus (MBV)

Bệnh MBV được phát hiện đầu tiên bởi Lightner và Redman (1981) trên tôm

sú (Penaeus monodon) tại Đài Loan Năm 1989 ở Thái Lan tìm thấy một số

lượng lớn thể ẩn polyhedral của MBV trong cơ quan gan tụy của postlarvae ở tôm sú (đây là loài tôm nuôi chủ yếu ở Thái Lan và các nước châu Á) MBV hiện diện phổ biến ở các Châu lục, gây bệnh cho tôm nuôi và tôm tự nhiên Virus gây tỷ lệ chết cao cho ấu trùng và ít nghiêm trọng hơn đối với tôm trưởng thành Tuy nhiên khả năng gây bệnh của MBV còn tùy thuộc vào độc lực của từng chủng virus ở từng vùng địa lý khác nhau (Bùi Quang Tề và ctv, 2004)

2.3.1 Tác nhân gây bệnh

Tác nhân gây bệnh MBV (Monodon Baculovirus) là virus type A Baculovirus

monodon, cấu trúc nhân là ADN, có lớp vỏ bao, dạng hình que Theo Mari (1993) thì chủng MBV của tôm sú từ Ấn Độ Thái Bình Dương có kích thước nhân 42 ± 3 x 246 ± 15 nm, kích thước vỏ bao 75 ± 4 x 324 ± 33 nm

Virus cảm nhiễm trên nhân gan tụy và nhân của biểu mô ruột giữa Sự lây nhiễm bệnh MBV còn xảy ra trong cơ quan bạch huyết (Bondad-Reantaso,

M.G et al., 2001)

2.3.2 Vật chủ cảm nhiễm

MBV có thể nhiễm ở nhiều loài tôm he khác nhau: Penaeus monodon, P merguiensis, P semisulcatus, P kerathurus, P plebejus, P indicus, P penicillatus, P esculentus, P Vannamei Trong đó, tôm sú (P monodon) thường bị nhiễm nặng và phổ biến nhất (K.K Vijayan et al., 1995)

2.3.3 Dấu hiệu bệnh lý

Đối với tôm Postlarvae khi nhiễm nhẹ không có dấu hiệu rõ ràng, khi nhiễm nặng thể hiện một số dấu hiệu như: yếu, bơi lội lờ đờ, cơ thể đổi màu xanh lơ hay xanh đen, chuyển giai đoạn chậm không đều Tỷ lệ chết tích lũy đến 90% nếu môi trường không ổn định (Bùi Quang Tề và ctv, 2004)

Cũng theo Bùi Quang Tề và ctv, (2004) tôm thịt khi bị nhiễm MBV thường

có màu đen tối, kém ăn còi cọc, chậm lớn, chu kỳ lột xác kéo dài, nên trên

mang và bề mặt cơ thể bị cảm nhiễm rất nhiều các tác nhân cơ hội như vi khuẩn dạng sợi, động vật đơn bào (Protozoa), tảo đơn hay đa bào và các tác nhân khác Có thể sau 3-4 tháng nuôi, tôm vẫn có kích thước rất nhỏ thường gọi là ”tôm kim”

2.3.4 Kiểu lan truyền

MBV lây truyền qua đường miệng do virus có trong phân của tôm bị nhiễm bệnh, hoặc do tôm ăn thịt tôm đã chết hoặc vừa chết Tôm trưởng thành bị nhiễm bệnh cũng có khả năng truyền sang con của chúng thông qua làm bẩn

khối trứng đã đẻ ra do phân (Bondad-Reantaso, M.G et al., 2001)

2.3.5 Phương pháp chẩn đoán

Theo tài liệu FAO về hướng dẫn chẩn đoán bệnh trên động vật thủy sản Châu

Á thì có các phương pháp chẩn đoán sau: dựa vào dấu hiệu bên ngoài, tôm bị nhiễm MBV cấp tính có biểu hiện yếu, bơi lội lờ đờ kém ăn, cơ thể đổi sang màu xanh lơ hay xanh đen, tôm còi cọc chậm lớn Tuy nhiên các dấu hiệu này cũng không đặc trưng cho bệnh MBV Có thể áp dụng phương pháp kiểm tra nhanh các mô gan tụy ép tươi không nhuộm hay có nhuộm bằng malachite green, dưới kính hiển vi có độ phóng đại lớn hơn hoặc bằng 40X Thông qua

sự tồn tại của các thể ẩn hình cầu bắt màu xanh đậm mà xác định MBV trên tôm

Hình 2.3: Tôm sú nhiễm bệnh MBV chậm lớn, màu xanh

xẫm (Bùi Quang Tề, 2004)

Có thể dùng phương pháp mô học, để phát hiện các thể ẩn hình cầu bắt màu hồng của thuốc nhuộm Eosin, nằm trong nhân phình to của tế bào gan tụy, trên các lát cắt mô gan tụy với thuốc nhuộm H&E, ở độ phóng đại đại lớn hơn hoặc bằng 40X

Có thể dùng các phương pháp hiện đại để chẩn đoán và nghiên cứu virus này như dùng kỹ thuật PCR để nhận biết ADN đặt trưng của MBV, dùng phương pháp kính hiển vi điện tử (TEM) phát hiện các thể MBV trong trong nhân tế bào biểu mô gan tụy

Hình 2.5: Gan tụy tôm sú bị nhiễm MBV, nhuộm H&E

(Bùi Quang Tề, 2004) Hình 2.4: Tiêu bản ép mô gan tụy của hậu ấu trùng tôm P monodon bị nhiễm MBV nhuôm malachite green (700X) (Bondad-Reantaso, M.G et al., 2001)

2.3.6 Các biện pháp kiểm soát bệnh

Theo Bondad-Reantaso, M.G et al (2001), mật độ nuôi cao, hóa chất và các

stress do môi trường đã làm tăng tính độc của bệnh MBV ở các loài tôm dễ bị nhiễm bệnh trong điều kiện nuôi

Việc phòng tránh nhiễm bệnh bằng cách chọn tôm bố mẹ không bị nhiễm MBV bằng phương pháp kiểm tra phân, tẩy uế bề mặt của ấu trùng nauplius hoặc các trứng đã thụ tinh bằng formalin, iodophore, và lọc sạch nước biển

Có thể tiệt trùng các dịch bệnh MBV ở một số cơ sở nuôi trồng thủy sản bằng cách cho tiêu hủy đàn tôm đã bị nhiễm bệnh, khử trùng dụng cụ nuôi, tránh virus tái nhiễm (từ các phương tiện nuôi khác ở bên cạnh, tôm tự nhiên,vv )

2.4 Bệnh đốm trắng WSSV

Năm 1993, WSSV lần đầu tiên được tìm thấy ở Đài Loan Từ đó virus này phân bố rộng và gây thiệt hại đáng kể cho nghề nuôi tôm ở vùng này Bệnh đốm trắng (WSSV) vẫn là một trong các bệnh virus nguy hiểm nhất đối với tôm nuôi hiện nay (Chou et al, 1995 trích dẫn bởi Nguyễn Văn Hảo, 2003)

2.4.1 Tác nhân gây bệnh

Trước năm 2002, có 3 chủng Baculovirus gây bệnh đốm trắng hoặc còn gọi là

virus Trung Quốc Tuỳ từng nước nghiên cứu chúng có tên gọi và kích thước như sau: (Bùi Quang Tề, 2004)

Tên virus Kích thước virus Kích thước nhân Virus Trung Quốc (HHNBV) 120 x 360 nm

Virus tôm Nhật 2 (RV-PJ-2) 83 x 275 nm 54 x 216 nm Virus bệnh đốm trắng Thái Lan

(SEMBV)

121 x 276 nm 89 x 201 nm

Virus bệnh đốm trắng (WSBV) 70-150x350-380nm 58-67x330-350nm Hội nghị virus học quốc tế lần thứ 12 (Paris, 2002) các tác giả: Just M Vlak, Jean-Robert Bonami, Tim W Flegel, Guang-Hsiung Kou, Donald V Lightner, Chu-Fang Lo, Philip C Loh và Peter J Walker đã phân loại virus gây hội

chứng đốm trắng là một giống mới Whispovirus thuộc họ mới Nimaviridae

Virus có dạng hình trứng, kích thước 120 x 275nm, có một đuôi phụ ở một đầu, kích thước 70 x 300nm Virus có ít nhất 5 lớp protein, trọng lượng phân

tử từ 15- 28 kilodalton Vỏ bao có hai lớp protein VP28 và VP19; nucleocapsid có 3 lớp VP26, VP24, VP15 Nhân cấu trúc ADN (Bùi Quang

Tề, 2004)

2.4.2 Vật chủ cảm nhiễm

Bệnh đốm trắng có số lượng vật chủ khá lớn Bệnh bùng phát được thông báo

lần đầu tiên từ trại nuôi tôm P.japonicus ở Nhật và sự lây nhiễm tự nhiên sau

đó đã quan sát thấy ở tôm P.chinensis, P.indicus, P merguiensis, P.monodon,

P setiferus, P.styliostris và P.vannamei Trong các nghiên cứu thực nghiệm, bệnh đốm trắng cũng gây chết cho tôm P.aztecus, P.duodarum và P.setiferus (Bondad-Reantaso, M.G et al., 2001)

2.4.3 Dấu hiệu bệnh lý

Bệnh đốm trắng bùng phát thường được đặc trưng bởi việc chết nhiều và nhanh của đàn tôm bị nhiễm bệnh sau khi có biểu hiện lâm sàng Tôm nhiễm bệnh hoạt động yếu bơi lờ đờ và dạt vào bờ Dấu hiệu đặ trưng là xuất hiện các đốm trắng tròn dưới lớp võ kiti Những đốm này ở trong lớp vỏ và không thể loại bỏ bằng việc chà sát Tôm sắp chết cũng có thể biến màu từ hồng sang đỏ Các loài tôm nhạy cảm khi đã có các biểu hiện lâm sàng thì dễ dàng bị chết nhiều Triệu chứng bệnh học kết hợp với sự phá huỷ hệ thống mô ngoại bì và trung bì của mang và các mô dưới lớp vỏ (Bùi Quang Tề, 2004)

2.4.4 Kiểu lan truyền

Bệnh đốm trắng lây truyền qua đường nằm ngang là chính Virus lây từ các giáp xác khác (tôm cua, chân chèo) nhiễm bệnh đốm trắng từ môi trường bên ngoài ao hoặc ngay trong ao nuôi tôm Khi các loài tôm bị bệnh đốm trắng trong ao sức khoẻ chúng yếu hoặc chết, các con tôm khoẻ ăn chúng dẫn đến bệnh lây lan càng nhanh hơn Có thể một số loài chim nước đã ăn tôm bị bệnh đốm trắng từ ao khác và bay đến ao nuôi đã mang theo các mẩu thừa rơi vào

ao nuôi Ngòai ra bệnh đốm trắng còn có khả năng lây truyền qua đường thẳng Hình2.6: Tôm sú bị bệnh đốm trắng có các đốm trắng dưới vỏ (Bùi

Quang Tề, 2004)

đứng, virus đốm trắng có thể lây lan theo chiều dọc khi gây cảm nhiễm từ tôm

bố mẹ mang mầm bệnh đốm trắng đã chuyển sang thế hệ con (Lo et al 1997,

ra

Làm tiêu bản ép nhanh: Hai kiểu làm tiêu bản ép nhanh có thể dùng để dự chẩn bệnh đốm trắng: (i) mẫu tôm tươi, không nhuộm màu, được cố định trong Formalin 10%, và soi trên nền tối của kính hiển vi với kính tụ quang ướt,

và (ii) các mô đã cố định được nhuộm màu bằng Haematoxylin và Eosin (H&E)

Mô bệnh học: Tôm nghi bị bệnh đốm trắng sắp chết được cố định trong dung dịch Davidson và nhuộm màu bằng H&E Với phương pháp này ta có thể quan sát được thể vùi WSSV phì đại trong nhân của tế bào bị nhiễm nó bắt màu của thuốc nhuộm H&E Những mô biểu hiện rõ nhất để xét nghiệm là dưới mô ở lớp biểu bì và mang

Hình 2.7: Tôm bị nhiễm đốm trắng, nhân tế bào biểu bì dạ dày trương to

có thể vùi màu hồng, mẫu mô nhuộm H&E (Bùi Quang Tề, 2004)

Việc chẩn đoán bệnh trọn vẹn có thể được hoàn thành bằng kỹ thuật PCR, kỹ

thuật lai tại chỗ, lai Western hoặc kính hiển vi điện tử (TEM)

2.4.6 Các biện pháp kiểm soát bệnh

Theo Bondad-Reantaso, M.G et al., 2001 hiện vẫn chưa có biện pháp chữa trị

tôm bị nhiễm virus đốm trắng, tuy nhiên đã có nhiều biện pháp phòng ngừa để hạn chế việc lây lan:

Với các cơ sở sản xuất tôm PL người ta đề nghị là tôm bố mẹ tự nhiên cần được kiểm tra sơ bộ bệnh đốm trắng bằng kỹ thuật Nested-PCR

Trong quá trình nuôi việc thay đổi nhanh nhiệt độ nước, độ cứng và độ mặn hoặc giảm mức oxy (<2ppm) trong giai đoạn dài có thể gây ra bùng phát bệnh đốm trắng ở tôm đã nhiễm cận lâm sàng Không nên dùng thức ăn có nguồn gốc động vật thủy sản tươi hoặc qua ướp đông để nuôi tôm thịt, nuôi thành thục và ương ấp trừ khi thức ăn đó đã được tiệt trùng bằng tia gama hoặc thanh trùng (giữ ở 70oC trong 10 phút)

Bất cứ ao nuôi nào bị bệnh cũng cần phải được xử lý ngay bằng Chlorin 30 ppm để diệt tôm bệnh và tất cả các vật mang bệnh khác Tôm và các động vật chết khác cần được dọn sạch và chôn vùi hoặc thiêu huỷ Nước phải được lưu giữ ít nhất 4 ngày trước khi thải đi Các chủ ao bên cạnh cần được thông báo ngay và không được thay nước ít nhất 4 ngày sau khi nước được tháo khỏi ao

có tôm bệnh nếu như có liên quan đến nguồn nước cấp riêng

2.5 Sơ lược về gen β-actin

Beta-actin có ở khắp nơi trong cơ thể tôm, Beta-actin là một mRNA, đóng vai trò rất quan trọng trong chức năng của cơ thể Nó có vai trò và chức năng cơ bản trong cơ thể sinh vật như: cấu trúc vỏ, sự phân chia tế bào, sự vận động và

co cơ Hơn nữa, gen Actin được ứng dụng trong nghiên cứu khoa học như phân tích sự phát sinh loài Actin trong cơ thể sinh vật có thể chia làm 2 nhóm: Actin tế bào chất (β và γ) và 4 Actin cơ (α-skeletal, α-cardiac, α-aortic, α-enteric) Đối với động vật không xương sống và thực vật hầu hết là Actin tế

bào chất (Zhu et al., 2004 trích dẫn Trần Nguyên Diễm Tú, 2008) 2.6 Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR)

PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E

coli hay nấm men Kỹ thuật này được phát minh và đặt tên bởi Mullis et al.,

1985 PCR có tính nhạy cao và cho phép tìm ra nhanh chóng, thậm chí chỉ với một tiểu phần virus Những virus ẩn, không có các biến đổi về mô học cũng có thể tìm thấy bằng kỹ thuật này (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2005)

Nguyên tắc của phản ứng PCR

Theo Đặng Thị Hoàng Oanh (2007) thì:

Tất cả các ADN polymerase khi tổng hợp một mạch ADN mới từ mạch khuôn điều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt Mồi là những đoạn ADN ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và ADN polymerase sễ nối dài mồi để hình thành mạch mới Nếu hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự ADN thì chỉ đoạn ADN nằm giữa hai mồi được tổng hợp Hai mồi này gồm một mồi xuôi và một mồi ngược so với chiều phiên mã của gen

Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm

3 giai đoạn sau:

Giai đoạn biến tính (denaturation): Trong một dung dịch phản ứng bao gồm

các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử ADN được biến tính ở nhiệt

độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của chúng, thường là 94-95oC trong vòng

30 giây đến 1 phút Đây là giai đoạn mạch đôi tách thành 2 mạch đơn

Giai đoạn lai (hybridization): Nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của các mồi cho

phép các mồi bắt cặp với khuôn Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40-70oC tùy thuộc Tm của mồi sử dụng mà thời gian bắt cặp khác nhau và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút Đây là giai đoạn quyết định tính đặc hiệu của phản ứng

Giai đoạn tổng hợp (extension): Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC Đó là điều kiện tốt nhất để cho Taq ADN polymerase hoạt động tổng hợp kéo dài mạch

theo nguyên tắc bổ sung từ 2 đầu sợi khuôn ban đầu Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự ADN cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều

phút Theo Geifand và White (1990), tốc độ tổng hợp của Taq là 150 nucleotit/

giây ở nhiệt độ 75 - 80oC; 60 nucleotit/ giây ở nhiệt độ 70oC; 24 nucleotit/ giây ở 55oC; 1,5 nucleotit/ giây ở 37oC và ở nhiệt độ 22oC chỉ còn 0,25 nucleotit/ giây

Sau một chu kỳ gồm 3 giai đoạn như trên, một phân tử ADN khuôn được nhân lên thành hai, các đoạn ADN vừa được nhân trong chu kỳ lại làm khuôn cho chu kỳ nhân bản tiếp theo vì hai đầu tận cùng của sản phẩm bổ sung với mồi

Do đó sau mỗi chu kỳ số lượng ADN được tổng hợp tăng lên gấp đôi và như vậy sau n chu kỳ nhân bản sẽ tạo ra 2n bản ADN từ một khuôn ban đầu Sau

30 chu kỳ sự khuếch đại sẽ là 106 so với lượng mẫu ban đầu

2.6.1 Một số nhân tố chính ảnh hưởng đến phản ứng PCR ADN chiết tách

ADN mẫu có vai trò rất quan trọng và ảnh hưởng rỏ rệt đến kết quả phản ứng PCR Hàm lượng ADN mẫu nằm trong khoảng 100ng-1μg Hàm lượng ADN quá thấp sẽ tạo ra ít sản phẩm, nhưng với hàm lượng lớn sẽ tạo ra nhiều sản phẩm phụ Hàm lượng ADN quá cao phản ứng PCR không xảy ra được (Newton và Graham, 1995 trích dẫn bởi Trần Thị Mỹ Duyên, 2006)

Enzyme (Taq ADN polymerase)

Thông thường người ta sử dụng nồng độ 2,5 U/phản ứng Việc tăng nồng độ Tap ADN polymerase hơn 2,5 U/ phản ứng đôi khi làm tăng hiệu quả của phản ứng PCR, nhưng chỉ trong khoảng nhất định Nếu nồng độ Taq ADN polymerase quá cao sẽ làm giảm hiệu xuất sản phẩm và sẽ tạo ra nhiều sản phẩm phụ không mong muốn Hơn nửa đây là thành phần đắt nhất của phản

ứng PCR nên việc chọn nồng độ thích hợp là rất quan trọng (Martha et al.,

2001 trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thúy Hằng, 2008)

Mồi và nhiệt độ gắn mồi

Mồi là yếu tố quan trọng quyết định hiệu quả phản ứng PCR, do đó phải tuân theo một số nguyên tắt sau (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2005):

+ Trình tự mồi được sao cho không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi và mồi ngược và giữa các thành phần khác nhau của cùng một mồi

+ Nhiệt độ nóng chảy của mồi xuôi và mồi ngược không được quá chênh lệch nhau (không quá 3°C)

+ Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự ADN cần khuếch đại, không trùng với trình tự lặp lại trên gen

+ Trình tự nằm giữa hai mồi xuôi và mồi ngược không qua lớn, phản ứng PCR sẽ tối ưu khi trình tự giữa hai mồi nhỏ hơn 1kb Độ dài mồi tốt nhất là từ 20-30 nucleotic

Nồng độ các nucleotide tự do (dNTP)

Nồng độ các dNTP khoảng 200μM cho mỗi phản ứng Nồng độ thấp hơn tăng cường độ chính xác của phản ứng nhưng tạo ra ít sản phẩm, còn nồng độ cao hơn thì làm giảm tính chính xác của phản ứng Cần phải có 4 loại nucleotide dạng triphosphat như: dATP, dTTP, dGTP, dCTP Nồng độ của mỗi dạng nucleotide phải ở dạng cân bằng, ứng với khoảng 20 - 200 μM cho mỗi loại nucleotide Nếu mất trạng thái cân bằng trong thành phần các dNTP thì sẽ gây

ra lỗi khi sao chép của enzyme ADN polymerase (Đặng Thị Hoàng Oanh,

2007)

Nồng độ Mg 2+

Ion Mg2+ là thành phần không thể thiếu được của phản ứng PCR, nồng độ

Mg2+ tối ưu để thực hiện phản ứng PCR từ 150 – 200 μM Nếu nồng độ Mg2+quá thấp sẽ không thấy được sản phẩm khuếch đại Nước sử dụng cho phản ứng phải là nước tinh khiết, không chứa bất kì ion lạ nào (Trần Thị Xô và Nguyễn Hương Lan, 2005)

Số lượng chu kì phản ứng

Số lượng chu kì cho một phản ứng PCR thông thường trong khoảng 30 – 40 chu kì Bởi vì phản ứng diễn ra theo hai giai đoạn: ở giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân và đến một giới hạn nào đó thì số lượng bản sao giảm, hiệu quả khuếch đại giảm do: hoạt tính của enzyme ADN polymerase giảm theo thời gian ở nhiệt độ cao, sự cạn kiệt các thành phần phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng, các sản phẩm vừa tổng hợp không kết hợp với mồi mà kết hợp với nhau Vì vậy, không nên sử dụng vượt quá 40 chu kì cho mỗi phản ứng PCR (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007)

2.6.2 Ứng dụng của phương pháp PCR trong thủy sản

Kỹ thuật PCR được ứng dụng cho nhiều lĩnh vực khác nhau Theo Trần Thị Tuyết Hoa (2004), kỹ thuật PCR được ứng dụng vào các lĩnh vực sau:

+ Phát hiện nhanh các tác nhân gây bệnh ở dạng tiềm ẩn giúp cho quá trình chọn lọc cá thể thủy sản có chất lượng tốt trong chọn giống và ương nuôi

+ Chuẩn đoán bệnh: điều tra nguyên nhân bùng nổ bệnh và cách giải quyết khi dịch bệnh xảy ra, đồng thời đề ra hướng ngăn chặn sự xuất hiện của dịch bệnh

+ Phòng bệnh và kiểm soát bệnh: kiểm tra tôm giống và tôm bố mẹ ở các trại giống, kiểm tra tôm nhập khẩu trước khi cho thả nuôi ở các địa phương

+ Ứng dụng trong đánh giá an toàn hàng thủy sản xuất khẩu – sự nhiễm

khuẩn hàng thủy sản bởi Vibrio parahaemolyticus, Escherichia coli

+ Góp phần vào quy trình xác định trình tự nucleotide đột biến của tác nhân gây bệnh, hay có thể là các loài động vật thủy sản

Hiện nay một số mầm bệnh thủy sản quan trọng ở cá và tôm được chuẩn đoán bằng phương pháp PCR gồm có:(i) ở cá có virus gây bệnh trên cá nheo Mỹ