ứng dụng kỹ thuật pcr và rt-pcr trong chẩn đoán wssv (white spot syndrome virus) và gav (gill-associated virus) trên tôm sú (penaeus monodon) ở đồng bằng sông cửu long

Nhiều phương pháp như lai In situ, Western blot, PCR, RT-PCR được phát triển nhằm khắc phục những nhược điểm vừa kể trong việc phát hiện GAV, WSSV trên tôm sú giúp người nuôi phát hiện

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN

TRẦN VIỆT TIÊN

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR VÀ RT-PCR TRONG CHẨN ĐOÁN WSSV (White Spot Syndrome virus) VÀ

GAV (Gill-associated virus) TRÊN TÔM SÚ

(Penaeus monodon)

Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Ts ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH Ths NGUYỄN MINH HẬU

Ks TRẦN THỊ MỸ DUYÊN

2007

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

Ban Chủ Nhiệm Khoa Thủy Sản, Bộ Môn Sinh Học và Bệnh Thủy Sản đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện đề tài này

Cô Đặng Thị Hoàng Oanh đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài

Thầy Nguyễn Minh Hậu, chị Trần Thị Mỹ Duyên đã nhiệt tình giúp đỡ tôi

Các thầy, cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt 4 năm đại học Gia đình và bạn bè luôn ở bên tôi trong suốt thời gian qua

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

TÓM TẮT

Đề tài được thực hiện nhằm xác định khả năng ứng dụng phương pháp PCR và PCR trong nghiên cứu tác nhân GAV và WSSV trên tôm sú giống ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long Trong 169 mẫu tôm sú giống được phân tích bằng kit IQ2000 YHV/GAV và WSSV thì có 10,7% mẫu cho kết quả dương tính với GAV và 4,2% mẫu cho kết quả dương tính với WSSV Sáu

RT-mẫu dương tính với GAV được chọn để thực hiện qui trình của Cowley et al.,

2000 Sản phẩm PCR cho kết quả ở 317 bp Sau đó tiếp tục xác định khả năng

ứng dụng khi kết hợp qui trình RT-PCR của Cowley et al (2000) và qui trình

RT-PCR phát hiện gen β-actin (Oanh, 2007)thì phát hiện đồng thời ARNtt của tôm ở vị trí 216 bp và GAV ở vị trí 317 bp Việc phát hiện cho thấy khả năng ứng dụng β-actin làm đối chứng ARN của tôm trong kỹ thuật RT-PCR Dựa trên kết quả đạt được, qui trình tương tự đối với WSSV cũng được thực hiện dựa theo qui trình phát hiện WSSV của OIE (2006) Theo qui trình này, sản phẩm PCR sẽ cho kết quả ở 941 bp và phát hiện đồng thời gen β-actin của tôm

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM TẠ - i

TÓM TẮT -ii

MỤC LỤC -iii

DANH SÁCH BẢNG -v

DANH SÁCH HÌNH - vii

CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU -1

CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU -3

2.1 Tổng quan về tình hình nuôi tôm -3

2.1.1 Trên thế giới -3

2.1.2 Ở Việt Nam -4

2.2 Tổng quan về tình hình dịch bệnh trên tôm -5

2.2.1 Trên thế giới -5

2.2.2 Ở Việt Nam -8

2.3 Sơ lược về GAV -9

2.3.1 Tác nhân gây bệnh -9

2.3.2 Phân bố - 10

2.3.3 Loài và giai đoạn cảm nhiễm - 10

2.3.4 Phương thức lây nhiễm - 10

2.3.5 Phương pháp chẩn đóan - 10

2.3.6 Một số nghiên cứu liên quan đến phương pháp (RT-PCR) phát hiện GAV - 13

2.4 Sơ lược về WSSV - 15

2.4.1 Tác nhân gây bệnh - 15

2.4.2 Phân bố - 16

2.4.3 Loài và giai đoạn cảm nhiễm - 16

2.4.4 Phương thức lây nhiễm - 17

2.4.5 Phương pháp chẩn đóan - 17

2.4.6 Phương pháp phòng và xử lí bệnh - 19

2.4.7 Một số nghiên cứu liên quan đến phương pháp (PCR) phát hiện WSSV - 20

2.5 Phương pháp PCR - 22

2.6 Phương pháp RT-PCR - 24

2.7 Ứng dụng của kĩ thuật PCR trong thủy sản - 25

CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 26

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu - 26

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

3.2 Vật liệu nghiên cứu - 26

3.2.1 Dụng cụ - 26

3.2.2 Hóa chất - 26

3.3 Phương pháp nghiên cứu - 28

3.3.1 Phương pháp thu mẫu - 28

3.3.2 Phát hiện GAV với Kit IQ2000YHV/GAV - 28

3.3.3 Qui trình RT- PCR phát hiện GAV (Cowley et al., 2000) 30 3.3.4 Qui trình RT-PCR phát hiện gen β - actin của tôm (Oanh, 2007) - 34

3.3.5 Phát hiện WSSV với Kit IQ2000WSSV - 36

3.3.6 Ly trích mẫu - 38

3.3.7 Phương pháp đo hàm lượng ADN, ARN bằng máy so màu quang phổ - 39

3.3.8 Khuếch đại ADN (OIE, 2006) - 39

3.3.9 Xử lí số liệu - 41

CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN - 42

4.1 Khảo sát tỉ lệ cảm nhiễm tự nhiên GAV, WSSV của tôm sú giống ở một số tỉnh ĐBSCL - 42

4.2 Thực hiện qui trình RT-PCR phát hiện GAV trên tôm theo phương pháp của Cowley et al., 2000 - 43

4.3 Thực hiện qui trình RT-PCR phát hiện gen β-actin của tôm (Oanh, 2007) - 45

4.4 Xác định khả năng ứng dụng của qui trình mRT-PCR phát hiện GAV và gen β-actin trên tôm - 47

4.5 Thực hiện qui trình PCR phát hiện WSSV trên tôm theo OIE (2006) - 48

CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ - 55

5.1 Kết luận - 55

5.2 Đề nghị - 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO - 56

PHỤ LỤC - 62

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1: Diện tích, sản lượng và giá trị xuất khẩu hàng năm của nuôi trồng

thủy sản Bảng 2.2: Sản lượng thủy sản phân theo khu vực địa phương (ĐV: Tấn) Bảng 2.3: Ước tính giá trị sản lượng thất thoát do dịch bệnh trên tôm ở Châu

Á và Châu Mĩ

Bảng 3.1: Trình tự 4 đoạn mồi sử dụng trong qui trình RT-PCR (Cowley et

al., 2000 )

Bảng 3.2: Trình tự 2 đoạn mồi sử dụng trong qui trình RT-PCT phát hiện

gen β – actin (Oanh, 2007)

Bảng 3.3: Trình tự 4 đoạn mồi sử dụng trong qui trình PCR (OIE, 2006) Bảng 3.4: Thành phần hóa chất tham gia vào quá trình trộn hỗn hợp A tạo

cDNA Bảng 3.5: Thành phần hóa chất tham gia vào quá trình trộn hỗn hợp B tạo

cDNA Bảng 3.6: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước 1

của qui trình RT-PCR (Cowley et al., 2000)

Bảng 3.7: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuyếch đại bước 2

của qui trình RT-PCR (Cowley et al., 2000)

Bảng 3.8: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuyếch đại của qui

trình RT-PCR phát hiện gen β – actin (Oanh, 2007) Bảng 3.9: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước 1

của qui trình OIE (2006) Bảng 3.10: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước 2

của qui trình OIE (2006) Bảng 4.1: Hàm lượng ARN của 6 mẫu phân tích Bảng 4.2: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của qui

trình mRT-PCR phát hiện GAV và gen β – actin trên tôm Bảng 4.3: Hàm lượng ADN của 3 mẫu phân tích

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Bảng 4.4: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước 1

theo qui trình của OIE (2006) Bảng 4.5: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước 2

theo qui trình của OIE (2006) Bảng 4.6: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước 1

theo qui trình của OIE (2006) với hàm lượng khuôn và mồi tăng gấp đôi

Bảng 4.7: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước 2

theo qui trình của OIE (2006) với hàm lượng khuôn và mồi tăng gấp đôi

Bảng 4.8: Hàm lượng ADN của 3 mẫu phân tích ly trích bằng DTAB/CTAB

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1: Sản lượng nuôi tôm nuôi và đánh bắt trên thế giới Hình 2.2: Sản lượng tôm nuôi một số nước trên thế giới

Hình 2.3: Sản lượng tôm nuôi trên thế giới năm 2001

Hình 2.4: Tôm bị nhiễm GAV Mang tôm chuyển sang màu vàng

Hình 2.5: Tôm bị nhiễm GAV Tòan thân tôm chuyển sang màu đỏ

Hình 2.6: Tôm bị nhiễm GAV Tế bào biểu mô có hiện tượng nhân kết đặc Hình 2.7: Cơ quan lymphoid nhiễm GAV, mũi tên chỉ sự hiện diện của vi

rút Hình 2.8: Cơ quan lymphoid của tôm nhiễm GAV, mũi tên chỉ sự hiện diện

của vi rút khi lai In situ

Hình 2.9: Quan sát GAV dưới kính hiển vi điện tử

Hình 2.10: Vi-rút nhuộm âm ở trong huyết tương của tôm sú nhiễm bệnh

WSSV, một số thể vi-rút có đuôi Hình 2.11: Vỏ của một tôm sú ấu niên bị bệnh đốm trắng

Hình 2.12: Lát cắt mô dạ dày của tôm P.chinensis ấu niên bị bệnh đốm trắng Hình 2.13: Lát cắt mang của tôm P.chinensis ấu niên bị bệnh baculovirus đốm

trắng Hình 3.1: Minh họa kết quả chạy PCR phát hiện YHV/GAV theo kit IQ2000 Hình 3.2: Minh họa kết quả chạy PCR phát hiện GAV theo qui trình RT-

PCR (Cowley et al., 2000)

Hình 3.3: Minh họa kết quả chạy PCR theo qui trình RT-PCR phát hiện gen

β – actin (Oanh, 2007) Hình 3.4: Minh họa kết quả chạy PCR phát hiện WSSV theo kit IQ2000 Hình 4.1: Tỉ lệ cảm nhiễm GAV trên tôm sú giống

Hình 4.2: Tỉ lệ cảm nhiễm WSSV trên tôm sú giống Hình 4.3: Kết quả chạy PCR bước 2 (6 mẫu) theo qui trình RT-PCR

(Cowley et al., 2000)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Hình 4.4: Kết quả chạy PCR bước 2 (6 mẫu) theo qui trình RT-PCR

(Cowley et al., 2000) với mẫu 123 pha loãng với hàm lượng khác

nhau Hình 4.5: Kết quả chạy PCR bước 2 theo qui trình RT-PCR phát hiện gen β

– actin (Oanh, 2007) với mẫu 123 và 124 Hình 4.6: Kết quả chạy PCR bước 2 theo qui trình RT-PCR phát hiện gen β

– actin (Oanh, 2007) với mẫu 123 pha loãng với hàm lượng khác nhau

Hình 4.7: Kết quả chạy PCR theo qui trình mRT-PCR phát hiện GAV và

β – actin trên tôm Hình 4.8: Kết quả chạy PCR bước 2 theo qui trình của OIE (2006) Hình 4.9: Kết quả chạy PCR bước 2 theo qui trình OIE (2006) với hàm

lượng khuôn và mồi tăng gấp đôi Hình 4.10: Kết quả kiểm tra ADN trên gel với agarose 1%

Hình 4.11: Kết quả chạy PCR bước 2 mẫu 142 (với 4 hàm lượng ADN

khuôn) theo qui trình OIE (2006) Hình 4.12: Kết quả chạy PCR bước 2 theo qui trình OIE (2006) của mẫu ly

trích bằng DTAB/CTAB

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

CHƯƠNG I

GIỚI THIỆU

Hiện nay ngành nuôi trồng thủy sản đã và đang ngày càng có vai trò quan trọng, đem lại hiệu quả kinh tế cao Đặc biệt là ở đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL), ngành nuôi trồng thủy sản đã trở thành thế mạnh của vùng trong những năm gần đây Tổng diện tích có tiềm năng phát triển khả năng nuôi trồng thủy sản trong vùng trên 1.200.000 ha bằng gần 55% diện tích nuôi của

cả nước (Bộ thủy sản, 2006) Ngành thủy sản với sự phát triển nhanh của mình

đã tạo ra hàng loạt việc làm, nuôi trồng thủy sản chủ yếu ở qui mô hộ gia đình nên đã trở thành nguồn thu hút một lực lượng lao động đông đảo tham gia vào tất cả công đoạn sản xuất, làm giảm sức ép của nạn thiếu việc làm trên cả nước Tuy nhiên ở khá nhiều nơi do phát triển ồ ạt, tự phát, thiếu quy hoạch người nuôi chưa có hiểu biết cơ bản về kỹ thuật nuôi tôm nhất là chưa nhận thức đúng mức về nguy cơ ô nhiễm môi trường và dịch bệnh trong quá trình nuôi tôm nên năng suất thấp, tổn thất là điều không tránh khỏi, gây khó khăn

về đời sống kinh tế cho người nuôi tôm Hiện nay có nhiều loại bệnh xuất hiện trong quá trình nuôi tôm nhưng nguy hiểm nhất là bệnh do vi-rút gây ra như vi-rút gây bệnh đốm trắng (White Spot Syndrome Virus - WSSV), vi-rút gây hội chứng Taura (Taura Syndrome Virus - TSV), vi-rút gây bệnh đầu vàng (Yellow Head Virus - YHV) Đặc biệt là vi-rút gây bệnh liên kết mang (Gill-associated Virus - GAV) bệnh này xuất hiện đầu tiên vào năm 1996 ở

Queensland, Úc (Spann et al., 1997) Do chưa có thuốc chữa trị đặc hiệu nên

công tác phòng ngừa và chẩn đoán bệnh sớm là rất cần thiết Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như mô bệnh học hay dựa trên kinh nghiệm của người nuôi không cho phép phát hiện sớm và chính xác tác nhân gây bệnh Nhiều

phương pháp như lai In situ, Western blot, PCR, RT-PCR được phát triển

nhằm khắc phục những nhược điểm vừa kể trong việc phát hiện GAV, WSSV trên tôm sú giúp người nuôi phát hiện kịp thời, hạn chế đến mức thấp nhất

thiệt hại do dịch bệnh gây ra, nâng cao năng suất (Phan Quốc Việt và ctv,

2003) Do đó đề tài “Ứng dụng kỹ thuật PCR và RT-PCR trong chẩn đoán

WSSV (White Spot Syndrome Virus) và GAV (Gill associated virus) trên

tôm sú (Penaeus monodon) ở đồng bằng sông Cửu Long” được thực hiện

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Mục tiêu của đề tài

Xác định khả năng ứng dụng qui trình RT-PCR và PCR trong chẩn đoán phát

hiện sớm vi-rút GAV, WSSV trên tôm sú (Penaeus monodon) ở đồng bằng

sông Cửu Long

Nội dung của đề tài

1 Xác định tỉ lệ cảm nhiễm tự nhiên của GAV và WSSV trên tôm giống xét nghiệm tại Khoa Thủy sản từ tháng 2-5/2007 sử dụng kit IQ2000YHV/GAV và kit IQ2000WSSV

2 Thực hiện qui trình RT-PCR phát hiện GAV ở tôm sú theo phương

pháp của Cowley et al (2000)

3 Thực hiện qui trình RT-PCR phát hiện gen β – actin ở tôm sú theo Oanh (2007)

4 Xác định khả năng ứng dụng qui trình mRT-PCR phát hiện GAV và

β - actin

5 Thực hiện qui trình PCR phát hiện WSSV trên tôm sú theo OIE (2006)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

0 1 2 3 4 5 6 7

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan tình hình nuôi tôm 2.2.1 Trên thế giới

Nghề nuôi tôm biển có lịch sử lâu đời, hiện nay đang giữ vai trò quan trọng trong nền kinh tế của các nước trong đó nuôi tôm thương phẩm mang lại giá trị to lớn cho người nuôi, sản lượng tôm nuôi của Châu Á và Nam Mỹ đạt 50.000 tấn vào năm 1970 và hơn 600.000 tấn năm 1988, tốc độ tăng trưởng hằng năm 20-30%, vượt qua thập kỉ 1985-1995, làm tăng sản lượng tôm nuôi trên thế giới xấp xỉ 400%, góp phần vào việc cung cấp 25% trong tổng sản lượng trên thế giới Tiêu biểu nhất là Châu Á nơi nắm 75% tổng sản lượng thế giới, 25% còn lại thuộc về các nước Châu Mĩ La Tinh nơi mà Brazil là nước nổi bật nhất với sản lượng 90.000 tấn năm 2003 Hiện nay có 2 khu vực nuôi

tôm lớn là Tây Bán Cầu và Đông Bán Cầu Loài nuôi chủ yếu là P.monodon

chiếm 86% sản lượng Đông Bán Cầu và 56% sản lượng thế giới, còn ở Tây

Bán Cầu là P.vannamei (http://en.wikipedia.org/wiki/Shrimp_farm") Năm

2003 sản lượng tôm nuôi đã vượt quá 1,6 triệu tấn mang lại hơn 9.000 triệu đô

la Thêm vào đó việc xuất khẩu Thẻ chân trắng ở Châu Á đã tạo nên sự bùng

nổ sản lượng, đặc biệt là Trung Quốc Đến năm 2005 sản lượng đã tăng lên nhanh chóng đạt gần 6,5 triệu tấn (Helga, 2004, 2007)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Hình 2.1 Sản lượng nuôi tôm nuôi và đánh bắt trên thế giới Nguồn: Globefish

Hình 2.2 Sản lượng tôm nuôi một số nước trên thế giới Nguồn: Globefish

2.1.2 Ở Việt Nam

Diện tích nuôi tôm ở ĐBSCL thời kỳ 1973-1974 đạt khoảng 70.000 ha Ở Miền Bắc, trước năm 1975 có khoảng 15.000 ha nuôi tôm nước lợ Đến giữa thập kỷ 90 (1994-1995), phát triển nuôi tôm ở Việt Nam có phần chững lại do gặp phải nạn dịch bệnh tôm Trong các năm 1996 -1999, bệnh dịch có giảm nhưng vẫn tiếp tục gây thiệt hại cho người nuôi

Sự bùng nổ của nghề nuôi tôm thương phẩm được đánh dấu vào năm 2000, khi Chính phủ ban hành Nghị quyết 09, cho phép chuyển đổi một phần diện tích trồng lúa, làm muối năng suất thấp, đất hoang hoá sang nuôi trồng thủy sản Diện tích nuôi tôm đã tăng từ 250.000 ha năm 2000, đến 2005 là 959.900

ha, nuôi tôm công nghiệp và bán công nghiệp hơn 36.559 ha (Tạp chí Thủy sản, 2006) Theo số liệu hiện có, Việt Nam là nước có diện tích nuôi tôm vào loại lớn trên thế giới, vượt xa Indonexia, nước có diện tích nuôi tôm lớn nhất vào năm 1996, khoảng 360.000 ha Phần lớn diện tích nuôi tôm ở Việt Nam tập trung ở ĐBSCL, rải rác dọc các cửa sông, kênh, rạch ven biển miền Trung

và ở đồng bằng sông Hồng, sông Thái Bình ở miền Bắc (http://www.vietlinh.com.vn/ html/tintuc)

Thái Lan Indonexia Ecuado

Ấn Độ Việt Nam Trung Quốc Khác

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Song song với việc mở rộng diện tích, sản lượng tôm nuôi cũng tăng mạnh từ những năm 90 và đặc biệt là từ sau năm 2000, Việt Nam trở thành một trong những nước có sản lượng tôm nuôi cao nhất trên thế giới

Việt nam 5% Bangladet 6%

Inđônêxia 11%

Ấn Độ 12%

Trung Quốc 12%

Thái lan 32%

Khác 22%

Việt nam Bangladet Inđônêxia

Ấn Độ Trung Quốc Thái lan Khác

Hình 2.3 Sản lượng tôm nuôi trên thế giới năm 2001.Nguồn:Globefish

Các loài tôm nuôi chính ở Việt Nam gồm tôm sú (Penaeus monodon), tôm he (Penaeus merguiensis), tôm nương (P.orientalis), tôm đất/rảo (Metapenaeus

ensis), trong đó tôm sú là loài nuôi chủ đạo, đóng góp sản lượng cao nhất Gần

đây tôm chân trắng Nam Mỹ (P.vannamei) cũng được đưa vào nuôi ở Việt

Nam Công nghệ nuôi tôm ở Việt Nam trong 20 năm qua đã đạt được những tiến bộ đáng kể Ở Việt Nam đã tồn tại cả 3 hình thức nuôi tôm là quảng canh (cải tiến), bán thâm canh và nuôi thâm canh Đến năm 2005 sản lượng là 1.437,4 nghìn tấn, chiếm trên 70% tổng sản lượng và 60% trong số 3,35 tỉ đô

la Mỹ kim ngạch xuất thủy sản của cả nước (Bộ Thuỷ sản, 2005) Năm 2003, giá trị kim ngạch xuất khẩu thủy sản của cả vùng đạt trên 1,28 tỷ đô la, chiếm trên 57% kim ngạch xuất khẩu của cả nước Nuôi trồng thủy sản ở ĐBSCL chuyển mạnh sang sản xuất hàng hóa quy mô lớn, từng bước trở thành một nghề sản xuất quan trọng, phát triển rộng khắp và có nhiều tiềm năng vững chắc trong thời kỳ đẩy mạnh công nghiệp hóa và hiện đại hóa đất nước (Phạm Đình Đôn, 2006)

2.2 Tổng quan về tình hình dịch bệnh trên tôm 2.2.1 Trên thế giới

Trong suốt 10 năm qua, nền công nghiệp tôm nuôi ở Châu Á-Thái Bình Dương và Châu Mỹ gặp phải khó khăn do sự tác động mạnh mẽ dịch bệnh do vi-rút gây nên (Walker, 1999) Tổng thiệt hại do vi-rút gây ra trung bình hàng năm cho thế giới khoảng hơn 1 tỷ đô la Có ít nhất 4 loại vi-rút là nguyên nhân

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

gây bùng nổ dịch bệnh ở các trại nuôi tôm trên toàn thế giới là White Spot Syndrome Virus (WSSV), Yellow Head Virus (YHV), Taura Syndrome Virus (TSV), và Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV)

Bảng 2.1 Diện tích, sản lượng và giá trị xuất khẩu hàng năm của nuôi trồng thủy sản

Năm

Tổng sản lượng thủy sản (tấn)

Sản lượng nuôi thủy sản (tấn)

Giá trị xuất khẩu (1.000 đô la)

Diện tích mặt nước NTTS (ha)

Sông Cửu Long

Nguồn: Bộ Thủy sản 2006

Ở Châu Á, theo Chanratchakool et al (1999) YHV là vi-rút gây thảm khốc và

làm suy giảm nền kinh tế ở Châu Á Bệnh được phát hiện đầu tiên ở Thái Lan vào năm 1990 Làm thất thoát hơn 30,6 triệu đô la năm 1992 và 650 triệu đô la vào năm 1994 Theo báo cáo của Walker (1999) thì vi-rút có họ hàng với YHV-GAV được phát hiện đầu tiên 1996 ở nông trại Bắc Queensland, Úc

Nhiễm 100% trên tôm sú tự nhiên Thời kì 1994-1998 làm mất 32,5 triệu đô

la, giảm 38% sản lượng Cùng với YHV, WSSV góp phần làm tôm nuôi chết hàng loạt WSSV được báo cáo đầu tiên vào năm 1992, 1993 ở Trung Quốc và Nhật Bản, năm 1994 WSSV đã gây thiệt hại 400 triệu đô la, ở Thái Lan hơn

500 triệu đô la năm 1996, Ecuador năm 1999 có khoảng 150.000 người mất việc do dịch bệnh tôm và thiệt hại hơn 580 triệu đô la năm 2000 (Toshiaki, 2003)

Theo đó là báo cáo về TSV xuất hiện vào năm 1992 ở gần sông Taura ở

Ecuador Đến năm 1993-1994 làm giảm 90% sản lượng P.vannamei ở nước

này Làm hơn 26.000 người mất việc Nhiều nông trại phải đóng cửa và 74%

thất nghiệp năm 1999 Giảm 15-25% sản lượng thế giới (Graindorge and Griffith, 1999) Đồng thời bùng phát ở Honduran cũng làm giảm 18% sản

lượng năm 1994 và 31% năm 1995 (Corralet et al., 1999)

Bảng 2.3 Ước tính giá trị sản lượng thất thoát do dịch bệnh trên tôm ở Châu Á

và Châu Mỹ

Vi-rút Từ năm xuất hiện đến

2001

Giá trị sản lượng bị thất thoát (đô la)

Bao gồm sản lượng thất thoát của Gulf of California fishery 1989-1994

MBV (Peneaus mondon type baculovirus) làm tôm nuôi chết hàng loạt ở Đài

Loan đến Mexico năm 1980 và ở Thái Lan 1990 (Flegel, 2004) Còn ở Úc thì

MBV được báo cáo trên cả P.mondon và P.merguiensis Năm 1984 trên

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

P.merguiensis ở Townsvill (Bắc Queensland) đã tìm thấy thể ẩn của MBV

Đến giữa 1994 thì vi-rút này gây tỉ lệ chết cao hơn 80% (Walker, 1999) IHHNVđược biết đến là loài vi-rút nhỏ nhất trên tôm, là nguyên nhân gây tỉ lệ

chết nghiêm trọng (>90%) trên tôm giống và tôm trưởng thành P.Stylirostris ,

P.vannamei ở trại nuôi thâm canh ở Hawaii Sau khi được phát hiện ở Hawaii

1981 thì IHHNV lại được tìm thấy ở những trại nuôi tôm ở Mỹ và tôm tự nhiên ở bờ biển Thái Bình Dương

Hiện nay, ngày càng có nhiều loài vi-rút xuất hiện trên tôm Theo Lightner, (2003) thì đã tìm thấy hơn 10 loài vi-rút gây bệnh trên tôm, chủ yếu là họ tôm

he (Penaeid) Là nguyên nhân gây tỉ lệ chết cao và làm thất thoát sản lượng, ảnh hưởng nghiêm trọng đến đối với nghề nuôi tôm trên thế giới

2.2.2 Ở Việt Nam

Song song với việc tăng diện tích, tăng sản lượng, tăng mức độ thâm canh thì tình hình dịch bệnh cũng tăng nhanh Ở Việt Nam ngay từ những năm đầu thập niên 90, cùng với sự phát triển của nghề nuôi tôm công nghiệp, "dịch bệnh" tôm ở Việt Nam bắt đầu xuất hiện Theo thống kê của Bộ Thủy sản (1995) từ năm 1993 – 1995 dịch bệnh tôm đã báo động trên toàn quốc, làm thiệt hại hàng ngàn tỷ đồng Trong năm 1994 tổng diện tích nuôi tôm có dịch bệnh là 84.558 ha với sản lượng thiệt hại ước tính là 5.225 tấn trị giá khoảng

294 tỷ đồng Năm 1990, MBV đã gây tỉ lệ chết cao ở hàng loạt những trại giống Trong trận dịch năm 1993 nghiên cứu thấy có sự xuất hiện của MBV, WSSV, YHV, Vibriosis làm mất hơn 100 triệu, đến năm 1994 đã làm thất

thoát 70-80% giá trị kinh tế của đất nước (Lê Văn Khoa và ctv., 1999) Đến

nay, dịch bệnh vẫn tồn tại và lây lan ngày càng rộng gây tổn thất nghiêm trọng

Thiệt hại nặng nhất là ĐBSCL vì đây là khu vực có phong trào nuôi tôm phát triển mạnh, tỷ lệ sản lượng tôm nuôi chiếm hơn 50% của cả nước Trong thời gian từ trung tuần tháng 12/2001 đến nay, ở một số tỉnh ĐBSCL đã và đang xảy ra dịch bệnh trên tất cả các mô hình nuôi, tỷ lệ diện tích bị nhiễm bệnh chiếm khoảng 30-60% trên tổng diện tích nuôi (Theo Khuyến ngư Kiên Giang, 2003) và được coi là “đại dịch tôm sú” Chủ yếu chết do đốm trắng và hiện tượng đỏ thân Tại các vùng mới chuyển đổi, đã có 20.854 ha bị thiệt hại, một

số vùng ở Cà Mau thiệt hại tới hơn 80% Vụ đầu năm 2002, bệnh tôm lại tái diễn ở ĐBSCL Đến hết tháng 9/2003, cả nước có 546.757 ha nuôi tôm nước

lợ thương phẩm, trong đó diện tích có tôm nuôi bị bệnh và chết là 30.083 ha Các tỉnh, thành ven biển từ Ðà Nẵng đến Kiên Giang có tới 29.200 ha nuôi tôm bị chết nhiều, chiếm 97,06% diện tích có tôm bị chết trong cả nước, Cà

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Mau bị hơn 232 ha, nhất là miền Trung thất bại nặng nề khi tính đến ngày 8/3, toàn tỉnh Quãng Ngãi có 150 ha tôm bị chết trong tổng số 450 ha được thả nuôi (Theo Lao Động, 2003) Khánh Hoà, Phú Yên, Quảng Nam, Ninh Thuận

có hàng nghìn ha tôm bị nhiễm bệnh Riêng thiệt hại của Khánh Hoà ước tính 26,6 tỷ đồng, Bình Định 40 tỷ (Mai Phương – Hà Yên, 2003) Còn ở các tỉnh miền Bắc như Bắc bộ, Thanh Hoá hơn 40% diện tích tôm nuôi bị bệnh, tập trung khu công nghiệp Hoằng Phụ, với 70/110 ha nuôi tôm bị bệnh Nghệ An

có 9,1-47,8% diện tích nuôi tôm bệnh đốm trắng, 25,6%-30,4% MBV, 54,5% bệnh đầu vàng (Hà Anh, 2004)

25-Trong vụ tôm sú năm nay (2007), tính đến thời điểm này ở các huyện vùng hạ dịch bệnh trên tôm sú đang bùng phát Theo thông tin sơ bộ ban đầu, ở huyện Cần Giuộc diện tích thiệt hại khoảng 600 ha, huyện Cần Đước 637 ha, huyện Châu Thành khoảng 100 ha, rải rác ở huyện Tân Trụ là 5 ha và đang có chiều hướng phát triển lan rộng (Theo báo Long An, 2007)

Do thời tiết diễn biến phức tạp, năm 2007 ở các tỉnh miền Bắc và miền Trung dịch bệnh tôm sú xảy ra sớm hơn những năm trước và xảy ra hầu hết ở các huyện Trong đó, Nghi Xuân 25 ha, Thạch Hà 15 ha, thị xã Hà Tĩnh 10 ha, Kỳ Anh 5 ha, Cẩm Xuyên 3 ha (Theo báo Hà Tĩnh, 2007)

Còn ở Bình Định, toàn tỉnh có 109 ha tôm nuôi bị dịch bệnh Địa phương có nhiều diện tích tôm nuôi bị dịch bệnh là Phù Mỹ với 43,6 ha, tiếp đến là huyện Tuy Phước 29 ha, TP Quy Nhơn 23, Hoài Nhơn 13,4 ha (Theo báo Bình Định, 2007)

Theo thống kê của Sở Thuỷ sản tỉnh TT-Huế, đến thời điểm này, trên địa bàn tỉnh có hơn 800 ha/2.848 ha hồ tôm đã thả nuôi ở các huyện Phú Vang, Phú Lộc, Quảng Điền, Hương Trà bị nhiễm bệnh, làm chết hơn 60 triệu con tôm nuôi từ 20 - 60 ngày tuổi, gây thiệt hại cho người dân hơn 13 tỉ đồng Trong số diện tích bị nhiễm bệnh, có đến 450 ha bị bệnh đốm trắng, số còn lại bị bệnh còi và đầu vàng Đặc biệt, dịch bệnh năm nay lại đến sớm và lây lan nhanh hơn so với mọi năm, và đến thời điểm này vẫn chưa có dấu hiệu cho thấy dịch bệnh đã được khống chế (Theo báo Lao Động, 2007)

2.3 Sơ lược về GAV 2.3.1 Tác nhân gây bệnh

Theo Cowley et al (2000) GAV (Gill associated virus) thuộc bộ Nidovirales,

họ Roniviridae, loài Okavirus GAV là một lọai vi-rút mà nucleocapsid có dạng ống xoắn và thể vi-rút (virion) hình que, có vỏ bao, hình dạng giống vi-rút đầu vàng Kích thước

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

nucleocapsid 16-18 x 166-435 nm Axit nhân là ARN mạch đơn (ssARN) (Bùi Quang Tề, 2003)

GAV được tìm thấy khá nhiều ở mang và cơ quan bạch huyết nhưng cũng được tìm thấy ở các tế bào máu Khi lây nhiễm cấp tính tế bào máu sẽ giảm nhanh, ở cơ quan bạch huyết bị rối loạn tổ chức và không có cấu trúc ống bình thường và phát hiện được vi-rút trong các mô liên kết của tất cả các cơ quan chủ yếu (Subasinghe, 2001)

2.3.2 Phân bố

GAV được phát hiện vào năm 1996 khi gây tỉ lệ chết cao ở 4 nông trại ở Queensland, Úc, và được báo cáo tìm thấy ở miền nam xứ Walve và miền bắc Territory (Herfort, 2004)

2.3.3 Loài và giai đoạn cảm nhiễm

Spann và cộng tác viên đã nghiên cứu sự nhạy cảm của bốn loài tôm Peneaus

monodon, Penaeus esculentus, Marsupenaeus japonicus, Fennerropennaeus merguiensis với GAV cho thấy lây nhiễm tự nhiên với GAV chỉ tìm thấy ở

tôm Peneaus monodon, nhưng lây nhiễm thực nghiệm đã gây ra tử vong ở tôm

Penaeus esculentus, Fennerropennaeus merguiensi Tính kháng bệnh có liên

quan đến tuổi và kích cỡ tôm đã được tìm thấy ở tôm Marsupenaeus

japonicus Mặc khác GAV là đặc hữu ở tôm Peneaus monodon khỏe mạnh ở

vùng bắc Queensland Hiện vẫn chưa rõ có phải việc gia tăng bệnh là do kết quả của streess môi trường dẫn đến triệu chứng lâm sàng của vi-rút trước khi hiện hữu, vì nó có thể xuất hiện với bệnh đầu vàng và bệnh đốm trắng hoặc liệu bệnh này phát sinh từ một lây nhiễm mới với một chủng gây bệnh của

GAV (Bodad-reantaso et al., 2001)

2.3.4 Phương thức lây nhiễm

Dạng lan truyền theo phương nằm ngang có hiệu quả nhất là do ăn thịt lẫn nhau, nhưng việc lan truyền cũng có thể do nguồn nước GAV cũng có thể truyền theo phương thẳng đứng từ tôm bố mẹ còn khỏe Vi-rút có thể lan truyền từ bố hoặc từ mẹ hoặc cả hai, nhưng không rõ sự lan truyền có trong

trứng hay không (Bodad-reantaso et al., 2001)

2.3.5 Các phuơng pháp chẩn đóan bệnh

Theo tài liệu của FAO về Hướng dẫn chẩn đoán bệnh trên động vật thủy sản Châu Á thì các phương pháp chẩn đóan GAV gồm:

2.3.5.1 Dự chẩn Các quan sát chung (Mức độ I)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Tôm bị nhiễm GAV cấp tính có biểu hiện lờ đờ, kém ăn, bơi lâu trên mặt nước hoặc quanh bờ ao Thân tôm biến thành màu đỏ sẫm, đặc biệt các phần phụ bộ, cánh đuôi và phần miệng, mang biến sang màu vàng-hồng Còn quan sát thấy

kí sinh trùng bám trên mang bẩn Những biểu hiện chung của GAV cấp tính luôn thay đổi và không phải luôn nhận thấy được, vì thế chúng không đáng tin cậy ngay cả chẩn đoán sơ bộ

Hình 2.4 Tôm bị nhiễm GAV, mang tôm chuyển sang màu vàng ( Bùi Quang

Tề, 2003)

Tế bào/mô bệnh học (Mức độ II)

Tiêu bản mô bệnh học nhuộm bằng H&E Các cơ quan bạnh huyết của tôm bị bệnh mất cấu trúc dạng tiểu quản thông thường Tại những nơi bị phá vỡ, không có nhân hoặc tế bào rõ ràng với nhân phình to, ngưng kết hoặc tạo ra không bào Foci của các tế bào không bình thường thấy ở trong các cơ quan bạch huyết và chúng bắt màu Eosin sẫm Các mang của tôm bệnh có biểu hiện

hư hại về cấu trúc như gắn kết các đầu tơ mang, hoại tử toàn bộ và mất lớp biểu bì của các lá mang sơ cấp và thứ cấp Cấu trúc tế bào của mang biểu hiện bình thường tách biệt với foci nhỏ bắt màu kiềm của các tế bào hoại tử

Hình 2.5 Tôm bị nhiễm GAV Toàn thân tôm chuyển sang màu đỏ

(D Callinan, trích dẫn bởi Herfort, 2004)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Hình 2.6 Tôm bị nhiễm GAV.Tế bào biểu mô có hiện tượng nhân kết đặc

(L Owens, trích dẫn bởi Herfort, 2004)

Hình 2.7 Cơ quan lymphoid nhiễm GAV, mũi tên chỉ sự hiện diện của vi-rút

(Flegel, 2004)

Hình 2.8 Cơ quan lymphoid của tôm nhiễn GAV, mũi tên chỉ sự hiện diện của

vi-rút khi lai In situ (Flegel, 2004)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

2.3.5.2 Kiểm khẳng định

Việc chẩn đoán bệnh trọn vẹn có thể được hoàn thành bằng kỹ thuật RT-PCR, kính hiển vi điện tử

Soi kính hiển vi điện tử TEM (Mức độ III)

Tế bào chất của các tế bào cơ quan bạch huyết của tôm bệnh có chứa cả các mảnh vi-rút có vỏ hình que lẫn các capsid nhân vi-rút Capsid nhân dài 166-

435 nm và rộng 16-18 nm Các capsid nhân có hệ vạch với chu kỳ 7 nm và thường thấy gắn kết với thể lưới nội chất Các vi-rút có vỏ thường ít phổ biến, xuất hiện chỉ khoảng 20% các tế bào trong khu vực bị phá vỡ của cơ quan bạch huyết Các vi-rút có vỏ (hình 2.9) dài 183-200 nm và rộng 34-42 nm cũng gắn kết với thể lưới nội chất Vi-rút có vỏ và capsid nhân đều có mặt trong mô mang nhưng capsid nhân là phổ biến hơn, chiếm 40-70% các tế bào trong khi đó các vi-rút có vỏ chỉ chiếm dưới 10%

Hình 2.9 Quan sát GAV dưới kính hiển vi điện tử (Walker, 2001)

2.3.6 Một số nghiên cứu liên quan đến phương pháp (RT-PCR) phát hiện GAV

Cowley et al (1999) đã dùng kỹ thuật RT-PCR và phân tích trình tự vùng gen

tương ứng của YHV (Yellow Head Virus) phân lập từ Thái Lan và GAV Asociated Virus) phân lập từ Úc 3 vùng được chọn để so sánh nằm trong vùng ORF1b Trước tiên ở vùng gen khoảng 577 bp sử dụng cặp mồi GAV5

(Gill-và GAV6 để khuếch đại thì nhận thấy YHV (Gill-và GAV giống nhau 85,1% trình

tự nucleotide và 95,8% trình tự amino acid Khi sử dụng cặp mồi 10F và 144R thì không thể phát hiện được GAV nhưng phân tích trình tự ở vùng gen 135 bp thì thấy giống nhau 83% trình tự nucleotide và 86,7% trình tự amino acid Còn

ở vùng khoảng 1068 nucleotide của YHV khi so sánh với GAV thì nhận thấy giống nhau 80,9% trình tự nucleotide và 86,5% trình tự amino acid Từ kết quả so sánh trình tự trên cùng với dấu hiệu bệnh, mô bệnh học và hình thái

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

học thì có thể kết luận rằng GAV và YHV có mối quan hệ họ hàng gần gũi Với những dữ liệu phân tử và so sánh về bệnh lí giúp ích rất nhiều trong việc nghiên cứu dịch tễ học của bệnh trong việc tìm hiểu nguồn gốc gây bệnh và ngăn ngừa việc lây lan

Đến năm 2000, Cowley et al đã phát hiện GAV (gill-asociated virus) và LOV (Lymphoid Organ Virus) trên P.mondon bằng kỹ thuật RT-nested PCR Kỹ

thuật này sử dụng 2 cặp mồi GAV5/6 để khuếch đại bước 1 cho sản phẩm ở

618 bp và cặp mồi GAV1/2 khuếch đại bước 2 cho sản phẩm ở 317 bp Độ nhạy của phương pháp này rất cao có thể phát hiện với 1fg ADN (tương đương 240 gen) ở bước 1 và với 1ag (tương đương 0.24 gen) ở bước 2 Với khả năng phát hiện cao phương pháp này rất có ích trong việc kiểm tra để phát hiện sớm vi-rút gây bệnh trên tôm giống và cả trên tôm bố mẹ, giúp người nuôi chọn được được giống sạch bệnh hạn chế đến mức thấp nhất rủi ro có thể xảy ra

Cowley et al (2002) đã sử dụng phương pháp kính hiển vi điện tử và

RT-nested-PCR để nghiên cứu sự lan truyền dọc của GAV trên tuyến sinh dục, cơ

quan lymphoid, trứng, nauplii, protozoa và PL5 của P.mondon Khi quan sát

dưới kính hiển vi điện tử thì thấy vài virion của GAV trong dịch lỏng của tuyến sinh dục và không phát hiện ra bất kì nucleocapside hay virion của GAV trong tế bào của tuyến sinh dục Nhưng lại phát hiện nucleocapside và virion của GAV trên 100% cơ quan lymphoid của tôm giống cỡ 1,2g Sử dụng phương pháp RT-PCR và phân tích trình tự từ tôm bố mẹ và trứng được thụ tinh nhân tạo thì thấy kiểu di truyền cả bố và mẹ đều hiện diện trong trứng tuy nhiên kiểu di truyền của tôm mẹ chiếm ưu thế hơn Từ dữ liệu RT-nested PCR

về mức độ nhiễm trên trứng, nauplii, protozoa và PL5 thì đưa ra giả thuyết rằng hầu như chắc chắn kiểu di truyền dọccủa vi-rút là từ con mẹ qua trứng

Phan Thi Ngoc Thuy et al (2003) đã thực hiện đề tài ”Phát hiện bệnh đầu

vàng (Yellow Head Virus-YHV) và hội chứng liên kết đầu vàng asociated virus-GAV) trên tôm sú giống ở Việt Nam” Đoạn mồi sử dụng để kiểm tra YHV và GAV cho các mẫu tôm giống thu năm 2000, 2001 được thiết

(gill-kế chung cho 2 loại vi-rút nằm trong đoạn ORF1b, (gill-kết quả phân tích cho thấy trong 171 mẫu tôm giống thì có hơn 55,76% mẫu dương tính với YHV hoặc GAV Tiếp theo tiến hành kiểm tra sự xuất hiện từng loại vi-rút bằng bộ kit Farming Intelligent Tech Corp của Đài Loan, đoạn mồi để kiểm tra các mẫu tôm giống 2002 được thiết kế riêng cho từng loại vi-rút YHV và GAV nhằm khẳng định sự hiện diện của từng loại vi-rút, kết quả cho thấy trong 21 mẫu tôm giống phân tích tỉ lệ cảm nhiễm YHV và GAV trên tôm sú giống thấp hơn năm 2000 và 2001 Điều này có thể do (1) quá trình thu mẫu có sự khác nhau,

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

(2) do đoạn mồi sử dụng năm 2000, 2001, 2002 là khác nhau Nhận định này

đã được kiểm tra lại và phát hiện các mẫu nhiễm vi-rút đó không thuộc YHV hay GAV mà thuộc nhóm vi-rút mới có liên quan đến 2 loại vi-rút này Vì vậy cần tiến hành nghiên cứu sâu hơn để khẳng định chúng cùng một loài vi-rút nhưng có mức độ đột biến cao hay cùng một nhóm vi-rút có liên quan

2.4 Sơ lược về WSSV 2.4.1 Tác nhân gây bệnh

Vi-rút dạng hình trứng, kích thước 120 x 275 nm, có một đuôi phụ ở một đầu, kích thước 70 x 300 nm Nhân có cấu trúc ADN dạng vòng với 2 chuỗi nucleotide và không có thể ẩn (Occlusion body) Bộ gen 292.967 bp Vi-rút có

ít nhất 5 lớp protein với trọng lượng phân tử từ 15- 28 kilodalton Vỏ bao có

có đường kính khoảng 120-150 nm và chiều dài 270-290 nm với 2 lớp protein VP28 và VP19, nucleocapsid có đường kính 65-70 nm, chiều dài 300-350 nm

với 3 lớp VP26, VP24, VP15 (Vlak et al., 2002)

Trước năm 2002, cả 3 chủng Baculovirus gây bệnh đốm trắng hoặc còn gọi là

vi-rút Trung Quốc Tùy từng nước nghiên cứu mà có tên gọi như sau (Bùi Quang Tề, 2003):

Tên vi-rút Kích thước vi-rút Kích thước nhân Vi-rút Trung Quốc (HHNBV) 120 x 360 nm -

Vi-rút tôm Nhật 1 (RV-PJ-1) - 84 x 226 nm Vi-rút tôm Nhật 2 (RV-PJ-2) 83 x 275 nm 54 x 216 nm Vi-rút bệnh đốm trắng Thái lan

Vi-rút bệnh đốm trắng (WSBV) 70-150 x 350-380 nm 58-67 x 330-350 nm

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Hình 2.10 Vi-rút nhuộm âm ở trong huyết tương cuả tôm sú nhiễm bệnh WSSV, một số thể vi-rút có đuôi (ảnh quan sát dưới kính hiển vi điện tử, vạch

kẻ a = 240, b = 150, c = 100 nm) (Graindorge và Flegel, 1999)

Hội nghị vi-rút học quốc tế lần thứ 12 (Paris, 2002) các tác giả: Just M Vlak, Jean-Robert, Bonami, Tim W Flegel, Guang-Hsiung Kou, Donald V Lightner, Chu-Fang Lo, Philip C, Loh and Peter J Walker đã thống nhất phân

loại vi-rút gây hội chứng đốm trắng (WSSV) là giống mới Whispovirusthuộc

họ mới là Nimaviridae

2.4.2 Phân bố

Bệnh đốm trắng lần đầu tiên được thông báo ở Đài Loan-Trung Quốc và Trung Quốc lục địa vào năm 1991-1992, ở Nhật vào 1993 từ tôm nhập khẩu của Trung Quốc Sau đó cũng phát hiện thấy bệnh ở những nơi khác của Châu

Á như Trung Quốc, Ấn Độ, Indonexia, Hàn Quốc, Malaysia, Đài Loan-Trung Quốc, Thái Lan và Việt Nam Ngoài các nước Châu Á đã nêu trên còn có nhiều triệu chứng và mô học của bệnh đốm trắng đã được thông báo ở Mỹ và Châu Mỹ La Tinh Như năm 1999, bệnh đốm trắng đã được phát hiện ít nhất ở

9 nước thuộc Châu Mỹ là Columbia, Ecuador, Guatemala, Honduras, Mexico,

Nicaragua, Panama, Peru, và Mỹ (Subashinghe et al., 2001)

2.4.3 Loài và giai đoạn cảm nhiễm

Rajendran et al (1999) đã nghiên cứu bệnh đốm trắng có số lượng vật chủ khá

lớn Nghiên cứu được tiến hành trên 5 loài tôm biển, 2 loài tôm nước ngọt, 4

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

loài cua và 2 loài tôm hùm và kết luận tất cả đều nhạy cảm với vi-rút gây bệnh đốm trắng Bệnh bùng phát được thông báo lần đầu tiên từ trại nuôi tôm

P.japonicus ở Nhật và sự lây nhiễm tự nhiên sau đó đã quan sát thấy ở tôm P.chinensis, P.indicus, P Merguiensis, P.mondon, P.setiferus, P.styliostris và P.vannamei Trong các nghiên cứu thực nghiệm, bệnh đốm trắng cũng gây

chết cho tôm P.aztecus, P.duodarum và P.setiferus

Ngoài ra còn phát hiện ở nhiều động vật giáp xác tự nhiên (> 40 loài) như các loài tôm he, tôm nước ngọt, cua, tôm hùm, chân chèo, ấu trùng và côn trùng Gây bệnh trên tôm giống và tôm trưởng thành ở khu vực nuôi thâm canh và quảng canh (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004 )

2.4.4 Phương thức lây nhiễm

Theo Bùi Quang Tề (2003) thì cho rằng bệnh đốm trắng lan truyền theo đường ngang là chính Vi-rút lây từ các giáp xác khác (tôm, cua, chân chèo) bị nhiễm đốm trắng từ bên ngoài hoặc bên trong ao nuôi tôm Có thể một số loài chim nước ăn các mẫu tôm bị nhiễm bệnh đốm trắng ở ao khác đã mang các mẫu thừa vào ao nuôi Cũng có thể tôm bệnh đốm trắng trong ao yếu hoặc chết, tôm khỏe ăn và bệnh lây lan càng nhanh hơn Bệnh đốm trắng không có khả năng lây lan theo chiều dọc, vì các noãn bào (trứng) bị nhiễm vi-rút đốm trắng thì không chín (thành thục) được Nhưng trong quá trình đẻ trứng, tôm có thể thải ra các vi-rút đốm trắng từ trong buồng trứng và do đó, ấu trùng tôm dễ

dàng bị nhiễm từ giai đoạn sớm Tuy nhiên, theo Lo et al (1997) thì lại cho

rằng vi-rút đốm trắng có thể lây lan theo chiều dọc khi gây cảm nhiễm từ tôm

bố mẹ mang mầm bệnh đốm trắng đã chuyển sang thế hệ tôm con

2.4.5 Các phương pháp chẩn đoán bệnh

Theo tài liệu của FAO về Hướng dẫn chẩn đoán bệnh trên động vật thủy sản Châu Á thì các phương pháp chẩn đoán WSSV gồm:

2.4.5.1 Dự chẩn Các quan sát chung (Mức độ I)

Khi bị bệnh tôm có nhiều đốm trắng kích thước 0,5-2,0 mm xuất hiện bên trong vỏ nhất là ở giáp đầu ngực, đốt bụng thứ 5, thứ 6 và lan toàn thân Bên cạnh đó tôm bệnh hoạt động kém, bỏ ăn, bơi lờ đờ ở mặt nước hay dạt vào bờ

ao Đôi khi tôm có dấu hiệu đỏ thân Bệnh thường xuất hiện ở thời điểm 1-2 tháng sau khi thả nuôi, khi môi trường nuôi tôm xấu bệnh dễ xuất hiện Khi các đốm trắng xuất hiện sau 3-10 ngày tôm chết hầu hết trong ao nuôi (100%),

tỉ lệ chết cao và nhanh (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Hình 2.11 Vỏ cuả một tôm sú ấu niên bị bệnh đốm trắng Những cặn vôi dưới

vỏ là các đốm trắng (Lightner, 1996)

Làm tiêu bản ép nhanh (Mức độ II)

Hai kiểu làm tiêu bản ép nhanh có thể dùng để dự chuẩn bệnh đốm trắng: (i) mẫu tôm tươi không nhuộm màu, được cố định trong formalin 10%, và soi trên nền tối cuả kính hiển vi với tụ quang ướt, (ii) các mô đã cố định được nhuộm màu H&E Kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử ở độ phóng đại 40X là thích hợp với phần lớn các nhân bắt màu kiềm đã trương nở tập trung ở giữa, các thể vùi được bao quanh bởi các chất nhiễm sắc

Tế bào/mô bệnh học (Mức độ II)

Tôm sắp chết do vi-rút đốm trắng có biểu hiện hủy hoại các mô trung bì và ngoại bì Nhân của các tế bào bị bệnh phình to và khi nhuộm màu với H&E sẽ nhìn thấy các thể vùi trung tâm bắt màu thuốc nhuộm kiềm từ nhạt đến sẫm và được bao quanh bởi chất nhiễm sắc Cũng có thể nhình thấy những thể vùi nội nhân này trong mẫu ép mang hoặc mô ở lớp dưới cutin hoặc trong lát cắt mô Những mô biểu hiện rõ nhất để xét nghiệm là dưới mô ở lớp dưới cutin của dạ dày, giáp đầu ngực hoặc các mô mang

Hình 2.12 Lát cắt mô dạ dày của tôm P.chinensis ấu niên bị bệnh đốm trắng

Nhìn thấy khá nhiều thể vùi nội nhân trong biểu mô lớp cutin và mô liên kết

phía dưới màng của cơ quan này (mũi tên) (Lightner, 1996)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Hình 2.13 Lát cắt mang của tôm P.chinensis ấu niên bị bệnh baculovirus đốm

trắng Ở các tế bào nhiễm bệnh các thể vùi nội nhân đã và đang phát triển đầy

đủ của baculovirus (mũi tên) (Lightner, 1996)

2.4.5.2 Kiểm khẳng định

Việc chẩn đoán bệnh trọn vẹn có thể được hoàn thành bằng kỹ thuật PCR (bước đơn hoặc nested PCR), kỹ thuật lai tại chổ, phân tích Western hoặc kính hiển vi điện tử

Phương pháp kính hiển vi điện tử (Mức độ III)

Các mô thích hợp cho việc kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử là các mô dưới lớp vỏ cutin, mang và các chân bò đã được kiểm tra trước đó bằng mô học hoặc nhuộm ép nhanh Khi quan sát dưới kính hiển vi sẽ thấy các virion bệnh đốm trắng có hình que đến elip với lớp vỏ 3 lớp, kích thước 80-120 x 250-380

nm

Phương pháp kính hiển vi điện tử nhuộm màu âm bản (Mức độ III)

Các tiêu bản huyết tương của tôm nhuộm âm bản có thể cho thấy các virion có các phần phụ dạng đuôi bên trong các tế bào bị bệnh có nhân trương phồng, nhưng không thấy rõ thể vùi

2.4.6 Phương pháp phòng và xử lí bệnh chung

Hiện nay bệnh vi-rút gây ra những thiệt hại rất lớn, việc điều trị bằng thuốc thường không hiệu quả nên áp dụng biện pháp phòng là chính Do đó theo Bùi Quang Tề, (2003) để phòng bệnh hiệu quả cần áp dụng những nguyên tắc sau: (i) tránh vận chuyển tôm từ nơi có bệnh đến nơi chưa phát bệnh để hạn chế lây lan vùng lân cận; (ii) quản lí chế độ ăn tốt; (iii) nước ao tôm bệnh không thải trực tiếp ra ngoài xử lí bằng vôi nung hoặc bằng chlorine; (iv) quan sát tôm thường xuyên, nếu phát hiện có dấu hiệu bệnh tốt nhất nên thu hoạch ngay (vi) tôm chết vớt khỏi ao, tốt nhất là chôn sống trong vôi nung hoặc đốt; (vii) nếu tôm quá nhỏ không đáng thu hoạch thì cần xử lí nước ao trước khi tháo bỏ

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Bên cạnh đó cần: (i) kiểm tra giống đầu vào; (ii) nuôi đúng thời điểm; (iii) duy trì mật độ tảo ổn định Ngòai ra phơi khô ao bị nhiễm bệnh cũng là một biện pháp có hiệu quả để ngăn chặn sự tồn lưu của vi-rút (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004)

2.4.7 Một số nghiên cứu liên quan đến phương pháp (PCR) phát hiện WSSV

Otta et al (1999) đã tiến hành nghiên cứu để đánh giá phương pháp PCR trong

việc phát hiện vi-rút gây bệnh đốm trắng trên tôm giống, tôm bố mẹ và cả trên giáp xác ở Ấn Độ Cặp mồi được sử dụng để phát hiện WSSV trên

P.japonicus là PJ1/2 và cặp mồi sử dụng cho tôm P.mondon là PM1/2 Tất cả

những mẫu tôm giống và tôm bố mẹ khỏe đều cho kết quả âm tính với 2 cặp mồi này Tuy nhiên ở những mẫu nhiễm WSSV ở mức độ trung bình thì chỉ cặp mồi PM cho kết quả Khi tiến hành kiểm tra trên giáp xác thì phát hiện 1

mẫu ấu trùng Artermia vài mẫu cua Scylla serrata, Sesarma oceanica, Matula

planipes và Charybdis lucifera cho kết quả dương tính với WSSV Kết quả

cho thấy WSSV không chỉ phổ biến trên tôm mà còn ở cả trên giáp xác ở Ấn

Độ

Hsu et al (1999) đã nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp PCR trong việc

phát hiện WSSV trên tôm bố mẹ Ông đã tiến hành kiểm tra những mẫu ADN

ly trích âm tính và cho kết quả dương tính ở bước 2 của những nghiên cứu trước được trữ ở -200 C Tiến hành lặp lại 5 lần cho mỗi mẫu Trong 45 tôm

mẹ trước khi cho đẻ thì cho kết quả dương tính với WSSV 67% (14/45 dương tính ngay bước 1; 15/45 cho kết quả dương tính ở bước 2; còn lại 15/45 cho kết quả âm tính) 15 tôm mẹ nhiễm nặng (dương tính ở bước 1) đều chết trong vòng 1-4 ngày Và tất cả trứng của chúng đều cho kết quả dương tính với WSSV ngay bước 1 30 tôm còn lại chia ra thành 2 nhóm, một nhóm nhiễm nhẹ (21 tôm) và một nhóm cho kết quả âm tính ở bước 2 (9) tôm Những con tôm đang đẻ của 2 nhóm rất cao (nhóm 1 có 81% và nhóm 2 có 78%) Ở nhóm 7/9 tôm đã cho kết quả dương tính sau khi đẻ Còn nhóm nhiễm nhẹ (nhóm 1) 6/21 tôm cho kết quả âm tính và 15/21 cho kết quả dương tính ở bước 2 Tuy nhiên tất cả chúng đều cho kết quả dương tính với WSSV sau khi đẻ và chết 4/21 con chết còn lại 17 con thì chỉ có trứng của 2 con là cho kết quả âm tính với WSSV Trứng của 15 tôm còn lại chia thành 2 nhóm, nhóm nhiễm nhẹ (8 tôm) và nhóm trở nên nhiễm nặng (7) Những tôm trở nên nhiễm nặng sau khi

đẻ thì 91% trứng của chúng cho kết quả dương tính với WSSV ở bước 2 Từ nghiên cứu này cho thấy, nên kiểm tra lại những tôm sau khi đẻ để loại những lỗi do âm tính giả, và loại bỏ những trứng mà tôm mẹ cho kết quả dương tính với WSSV ở bước 1 Mặc khác lại thích hợp cho việc kiểm tra trứng của

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

những tôm mẹ cho kết quả dương tính ở bước 2 để tìm ra được những ấu trùng không nhiễm đốm trắng hạn chế sự phát bệnh và lây lan khi nuôi

Thakur et al (2002) đã tiến hành nghiên cứu mức độ phổ biến vi-rút đốm trắng trên ấu trùng tôm sú P.mondon ở khu vực nuôi tôm bờ biển phía tây Ấn

Độ trong thời gian từ tháng 9/1999 – 1/2000 Ông thu thập khoảng 300 ấu trùng và chia làm 73 nhóm và kiểm tra bệnh đốm trắng bằng kỹ thuật PCR 2 bước Kết quả có 36 nhóm (chiếm 49%) trong 73 nhóm cho kết quả dương tính với WSSV Trong đó 3 nhóm được phát hiện ngay PCR bước 1 và 33 nhóm được phát hiện ở PCR bước 2 Từ kết quả nghiên cứu cho thấy được mức độ phổ biến của đốm trắng trên ấu trùng là khá cao, vì vậy việc kiểm tra

số lượng lớn ấu trùng là rất cần thiết để giảm thiểu những lỗi từ kết quả âm tính giả

Wongteerasupaya et al (2003) đã ứng dụng kỹ thuật PCR-genotyping để xác

định số lần lặp lại của trình tự 54 bp bằng đoạn mồi ORF94 với 65 mẫu từ 55

ao tôm phát dịch bệnh từ tháng 10/2000 – 01/2002 Kết quả tìm thấy 12 dòng WSSV (với số lần lặp lại là 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 lần) trong đó có 8 vùng lặp lại chiếm đa số Sự khác nhau này hữu ích cho việc nghiên cứu dịch tễ học của bệnh đốm trắng, từ sự thay đổi lớn về số lần lặp lại nhưng không có sự thay đổi lớn về trình tự

Magbanua et al (2000) đã nghiên cứu về mức độ phổ biến và sự phân bố địa lí

của vi-rút gây bệnh đốm trắng ở Phillipines từ thắng 5/1999 bằng kỹ thuật PCR và Western blot Tổng số 71 mẫu tôm kiểm tra vi-rút gây bệnh đốm trắng

có 18 mẫu ở giai đoạn ấu trùng và 53 mẫu ở giai đoạn trưởng thành (56 – 160 ngày nuôi) Trong 71 mẫu kiểm tra có 51 mẫu (72%) cho kết quả dương tính với WSSV trong đó 31/51 mẫu (61%) cho kết quả ở bước 1 và 20/51 mẫu (39%) cho kết quả dương tính ở bước 2 Kết quả 50% mẫu ấu trùng và 79% mẫu tôm trưởng thành dương tính với WSSV Tuy nhiên khi kiểm tra 51 mẫu bằng phương pháp Western blot thì chỉ có 6 mẫu cho kết quả dương tính với WSSV Nghiên cứu cho thấy phương pháp PCR rất nhạy Nó có khả năng phát hiện những mẫu nhiễm nhẹ và nặng Còn phương pháp Western blot độ nhạy thấp hơn nhiều nhưng nó là một phương pháp hữu ích trong việc khẳng định kết quả dương tính từ phương pháp PCR cuả những mẫu tôm nhiễm nặng

Lo et al (1999) đã nghiên cứu mối quan hệ của vi-rút gây bệnh đốm trắng ở những vùng địa lí khác nhau gồm: (1) China 96-116A từ P.chinesis, (2) India 95-314 từ P.mondon, (3) Thailand 95-204 từ P.mondon, (4) Crayfish 97-25 từ

Orconectes punctimanus ở U.S, (5) Thailand 95-46 từ P.vannamei gây nhiễm

thực nghiệm, (6) Nam California 97-64 từ P.vannamei, (7) Texas 95-242 và

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Texas 96-7 từ P.vannamei Sử dụng phương pháp lai tại chỗ tiến hành kiểm tra

thì thấy những mẫu nhiễm vi-rút đốm trắng từ những vùng địa lí khác nhau này có mối quan hệ gần gũi tuy nhiên có mẫu ở India 95-314, Crayfish 97-25, Texas 95-242 và Texas 96-7 lại không cho kết quả với một số mẫu dò lỗi này

có thể do sự hiện diện của vi-rút gây bệnh đốm trắng là quá thấp nên phương pháp không thể phát hiện ra Sau đó những mẫu này được tiếp tục nghiên cứu bởi phương pháp PCR Sản phẩm khuếch đại sau đó được phân loại bằng

enzyme giới hạn Cfo I, Hae III, Hpa II, và Rsa I Kết quả chỉ có một loạt

những mẫu vi-rút ở Texas khác biệt với những mẫu ở vùng địa lí khác Tuy nhiên để khẳng định hay bác bỏ giả thuyết này cần nhiều thời gian nghiên cứu hơn nữa

Bui Thi Minh Dieu et al (2004) tiến hành nghiên cứu những mẫu tôm dương

tính với WSSV trên 8 ao tôm ở Việt Nam để tìm hiểu dịch tễ học phân tử của vi-rút gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm ở Việt Nam Bộ gen của WSSV khi được khuếch đại bởi 2 cặp mồi ORF23/24, ORF14/15 thì thấy có cùng nguồn gốc với WSSV-TW (WSSV Đài Loan) và WSSV- TH (WSSV Trung Quốc) Dựa vào số lượng và số lần lặp lại khác nhau mà 3 cặp mồi còn lại ORF75, ORF94, ORF125 sẽ xác định số lần lặp lại của bộ gen để từ đó phân loại những dòng vi-rút mới ở Việt Nam

2.5 Phương pháp PCR

PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật khuếch đại trình tự ADN chuyên biệt trong ống nghiệm từ một đoạn ADN với sự hiện diện của một hoặc hai đoạn mồi (oligonucleotides), enzyme tổng hợp ADN, các nucleotide

tự do và dung dịch đệm (buffer) theo các chu kỳ nhiệt Kỹ thuật này được phát

minh và đặt tên bởi Mullis et al , 1985 PCR có tính nhạy cao và cho phép tìm

ra nhanh chóng, thậm chí chỉ với một tiểu phần vi-rút Những vi-rút ẩn, không

có các biến đổi về mô học cũng có thể tìm thấy bằng kỹ thuật này Hiện nay PCR được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu để phát hiện và tạo ra đột biến gen, chẩn đoán phát hiện mầm bệnh Theo Khuất Hữu Thanh, (2003) thì PCR là một chuỗi phản ứng gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước là:

Bước 1: Giai đoạn biến tính (denaturation): trong một dung dịch phản ứng bao

gồm các thành phần cần thiết cho tái bản ADN (dNTP, enzyme ADN polymerase, Mg2+…), phân tử ADN được biến tính cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử, thường là 94- 950C thường 30-60 giây Nếu đoạn ADN khuôn có tỉ lệ G – C cao, chuỗi G- C liền nhau dài cần tính toán để có nhiệt độ phù hợp

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Bước 2: Giai đoạn lai (anealation): trong bước này nhiệt độ được hạ thấp hơn

Tm của các đoạn mồi cho phép mồi bắt cặp với khuôn Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 60-700C Tùy theo độ lớn và Tm của các đoạn mồi sử dụng và kéo dài 30-60 giây

Bước 3: Giai đoạn tổng hợp (elongation): nhiệt độ được tăng lên 720C giúp cho ADN polymerase tổng hợp tốt nhất (thường dùng Taq ADN polymerase

tách chiết từ̀ vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus) Thời gian của các

bước này tùy thuộc độ dài của ADN cần khuếch đại, thường 30 giây đến nhiều phút

Mỗi chu kỳ gồm 3 bước trên sẽ lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu so với lần trước Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân Theo tính toán thì sau 25 đến 35 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ cho ra khoảng 225 –

235 bản sao

Trong qui trình PCR, sau những chu kỳ đầu, các chu kỳ cuối nhiệt độ cần tăng thêm 1-20C Do về sau lượng mồi giảm, lượng khuôn tăng lên, mặt khác enzyme Taq ADN polymerase hoạt động yếu dần do tác động nhiệt độ, vì vậy cần tăng nhiệt độ chu kỳ sau để tăng hiệu quả tổng hợp ADN

Sau phản ứng các ADN được nhuộm bởi Ethidium Bromide và có thể quan sát thông qua điện di sản phẩm PCR trong gel agarose và đọc kết quả dưới bàn đọc UV

PCR là phương pháp được thực hiện ở mức phân tử nên chịu ảnh hưởng bởi các nhân tố sau:

ADN khuôn: Theo Khuất Hữu Thanh, (2003) khuôn ADN có vai trò rất quan trọng, ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả PCR Phản ứng tối ưu với các đoạn khuôn hoàn toàn tinh sạch, nhưng khi các đoạn khuôn không sạch có lẫn các protein thì hiệu quả giảm theo tỉ lệ thuận với độ tinh sạch của ADN khuôn

Enzyme: ADN polymerase càng mạnh, phản ứng PCR càng triệt để Tùy các đặc tính của ADN polymerase, tùy thuộc nguồn gốc tách chiết enzyme mà hiệu quả phản ứng khác nhau

Mồi và nhiệt độ gắn mồi: Mồi là yếu tố quan trọng quyết định hiệu quả phản ứng PCR Chọn mồi cần tính toán để bảo đảm Tm của mồi xuôi và mồi ngược không chênh lệch nhau quá lớn, thông thường trong khoảng 4-50C và nhiệt độ nóng chảy của mồi khoảng 720C Độ dài mồi cần chọn khoảng 18-30 nucleotide, nếu mồi nhỏ hơn 10 nucleotide, mồi bám không đặc hiệu Còn mồi dài hơn 30 nucleotide sẽ ảnh hưởng đến cơ chế tổng hợp ở bước 3 (Trần Thị

Xô và Nguyễn Thị Lan, 2005) Các mồi phải có trình tự nucleotide chỉ có thể

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

bắt cặp bổ sung ở hai đầu của các mạch khuôn, nếu mồi bắt cặp ở giữa khuôn PCR không thành công Tỉ lệ G-C giữa các mồi thường chiếm khoảng 40-75%

để đảm bảo liên kết gắn mồi với khuôn bền vững Tuy nhiên trình tự GC không lặp lại quá nhiều lần trong một mồi Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự ADN cần khuếch đại Trình tự ADN cần khuếch đại, là trình tự nằm giữa hai mồi không quá lớn 1kb Sợi ADN được tổng hợp khi đầu 3’ của mồi

đã liên kết với khuôn mặc dầu đầu 5’ có thể tự do Do đó đầu 5’ của mồi có thể được gắn thêm linker, hoặc đoạn nucleotide điều khiển (promoter) Thể tích mồi khoảng 0,1 mM đến 0,5 mM Thể tích mồi thường được xác định dựa vào giá trị OD đo ở 260 nm (Võ Thị Thương Lan, 2006)

Nồng độ các loại nucleotide tự do: Nồng độ các loại nucleotide (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) khoảng 20 – 200 µM / mỗi loại, khi nồng độ nucleotide qua thấp

sẽ giảm hiệu quả PCR, ngược lại nồng độ nucleotide quá cao dễ dẫn đến sự khuếch đại “kí sinh” (Khuất Hữu Thanh, 2003)

Nồng độ Mg2+: Theo Trần Thị Xô và Nguyễn Thị Lan (2005) ion Mg2+ là thành phần không thể thiếu được của phản ứng PCR, nồng độ Mg2+ tối ưu để thực hiện phản ứng PCR từ 150-200 µM Nước sử dụng cho phản ứng phải là nước tinh khiết, không chứa bất kì ion lạ nào Không chứa các enzyme cắt hạn chế và các enzyme phân hủy acid nucleic Môi trường dung dịch đệm phải ổn định Dung tích tổng số cho một phản ứng PCR khoảng từ 20-50 µl

Chu kỳ phản ứng: Cũng theo Hồ Huỳnh Thùy Dương, (2003) số lượng chu kỳ PCR thường không vượt quá 40 chu kỳ cho một phản ứng Sở dĩ như vậy là vì phản ứng PCR diễn tiến qua 2 giai đoạn, trong giai đọan đầu số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì những nguyên nhân sau: (1) sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng (2) sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng (3) các bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau…

2.6 Phương pháp RT-PCR Phương pháp tách chiết ARN

Các phân tử ARN không bền, dễ bị phân hủy bởi các ribonuclease (Rnase) Hơn nữa các phân tử Rnase lại có mặt khắp nơi (có rất nhiều trên đầu ngón tay người thao tác), nên việc tách chiết ARN đòi hỏi nhiều thận trọng để tránh tạp nhiễm các Rnase từ môi trường Theo Hồ Huỳnh Thùy Dương, (2003) thì phương pháp tách chiết ARN gồm các bước sau: (1) Tế bào /mô được nghiền trong một dung dịch gồm một chất tẩy mạnh như SDS hay sarcosyl ở nồng độ cao, một tác nhân làm biến tính protein mạnh, một chất khử Hai loại chất có tác dụng ức chế hoạt động của ARN nội bào và tách các protein liên kết khỏi

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

phân tử ARN (2) Các protein được loại bỏ khỏi mẫu qua xử lí phenol: chloroform và li tâm (3) ARN hòa tan trong pha nước được tủa bằng ethanol

và được thu nhận lại qua li tâm

Phương pháp RT – PCR

Do Taq polymerase không hoạt động trên ARNtt nên người ta dùng phối hợp RT-PCR với enzyme phiên mã ngược RT-PCR (Reverse transcriptase-PCR) Trước hết ARN được chuyển thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngược Mồi

sử dụng cho giai đoạn này có thể là mồi ngược của PCR giai đoạn sau, có thể

là oligonucleotide oligo T (để bắt cặp với đuôi polyA của các ARNtt), mà cũng

có thể là các hexannucleotide (trình tự gồm 6 nucleotide) bắt cặp ngẫu nhiên với một trình tự ngắn trên ARNtt Sau đó cDNA được khuếch đại nhờ Taq Polymerase Kỹ thuật PR-PCR cho phép nghiên cứu các ARNtt tồn tại với hàm lượng rất thấp, không thể phát hiện với các phương pháp cổ điển như Northern blot (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003)

2.7 Ứng dụng của kỹ thuật PCR trong thủy sản

Theo Trần Thị Tuyết Hoa (2004) thì ứng dụng của PCR là:

Phát hiện nhanh tác nhân gây bệnh ở dạng tiềm ẩn giúp cho quá trình chọn lọc

cá thể thủy sản có chất lượng tốt trong chọn giống và ương nuôi: (1) Chẩn đoán bệnh: điều tra nguyên nhân bùng nổ bệnh và cách giải quyết (2) Phòng bệnh: kiểm tra tôm bố mẹ và tôm giống ở trại sản xuất giống (3) Kiểm soát bệnh: theo dõi kiểm tra theo khu vực và kiểm tra tôm giống nhập khẩu

Ứng dụng trong đánh giá an toàn hàng thủy sản xuất khẩu – Sự nhiễm khuẩn

hàng thủy sản bởi Vibrio parahaemolyticus, Escherichia coli

Góp phần vào qui trình xác định trình tự nucleotide đột biến của tác nhân gây bệnh, hay có thể là các loài động vật thủy sản

Hạn chế của PCR

Phương pháp PCR thường không hoạt động với những đoạn ADN có chiều dài lớn hơn 3kb (kết quả tốt với những đoạn ADN có chiều dài nhỏ hơn 1,5 kb)

Dễ bị nhiễm do sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước

Các sai sót do enzyme Taq ADN polymerase (khoảng 10.000 nucleotide thì enzyme gắn sai một nucleotide) (Phạm Thành Hổ, 2003)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

CHƯƠNG III

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

• Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 02/2007 – 05/2007

• Địa điểm phân tích mẫu: Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản – Khoa Thủy Sản, trường Đại học Cần Thơ

3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Dụng cụ

- Máy chu kỳ nhiệt

- Máy so màu quang phổ

- Dung dịch chạy điện di TAE

- Dung dich nạp mẫu 6X

- Kit IQ2000 YHV/GAV

GAV5 (mồi xuôi) 5’- AAT TTT GCC ATC CTC GTC AC - 3’

GAV6 (mồi ngược) 5’- TGG ATG TTG TGT GTT CTC AAC - 3’

GAV1 (mồi xuôi) 5’ - ATC CAT ACT ACT CTA AAC TTC C -3’

GAV2 (mồi ngược) 5’- GAA TTT CTC GAA CAA CAG ACG -3’

3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp thu mẫu

Tôm giống cỡ PL12-15 được thu từ các trại giống và được vận chuyển đến phòng thí nghiệm trữ trong túi nilon 2 lớp có bơm oxy

3.3.2 Phát hiện GAV với kit IQ2000YHV/GAV (thực hiện theo tài liệu

hướng dẫn của nhà sản xuất Farming Intelligene Corporation, Đài Loan)

a) Ly trích ARN

− Cho mẫu (mang hoặc 5, 10 tôm bột) vào ống eppendorf 1,5 ml có chứa 500

µl dung dịch ly trích ARN

− Nghiền mẫu trong típ bằng que nghiền và giữ ở nhiệt độ phòng 5 phút

− Thêm 100 µl CHCl3 sau đó lắc kĩ trong 20 giây Giữ ở nhiệt độ phòng 2-3 phút, sau đó ly tâm (12.000 vòng/phút) trong 15 phút

− Chuyển 200 µl phần trong phía trên sang một ống eppendorf 0,5 ml mới có chứa 200µl 2-propanol (isopropanol)

− Lắc nhẹ, ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 10 phút, sau đó rút bỏ isopropanol

− Rửa phần viên bằng 0,5 ml ethanol 75% sau đó ly tâm cho lắng xuống trong 5 phút ở 75.000 vòng/phút đến khi xuất hiện phần viên, sau đó rút bỏ ethanol và làm khô phần viên

− Hòa tan phần viên với 500 µl nước cất tiệt trùng

b Quy trình khuếch đại Hóa chất phản ứng :

Phản ứng RT-PCR 1: 8 µl / Phản ứng

Chuẩn bị các chất cần thiết sau:

- RT - PCR Pre-Mix reagent 7,0 µl

- Iqzyme ADN Polymerase 2UI/µl 0,5 µl

- Reverse Transcriptase (RT) Enzyme Mix 0,5 µl Phản ứng nested PCR : 15 µl / Phản ứng

Chuẩn bị các chất cần thiết sau:

- Nested Pre-Mix reagent 14 µl

- Iqzyme ADN Polymerase 2UI/µl 1 µl

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu