tìm hiểu sự khác nhau về các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa giữa các dòng vi khuẩn edwardsiella ictaluri xác định bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và api 20e

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứuTRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Edwardsiella ictaluri XÁC ĐỊNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HÓA TRUYỀN THỐNG VÀ API 20E LUẬN VĂN TỐT NGHI

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Edwardsiella ictaluri XÁC ĐỊNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP

SINH HÓA TRUYỀN THỐNG VÀ API 20E

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN N

2008

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Edwardsiella ictaluri XÁC ĐỊNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP

SINH HÓA TRUYỀN THỐNG VÀ API 20E

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN N

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH

NGUYỄN THỊ TIÊN

2008

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

LỜI CẢM ƠN

Được làm luận văn tốt nghiệp là mong muốn của rất nhiều sinh viên, trong đó có bản thân tôi Tuy nhiên để có thể hoàn thành luận văn này là cả một quá trình phấn đấu, phải mất nhiều thời gian và công sức để nghiên cứu, đồng thời phải được sự hướng dẫn nhiệt tình của thầy cô

Lời đầu tiên tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô khoa thủy sản trường Đại Học Cần Thơ, đặc biệt là các thầy cô bộ môn sinh học và bệnh thủy sản đã truyền đạt những kiến thức, những kinh nghiệm quý báo trong thời gian tôi theo học và nghiên cứu tại trường

Xin cám ơn gia đình đã động viên giúp đỡ không chỉ về vật chất mà cả về tinh thần

từ khi tôi bước chân vào trường

Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Đặng Thị Hoàng Oanh và chị Nguyễn Thị Tiên đã tận tình giúp đỡ trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài

Xin gởi lời cám ơn đến cô Nguyễn Thị Thu Hằng và thầy Đoàn Nhật Phương đã nhiệt tình quan tâm động viên trong suốt thời gian làm cố vấn học tập

Đồng thời xin gởi lời cám ơn đến tập thể lớp nuôi trồng và bệnh học thủy sản K30

đã động viên, hỗ trợ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Tất cả các chủng đều có đặc điểm của vi khuẩn E ictaluri như dạng hình que,

gram âm, cho phản ứng oxidase âm tính, có khả năng lên men và oxi hóa đường glucose, không có khả năng sinh khí H2S và không tạo sản phẩm indole Hầu hết các chỉ tiêu đều giống nhau ở cả 2 phương pháp

Đề tài cũng tiến hành điện di, kết quả sản phẩm PCR có sự hiện diện của vi khuẩn

E ictaluri tất cả đều hện vạch tại vị trí 407pb

Chọn ngẫu nhiên 5 chủng CAF258, E223, 3B3, C1 và C2 tiến hành gây cảm nhiễm Kết quả 3 bể CAF28, C1 và C2 cá có xuất hiện dấu hiệu bệnh lý Sau khi tái phân lập và tái định danh tất cả các chủng đều có đặc điểm giống chủng ban đầu, cho kết quả PCR giống nhau (hiện vạch 407 bp)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

MỤC LỤC iii

DANH SÁCH BẢNG iv

DANH SÁCH HÌNH v

Chương I : Giới thiệu 1

Chương II: Lược khảo tài liệu 3

2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh cá 3

2.2 Tình hình nuôi và dịch bệnh trên cá tra ở ĐBSCL 3

2.3 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá da trơn 4

2.31 Bệnh xuất huyết 4

2.3.2 Bệnh mủ gan trên cá tra 5

2.4 Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp 8

Chương III: Nội dung và phương pháp nghiên cứu 11

3.1 Thời gian và địa điểm 11

3.1.1 Thời gian 11

3.1.2 Địa điểm 11

3.2 Nội dung thực hiện 11

3.3 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 11

3.3.1 Vật liệu 11

3.3.2 Thiết bị 11

3.4 Thuốc thử, môi trường dùng cho nghiên cứu 12

3.3.4 Số chủng vi khuẩn cần thiết 12

3.5 Phương pháp nghiên cứu 13

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

3.5.1 Số chủng vi khuẩn cần thiết 13

3.5.2 Nguồn vi khuẩn 13

3.5.3 Phương pháp phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn 14

3.5.4 Định danh vi khuẩn theo phương pháp truyền thống 14

3.5.5 Định danh vi khuẩn bằng bộ kit API20E 15

3.5.6 Phương pháp PCR 16

3.5.7 Thí nghiệm gây cảm nhiễm 17

Chương IV: Kết quả- thảo luận 19

4.1 Phương pháp sinh hóa truyền thống 19

4.2 Kết quả test API 21

4.3 Kết quả định danh vi khuẩn bằng PCR 23

4.4 Kết quả gây cảm nhiễm và tái định danh vi khuẩn 24

4.5 Thảo luận 28

Chương V: Kết luận – Đề xuất 32

5.1 Kết luận 32

5.2 Đề xuất 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

DANH SÁCH BẢNG

Trang Bảng 3.1: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn sử dụng cho đề tài 13 Bảng 3.2: Bảng test các chỉ tiêu sinh hóa của vi khuẩn 14

Bảng 3.3: Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn được xác định

bằng bộ kít API 20E 15

Bảng 3.4: Thành phần hóa chất thực hiện phản ứng PCR 16

Bảng 4.5: Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa các chủng

vi bằng phương pháp sinh hóa truyền thống 19

Bảng 4.6: Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa các chủng

vi bằng bộ kit API 20E 22

Bảng 4.7: Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa các chủng

vi khuẩn tái phân lập từ thí nghiệm cảm nhiễm bằng phương pháp sinh hóa

truyền thống 26

Bảng 4.8: Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa các chủng

vi khuẩn tái phân lập từ thí nghiệm cảm nhiễm bằng bộ kít API 20E 27

Bảng 4.9: Các đặc điểm khác nhau giữa loài E ictaluri với các loài khác thuộc

nhóm Enterobacteriaceace (OIE, 2003) 29

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 3.1: Các bước chuẩn bị vi khuẩn thí nghiệm 18

Hình 4.2: Hình nhuộm gram vi khuẩn E ictaluri 20

Hình 4.3: Khả năng lên men và oxi hóa đường glucose của E ictaluri 20

Hình 4.4: Kết quả âm tính với indole cua vi khuẩn E ictaluri 21

Hình 4.5: Khả năng thủy phân ornithine và lysine của E ictaluri 21

Hình 4.6: Kết quả test API của vi khuẩn E ictaluri 23

Hình 4.7: Kết quả điện di sản phẩm PCR các chủng vi khuẩn E ictaluri 23

Hình 4.8: Thận cá tra nhiễm dòng vi khuẩn CAF258 25

Hình 4.9: Dấu hiệu bên ngoài của cá tra gây cảm nhiễm dòng E ictaluri 25

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU

Một trong bảy vùng kinh tế quan trọng của cả nước Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) có nhiều điều kiện tự nhiên thuận lợi cho nuôi trồng thủy sản phát triển Trong những năm gần đây nuôi trồng thủy sản đã đóng góp đáng kể vào kim ngạch xuất khẩu ở Việt Nam, tạo công ăn, việc làm, tăng thu nhập, xóa đói giảm nghèo cho các vùng nông thôn Nổi bật là nghề nuôi cá tra do đây là đối tượng dễ nuôi, mau lớn, chất lượng thịt ngon, có khả năng thích ứng cao với điều kiện môi trường khắc nghiệt Năm 2006, sản lượng cá tra nuôi ở ĐBSCL đạt 800.000 tấn, xuất khẩu được 292.800 tấn, thu về kim ngạch xuất khẩu 773,64 triệu USD, chiếm 23,4% so với xuất khẩu thủy sản của cả nước (www.fistenet.gov.vn)

Tuy nhiên khi diện tích nuôi được mở rộng, nghề nuôi được thâm canh hóa nhất là nuôi với mật độ cao thì vấn đề dịch bệnh xảy ra thường xuyên hơn và gây thiệt hại cũng nhiều hơn Có thể nói trong những năm gần đây nghề nuôi thủy sản đang phải đương đầu với tình trạng dịch bệnh bùng nổ do sự suy thoái về môi trường và lây lan của mầm bệnh Trong đó bệnh truyền nhiễm mà nhất là bệnh vi khuẩn đã và đang gây thiệt hại nghiêm trọng đến năng suất và sản lượng cá nuôi với sự nổi bật là bệnh mủ gan đã gây thiệt hại không nhỏ về kinh tế cho nhiều hộ nuôi Các kết quả nghiên cứu gần đây xác định bệnh mủ

gan là do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra, bệnh xảy ra trên cá tra nuôi ở

tất cả các giai đoạn, tỉ lệ hao hụt có thể lên đến 90% (Nguyễn Quốc Thịnh và

ctv, 2003)

Hiện nay phương pháp xác định vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên

cá tra phổ biến là phương pháp sinh hóa sử dụng phương pháp kiểm tra xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa truyền thống hoặc sử dụng bộ kit API 20E Tuy nhiên, chưa có những thông tin về sự đồng nhất hay sai khác khi xác định đặc

tính sinh lý và sinh hóa của hai phương pháp này khi định danh vi khuẩn E

ictaluri Đề tài “Tìm hiểu sự khác nhau về các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa giữa các dòng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri được xác định bằng phương

pháp sinh hóa truyền thống và sử dụng bộ kít API 20E” được thực hiện

nhằm tìm ra những chỉ tiêu sinh hóa giống và khác nhau khi sử dụng hai phương pháp nêu trên, góp phần vào việc chuẩn hóa phương pháp nghiên cứu

bệnh do vi khuẩn E ictaluri gây ra trên cá tra

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Mục tiêu nghiên cứu

So sánh các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa giữa các dòng vi khuẩn E ictaluri

được xác định bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và sử dụng bộ kit API 20E

Nội dung nghiên cứu

 Xác định các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa các dòng vi khuẩn E ictaluri

xác định bằng phương pháp truyền thống

 Xác định các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa các dòng vi khuẩn E ictaluri

bằng bộ kit API 20E

 Xác định kết quả định danh bằng phương pháp PCR

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh cá

Bệnh cá được bắt đầu nghiên cứu từ cuối thế kỷ XIX nhưng cơ bản vẫn mô tả các dấu hiệu lâm sàng Sang đầu thế ký XX các nhà khoa học thế giới đã bắt đầu nghiên cứu các triệu chứng cũng như tác nhân gây bệnh trên cá Năm

1904, Bruno Hofer người Đức đã viết cuốn sách “Father of fish Pathology” (Bùi Quang Tề, 2006)

Viện sĩ V.A Dogiel thuộc viện hàn lâm khoa học Liên Xô cũ là người có công lớn khi viết phương pháp nghiên cứu ký sinh trùng trên cá (1929), mở đầu cho việc nghiên cứu ký sinh trùng trên cá Năm 1939 ông cũng cho xuất bản quyển “Bacterial Disease of Fish” Những năm 1930 bệnh truyền nhiễm của cá đã được nghiên cứu trong các phòng thí nghiệm Năm 1949 nhà khoa học người Liên Xô E M Lyaiman cho xuất bản sách giáo khoa về bệnh cá (Bùi Quang Tề, 2006)

Kết quả nghiên cứu các tác nhân gây bệnh trên động vật thủy sản đến nay rất phong phú, bệnh virút của cá đến nay đã phân loại được hơn 60 loại virút thuộc 5 họ có cấu trúc ADN hoặc ARN (Bùi Quang Tề, 2006) Ở Việt Nam bộ môn bệnh cá được Hà Ký thành lập năm 1960 Sau đó được đưa vào giảng dạy trong các trường đại học Từ cuối năm 1960 trở lại đây hàng loạt nghiên cứu

về bệnh của động vật thủy sản được tiến hành:

Nghiên cứu ký sinh trùng và bệnh của các loài cá nước ngọt miền Bắc Việt Nam của tiến sĩ Hà Ký, 1961- 1967 (Bùi Quang Tề, 2006)

Công trình nghiên cứu khu hệ ký sinh trùng của một số loài cá nước ngọt

Đồng Bằng Sông Cửu Long của Bùi Quang Tề và ctv,1984-1990 (Trích lược

bởi Trần Thị Ngọc Hân, 2006) Nghiên cứu khu hệ ký sinh trùng cá nước ngọt miền Trung và Tây Nguyên của

Nguyễn Thị Muội và ctv, 1981- 1985 (Trích lược bởi Trần Thị Ngọc Hân,

2006)…

2.2 Tình hình nuôi và dịch bệnh xảy ra trên cá tra ở ĐBSCL

Tính từ năm 2006, sản lượng cá tra nuôi ở ĐBSCL đạt 800.000 tấn, xuất khẩu được 292.800 tấn, thu về kim ngạch xuất khẩu 773,64 triệu USD, chiếm 23,4% so với xuất khẩu thủy sản của cả nước Trong 6 tháng đầu năm 2007, diện tích nuôi cá tra toàn vùng ĐBSCL đã lên đến 3.642 ha, tăng 1.256 ha so

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

với năm trước Từ đó, sản lượng cá tra đạt 380.489 tấn, số lượng cá tra xuất khẩu được 173.100 tấn, đạt kim ngạch xuất khẩu 462,4 triệu USD, tăng 32%

về lượng và 38,9% kim ngạch so với năm 2006 (www.fistenet.gov.vn) Tuy nhiên khi mật độ nuôi quá dày nhưng lại không đồng đều về kỹ thuật, môi trường nuôi sẽ bị ô nhiễm tạo điều kiện cho dịch bệnh xảy ra Dịch bệnh trên

cá tra xảy ra quanh năm kể cả mùa khô, mùa mưa, nhưng nặng nhất vào lúc giao mùa, mùa nước đổ, thời tiết thay đổi đột ngột sẽ làm tăng tần số xuất hiện

bệnh Theo Từ Thanh Dung và ctv (2004) thì tần số xuất hiện bệnh trên động

vật thủy sản là vi khuẩn (50,9%), virút (24,6%), ký sinh trùng (21,1%), nấm (3,4%) (trích dẫn bởi Lê Phú Khởi, 2006)

Cũng theo điều tra của Lê Phú Khởi (2006) tại An Giang đã ghi nhận được một số bệnh xuất hiện trên cá tra với tần suất khác nhau từ năm 2004 trở lại đây là: bệnh đốm đỏ, mủ gan, ký sinh trùng, thối đuôi, vàng da, đường ruột, nổ mắt, tuột nhớt, rong bè (bỏ ăn), sưng thận, nấm, thối mang Trong đó 3 bệnh là gan có mủ, đốm đỏ và ký sinh trùng xảy ra với tần suất cao nhất

Kết quả này cũng phù hợp với điều tra của Nguyễn Chính (2005) là tình hình bệnh trên cá tra nhìn chung chưa thấy phát sinh bệnh mới mặc dù tỉ lệ cảm nhiễm và cường độ cảm nhiễm ngày càng cao hơn

2.3 Vi khuẩn E ictaluri gây bệnh trên cá da trơn

2.3.1 Bệnh xuất huyết

Vi khuẩn E ictaluri gây bệnh xuất huyết được phân lập đầu tiên trên cá nheo

Mỹ bởi Hawke (1979) Năm 1999, Austin đã phát hiện ra vi khuẩn này gây bệnh nhiễm trùng máu cấp tính (enteric septicemia of catfish - ESC) trên cá

nheo mỹ, gây thiệt hại lớn cho ngành công nghiệp nuôi cá nheo (Hawke và

ctv,1998)

Plumb, 1999 cho biết bệnh do vi khuẩn E ictaluri xảy ra trên cá trơn vào mùa

có nhiệt độ thấp Trên cá nheo, bệnh ESC thường xảy ra vào cuối mùa xuân đến đầu mùa hè và trong suốt mùa thu khi nhiệt độ nước khoảng 18 - 28C

Theo mô tả của Inglis và ctv (1993), khi cá bị bệnh trên đầu xuất hiện những

vết loét, cá bơi lờ đờ trên mặt nước, bơi xoay tròn với tư thế đầu trên đuôi dưới, sưng tấy ở da, miệng, nắp mang và bụng, phù mắt Bên trong xoang bụng có chất dịch màu vàng, thận và tỳ tạng sưng to, quan sát mô và các cơ quan có hiện tượng xuất huyết, đặc biệt là có những đốm trắng ở gan Bệnh này bên cạnh xuất hiện trên cá nheo nuôi ở miền Đông Nam Mỹ, thì bệnh cũng được tìm thấy ở Indiana, Idaho, California, Arizona và New Mexico

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Ngoài cá nheo, các loài blue catfish (Ictalurus furcatus), white catfish (Ictalurus melas) cũng nhạy cảm với E ictaluri (Plumb và Sanchez, 1983) và theo ghi nhận của Kasornchandra và ctv (1987) thì vi khuẩn này cũng được tìm thấy trên cá trê trắng (Clarias batrachus) ở Thái Lan

Hawke và ctv (1998) mô tả đặc điểm của vi khuẩn E ictaluri là loài vi khuẩn

thuộc nhóm Enterobacteriaceace, vi khuẩn Gram âm, di động yếu ở 25-30 C,

ở nhiệt độ cao hơn không di động, H2S và indole âm tính, có khả năng lên men O/F, phát triển chậm trên môi trường thạch, trên môi trường BHI (brain heart infusion) sau 36 - 48 giờ ở 28 - 30C hình thành khuẩn lạc nhỏ, không phát triển ở 37C (Plumb, 1999)

Năm 1986, Shotts và ctv tiếp tục nghiên cứu về đặc điểm sinh hoá của vi khuẩn E ictaluri, ngoài các đặc điểm trên thì vi khuẩn này còn cho phản ứng

cytochrome oxidase, có khả năng lên men glucose và sinh sản phẩm NO3- từ

NO2- (trích dẫn bởi Lê Minh Đương, 2007)

Vi khuẩn này tồn tại trong môi trường nước thời gian ngắn hay dài còn tuỳ theo nhiệt độ Nếu nhiệt độ nước là 5C thì vi khuẩn có thể tồn tại trong ao 15 ngày nhưng khi nhiệt độ nước tăng lên 25Cthì thời gian sống của chúng rút ngắn chỉ còn khoảng 10 ngày Tuy nhiên trong lớp bùn đáy ao vi khuẩn này có thể tồn tại khoảng 15 ngày ở 5C, 45 ngày ở 18C và 95 ngày ở 25C (Plumb 1999)

2.3.2 Bệnh mủ gan trên cá tra

Năm 2001, Ferguson và ctv phát hiện đầu tiên bệnh mủ gan trên cá tra nuôi ở

ĐBSCL vào cuối năm 1998 và gọi là bệnh BNP (bacillary necrosis of Pangasius)

Theo Từ Thanh Dung và ctv (2005) ở Việt Nam, vùng ĐBSCL bệnh mủ gan

xuất hiện đầu tiên ở các tỉnh nuôi cá tra thâm canh phát triển mạnh như An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ, sau đó bệnh lây lan sang các vùng lân cận Đặc biệt những năm gần đây bệnh cũng xuất hiện ở một số tỉnh mới phát triển nuôi cá tra như Trà Vinh, Bến Tre và Sóc Trăng Tỷ lệ hao hụt lớn ở cá giống nhưng gây thiệt hại kinh tế lớn nhất ở giai đoạn cá có trọng lượng từ 300- 500g

Nguyễn Quốc Thịnh (2002) kết luận khi cá bị bệnh mủ gan biểu hiện bên ngoài không có gì đặc biệt, một số có hiện tượng xuất huyết ở các vi, có khi xuất huyết toàn thân, khi giải phẫu và quan sát nội tạng thấy có nhiều đốm trắng trên gan, thận và tỳ tạng Thêm vào đó, trong xoang bụng có chứa dịch

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

hơi đặc Khi cấy những đốm trắng lên môi trường agar sau 24 - 48 giờ thấy xuất hiện các khuẩn lạc rất thuần

Tác nhân gây bệnh mủ gan được xác định là Edwardsiella ictaluri (Từ

Thanh Dung và ctv, 2005)

Mùa vụ xuất hiện và mức độ gây thiệt hại: Bệnh mủ gan thường xuất hiện

vào mùa lũ, cao điểm vào tháng 7, 8 Tuy nhiên trong hai năm gần đây bệnh này xuất hiện trên cá tra hầu như quanh năm Trong 1 vụ nuôi bệnh mủ gan có thể xuất hiện 3-4 lần Tỉ lệ hao hụt lên đến 10-15%, tùy thuộc vào chế độ

chăm sóc và quản lý (Từ Thanh Dung và ctv, 2005)

Dấu hiệu bệnh lý

Cá bị bệnh không có những dấu hiệu bệnh lý bất thường, ở giai đoạn mới chớm bệnh cá vẫn còn bắt mồi nhưng giảm ăn Một số trường hợp cá có biểu hiện gầy, bơi lờ đờ da nhợt nhạt có biểu hiện xuất huyết trên da và hậu môn Dấu hiệu bệnh lý đặt thù nhất là bên trong nội quan các cơ quan gan, thận, tỳ tạng xuất hiện những đốm trắng đường kính 1-3 mm, các cơ quan này sưng to

và có biểu hiện nhũng ở thận (Ferguson và ctv, 2001)

Kết quả nghiên cứu mô bệnh học cá tra bị bệnh trắng gan của Nguyễn Quốc

Thịnh và ctv (2003) cho thấy có nhiều hiện tượng thay đổi về cấu trúc đặc biệt

là ở gan, thận, tỳ tạng có hiện tượng xung huyết, xuất huyết và nhiều vùng bị hoại tử trầm trọng Vi khuẩn cũng được tìm thấy trên mẫu mô của tất cả các cơ quan này, những vi khuẩn này tạo thành bó ở rìa các vết hoại tử

Đặc điểm sinh lý và sinh hóa

E ictaluri là loài thuộc họ Enterobacteriaceace, vi khuẩn gram âm, hình que

và có kích thước biến đổi, không di động hoặc di động yếu, lên men, cho phản ứng catalate dương tính và oxidase âm tính, phản ứng indole và H2S âm tính

Vi khuẩn E ictaluri phát triển tốt ở 28C sau 24-48 giờ tạo thành những khuẩn lạc kích thước rất nhỏ (Từ Thanh Dung và ctv, 2005)

Năm 2004, Từ Thanh Dung và ctv phân lập được 108 dòng vi khuẩn thuộc loài

E ictaluri từ 181 mẫu cá tra bệnh Vi khuẩn này sau khi phát triển 24 giờ trên

môi trường TSA tạo thành những khuẩn lạc có màu trắng, không có nhân, rìa

có dạng không đồng nhất Đồng thời vi khuẩn này cũng có một số đặc điểm khác với mô tả của Plumb (1993) như có dạng que và có kích thước biến đổi

(trích lược bởi Từ Thanh Dung và ctv, 2004), phát triển tốt ở 28C, phát triển yếu ở 37C, điều này lý giải tại sao E ictaluri cho tới nay chỉ phát hiện trên cá

mà chưa tìm thấy ở các loài động vật máu nóng khác như chim, gia súc, heo, động vật có vú ở biển

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Độc lực của vi khuẩn E ictaluri

Đã có nhiều tác giả tiến hành thí nghiệm gây cảm nhiễm xác định khả năng

gây bệnh của vi khuẩn E ictaluri trên nhiều đối tượng khác nhau bằng phương

pháp tiêm hoặc ngâm với các mật độ vi khuẩn khác nhau

Newton và ctv (1989), tiến hành ngâm cá nheo trong dung dịch có mật độ vi khuẩn E ictaluri là 5x108 CFU/ml nhận thấy có 93% cá nheo bị nhiễm và biểu hiện bệnh ESC (trích dẫn bởi Plumb, 1999)

Năm 1993, để kiểm tra đường xâm nhập của vi khuẩn E ictaluri vào hệ tiêu hóa cá, Baldwin và Newton tiến hành gây cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri trên

140 cá nheo mỹ (khoảng 8-10 tháng tuổi) bằng phương pháp đưa vi khuẩn vào

hệ tiêu hóa với mật độ 1x109 CFU/ml Kết quả tại thời điểm 0,25 giờ đã tìm thấy vi khuẩn ở thận trước

Hai nhà khoa học là Williams và Laurence (2005) đã sử dụng phương pháp

tiêm vi khuẩn E ictaluri so sánh với phương pháp ngâm trên cá nheo Mỹ ở các mật độ tăng dần Đối với E ictaluri R4383 WT (dùng phương pháp tiêm)

với mật độ 5,2x103 CFU/ml, 5,2x104 CFU/ml, 5,2x105 CFU/ml thì tỷ lệ cá chết

lần lượt là 67,2%, 100% và 100% Trong khi đó E ictaluri R4383 WT (dùng

phương pháp ngâm) với mật độ 5,7x103 CFU/ml, 5,7x104 CFU/ml, 5,7x105 CFU/ml, 5,7x106 CFU/ml thì tỷ lệ cá chết lần lượt là 63,5%, 98,7%, 100% và 100% Qua thí nghiệm này họ kết luận không có sự khác nhau về tỷ lệ chết giữa hai phương pháp ngâm và tiêm

Phan Thị Mỹ Hạnh (2004) tiến hành thí nghiệm một số yếu tố ảnh hưởng của

bệnh mủ gan do vi khuẩn E ictaluri gây ra trên cá tra ở ĐBSCL đưa ra kết

luận mật độ vi khuẩn khác nhau sẽ ảnh hưởng khác nhau đến khả năng nhiễm bệnh mủ gan trên cá tra Khi ngâm cá với mật độ vi khuẩn là 1,5x102 và 1,5x103 CFU/ml thì tỉ lệ cá chết dao động từ 56,6-56,7%

Lương Trần Thục Đoan (2006) đã chứng minh rằng ngâm cá tra với mật độ vi khuẩn 1x107 CFU/ml trong 1h, thời gian thí nghiệm 10 ngày, tỉ lệ cá chết là 75% so với hai nồng độ còn lại là 1x105 CFU/ml và 1x106 CFU/ml và đưa ra kết luận rằng mật độ vi khuẩn 1x107 CFU/ml có độc lực cao nhất

Ở một số thí nghiệm khác, Trần Thị Ngọc Hân (2006) khảo sát sự biến đổi cấu trúc mô học của cá tra bệnh mủ gan bằng cách gây cảm nhiễm cá tra với dòng

vi khuẩn E ictaluri ở các mật độ vi khuẩn lần lượt là 1x105, 1x106, 1x107CFU/ml (phương pháp ngâm) và 104, 105 và 106 CFU/ml (phương pháp tiêm), theo dõi tỷ lệ cá chết trong thời gian 10 ngày thì thấy cso sự biến đổi về mặt cấu trúc ở các mô thận, gan, tỳ tạng là nhiều nhất

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Phương pháp sinh hóa truyền thống: Sinh hóa truyền thống là phương pháp

có từ rất lâu đời, được ứng dụng nhiều trong thủy sản và mang lại kết quả to lớn, định danh thành công các loài vi khuẩn trong môi trường nước, góp phần vào việc nghiên cứu, tìm ra tác nhân gây bệnh Không phải tác giả nào cũng đưa ra các chỉ tiêu giống nhau để định danh vi khuẩn, chẳng hạn chỉ tiêu này

là quan trọng cho loài này nhưng lại không cần thiết cho loài khác, nhưng nhìn chung tất cả đều dựa vào một số chỉ tiêu cơ bản Người ta chia vi khuẩn thành các nhóm khác nhau, nhóm vi khuẩn gram âm và gram dương, nhóm di động hay không di động mà từ đó có hướng đi khác nhau cho từng loài vi khuẩn Việc định danh vi khuẩn dùng sơ đồ gia phả đã được áp dụng bởi nhiều tác

giả, và định danh ra các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio, Edwardsiella,

Aeromonas… Năm 2004, Buller dùng phương pháp định danh truyền thống

với 41 chỉ tiêu cho các chủng E ictaluri để kiểm tra các đặc tính sinh lý, sinh hóa Tương tự, thì Plumb và ctv (1983) cũng đã dùng test sinh hóa truyền thống, kiểm tra các đặc điểm sinh hóa và sinh lý của E ictaluri với 47 chỉ tiêu

Bộ kít API 20E

Kit API 20E là bộ kit do hãng bioMerieux sản xuất, nó được dùng cho việc định danh các loài vi khuẩn gram âm, hình que Mặc dù API là phương pháp được ứng dụng cho việc định danh các loài vi khuẩn trên động vật nhưng ngày nay cũng sử dụng rộng rãi trong thủy sản do các thao tác nhanh đơn giản không mất nhiều thời gian, cho kết quả sớm Cùng với phương pháp sinh hóa truyền thống API được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực nghiên cứu các giống loài

vi khuẩn Cụ thể năm 2002, Crumlish và ctv đã sử dụng API để kiểm tra các đặc tính sinh lý, sinh hóa loài E ictaluri trên cá tra ở 2 tỉnh An Giang và Cần

Thơ Một nghiên cứu gần đây của Buller (2004) dùng kit API 20E không chỉ

cho chủng E ictaluri mà còn cho các loài khác Hàng loạt các đề tài nghiên

cứu của Lương Trần Thục Đoan (2006), Tiết Ngọc Trân (2007), Lê Minh Đương (2007) cũng đã sử dụng kit API 20E để kiểm tra các đặc điểm sinh hóa

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của chúng, thường là 94-95C trong vòng 30 giây đến 1 phút

b Giai đoạn lai: nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với khuôn Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40-70C, tùy thuộc vào Tm của các mồi sử dụng mà thời gian bắt cặp khác nhau và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút

c Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ được tăng lên 72C, đó là điều kiện tốt nhất

để cho Taq polymerase hoạt động tổng hợp kéo dài mạch theo nguyên tắc

bổ sung từ hai đầu sợi khuôn ban đầu giúp cho ADN polymerase hoạt động Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự ADN cần khuyếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút

Sau một chu kỳ gồm ba giai đoạn như trên, một phân tử ADN khuôn được nhân lên thành hai, các đoạn ADN vừa được nhân trong chu kỳ lại làm khuôn cho chu kỳ nhân bản tiếp theo Do đó sau mỗi chu kỳ số lượng ADN được tổng hợp sẽ tăng lên gấp đôi và như vậy sau n chu kỳ nhân bản sẽ tạo ra 2n bản ADN từ một khuôn ban đầu

Ở các lĩnh vực khác kể cả thủy sản, PCR là một công cụ hữu hiệu trong việc phát hiện mầm bệnh vi khuẩn, virút, ký sinh trùng và nấm Một số mầm bệnh thủy sản quan trọng ở tôm nuôi hiện nay được chẩn đoán bằng PCR gồm: virút đốm trắng (WSSV), virút đầu vàng (YHV), virút gây hoại tử cơ quan tạo máu

và cơ quan tạo lập biểu mô (IHHNV), virút gây hội chứng Taura (TSV) (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007)

Phương pháp phức hợp PCR (multiplex PCR - mPCR) là một dạng biến hóa của PCR Phương pháp này cho phép phát hiện đồng thời nhiều loại bệnh, giúp tiết kiệm công sức lẫn chi phí xét nghiệm

Đối với virút đặc biệt là virút trên tôm, mPCR đã có những bước phát triển mới phát hiện nhiều loại bệnh cùng lúc, đem lại các kết quả chẩn đoán nhanh,

chính xác, tiết kiệm nhiều thời gian và công sức Cụ thể Yang và ctv (2006),

đã phát triển phương pháp m-PCR phát hiện đồng thời hai loại virút IHHNV

và WSSV trên tôm he Với đoạn mồi I 2814, I 3516 và W1, W2 lần lượt cho hai loại bệnh trên với trọng lượng phân tử của sản phẩm PCR lần lượt là 703

và 824 bp

Wongteerasupaya và ctv (1998) đã phát triển phương pháp mRT- PCR phát

hiện đồng thời cả ARN và ADN của hai loại virút khác nhau trên tôm là YHV

và WSSV, chúng hiện là nguyên nhân gây thiệt hại nghiêm trọng và phổ biến trong nuôi tôm công nghiệp ở Thái Lan và châu Á Phương pháp cho phép

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

chẩn đoán nhanh bằng cách thực hiện một bước ly trích cả RNA và DNA sử dụng TrizolTM Acid nucleic sau khi ly trích được khuếch đại bằng mRT-PCR dùng qui trình RT-PCR một bước với mồi 10F-144R cho YHV và WSV4.2F-WSV4.2R3 cho WSSV

Năm 2008, Khawsak và ctv đã tìm ra một phản ứng mRT-PCR có thể phát

hiện cùng lúc 6 loại virus ở tôm là YHV, WSSV, TSV, HPV, IHHNV và MBV trên tôm he Sáu cặp mồi khuếch đại các acid nucleic cho kết quả là các sản phẩm với các kích thước khác nhau Những cặp mồi đặc hiệu cao và không gắn vào những acid nucleic của tôm và virút khác Độ nhạy của phương pháp mRT-PCR là 0.15 pg IHHNV, 0.15 pg TSV, 1 pg HPV, 1.5 pg MBV, 5

pg WSSV và 10 pg YHV Phương pháp này được thử trên 42 mẫu bao gồm tất

cả mô của tôm post và gan tụy của tôm sú đã chọn từ những ao ở trung tâm và vùng phía Nam Thái Lan từ năm 2002 - 2005 được kiểm tra bằng phương pháp mRT-PCR Kết quả cho thấy rằng ảnh hưởng đơn lẻ là chủ yếu và WSSV là phổ biến nhất tại thời điểm đó

Gần đây, Panangala và ctv (2007) vừa được công bố phương pháp mPCR có

thể xác định cùng lúc cả ba loài vi khuẩn gây bệnh trên cá, đó là

Flavobacterium columnare (504pb), Edwardsiella ictaluri (407pb), và Aeromonas hydrophila (209pb)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

CHƯƠNG III NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

3.2 Nội dung thực hiện

- Phục hồi vi khuẩn từ nguồn vi khuẩn liệt kê ở Bảng 3.1

- Nuôi tăng sinh vi khuẩn

- Định danh vi khuẩn theo phương pháp truyền thống

- Định danh vi khuẩn bằng kit API 20E

- Dùng phương pháp PCR khẳng định kết quả định danh

- Tiến hành thí nghiệm gây cảm nhiễm, tái phân lập và tái định danh vi khuẩn

3.3 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 3.3.1 Vật liệu

 Que cấy, bình xịt cồn, đèn cồn,

 Đĩa petri, ống nghiệm,

 Ống đong, lame, lamella,

 Chai nấu môi trường, bình tam giác,

 Cá từ, pipet, đầu cone, ống hút, găng tay,

 Các vật liệu nghiên cứu khác, v.v…

3.3.2 Thiết bị

 Kính hiển vi,

 Tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh, tủ cấy,

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

 Bếp nấu môi trường, máy lắc, nồi thanh trùng,

 Máy ly tâm, máy chu kỳ nhiệt, máy ủ nhiệt, máy so màu quang phổ,…

 Cân điện tử, lò viba, bộ điện di…

 Môi trường OF (Merck) dùng để kiểm tra khả năng oxi hóa và lên men của vi khuẩn

 Môi trường thạch Simon Citrate (Merck) dùng để kiểm tra khả năng sử dùng nguồn cacbon của vi khuẩn

 Môi trường MR-VP (Voges Proskauer; Merck) dùng cho phản ứng VP

 Môi trường NB (nutrient broth; Merck) dùng kiểm tra khả năng sinh indole

 Môi trường decarboxylase (Himedia) + yeast extract (Merck) + 1% acid amin (arginine, lysine và ornithin) (Merck) dùng kiểm tra khả năng khử amino acid

 Môi trường 0.1% pepton (Himedia) + 0.2% KH2PO4 (Merck) + 0.0012% phenol red (Merck) +0.1% glucose + 2% ure (Merck) dùng kiểm tra khả năng sử dụng urea của vi khuẩn

 Môi trường TSI (triple sugar iron; Merck) dùng kiểm tra khả năng sinh khí H2S của vi khuẩn

Thuốc thử

 Dung dịch oxy già H2O2 3% cho phản ứng catalase

 Que thử Oxidase (Merck)

 Đĩa ONPG (Ortho-nitrophenyl galactosidase; Merck)

 Thuốc thử Kovac’s (Merck) cho phản ứng sinh indole

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

 Thuốc thử Lugol’s Iodine (cách pha được trình bày ở phần Phụ lục) cho khả năng thủy phân tinh bột (starch)

 Thuốc thử cho phản ứng VP

 Các dung dịch nhuộm Gram

Các hóa chất cần thiết cho phản ứng PCR

 LB (10g tryptone, 5g yeast extract và 5g sodium chloride, trong 1L nước cất )

- Chủng tham khảo: E223

- Chủng nghiên cứu: 6 chủng (2 chủng phân lập trực tiếp từ cá bệnh và 4 chủng phục hồi từ nguồn vi khuẩn của Khoa Thủy sản)

3.5.2 Nguồn vi khuẩn

- Các dòng vi khuẩn E ictaluri phân lập từ cá tra bị bệnh mủ gan từ

nhiều nguồn khác nhau, sau khi phân lập được trữ ở -80 C

- Vi khuẩn phân lập trực tiếp từ cá bệnh (mẫu dịch vụ)

- Chủng vi khuẩn E ictaluri tham khảo mã số 223 được phân lập từ ao cá

tra bệnh ở An Giang (Từ Thanh Dung, 09/2002, khoa thuỷ sản, trường Đại Học Cần Thơ)

Bảng 3.1 Nguồn gốc các dòng vi khuẩn sử dụng cho đề tài

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

3.5.3 Phương pháp phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn

- Vi khuẩn được phục hồi bằng cách cấy lên môi trường TSA, ghi nhận kết quả phục hồi của vi khuẩn sau 24-48 giờ ở 28 C

- Chọn một khuẩn lạc từ đĩa cấy thuần cho vào ống nghiệm 5ml NB đặt trên máy lắc sau 24 - 48 giờ kiểm tra kết quả

3.5.4 Định danh vi khuẩn theo phương pháp truyền thống

Hình dạng, kích thước tính ròng và các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn được xác định bằng phương pháp của Barrow và Feltham (1993)

Các chỉ tiêu sinh hóa được thực hiện cho phương pháp sinh hóa truyền thống

và sử dụng bộ kít API 20E được trình bày ở Bảng 3.2 và Bảng 3.3 Các chỉ tiêu sử dụng phương pháp sinh hóa truyền thống được thực hiện lặp lại 3 lần, kết quả được ghi nhận là kết quả có ít nhất hai lần lặp lại Cách tiến hành, thành phần môi trường và cách pha chế được trình bày ở phụ lục 1

Bảng 3.2 Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn được xác định bằng phương pháp sinh hóa truyền thống

13 Khả năng sinh urease

14 Khả năng sinh indole

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

3.5.5 Định danh vi khuẩn bằng bộ kít API 20E

Định danh theo hướng dẫn của nhà sản xuất (BioMerieux) Đọc kết quả theo 7 giá trị

- Cho paraffin tiệt trùng vào các ô ADH, LDC, ODC, H2S và URE

- Ủ trong tủ ấm ở 28C và đọc kết quả sau 48 giờ

- Các chỉ tiêu còn lại đọc kết quả dựa vào bảng chỉ tiêu, không cần sử dụng thuốc thử Sau khi cho thuốc thử vào không nên đem ủ trở lại trong tủ ấm

Bảng 3.3: Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi

khuẩn được xác định bằng bộ kit API 20E

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

 Nuôi tăng sinh vi khuẩn (24 giờ) trong ống nghiệm có chứa 5ml môi trường LB

 Chuyển 1.5ml dung dịch vi khuẩn sang ống eppendorf và cho vào 100µl dung dịch TE (10mM Tris HCl và 1mM EDTA)

8 Nước cất -

- Chu kỳ nhiệt

1 Giai đoạn tiền biến tính: 95C trong 4 phút

2 Tiếp theo là 30 chu kỳ gồm:

- Giai đoạn biến tính: 95C trong 30 giây

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

- Giai đoạn gắn mồi: 53C trong 45 giây

- Giai đoạn kéo dài chuỗi: 72C trong 30 giây

3 Giai đoạn kéo dài chuỗi cuối cùng: 72C trong 10 phút

Điện di

Quá trình điện di được thực hiện với dung dịch TAE 0,5X và bản thạch chứa 1.5% agarose Đun nóng dung dịch agarose tan hoàn toàn Sau đó để dung dịch nguội khoảng 50-60C cho ethidium bromide vào và đổ agarose vào khay Thể tích gel tùy thuộc vào kích cỡ của khay đựng gel Độ dày của gel chỉ cần cao hơn đáy của lược gel khoảng 0,3-0,5 cm và bề dày gel không quá 0,8cm Cho gel vào bồn điện di Thêm dung dịch điện di cho vừa bao phủ gel Dùng pipette hút 10µl cho mẫu cần phân tích trộn với một giọt 6X dung dịch nạp mẫu vào từng giếng một Sử dụng thang DNA để xác định khối lượng phân tử của sản phẩm PCR Sử dụng dòng điện từ 100-150V Ngừng điện di khi màu xanh đậm di chuyển khoảng 1/2 đến 2/3 gel

3.5.7 Thí nghiệm gây cảm nhiễm

Mục đích của thí nghiệm gây cảm nhiễm trong đề tài này là để kiểm chứng lại kết quả tái định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và bằng bộ kit API 20E Thí nghiệm được bố trí như sau:

- Bể composite (100L) và các dụng cụ được khử trùng bằng chlorine, xà phòng, rửa lại bằng nước sạch Sau đó cho nước vào bể và lắp hệ thống sục khí liên tục vài ngày để loại hết chlorine

- Cá tra có trọng lượng 50-60g/con, màu sắc tươi sáng, phản ứng linh hoạt được chọn và bố trí ngẫu nhiên 6con/bể vài ngày cho cá quen dần với môi trường nước Vẫn cho ăn bình thường, tiến hành kiểm tra ký sinh trùng và vi sinh trước khi gây cảm nhiễm

- Vi khuẩn sau khi phục hồi trên môi trường TSA, giữ trong tủ ấm 48 giờ

ở 28C, sau đó chọn một khuẩn lạc nuôi tăng sinh trong môi trường nutrient broth 24 giờ, sau đó ly tâm 15 phút (4000 vòng/phút), rửa bằng nước muối sinh lý (0.85% NaCl), xác định mật độ vi khuẩn bằng máy

so màu quang phổ ở bước sóng 650nm, xác định OD = 1(tương đương